KR100201584B1 - 사람 파필로마 바이러스 18형 이6 단백질에 대한 인체의 면역성 조절 기능을 갖는 펩타이드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사람 파필로마 18형 E6 단백질 항원에 대한 세포독성 T임파구(cytotoxic T 1ynphocyte, CTL)를 유도 하거나 이 바이러스에 대한 인체의 면역성을 조절할 수 있는 신규한 펩타이드에 관한 것이다.

Description

사람 파필로마 바일러스 18형 E6 단백질에 대한 인체의 면역성 조절기능을 갖는 펩타이드

제1도는 T2 세포의 표면에 발현되는 MHC class I 분자의 양이 배약액 중에 존재하는 합성 펩타이드의 종류에 따라 변화하는 것을 형광강도지수로 나타낸 것이다.

제2도는 각 펩타이드에 의하여 유도된 세포독성 T 임파구가 그 합성 펩타이드를 표면에 결합시킨 T2 세포를 살해하는 양상을 나타낸 것이다.

[발명의 목적]

본 발명은 사람 파필로마 바이러스 18형 E6 단백질에 대한 인체의 면역성 조절기능을 갖는 신규한 펩타이드에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 사람 파필로마 바이러스 18형 E6 단백질 항원에 대한 세포독상 T 임파구(cytotoxic T 1ymphocyte, CTL)를 유도하거나 면역조절을 유도할 수 있는 항원의 특정부위(epitope)에 해당하는 신규한 펩타이드에 관한 것이다.

[발명이 속하는 기술분야 및 그 분야의 종래기술]

사람 파필로마 바이러스에 속하는 몇가지 종(예를 들어, 16 형 및 18형)은 E6 및 E7 과 같은 발암성 단백질의 작용에 의하여 여성에게 있어서 자궁암을 유발한다고 알려져 있다.

따라서, 인체가 이 바이러스에 감염되면 인체내에서는 이에 대한 항체를 생산하여 독성물질을 제거하는 한편, 바이러스에 감염된 세포를 파괴하여 제거하기 위한 면역반응이 일어나게 되고 궁극적으로는 바이러스의 감염으로부터 회복되게 된다. 특히, 감염된 세포의 파괴는 세포살해능을 가진 CTL이란 세포의 활성이 유도됨에 따라 이루어지는데, CTL이 활성화되어 세포살해능을 갖기 위해서는 감염된 바이러스의 단백질의 일부를 인지하는 과정이 필수적이다. 바이러스 단백질의 인지는 일반적으로 감염된 세포내에서 합성된 바이러스 단백질이 세포내 분해과정을 거쳐 8 내지 15 개의 아미노산으로 구성된 펩타이드로 전화되고 그중 일부가 세포내에 있는 주조직적합분자(major histocompatibility complex molecule, MHC) 제 1 군 (class I)과 결합한 형태로 세포표면에 나타나면 이를 CTL이 인지하여 활성화되고 감염된 세포를 파괴하는 기작으로 진전하게 된다.

그러나, CTL이 인지하는 단백질의 특정부위(펩타이드)는 바이러스 단백질의 분해결과로 생성된 펩타이드 중 반드시 특정한 아미노산 서열을 갖고 있어야 한다. 이러한 특정 아미노산 서열을 규명하게 되면 그 아미노산 서열에 해당하는 펩타이드를 화학적 방법으로 합성하여 생산할 수 있게 되므로 인체 내의 바이러스를 특이적으로 인지하는 CTL을 인위적으로 유도하는 등 면역반을을 조절하여 그 바이러스에 의하여 유발되는 질명의 예방과 치료효과를 거둘 수 있게 된다.

[발명이 이루고자 하는 기술적 과제]

이에 본 발명자들은 사람 파필로마바이러스 18형의 E6 단백질 서열중에서 상기와 같이 CTL 에 의하여 인지됨으로써 세포독성을 유발할 수 있는 특정 펩타이드 서열을 밝혀내고자 집중적인 연구를 수행한 결과, 표 2에 나타낸 3 가지의 펩타이드가 이러한 목적에 부합하여 소기의 목적을 달성할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

[발명의 구성 및 작용]

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

본 발명은 사람 파필로마 바이러스 18형 E6 단백질 항원에 대한 CTL을 유도하거나 면역조절을 유도할 수 있는 신규한 펩타이드 서열에 관한 것이다.

사람 파필로마 바이러스 18형 E6 단백질의 전체 아미노산 서열은 문헌(참조: Journal of Molecular Biology 193, 599)에 공지되어 있으므로 본 발명자들은 이 공지 서열을 기초로 하여 하기 표 1에 나나낸 바와 같은 18 가지의 펩타이드를 먼저 합성하였다.

