JP3424752B2 - Ｍｈｃ−分子のペプチドモチーフの決定 - Google Patents

Ｍｈｃ−分子のペプチドモチーフの決定

Info

Publication number
JP3424752B2
JP3424752B2 JP50920192A JP50920192A JP3424752B2 JP 3424752 B2 JP3424752 B2 JP 3424752B2 JP 50920192 A JP50920192 A JP 50920192A JP 50920192 A JP50920192 A JP 50920192A JP 3424752 B2 JP3424752 B2 JP 3424752B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
mhc
peptide
molecules
molecule
peptides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP50920192A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH06510850A (ja
Inventor
ラメンゼー，ハンス−ゲオルク
ファルク，キルステン
レチュケ，オーラフ
ステファノヴィッチ，シュテファン
ユング，ギュンター
Original Assignee
マックス−プランク−ゲゼルシャフト ツール フェルデルング デル ヴィッセンシャフテン エー ファウ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19914116256 external-priority patent/DE4116256C2/de
Application filed by マックス−プランク−ゲゼルシャフト ツール フェルデルング デル ヴィッセンシャフテン エー ファウ filed Critical マックス−プランク−ゲゼルシャフト ツール フェルデルング デル ヴィッセンシャフテン エー ファウ
Publication of JPH06510850A publication Critical patent/JPH06510850A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3424752B2 publication Critical patent/JP3424752B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56977—HLA or MHC typing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6878—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids in eptitope analysis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）の分子
のペプチドモチーフもしくは−エピトープの決定法、並
びに、これにより決定されたペプチドモチーフ、及び診
断薬又は治療薬を製造するためのその使用に関する。
細胞障害性Ｔリンパ球（CTL）は、MHC−コードされた
分子と結合した抗原ペプチドエピトープを認識する。こ
の現象を、MHC−拘束（MHC−Restriktion）という（文
献;1〜５）。ヒトMHCクラスＩ−分子、HLA−2Aw68の結
晶学は、重鎖のα１−及びα２−ドメインにより形成さ
れるスリット（Spalt）を生じた（文献;3、６）。この
スリットは、抗原ペプチドエピトープに関する結合部位
であると思われる。それというのも、この双方の結晶
は、MHC−配列と適合せずに、このスリットに接して存
在している大きさのペプチドの構造を有するからである
（文献;6）。
これらのペプチドが細胞内タンパク質に由来し、かつ
細胞表面に存在しているので、細胞障害性Ｔリンパ球
が、異常な特徴に関して細胞を試験することができると
考えられている。Ｔ−細胞エピトープを表出する、予め
MHC−会合された（assoziierte）ペプチドを、普通の又
はウイルス感染した細胞から抽出した（文献;2、４、
５、７、８）。相当する方法で、MHCクラスII拘束Ｔ細
胞により認識される抗原も、合成ペプチドにより模倣さ
れ得（文献;9）、MHC−会合された抗原ペプチドが、MHC
クラスII−分子から溶離した（文献;10）。Ｔ−細胞受
容体、ペプチド及びMHC−分子からなる３分子複合体
（文献;11）の真中のその位置に基づいて、Ｔ−細胞エ
ピトープは、特異的免疫系の中心点であり、かつ従っ
て、その発生の法則性の理解並びに決定法に対する多く
の必要性がある（文献;12〜15）。
本発明による課題は、 （ａ）MHC−分子を含有する細胞の溶解により細胞抽出
物を得、 （ｂ）MHC−分子を、その上に存在するペプチド混合物
と共に、免疫沈降により細胞抽出物から分離し、 （ｃ）ペプチド混合物を、MHC−分子及びその他のタン
パク質成分から分離し、 （ｄ）個々のペプチド又は／及びその混合物を配列決定
し、かつ （ｅ）得られた、殊に混合物の配列決定又は一連の個々
のペプチドの配列決定の情報から、対立遺伝子特異性ペ
プチドモチーフ（allelspezifische Peptidmotiv）を引
き出すことを特徴とする、 クラスＩ又はIIの主要組織適合遺伝子複合体（MHC）の
対立遺伝子特異性ペプチドモチーフを決定する方法によ
り解決される。
本発明方法により、MHC−分子がそれに従ってペプチ
ドを選択し、かつ提示する法則性を有しするペプチドモ
チーフが決定される。
本発明の方法は、クラスＩのMHC−分子を用いても、
