KR100190910B1

KR100190910B1 - C형 간염 바이러스에 대한 인체 면역조절기능을 가진펩타이드

Info

Publication number: KR100190910B1
Application number: KR1019950065410A
Authority: KR
Inventors: 황유경; 조성유; 최윤; 이기영; 정현용; 박용식; 정홍석; 문홍모
Original assignee: 허영섭; 재단법인 목암생명공학연구소
Priority date: 1995-12-29
Filing date: 1995-12-29
Publication date: 1999-06-01
Also published as: KR970032887A

Abstract

본 발명은 C형 간염 바이러스에 대한 인체의 면역성 조절기능을 가지는 신규한 일련의 펩타이드군에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 C형 간염 바이러스 단백질 항원중 간염 바이러스에 대한 세포독성 T-임파구(cytotoxic T lymphocytes, CTL)를 유도하거나, 그 바이러스에 대해 면역관용(immunological tolerance)을 유도하는 항원의 특정부위(epitope)에 해당하는 펩타이드의 아미노산 서열에 관한 것이다. 본 발명의 P3, P7, P9, P14, P21, P29, P36, P45 등 10종의 신규한 펩타이드는 인체내에 존재하는 C형 간염 바이러스 항원을 인지하는 CTL을 활성화시키며, 그 CTL에 의해 다시 인지될 수 있는 펩타이드로서, 간염 바이러스 관련 질환의 예방과 치료에 사용될수 있을 것이다.

Description

C형 간염 바이러스에 대한 인체 면역조절기능을 펩타이드

제1도는 T2 세포의 표면에 발현되는 MHC Class I 분자의 변화를 형광강도로 나타낸 그래프이다.

제2(A) 및 2(B)도는 CTL에 의한 T2 세포의 살해능을 나타내는 그래프이다.

본 발명은 C형 간염 바이러스에 대한 인체의 면역성 조절기능을 가지는 신규한 펩타이드군에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 C형 간염 바이러스 단백질항원중 간염 바이러스에 대한 세포독성 T-임파구 (cytotoxic T lymphocytes, 이하 'CTL'이라 함)를 유도하거나, 그 바이러스에 대해 면역관용(immunological tolerance)을 유도하는 항원의 특정부위(epitope)에 해당하는 펩타이드의 아미노산 서열 및 그를 이용하여 C형 간염 바이러스에 특이성을 가지는 세포독성 T-임파구를 유도하는 방법에 관한 것이다.

인체에 C형 간염 바이러스가 감염이 되면, 인체내에서는 이 바이러스를 제거할 목적으로 여러가지 생리현상이 일어나는데, 가장 중요한 현상 중의 하나는 이미 감염된 세포를 파괴하여 제거하는 일이며, 이러한 과정을 통하여 궁극적으로 바이러스 감염으로 부터 회복할 수 있다. 이러한 감염세포의 파괴는 세포살해능(cytotoxicity)을 가진 또 다른 종류의 세포에 의해 이루어지는데, 이 세포는 '세포독성 T-임파구(CTL)'라 불리워진다. 이 CTL이 자신이 갖고 있는 세포 살해능을 발휘하기 위해서는 감염된 바이러스를 구성하는 단백질의 일부를 먼저 인지하는 과정을 거쳐야 한다. 일반적으로, 바이러스 단백질은 감염된 세포내에서 합성되어진 후, 세포내 분해과정을 통하여 8 내지 15개의 아미노산으로 구성된 짧은 펩타이드 형태로 전환된다. 이렇게 생성된 펩타이드 중의 일부가 세포내에 있는 주조직 적합분자(major histocompatibility complex molecule, 이하 'MHC'라 함)와 결합한 형태로 세포 표면에 나타나게 되면, CTL이 이를 인지하여 감염된 세포를 파괴하게 된다. 한편, MHC는 제1군 (Class I)과 제 2군(Class II)의 두종류로 나뉘어지는데, 이들 중 제1군(Class I)이 CTL의 유도에 더욱 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나, CTL이 인지하는 단백질의 부위(펩타이드)는 바이러스 단백질의 분해결과로 일어난 펩타이드 중 반드시 특정한 아미노산 서열을 갖고 있는 경우에 한정되는 것으로 알려져 있다(참조 : Fremont, D. et al., Science, 257 : 919-926(1992); Matsumura, M. et al., Science, 257:929-934(1992)). 따라서, 이러한 특정한 부위의 아미노산 서열을 알게 되면 그 아미노산 서열에 상응하는 펩타이드를 화학적 방법으로 합성, 생산할 수 있게 되고, 이를 이용하여 인체내에 간염 바이러스를 특이적으로 인지하는 CTL을 인위적으로 유도해내거나 면역억제 등의 다른 면역반응을 조절함으로써, 간염 바이러스에 의해 유발되는 유도해내거나 면역억제 등의 다른 면역반응을 조절함으로써, 간염 바이러스에 의해 유발되는 질환의 예방과 치료에 효과를 거둘 수 있게 된다.