본 연구에서 사용된 상기 18종의 펩타이드는 이미 보고된 다른 종류의 단백질에서 HLA-A2 에 결합가능한 것으로 알려진 서열부분에 공통되는 모티브(motif)를 함유하도록 선택된 것이다. 즉, 공지된 사람 파필로마 바이러스 18형 E6 단백질의 전체 아미노산 서열중에서 9개 또는 10개의 아미노산을 함유하는 펩타이드로서 2번째 아미노산이 로이신이나 메티오닌이고 9번째 또는 10번째 아미노산이 로이신, 발린 또는 이소로이신인 경우에 해당하는 서열들을 선별하였다(참조: Nature 351:2900, Science 255:1261, Cell 74:929 and J. Immunol 152:3904).

이와 같이 선별된 상기 18종의 펩타이드중 실제로 본 발명의 목적에 맞는 특정의 성질을 갖는 펩타이드가 어느 것인지 선별하기 위하여, 본 발명자들은 합성된 각 펩타이드를 대상으로 하여 T2 세포의 표면에 발현되는 MHC class I 분자의 양을 측정하는 한편, 합성 펩타이드가 부착된 T2 세포가 세포독성 T 임파구에 의해 살해될 수 있는지 여부를 실험하였다.

먼저, 합성 펩타이드가 MHC class I 분자와 결합하는지를 조사하기 위하여 T2 세포주를 사용하였는데, T2 세포주는 HLA-A2.1 형의 MHC class I 분자를 발현하는 원세포주인 T1 세포에 돌연변이를 일으킨 세포주로서, 세포내의 펩타이드 이동에 관여하는 효소의 이상에 의하여 MHC class I 분자가 펩타이드와 정상적으로 결합하는 것이 저해되어 불안정한 분자구조를 갖게 되고 결과적으로 정상적인 생장조건에서 낮은 MHC class I의 발현정도를 보이는 특징을 갖는다. 그러나, 세포의 배양액내에 MHC class I 분자와 결합가능한 펩타이드가 존재할 경우에는 그 펩타이드가 세포표면의 MHC class I 분자와 결합하여 분자구조가 안정됨으로 해서 결과적으로 MHC class I 분자의 발현이 증가되는 양상을 보이므로 특정 펩타이드와 MHC class I 분자와의 결합가능성을 측정할 수 있게 된다.

본 실험에서도 이러한 원리를 이용하여 T2 세포표면의 MHC class I 분자의 발현정도를 측정함으로써 특정 펩타이드의 결합정도를 측정하였으며(실시예 1 참조), 그 결과를 제1도에 나타내었다. 제1도에서 T1 및 T2 는 각기 해당하는 세포주의 자체 형광강도값, 즉 특정의 펩타이드가 첨가되지 않은 상태에서의 형광강도값을 나타내며 이를 기준으로 하여 각 합성 펩타이드의 활성을 가늠함으로써 A8, B4 및 C1을 포함한 8 가지 정도의 펩타이드가 MHC class I 분자에 대하여 높은 결합력을 나타내는 것으로 관찰되었다.

한편, 특정 펩타이드가 CTL 에 의하여 인지되기 위해서는 MHC class I 과 결합한 형태로 T 임파구의 세포수용체(T cell receptor)에 의하여 인식되어야 한다. 따라서, 제1도에 나타낸 비교적 높은 결합력을 갖는 펩타이드가 실제로 인체내의 사람 파필로마 바이러스를 인지하는 CTL 에 의하여 인식되고, 이에 따라 합성펩타이드로 감작시킨 T2 세포(표적세포)가 CTL (효능세포)에 의해 살해되는지를 조사하였다(실시예 2 참조).

그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이 A8, B4 및 C1 햅 3가지 펩타이드가 인체내에 존재하는 사람 파필로마 바이러스 항원을 인지하는 CTL을 고도로 활성화시킬 뿐아니라, 그 CTL에 의하여 다시 인지될 수 있는 새로운 종류의 펩타이드임이 확인되었다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

단, 하기 실시예 실험에서 사용한 시약들은 시그마(Sigma)사의 제품을 사용하였으며, 항체는 바이오리소스(Bioresource)사의 제품을 사용하였다. 또한, 항체를 분비하는 세포주 BB7.2 및 T1, T2 세포주는 ATCC 로부터 구입하여 사용하였다.

[실시예 1]

[본 발명에 따른 합성 펩타이드의 MHC class I 분자에 대한 결합능]

사람 파필로마바이러스 18형 E6 단백질의 아미노산 서열로부터 표 1에 명기한 펩타이드를 포함하는 18종의 펩타이드를 화학적 방법으로 합성하고 인산 완충용액((phosphate buffered saline, PBS, pH 7.6)에 용해 시켰다. 사용한 18종의 펩타이드의 아미노산 서열은 표 1에 명기한 바와 같다.

본 실험에서는 T2 세포 표면의 MHC class I 분자의 발현정도를 측정하여 특정 펩타이드의 결합정도를 측정하고자 다음과 같이 실험하였다.

합성된 여러종류의 펩타이드를 T2 세포주의 배양액 0.5ml에 10*g/ml의 농도로 첨가하여 37℃에서 3 시간동안 반응시킨 후 PBS로 미반응 펩타이드를 제거하였다. 세포를 항 MHC class I 항체인 BB7.2 의 배양액 100㎕와 4℃에서 40분간 반응시키고 세척한다음 플루오르신 이소티오시아네이트(fluorescine isothiocyanate, FITC)를 부착한 항 생쥐 면역글로블린 항체(anti-mouse immunoglobulin antibody)를 50:1 로 희석시킨 용액 50㎕와 혼합하여 4℃에서 30분간 반응시키고 세척하여 이 세포들의 형광강도를 플로우사이토미터(flow cytometer)로 측정하였다.