クラスIIのMHC−分子を用いても実施することができ、
その際、クラスＩのMHC−分子が有利である。Ｈ−2K
d−、Ｈ−Kb−、Ｈ−2Db−、Ｈ−2Kk、Ｈ−2Km′又はHL
A−Ａ＊0201又はＡ＊0205−分子は、殊に有利である。
本発明方法によるMHC−分子の免疫沈降の際に、それ
ぞれ、所望のMHC−分子に関して特異的である適当な抗
体を使用する。本発明の使用のために有利なMHC−クラ
スＩ−分子は、分子A1、A2、A3、A9、A10、A11、A28、A
29、Aw19、B5、B7、B8、B12〜B18、B21、B35及びB37を
包含するが、これらに限定されない。本発明による使用
のために有利なMHC−クラスII−分子は、分子DR1、DR
2、DR3、DR4、DR5、DRw6、DR7、Dw1、Dw2及びDw3を包含
するが、これらに限定されない。Ｈ−2Kd−又はＨ−2Db
−分子の決定のためには、例えば、Kd−特異性抗体（文
献;25）又はDb−特異性抗体（文献;26）を使用する。有
利には、モノクローナル抗体を使用するが、相当する精
製したポリクローナル抗血清の使用も可能である。本発
明により使用することができる抗体は、当業者によく知
られた標準技術を用いて、新たに製造することができ
る。本発明で使用することができる抗体の例は、ATCC
（American Type Culture Collection、12301 Parklawn
Drive,Rockville、MD20852）の「カタログ・オブ・セ
ル・ラインズ・ハイブリドーマス（Catalogue of Cell
Lines and Hydridomas）」中に記載されているHLA−抗
原に対する全ての抗体を包含するが、これらに限定され
ない。
有利な例（ATCC−命名法）は、HB82、117、166、54、
122、164、95、120、116、118、94、152、178、56、11
5、157、119、59、105、165、144、180、103、110、10
9、151及び104を包含する。カタログ中に記載されてい
るマウス−Ｈ−２−抗原に対する全ての抗体は、同様
に、本発明で使用することができる。固相結合した抗体
による免疫沈降は、殊に有利に行なわれる。固相結合し
た抗体は、当業者に公知の方法で、例えば抗体と、ブロ
ムシアン活性化されたセファロース4B（ファルマシア
（Pharmacia）LKB）とを結合させることにより製造する
ことができる。本発明で使用するための抗体に結合させ
ることができる他の固相の例は、アガロース、セルロー
ス、セファデックス、プロテインＡ−セファロース及び
プロテイン−Ｇ−セファロースを包含するが、これらに
限定されない。免疫沈降の有利な方法は、臭化シアン活
性化されたセファロース4B（例１参照）から製造された
小球に結合している抗体を用いる、吸着クロマトグラフ
ィーである。
MHC−分子及びその他のタンパク質成分からの、決定
すべきペプチド混合物の分離は、クロマトグラフィー法
により、特に逆相−HPLCにより行なうのが有利である。
その際、トリフルオロ酢酸/H2O−トリフルオロ酢酸／ア
セトニトリル−勾配で分離を行なうことは、有利である
ことが判明した。MHC−分子からペプチド混合物を分離
するための本発明により使用することができる他の方法
は、イオン交換、ゲル濾過、電気焦点泳動、高性能毛管
電気泳動（HPCE）及びゲル電気泳動を包含するが、これ
らに限定されない。分離を実施するためのもう１つの方
法は、超遠心分離であり、その際、3000Da又は5000Da又
は10000Daの透過性を有する膜を使用する。HPLCを用い
る分離が、有利に実施される。
ペプチド混合物のクロマトグラフィー分離の際に、多
くの場合に、単独のペプチド種を単離することができ
る。従って、本発明方法の工程（ｄ）は、ペプチド混合
物の配列決定（これにより、それぞれのMHC−分子のペ
プチドモチーフに関する共通配列が決定される）又は／
及び明確なペプチドの配列決定よりなる。
ペプチドモチーフの決定に関する出発物質として、正
常細胞、腫瘍細胞も、ウイルス又はこのような病原体に
より感染した細胞も、並びに試験管内で培養したヒト又
は動物の細胞も使用することができる。本発明で使用す
ることができる正常細胞は、新しい細胞、例えば抹消血
液リンパ球、脾臓、肺、胸腺の細胞又はMHC−分子を表
現する他の組織の細胞を包含するが、これらに限定され
るものではない。本発明で使用した腫瘍細胞系には、腫
瘍細胞EL4及びP815を包含するが、同様に、これらに限
定されるものではない。本発明により使用することがで
きるウイルス感染した細胞は、これらに限定されるもの
ではないが、エプスタイン−バール−ウイルス（Epstei
n−Barr−Virus）により形質転換されたヒトＢ−細胞で
あるJY−細胞を包含する。本発明方法により決定された
ペプチドモチーフは、次の基本原理に相当する： ａ）これらは、MHC−クラスＩ−分子の場合には、アミ
ノ酸８、９、10又は11個、並びにMHC−クラスII−分子
の場合には、アミノ酸８〜15個の対立遺伝子特異性ペプ
チドの長さを有する。
ｂ）これらは、２個のアンカー位置（Ankerposition）
（「アンカー位置」なる名称は、位置が単独のアミノ酸
残基の強いシグナルを示すか、又は位置が非常によく類
似した側鎖を有する僅かなアミノ酸残基で占められる場
合に使用する）を有し、そのうち、１個のアンカー位置
は、常にＣ−末端に存在し、かつしばしば脂肪性であ
り、かつ ｃ）ペプチドは、もちろん、正常の、ウイルス感染し
た、他の方法で感染した、又は遺伝子を用いて形質転換
したか、又は抗原を負荷した細胞のMHC−分子上に提示
される。
MHC−クラスＩ−分子H2Kd、H2Kb、H2Db及びHLA−A2か