이러한 배경 아래, 여러 연구자들이 간염 바이러스 단백질의 아미노산 서열가운데서 CTL에 의해 인지된느 펩타이드의 아미노산 서열을 알아내기 위한 노력을 기울여 왔으며, 그 결과 이미 몇개의 특정 아미노산 서열이 보고되었고, 앞으로도 몇종류가 더 발견되리라고 기대되고 있다.

그러나, 간염 바이러스 관련 질환의 예방과 치료에 의와 같은 펩타이드를 사용하려면 되도록 많은 종류의 펩타이드를 동시에 사용하는 것이 필요할 뿐만 아니라, 펩타이드의 종류에 따라 그 효능이 달라질 수 있기 때문에, 새로이 발견되는 펩타이드의 아미노산 서열은 매우 중요한 의미를 갖게 되는 것이다.

본 발명의 발명자들은 상기와 같이 CTL에 의해 인지되어지는 C형 간염 바이러스의 펩타이드 중 지금까지 보고된 적이 없는 일련의 펩타이드군을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 목적은 CTL에 의해 인지되어 바이러스에 의해 살해능을 나타내는 C형 간염 바이러스의 펩타이드군을 제공하는 것이다.

본 발명에서 발견된 신규한 펩타이드 서열은 하기 표1에 나타낸 바와 같다.

표1 : C형 간염 바이러스 단백질 중 CTL에 의해 인지되어지는 펩타이드의 아미노산 서열 및 단백질 내의 위치

* 아미노산 서열은 IUPAC의 명명법에 따라 기재하였다.

또한, 본 발명은 그 취지에 따라 전기 9개 내지 10개의 아미노산을 포함하는 펩타이드 뿐만 아니라, 전기 펩타이드 전, 후에 최소 1개 내지 5개의 아미노산을 추가로 포함하는 모든 펩타이드 및 그의 기능적 등가물을 포함한다. 본 발명에서, '기능적 등가물'이라 함은 전기 펩타이드의 아미노산 서열 중 1개 또는 2개가 치환된 모든 펩타이드를 의미한다. 예를 들면, 치환은 Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; 및, Phe, Tyr과 같은 조합을 포함한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

(실시예 1)

C형 간염 바이러스 펩타이드의 발견 및 아미노산 서열의 결정

본 발명에서 사용한 펩타이드는 MHC 제1군(Class I) 분자와 결합할 수 있는 펩타이드가 특정 아미노산 서열을 가진다는 사실 및 MHC 제1군(Class I) 분자가 갖는 구조적 특성에 착안하여, C형 간염 바이러스 항원 단백질의 전체 아미노산 서열로 부터 MHC Class I 분자와 결합할 가능성이 있는 펩타이드의 아미노산 서열을 결정하였다. 즉, 사람의 MHC 제1군(Class I) 분자인 HLA-A2와 결합할 수 있는 펩타이드는 N말단으로 부터 두번째 위치의 아미노산과 C말단의 아미노산이 루신(leucine), 발린(valine) 혹은 이소루신(isoleucine)등으로 이루어진다는 사실을 근거로 하여(참조 : Matsumura, M. et al., Science, 257:929-934(1992)), 이러한 조건을 충족시키는 아미노산 서열을 C형 간염 바이러스 항원 단백질의 전체 아미노산 서열로 부터 찾아내고, 이들 중 HLA-A2분자의 3차구조에 적합하게 결합될 가능성이 가장 높은 것들을 선택하여 이들의 아미노산 서열에 따라 화학적으로 합성하였다.