제1도 측정한 형광강도값을 각각 하기 수학식 1에 의거하여 얻어진 형광지수의 평균값으로 환산하여 나타낸 것이다.

형광지수 = (형광강도-기본 형광강도) / T2 세포주 자체의 형광강도 × 100

여기서, 기본 형광강도는 비특이적 항체반응에 의하여 나타나는 형광강도값을 의미한다.

실험결과, 합성된 18종의 펩타이드중 하기 표 2에 나타낸 8 가지의 펩타이드가 다른 것에 비하여 높은 결합능을 나타내는 것으로 확인되었으므로 본 발명자들은 다음 단게로 이들 8 종의 합성 펩타이드에 대하여 하기 실시예 2 의 실험을 수행하였다.

[실시예 2]

[본 발명에 따른 합성 펩타이드로 감작시킨 표적세포에 대한 펩타이드 특이성 T 세포의 세포살해능]

일반 헌혈자의 혈액으로부터 원심분리방범으로 백혈구를 분리하여 상기의 펩타이드를 10㎍/ml의 농도로 첨가하고 5%의 이산화탄소를 함유하는 항온항습배양기에서 배양하였다. 1주일 후 자극세포로서 감마선으로 불황성화시킨 동일 조직 적합항원의 백혈구세포를 배양하는 세포의 3배수 내지 5배수로 첨가하고 동량의 동일 펩타이드롤 함께 첨가하여 배양하였다. 이때, 자극세포는 CTL을 유도하고 증식시키는 작용을 하는데, 감마선으로 자극세포의 증식을 불황성화시키지 않으면 원래의 T 세포와 함께 증식하여 구분을 할 수 없게 되므로 이와 같이 감마선으로 불활성화 시킨 자극세포를 사용하였다. 배양한지 1주일 후부터는 여기에 10 유닛(unit)의 인터로이킨-2(interleukin-2)를 추가하여 배양하였다.

펩타이드 특이성 혈구세포가 특정 펩타이드 항원을 표면에 부착시킨 T2 세포주를 인지하여 파괴하는 정도는 하기 방법에 따라 측정하였으며, 측정결과는 표 3 및 제2도에 나타내었다.

T2 세포에 각 펩타이드를 10㎍/ml의 농도로 첨가하여 3시간동안 37℃에서 반응시킨 후 세척하고 옥타데카노일아미노플루오르신(octadecanoylaminofluorescine, OAF)을 100ng/ml의 농도로 처리하여 30분간 37℃에서 반응시켜 세척하였다. 반응이 끝난 T2 세포주를 표 3에 나타낸 비율로 혈구세포와 혼합하여 37℃에서 반응시킨 다음, 프로피듐요오다이드(propidium iodide, PI)를 3㎍/ml의 농도로 30분간 철기한 후 세척하고 세포혼합액의 형광강도를 측정하여 파괴된 T2 세포의 양을 측정하였다. 이때, 표적세포로 사용된 T2 세포주는 OAF 에 의한 형광을 나타내고 죽은 세포는 P1에 의한 형광을 나타내므로 OAF와 P1 에 의한 두가지 형광을 모두 나타내는 세포가 파괴된 T2 세포주이다.

실험 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 사용된 8 가지의 합성 펩타이드 중에서 A8, B4 및 C1 의 3가지 펩타이드가 인체내에 존재하는 사람 파필로마 바이러스 항원을 인지하는 CTL을 활성화시킬 뿐아니라 그 CTL 에 의하여 다시 인지될 수 있는 새로운 종류의 펩타이드임이 확인되었다.

[발명의 효과]

상기 실시예 1 및 2를 통해 구체적으로 확인된 바와 같이, 본 발명에 따른 합성 펩타이드 A8, B4 및 C1는 MHC class I 분자에 대한 높은 결합능을 보유하는 동시에, 사람 파필로마 바이러스 항원을 인지하는 CTL을 활성화시켜 그 활성화된 CTL에 의해 다시금 바이러스에 감염된 세포가 살해될 수 있도록 작용한다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 바이러스 감염으로부터의 회복은 물론이고, 궁극적으로는 인체내의 면역기전을 조절하는 역할을 수행할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (2)

1. 사람 파필로마 바이러스 18형 E6 단백질 항원에 대한 인체의 면역성 조절기능을 갖는 하기 서열식 1 내지 3 중에서 선택된 어느 하나의 펩타이드.

   Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Glu-Ile-Thr-Cys-Val

   Glu-Leu-Thr-Glu-Val-Phe-Glu-Phe-Ala

   Lys-Leu-Thr-Asn-Thr-Gly-Leu-Tyr-Asn-Leu
2. 제1항에 있어서, 서열식 1인 펩타이드.