らの自己ペプチド混合物の配列決定は、クラスＩ−分子
のそれぞれにより提示される、それぞれ異なる対立遺伝
子特異性ペプチドモチーフを示す。Kd、Db及びA2により
提示されたペプチドは、９量体である一方、Kb−提示ペ
プチドは８量体であり、その際、相当するペプチドモチ
ーフは、固有のアミノ酸残基又はよく類似した側鎖を有
する僅かな数のアミノ酸残基で占められている、２個の
アンカー位置を含有する。これらのアンカー位置は、異
なるモチーフの場合には、同じ位置に存在せず、これら
は、例えば位置５及び９（Db）又は位置２及び８（Kd、
A2）又は位置５及び８（Kb）に存在しうる。全てのモチ
ーフのＣ−末端アンカー基は、疎水性アミノ酸である。
アンカー位置に存在しないアミノ酸残基は、かなり可変
性であってよいが、いくつかは特に特定のアミノ酸で占
められ、例えば、Kd−モチーフの位置４にPro、Kb−モ
チーフの位置３にTyrが見られ、かつ疎水性基は、Db−
モチーフの位置３及びA2モチーフの位置６で優勢であ
る。Ｈ−2Ldのためには、アンカー基は、位置２のプロ
リンであった。
本発明方法により得られた結果は、MHC−クラスＩ−
分子で結晶学的に見られたスリットの構造に非常に良好
に相当する（文献;3、６）。異なるMHC−クラスＩ−対
立遺伝子は、このスリットのところの、異なるポケット
（Taschen）の存在により異なっている。このことは、
おそらく、ポケットが、それぞれ異なるアミノ酸を収容
しうることに起因する。従って、MHC−結晶中の対立遺
伝子特異性ポケットと対立遺伝子特異性アンカー基の側
鎖とは、おそらく相補的構造を示す。
本発明のもう１つの課題は、診断薬又は治療薬の製法
における、本発明によるペプチドモチーフの使用であ
る。このペプチドモチーフの可能な使用範囲は、MHC−
分子の診断学的証明である。MHC−分子は、ペプチドの
その個々の特異な結合により特徴付けられるので、標識
基のペプチドを介しての結合証明を行なうことができ、
その際、標識基として、例えばビオチン基又は蛍光基を
ペプチドと結合させる。当業者に公知の他の標識は、同
様に、本発明で使用することができる。この標識は、こ
れらに限定されるものではないが、例えばペプチドのチ
ロシン基に結合した131I又は125I、又は3H又は14C（双
方は、合成の間にペプチド中に取り込まれる）のような
放射性標識を包含する。標識のペプチドへの結合は、当
業者に公知の方法により達成することができる。標識
は、非−アンカー位置で行なうのが有利である。このよ
うな方法で分かった、自己免疫患者の発生と、疾病特異
性ペプチドモチーフを有するMHC−分子の表現との間の
相関関係を、診断学的に使用することができる。本発明
のペプチド配列の試験管内での診断学的使用の例は、こ
れらに限定されないが、次のものを包含する;MHC−分子
の結合特異性の測定、MHC−分子の結合特異性と疾病と
の相関関係付け、及び興味深いMHC−分子をペプチド−
バンク（試験したモチーフに合うペプチドの混合物）の
HPLC−フラクションで表現する、適当な細胞のインキュ
ベーションによる未知の起源のＴ−細胞エピトープの配
列の決定、及び天然のＴ−細胞エピトープとＴ−細胞エ
ピトープとして認識された合成ペプチドとのクロマトグ
ラフィー比較により行なわれる、Ｔ−細胞により認識さ
れたペプチドの決定（Nature 348:252〜254（199
0））。
本発明のもう１つの課題は、免疫系の障害又は腫瘍疾
病を治療するための医薬の製法における本発明によるペ
プチドモチーフの使用である。殊に、本発明のペプチド
モチーフは、自己免疫疾患における干渉（予防及び治
療）のために、例えば一定のMHC−分子の遮断並びにＴ
−細胞のペプチド特異的非−反応性の誘導により使用す
ることができる。更に、移植拒絶反応及び移植片対宿主
反応（Graft−versus−Host−Reaktionen）における干
渉が、同様の方法で可能である。更に、本発明によるペ
プチドは、腫瘍細胞に対するＴ−細胞の誘導又は強化も
しくは増強のために、殊に腫瘍疾病に対するワクチン化
及び存在する腫瘍疾病の治療のために、試験管内及び生
体内で使用することができ、その際、殊に、いわゆる移
植片対白血病作用（Graft−versus−Leukaemia−Effek
t）（Sullivan等,N.Engl.J.Med.320:828〜834）を利用
することができる。本発明によるペプチドは、同様に、
感染方法（infektioese Mittel）又は腫瘍に関して特異
的であるMHC−結合ペプチドを生体内で使用することに
より、感染性又は悪性疾病に対するＴ−細胞応答を強化
するために使用することができる。二者選択的に、Ｔ−
細胞は、動物から得ることができ、その数を、試験管内
で、ペプチドの使用及びサイトカイン、例えばインター
ロイキン２、インターロイキン４又はインターロイキン
６を包含する適当な成長条件の使用により増加させ、か
つ引き続き、患者に戻すことができる。本発明によるペ
プチドは、更に、Ｔ−細胞により攻撃可能な抗原を発現
する、次のものを包含するがこれらに限定されない全て
の腫瘍；黒色腫、乳癌、ウイルス起源の腫瘍、例えばバ
ーキットリンパ腫（Burkittslymphom）、及びヒト乳頭
腫ウイルスによるような腫瘍、例えば頸部ガン腫及び他
の生殖器（anogenitale）腫瘍を治療するために使用す
ることができる。Ｔ−細胞受容体−分子又は抗体分子に
起因するペプチドは、更に、免疫調節的機構の、目的と
する処置のために、殊に、自己免疫疾病及び移植拒絶反
応並びに移植片対宿主反応の治療のために使用すること
ができる。予防のための、本発明によるタンパク質の生
体内使用において、その使用は、これらに限定されるも