(실시예 2)

펩타이드의 합성 및 MHC 분자와의 결합도 측정

C형 간염 바이러스 단백질의 아미노산 서열로 부터 상기 표 1에 표시한 바와 같은 펩타이드를 포함하여 서로 다른 아미노산 서열을 가진 24종의 펩타이드를 화학적 방법으로 합성하고, 이들을 인산완충용액(phosphate buffered saline, 이하 'PBS'라 함)에 용해시켰다. 이들 펩타이드가 MHC 분자, 그 중에서도 CTL의 유도와 관계가 있는 제1 군(Class I) 분자와 결합할 수 있는지의 여부를 확인하기 위하여, 이들 펩타이드를 T2 세포주에 100ug/ml 부터 시작하여 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1ug/ml의 농도가 되도록 각각 넣어주고, 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, PBS로 세척하여 미반응 펩타이드를 제거하고, 이 세포를 사람 MHC 제1군(Class I) 분자의 일종인 HLA-A2.1에 대한 항체(anti-HLA-A2.1 antibody) BB7.2를 가해준 다음, 다시 1시간 동안 4oC에서 반응시켰다. 이 세포를 다시 PBS로 세척하고 여기에 플루오르신 이소치오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC)를 부착한 항마우스 면역글로불린 항체(anti-mouse immunoglobulin antibody)를 가하여 1시간 동안 4℃에서 반응시킨 후, 이 세포들이 띠고 있는 형광강도를 형광분광기(Spectrofluorometer)를 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 제1도에 나타내었다.

제1도에서 보듯이, P2, P3, P7, P8, P9, P10, P14, P16, P17, P21, P23, P29, P30, P31, P36, P39, P40, P45, P50, 및 P52등 20 종류의 펩타이드가 T2세포 표면에 있는 MHC 제1군(Class I) 분자와의 결합력이 양호한 것으로 나타났다. 또한, 본 실험에 사용된 펩타이드의 종류는 하기 표2에 나타난 바와 같다.

본 실시예에 사용한 T2 세포주는 세포내 펩타이드의 이동경로에 이상이 생겨 MHC 제1군(Class I) 분자가 펩타이드와 적절히 결합할 수 없어 분자구조의 불안정화를 초래하게 되고, 결과적으로 정상 생육온도인 37℃에서 배양하면 MHC 분자의 발현정도가 낮은 상태를 유지하게 된다. 그러나, T2 세포의 배양시에 MHC 분자와 결합할 수 있는 펩타이드가 배양액 가운데 존재할 경우에는 그 펩타이드의 MHC 분자와 결합하게 되고, 그 결과로 MHC 분자의 분자적 안정성이 증가함에 따라 MHC 분자의 발현이 증가하는 특성을 갖고 있어, 이를 이용하면 특정 펩타이드가 T2 세포표면의 MHC 분자와 결합하는 정도는 BB7.2항체가 세포표면에 결합되는 정도를 측정함으로써 정량할 수 있었다.

(실시예 3)

펩타이드와 CTL 간의 인지도 측정

어떤 특정 펩타이드가 MHC 분자와 결합한다는 사실이 곧 CTL에 의해 인지된다고는 할 수 없으므로, 결합력이 양호하다고 판정된 9개의 펩타이드를 가지고 실제적으로 인체내에 존재하는 C형 간염 바이러스를 인지하는 CTL에 의해 인지되는지를 알아보기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.

즉, 일반 헌혈자들로 부터 수집된 혈액중 C형 간염 바이러스 항체가 양성으로 판정된(ELISA 값; 1.0이상) 혈액을 수집하고, 원심분리하여 세포들을 모아 혈액세포로 부터 적혈구를 제거하고 남은 백혈구에 상기의 펩타이드를 10mg/ml 농도가 되도록 넣어준 다음, 37℃에서 5%의 이산화탄소를 함유하고 있는 배양기(CO₂incubator)에서 배양하였다. 배양 시작 2일후 10단위(unit)의 인터루킨-2(interleukine-2)를 배양액에 첨가해 주고 3일간 추가 배양한 다음, 자극세포로서 동일한 MHC의 혈구세포를 미토마이신 C(mitomycin C)로 불활성화시켜 넣어주고, 펩타이드와 인터루킨-2를 추가하였다. 이들을 7일간 더 배양한 다음, 이들 혈구세포가 특정 펩타이드를 표면에 결합시킨 T2 세포를 인지하여 파괴하는지를 측정하여, 그 결과를 하기 표 3과 제2도에 나타내었다.