のではないが、次のものを包含する；感染性又は悪性疾
病に対するペプチドワクチンとして、及び組換え接種物
質（ウイルス、例えばワクシニア菌又はバクテリア、例
えばサルモネラ又はマイコバクテリアを含む）及び組換
えバクテリア（例えばE.コリ）又は他の細胞（酵母−、
昆虫−、マウス−又はヒト細胞を含む）の使用により製
造されたタンパク質を含む他の全ての種類の接種物質中
への本発明によるタンパク質の導入のための適当なＴ−
細胞エピトープに関する本発明で集められた情報の使
用。
本発明のペプチドの用量又は濃度は、当業者により常
法で決めることができる。これらは、生体内で、10μｇ
〜1gの範囲で予想することができる。試験管内濃度は、
１フェムトモル〜１マイクロモルの範囲で予想すること
ができる。生体内投与は、これらに限定されないが、皮
下、筋肉、静脈内、腸管内及び経口法を包含する。
治療的使用において、本発明によるペプチドモチーフ
に相当し、Ｎ−又は／及びＣ−末端が親油性もしくは両
親媒性基、殊に親油性ペプチド−ヘリックスと共有結合
するペプチドが有利である。このような基の例は、トリ
パルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニル−セリルセ
リンである。
本発明を、次の例により、図１と結び付けて、明らか
にする。
次のものを示す； 図1aは、P815ライゼート（Lyssat）からの抗−Kd−抗体
を用いて分離した物質のHPLC−特徴、 図1bは、1aからのクロマトグラムの１部拡大部分（フラ
クション15〜35）、 図1cは、1b中の矢印を付した部分の自己ペプチドの再ク
ロマトグラフィー。
例１ P815−腫瘍細胞（Ｈ−2Kd）10〜20×109をペレット化
し、かつ0.5％ノニデット（Nonidet）P40 250mlと共
に、フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）0.1
ミリモル/lを有するリン酸塩緩衝された塩溶液（PBS）
中で、30分間、４℃で撹拌した。上澄を、250gで５分間
及び150000g及び４℃で30分間で遠心分離し、次いで、
吸着クロマトグラフィー装置に導いた。この吸着クロマ
トグラフィー装置は、それぞれ約1mlの層容量を有する
カラム３個からなった。カラム物質は、製造元の記録に
よりブロムシアン−活性化されたセファロース4B（Phar
macia LKB）から製造された、抗体−結合したもしくは
グリシン−結合した小粒からなった。抗体としては、Kd
−特異性抗体20−８−4S（IgG 2a、kappa;25）又はDb−
特異性抗体B22−249それぞれ5mgを小球1mlに結合させ
た。細胞抽出物の上澄を、先ず、グリシン−結合した小
球を有するカラムに、次いで、抗−Kd−小球を有するカ
ラムに、かつ次いで、偽沈降（Scheinpraezipitation）
のために抗−Db−小球上に導いた。
小球を、全ての３個のカラムから除去し、かつ0.1％
トリフルオロ酢酸と共に15分間渦動させた（文献;7）。
上澄を真空遠心分離により乾燥させ、かつ逆相HPLCによ
り、スーパーパック（Superpac）PepSカラム（C2/C18;5
μｍ粒子、4.0×250mm、ファルマシア（Pharmacia）LK
B）及びファルマシアLKB−装置の使用下で分離した（文
献;4）。溶離剤：溶液Ａ H2O中の0.1％トリフルオロ酢
酸（v/v）、溶液Ｂ アセトニトリル中の0.1％トリフル
オロ酢酸。
図1a及びｂ中に示したクロマトグラフィー分離のため
に、次の勾配を使用した： ０〜５分、A100％ ５〜40分、B60％まで直線的に増大 40〜45分、B60％ 45〜50分、B0％まで減少 流速:1ml/分、フラクション量:1ml。
個々のフラクションを集め、かつ真空遠心分離により
乾燥させた。
図１は、免疫沈降され、かつトリフルオロ酢酸処理さ
れたKd−分子のHPLC−分離を示す。図1aは、抗−Kd（実
線）もしくは抗−Db（点線）を用いてP815−ライゼート
から沈降させた、TFA処理した物質のHPLC−特徴を示
す。フラクション20〜28の間で、目標対立遺伝子特異性
ペプチド混合物である不均一物質が、僅かな量溶離す
る。
フラクション20〜28は、Kd−バッチ（Ansatz）から
も、偽沈降によっても集められた。双方のバッチを、エ
ドマン分解法の使用下で自動的に配列決定した（Edmann
等、Eur.J.Biochem.1:80〜91（1967））。このエドマン
分解を、オンラインPTH−アミノ酸分析機120A（Applied
Biosystems,Foster City,CA,94404,USA）を備えたタン
パク質シークエンサー477A中で実施した。ガラス繊維フ
ィルターを、バイオプレーン・プラス（BioPrene Plu
s）1mgで被覆し、かつ前循環（praezyklisiert）させな
かった。この配列決定を、標準プログラム BEGIN−１
及びNORMAL−１（Applied Biosystems）の使用下に実施
した。システインは修飾されず、かつ従って確認されな
かった。
エドマン法は、それぞれクロマトグラフィーにより同
定されるＮ−末端の逐次誘導体化及びアミノ酸除去を包
含する。ペプチドの錯体混合物を配列決定することは異
例であるので、配列決定装置から直接得られたデータを
提示する。第1a表及びｂは、Kd−溶離したペプチドに関
する、２種の配列決定試験からの結果を示す。第1c表
は、P815−ライゼートのDb−特異性抗体での偽溶離の配
列決定結果を示す。Kd−溶離したペプチドは、１〜９の
各位置に明らかなアミノ酸形を１個有し、偽溶離した物
質は、それぞれの基の吸収量を減少しながら、それぞれ
のサイクルにおいて、例外なく、同じ形のアミノ酸形を
示している。Kd−溶離したペプチドにおいては、前又は
前の前のサイクルと比較して50％より多いピークが絶対
量で示され、重要とみなされ、かつ下線を引いた。最初
の位置は、評価することが困難である。それというの
も、前のサイクルが存在せず、かつ更に、HPLC−プール
（Pool）中に存在する、全ての遊離アミノ酸がこの位置
で確認されるからである。第２の位置に関して、以前の
サイクルと比較してその頻度が明らかに高い固有の基
は、チロシン（例えば第1a表で60.9pmolから875.6pmol
に）である。（僅かな）ピークを示す他の固有の基は、
Tyrに類似した側鎖を有するフェニルアラニンである。
このことは、天然のKd−拘束インフルエンザ−エピトー
プ（TYQRTRALVの配列を有する）と他のKd−拘束ペプチ
ドとの比較から、位置２のチロシン基を考慮した場合に
得られる仮定を裏付けする。これに反して、続く位置３
〜８に関して特徴的である、定義されたアミノ酸基は存
在しない。個々の位置において、14個までの種々異なる
基が見つけられる。位置９には、Ile及びLeuが見つけら
れる。位置10にシグナルピークはなく、このことは、多
くのKd−結合した自己ペプチドが９個より長い基でない
ことを示唆している。従って、天然のKd−拘束インフル
エンザ−ペプチドは、ノナペプチド（Nonapeptid）（文
献;4）である。この結果から、由来する共通配列形を、
第1c表中に示す。大抵、目に付くのは、位置２のTyr、
及び位置９のIle又はLeuであり、他の全ての位置には、
より多数の基が見られる。このモチーフと、Kd−拘束エ
ピトープを含有するペプチド配列との比較は、そのほと
んどがKd−拘束共通モノマーモチーフに良好に合致する
ことを示す（第1d表）。
図1bのフラクション29中で矢印を付したピーク及び偽
沈降の相当するフラクションを、高い溶解性下に新たに
クロマトグラフィーにかけたが、その際、フラクション
容量は0.5mlであった（図1c）。急な特異的なピーク
は、直接配列決定により決定されたアミノ酸配列SYFPEI
THIを有するペプチドであった。合成SYFPEITHI−ペプチ
ドとの天然細胞ペプチドの同一性は、共溶離（Coelutio
n）によりHPLCで証明された（図1c）。この配列は、フ
ラクション20〜28のプールからの共通モチーフに合致し
（図1a、ｂ）、このことにより、特異なKd−拘束ペプチ
ドモチーフ（第1d表）の存在が証明される。
＊Kd−拘束Ｔ−細胞エピトープを含有することで知られ
ているペプチドを、そのTyr−基により合致させた。自
然にプロセシングされることが知られているペプチドに
は下線を引いた。
例２ Kb−及びDb−分子からのペプチドの溶離 EL4−腫瘍細胞（Ｈ−2b）からのデタージェント−ラ
イゼート（Detergenz−Lysate）を、例えば例１で記載
したようなKb−特異性及びDb−特異性抗体を用いて免疫
沈降させた。Db−抗体としてはB22−249（例１参照）
を、及びKb−抗体としてはK9−178（IgG 2a、Ｋ、27）
を使用した。MHC−分子から解離したペプチドを、逆相H
PLCにより分離した。Kb−もDb−物質も、例１からのKd
−物質にいくらか相当する特徴を有して溶離され、その
際、しかしながら、フラクション20〜28の間で溶離され
た不均一物質は明らかな相違を生じた。
Db−拘束ペプチドモチーフ Db−バッチからの集めたフラクション20〜28を配列決
定した（第2a、ｂ表）。位置２〜４は、多くの基を含有
した。これに反して、サイクル５は、Asnに関する強い
シグナルを示した。従って、Db−溶離された自己ペプチ
ドの位置５の優勢基は、Asnである。Aspに関する弱いシ
グナルは、配列決定条件下でAsnがAspへ加水分解するこ
とに起因する。位置６〜８は、異なる証明可能な基５〜
14個を含有した。位置９は、Metに関する強いシグナル
を有し、Ileに関する中間のシグナル及びLeuに関する弱
いシグナルを有した（全て疎水性）。（Db−拘束エピト
ープ中のMet又はIleの条件は、既に記載されている。17
参照）。位置10にはシグナルがなく、このことは、Db−
提示された自己ペプチドがノナペプチドであることを示
唆している。この結果により決定された共通モチーフを
第2c表中に示す。このモチーフと、天然のDb−拘束ペプ
チド及びDb−拘束エピトープを含有する他のペプチドと
の比較は、位置５のAsnが、Db−拘束ペプチドモチーフ
の不変のアンカー基でありうることを示す。Db−拘束エ
ピトープの他の基は、第２のアンカー位置のように見え
る（Met、Ile又はLeuを有する）位置９以外、著しく異
なっている。
Kb−拘束ペプチドモチーフ Kb−バッチからの集めたフラクション20〜28を配列決
定した（第3a、ｂ表）。位置３は、Tyrに関する強いシ
グナル及びProに関する弱いシグナルを有する。位置４
は、５個の基に関する弱いシグナルを示した。Phe及びT
yrに関する強いシグナルが、これらの双方の基を位置５
で優勢にする。次の双方の位置は、５個もしくは３個の
シグナルを含有する。位置８はLueに関する強いシグナ
ル、Metに関する中間のシグナル及びIle及びValに関す
る弱いシグナルを示した。位置９は、何かの基に関する
ピークは示さず、このことは、８量体である（文献;5）
公知のKb−拘束天然のペプチドの長さと合致する。Kb−
拘束共通モチーフの分析及びエピトープとの比較は、２
個のアンカー位置を示す：位置５のTyr又はPhe（双方と
も類似の芳香族側鎖を有する）及び位置８のLeu、Met、
Ile又はVal（全て同様の疎水性側鎖を有する）。
例３ HLA−A2.1−拘束ペプチドモチーフ HLA−A2.1−MHC−分子（文献;45）を有するヒトJY−