배양된 혈구세포에 의한 T2세포의 파괴를 측정하는 방법은 다음과 같다 : T2세포에 100ug/ml의 펩타이드를 가하여 3시간 동안 37℃에서 반응시킨 다음, 그 세포를 충분히 세척하여 미반응 펩타이드를 제거하고, 그 T2세포에 방사능을 가진 소디움크로메이트(Cr⁵¹)를 더하여 37℃의 CO₂배양기에서 2시간동안 반응시켰다. 반응이 끝난 다음, RPMI 배양액으로 충분히 세척하여 미반응한 소디움크로메이트를 제거하고, PBS로 세척한 혈구세포를 일정한 비율로 섞어주어 37℃의 CO₂배양기에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응한 배양액을 수거하여 감마선의 세기를 측정함으로써, 혈구세포가 표적세포인 T2를 살해하는 능력을 측정할 수 있었다.

상기 표3에서 보는 바와 같이, P3, P7, P9, P14, P17, P21, P29, P 36, P39, P45, C2, C20의 경우는 배양한 혈구세포에 의해 인지됨을 알 수 있었는데, 이들 중 C2 및 C20은 이미 공지된 것들로서, 본 실실예에서 사용한 실험방법들이 적절하다는 것을 보여주는 양성 대조군의 역할을 하고 있음을 확인하였다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명의 P3, P7, P9, P14, P17, P21, P29, P 36, P39, P45등 10종의 펩타이드군은 인체내에 존재하는 C형 간염 바이러스 항원을 인지하는 CTL을 활성화시키며, 그 CTL에 의해 다시 인지될 수 있는 펩타이드로서, 간염 바이러스 관련 질환의 예방과 치료에 사용될 수 있을 것이다.

Claims

하기와 같은 C형 간염 바이러스 펩타이드를 포함하며, 세포독성 T임파구(CTL)에 의해 인지되어 바이러스에 의해 세포살해능을 나타내는 펩타이드;

LLSTTEWQV

(상기에서, 아미노산 서열은 IUPAC의 명명법에 따라 기재하였다.)
하기와 같은 C형 간염 바이러스 펩타이드를 포함하며, 세포독성 T임파구(CTL)에 의해 인지되어 바이러스에 의해 세포살해능을 나타내는 펩타이드;

YLYGIGSAVV

(상기에서, 아미노산 서열은 IUPAC의 명명법에 따라 기재하였다.)
하기와 같은 C형 간염 바이러스 펩타이드를 포함하며, 세포독성 T임파구(CTL)에 의해 인지되어 바이러스에 의해 세포살해능을 나타내는 펩타이드;

AVYGIWPLL

(상기에서, 아미노산 서열은 IUPAC의 명명법에 따라 기재하였다.)
하기와 같은 C형 간염 바이러스 펩타이드를 포함하며, 세포독성 T임파구(CTL)에 의해 인지되어 바이러스에 의해 세포살해능을 나타내는 펩타이드;

HLQVWVPPL

(상기에서, 아미노산 서열은 IUPAC의 명명법에 따라 기재하였다.)
하기와 같은 C형 간염 바이러스 펩타이드를 포함하며, 세포독성 T임파구(CTL)에 의해 인지되어 바이러스에 의해 세포살해능을 나타내는 펩타이드;

YLNTPGLPV

(상기에서, 아미노산 서열은 IUPAC의 명명법에 따라 기재하였다.)
하기와 같은 C형 간염 바이러스 펩타이드를 포함하며, 세포독성 T임파구(CTL)에 의해 인지되어 바이러스에 의해 세포살해능을 나타내는 펩타이드;

LLREEVTFQV

(상기에서, 아미노산 서열은 IUPAC의 명명법에 따라 기재하였다.)
하기와 같은 C형 간염 바이러스 펩타이드를 포함하며, 세포독성 T임파구(CTL)에 의해 인지되어 바이러스에 의해 세포살해능을 나타내는 펩타이드;

VLDDHYQDV

(상기에서, 아미노산 서열은 IUPAC의 명명법에 따라 기재하였다.)
제1항 내지 제7항의 펩타이드를 1종 이상 사용하여 인간을 제외한 포유동물의 C형 간염 바이러스에 대한 특이성을 가진 세포독성 T 임파구(CTL)를 유도하는 방법.