細胞のデタージェント−ライゼートを、A2−特異性抗体
（BB7.2、IgG2b、文献箇所28）を用いて免疫沈降させ
た。A2−分子から解離されたペプチドを、HPLCにより分
離した。フラクション20〜28を集め、かつ前記のように
配列決定した（第４表）。第２の位置は、Leuに関する
強いシグナル及びMetに関する中間のシグナルを有し
た。位置３〜５には、それぞれ６〜８個の基が見られ
た。位置６は、Val、Leu、Ile及びThrを有した。引き続
く２個の位置は、それぞれ３個のシグナルを示した。位
置９は、強いVal−及び弱いLeu−シグナルを示した。位
置10は、１個の基のピークも示さず、このことは、A2−
拘束エピトープがノナペプチドであることを示唆してい
る。位置２のLeu又はMet及び位置９のVal又はLeuは、ア
ンカー基であるように見える。A2−拘束エピトープを有
する公知のペプチドのいくつかが、モチーフと合致しう
る一方、これは、他のものにおいては部分的に可能であ
るに過ぎない（第4c表）。A2−分子の多くの変法の現存
は、いくつかのペプチドとモチーフとのこの劣悪な合致
の原因である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 レチュケ，オーラフ ドイツ連邦共和国 Ｄ−7400 チュービ ンゲン フンツカプフクリンゲ 42 (72)発明者 ステファノヴィッチ，シュテファン ドイツ連邦共和国 Ｄ−7400 チュービ ンゲン シュールシュトラーセ 18 (72)発明者 ユング，ギュンター ドイツ連邦共和国 Ｄ−7400 チュービ ンゲン オプ デア グラーフェンハル デ ５ (56)参考文献 Ｃｅｌｌ，44（1986）ｐ．959−968 Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，166（1987) ｐ．678−692 Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，171（1990) ｐ．763−773 Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，169（1989) ｐ．603−612 Ｃｅｌｌ，62（1990）ｐ．563−567 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ 86（1989）ｐ．9514−9518 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N C07K A61K ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】クラスＩ又はIIの主要組織適合性遺伝子複
    合体（MHC）の分子の対立遺伝子特異性ペプチドモチー
    フを決定する方法において、 （ａ）MHC−分子を含有する細胞の細胞溶解により細胞
    抽出物を得、 （ｂ）MHC−分子を、その上に存在するペプチド混合物
    と共に、免疫沈降により細胞抽出物から分離し、 （ｃ）MHC−分子及び他のタンパク質成分からのペプチ
    ド混合物を分離し、 （ｄ）個々のペプチド又は／及びその混合物を配列決定
    し、かつ （ｅ）得られた、殊に混合物の配列決定、又は一連の固
    有ペプチドの配列決定の情報から、対立遺伝子特異性ペ
    プチドモチーフを引き出すことを特徴とする、クラスＩ
    又はIIの主要組織適合性遺伝子複合体（MHC）の分子の
    対立遺伝子特異性ペプチドモチーフを決定する方法。
  2. 【請求項２】クラスＩのMHC−分子上のペプチドモチー
    フを決定する、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】Ｈ−2Kd−、Ｈ−Kb−、Ｈ−2Db−、Ｈ−2K
    k、Ｈ−2Km′又はHLA＊0201又はHLA−Ａ＊0205−分子の
    ペプチドモチーフを決定する、請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】免疫沈降のために、MHC−分子に対して特
    異的である抗体を使用する、請求項１から３のいずれか
    １項記載の方法。
  5. 【請求項５】固相結合した抗体を使用する、請求項４記
    載の方法。
  6. 【請求項６】MHC−分子及び他のタンパク質成分からの
    ペプチド混合物の分離をクロマトグラフィーにより行
    う、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
  7. 【請求項７】分離を逆相−HPLCで行う、請求項６記載の
    方法。
  8. 【請求項８】分離を、トリフルオロ酢酸/H2O−トリフル
    オロ酢酸／アセトニトリル−勾配で行う、請求項７記載
    の方法。
JP50920192A 1991-05-17 1992-05-15 Ｍｈｃ−分子のペプチドモチーフの決定 Expired - Fee Related JP3424752B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4116256.0 1991-05-17
DE19914116256 DE4116256C2 (de) 1991-05-17 1991-05-17 Bestimmung von Peptidmotiven auf MHC-Molekülen
PCT/EP1992/001072 WO1992021033A1 (de) 1991-05-17 1992-05-15 Bestimmung von peptidmotiven auf mhc-molekülen

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2002357021A Division JP2003176300A (ja) 1991-05-17 2002-12-09 Ｍｈｃ−分子のペプチドモチーフ

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH06510850A JPH06510850A (ja) 1994-12-01
JP3424752B2 true JP3424752B2 (ja) 2003-07-07

Family

ID=6431930

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP50920192A Expired - Fee Related JP3424752B2 (ja) 1991-05-17 1992-05-15 Ｍｈｃ−分子のペプチドモチーフの決定
JP2002357021A Ceased JP2003176300A (ja) 1991-05-17 2002-12-09 Ｍｈｃ−分子のペプチドモチーフ

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2002357021A Ceased JP2003176300A (ja) 1991-05-17 2002-12-09 Ｍｈｃ−分子のペプチドモチーフ

Country Status (10)

Country Link
US (1) US5747269A (ja)
EP (1) EP0584136B1 (ja)
JP (2) JP3424752B2 (ja)
AT (1) ATE189527T1 (ja)
AU (1) AU1694392A (ja)
CA (2) CA2103148C (ja)
DE (2) DE4143467C2 (ja)
DK (1) DK0584136T3 (ja)
ES (1) ES2145007T3 (ja)
WO (1) WO1992021033A1 (ja)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7252829B1 (en) 1998-06-17 2007-08-07 Idm Pharma, Inc. HLA binding peptides and their uses
US7611713B2 (en) 1993-03-05 2009-11-03 Pharmexa Inc. Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide compositions
US9340577B2 (en) 1992-08-07 2016-05-17 Epimmune Inc. HLA binding motifs and peptides and their uses
CA2141960A1 (en) * 1992-08-07 1994-02-17 Ralph T. Kubo Hla binding peptides and their uses
DE4238416A1 (de) * 1992-11-13 1994-05-19 Max Planck Gesellschaft Bestimmung von Peptidmotiven auf MHC-Molekülen
DE4423392A1 (de) * 1994-07-04 1996-01-11 Birsner & Grob Biotech Gmbh Verfahren zur Identifizierung antigener Peptide
US6413517B1 (en) 1997-01-23 2002-07-02 Epimmune, Inc. Identification of broadly reactive DR restricted epitopes
US6994851B1 (en) 1997-07-10 2006-02-07 Mannkind Corporation Method of inducing a CTL response
US6977074B2 (en) * 1997-07-10 2005-12-20 Mannkind Corporation Method of inducing a CTL response
US20030138808A1 (en) * 1998-02-19 2003-07-24 Simard John J.L. Expression vectors encoding epitopes of target-associated antigens
US6379970B1 (en) * 1999-04-30 2002-04-30 The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Analysis of differential protein expression
DE19925235A1 (de) 1999-06-01 2000-12-07 Medigene Ag Zytotoxische T-Zellepitope des Papillomavirus L1-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie
DE19925199A1 (de) * 1999-06-01 2000-12-07 Medigene Ag Zytotoxische T-Zellepitope des Papillomavirus L1-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie
AU6226100A (en) * 1999-07-19 2001-04-24 Epimmune, Inc. Inducing cellular immune responses to hepatitis c virus using peptide and nucleic acid compositions
DK1230268T3 (da) 1999-11-18 2010-02-08 Epimmune Inc Heteroklitiske analoger af klasse I-epitoper
US7026443B1 (en) 1999-12-10 2006-04-11 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to human Papillomavirus using peptide and nucleic acid compositions
US7462354B2 (en) 1999-12-28 2008-12-09 Pharmexa Inc. Method and system for optimizing minigenes and peptides encoded thereby
US7297330B2 (en) * 2000-02-04 2007-11-20 Thomas Jefferson University Low dose haptenized tumor cell and tumor cell extract immunotherapy
US20030215425A1 (en) * 2001-12-07 2003-11-20 Simard John J. L. Epitope synchronization in antigen presenting cells
DE60142615D1 (de) * 2000-04-28 2010-09-02 Mannkind Corp Epitop-synchronisierung in antigen präsentierenden zellen
US6861234B1 (en) 2000-04-28 2005-03-01 Mannkind Corporation Method of epitope discovery
US7919467B2 (en) * 2000-12-04 2011-04-05 Immunotope, Inc. Cytotoxic T-lymphocyte-inducing immunogens for prevention, treatment, and diagnosis of cancer
CN1313617C (zh) * 2001-11-07 2007-05-02 曼康公司 编码靶相关抗原表位的表达载体及其设计方法
US20050221350A1 (en) * 2002-05-29 2005-10-06 Toni Weinschenk Method for identifying immunoreactive peptides
US9090673B2 (en) 2003-12-12 2015-07-28 City Of Hope Synthetic conjugate of CpG DNA and T-help/CTL peptide
EP2351576A1 (en) * 2004-12-29 2011-08-03 Mannkind Corporation Methods to trigger, maintain and manipulate immune responses by targeted administration of biological response modifiers into lymphoid organs
WO2006124408A2 (en) * 2005-05-12 2006-11-23 Merck & Co., Inc. System and method for automated selection of t-cell epitopes
US7964200B2 (en) 2005-05-18 2011-06-21 Children's Hospital & Research Center At Oakland Methods and compositions for immunizing against Chlamydia infection
US20070248628A1 (en) * 2005-12-06 2007-10-25 Keller Lorraine H Immunogens in cancer stem cells
US20080107668A1 (en) * 2006-08-30 2008-05-08 Immunotope, Inc. Cytotoxic t-lymphocyte-inducing immunogens for prevention, treatment, and diagnosis of cancer
ES2527412T3 (es) 2007-02-15 2015-01-23 Mannkind Corporation Método para aumentar la respuesta de los linfocitos T
WO2008148068A1 (en) * 2007-05-23 2008-12-04 Mannkind Corporation Multicistronic vectors and methods for their design
JP5792630B2 (ja) 2009-01-28 2015-10-14 エピミューン，インコーポレイティド Ｐａｎ−ｄｒ結合ポリペプチドおよびその使用
AU2010310468A1 (en) 2009-10-23 2012-05-24 Mannkind Corporation Cancer immunotherapy and method of treatment
IL293135A (en) 2015-05-13 2022-07-01 Agenus Inc A preparation containing at least two different complexes of purified stress protein linked to an antigenic peptide

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0365525B1 (en) * 1987-01-30 1995-08-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Lymphocyte inhibition by hla peptides
IL92629A0 (en) * 1989-12-10 1990-08-31 Yeda Res & Dev Direct binding of t-cell epitopes to mhc gene products on intact living antigen presenting cells and the use thereof for identifying epitopes causing autoimmune diseases and pharmaceutical compositions for treating such diseases

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｃｅｌｌ，４４（１９８６）ｐ．９５９−９６８
Ｃｅｌｌ，６２（１９９０）ｐ．５６３−５６７
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６６（１９８７）ｐ．６７８−６９２
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６９（１９８９）ｐ．６０３−６１２
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７１（１９９０）ｐ．７６３−７７３
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６（１９８９）ｐ．９５１４−９５１８

Also Published As

Publication number Publication date
WO1992021033A1 (de) 1992-11-26
DE4143467C2 (de) 1995-02-09
CA2103148A1 (en) 1992-11-18
ATE189527T1 (de) 2000-02-15
US5747269A (en) 1998-05-05
CA2471093A1 (en) 1992-11-26
JP2003176300A (ja) 2003-06-24
CA2103148C (en) 2004-07-20
DK0584136T3 (da) 2000-05-22
DE59209810D1 (de) 2000-03-09
JPH06510850A (ja) 1994-12-01
EP0584136A1 (de) 1994-03-02
ES2145007T3 (es) 2000-07-01
AU1694392A (en) 1992-12-30
EP0584136B1 (de) 2000-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3424752B2 (ja) Ｍｈｃ−分子のペプチドモチーフの決定
AU2020250313B2 (en) Immunogenic WT-1 peptides and methods of use thereof
KR100194117B1 (ko) Mhc 분자상의 펩티드 모티프 측정방법
US11859015B2 (en) Immunogenic WT-1 peptides and methods of use thereof
CA2881594C (en) Cancer vaccine composition
JPH10503473A (ja) 細胞傷害性ｔリンパ球刺激およびｈｃｖ曝露診断用ｃ型肝炎ウイルスコアペプチド
Johansen et al. Both α and β chain polymorphisms determine the specificity of the disease-associated HLA-DQ2 molecules, with β chain residues being most influential
Rougon et al. Induction with a synthetic peptide of antibodies to HLA class I C-terminal intracytoplasmic region
Fehlner et al. Murine T cell responses to melittin and its analogs.
JPH10506877A (ja) ライグラス花粉アレルゲンのｔ細胞エピトープ
JP2001511143A (ja) コラーゲン▲ｉｉ▼に特異的なｔ細胞エピトープを含むペプチド
KR100190910B1 (ko) C형 간염 바이러스에 대한 인체 면역조절기능을 가진펩타이드
Johansen et al. Both αα and ββ chain polymorphisms determine the specificity of the disease-associated HLA-DQ2 molecules, with ββ chain residues being most influential
Sollid et al. The Molecular Basis of the HLA Association in Celiac Disease: A Model Disease for Type 1 Diabetes and other HLA Associated Diseases

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Cancellation because of no payment of annual fees