KR100194117B1

KR100194117B1 - Mhc 분자상의 펩티드 모티프 측정방법

Info

Publication number: KR100194117B1
Application number: KR1019950701922A
Authority: KR
Inventors: 올라프 뢰쯔쉬케; 키르스텐 팔크; 스테판 스테파노빅; 귄터 융; 한스-게오르그 람멘제
Original assignee: 하인리히 쿤; 막스-플랑크-게젤샤프트 쭈어 푀르데룽 데어 비쎈샤프텐 에.파우.
Priority date: 1992-11-13
Filing date: 1993-11-12
Publication date: 1999-06-15
Also published as: CA2147863A1; EP0669001B1; WO1994011738A1; AU673212B2; DE4238416A1; GR3025655T3; EP0669001A1; JPH07509319A; KR950704688A; ES2109658T3; DE59307354D1; CA2147863C; AU5465694A; DK0669001T3; ATE158082T1

Abstract

본 발명은 I 군 및 II 군의 주요 신체적합성 착물 ( MHC ) 분자상에서 대립유전자 - 특이펩티드 모티프를 측정하는 방법 및 이 방법에 의해 얻어진 펩티드 모티프에 관한다. 또한 본 발명은 진단 또는 치료제 제조용으로 사용되는 상기 펩티드 모티프의 용도에 관한다.

Description

MHC 분자상의 펩티드 모티프 측정방법

본 발명은 주요 조직적합복합체 (MHC) 분자상의 펩티드 모티프 또는 에피토프를 측정하는 방법, 이 방법으로 측정한 펩티드 모티프 및 이의 진단 또는 치료제 제조용으로서의 용도에 관한다.

세포독성 T 림프구 (CTL) 는 MHC - 암호화한 분자들과 결합하여 항원 펩티드 에피토프를 인지한다. 이러한 현상은 MHC 제한 (1-5) 이라 일컫는다. 결정학적 분석결과 인간 MHC I 군 분자들 (HLA - 2 및 Aw 68) 은 무거운 사슬 (3, 6)의 α1 및 α2 영역으로 형성된 그루브 (groove) 임이 밝혀졌다. 상기 HLA - 2 및 Aw 68 두 결정들이 상기 그루브 (6) 에 위치하고 MHC 서열과 비사용적인 펩티드 크기의 구조를 갖기 때문에 이러한 그루브는 항원 펩티드 에피토프에 대한 결합부위인 것으로 추정된다.

이러한 펩티드는 세포내 단백질로부터 유도되고 세포독성 T 림프구가 비정상적인 특성에 대해 세포를 조사할 수 있도록 세포 표면에 존재하는 것으로 사료된다. T 세포 에피토프로 나타내어지는 MHC - 결합된 펩티드는 이미 정상 또는 바이러스 감염된 (2, 4, 5, 7, 8)에서 추출되었다. MHC II군 - 제한된 Y 세포에 의해 인지된 항원은 또한 인공 펩티드(9) 에 의해 당해 방식으로 모방되어 질 수 있고 MHC - 결합된 항원 펩티드는 MHC II군 분자 (10) 들에 의해 용리되었다. T 세포수용체, 펩티드 및 MHC 분자(11) 로 이루어지는 3 분자 착물의 중앙에 위치하기 때문에, T 세포 에피토프는 특히 면역시스템의 중점이 되므로 이들의 발생을 지배하는 규칙 및 측정방법 (12 -15)을 이해할 필요가 크다.

본 발명의 목표는 (a) HMC 분자를 함유하는 세포를 용균시켜 세포추출물을 얻는 단계, (b) MHC 분자와 그 위에 위치한 펩티드 혼합물을 면역침강시켜 상기 세포추출물로부터 분리시키는 단계, (c) MHC 분자 및 다른 단백질 성분들로부터 펩티드 혼합물을 분리시키는 단계, (d) 개별적 펩티드 또는/ 및 이의 혼합물을 배열시키는 단계, (e) 얻어진 정보로부터, 특히 혼합물의 배열들로부터 또는 다수의 개별적 펩티드의 배열로부터 대립유전자 - 특히 펩티드 모티프를 유도하는 단계로 구성되고, 펩티드 모티프가

로 이루어지는 그룹에서 선택된 분자상에서 측정되는 것을 특징으로하는, I 군 또는 II 군의 주요 조직적합복합체 (MHC) 분자상의 대립유전자 - 특히 펩티드 모티프를 측정하는 방법에 의해 달성되어진다.

펩티드 모티프는 MHC 분자들이 펩티드를 선별하고 제공하는 규칙들로 구성되는 본 발명 방법에 의해 측정된다.

본 발명 방법은 I 군의 MHC 분자 및 II 군의 MHC 분자로 수행가능하나 I 군의 MHC 분자가 바람직하다. 펩티드 모티프인 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 는 I 군의 MHC 분자에 대한 리간드이다. 펩티드 모티프 HLA-DR, HLA-DQ, 및 HLA-DP 는 II 군의 MHC 분자에 대한 리간드이다.

본 발명방법으로 MHC 분자를 면역침강시키는 경우, 각각의 경우에 바람직한 MHC 분자에 대하여 특이성을 지닌 항체를 사용하는 것이 유리하다. H-2K^d또는 H-2D^b분자 측정용으로 예를 들면 K^d- 특이항체 (25) 또는 D^b- 특이항체 (26) 가 사용된다. 바람직하게는 모노클론 항체 (26)를 사용하지만, 적당히 정제시킨 폴리클론 면역혈청 또한 사용할 수 있다. 본 발명에 따라 사용가능한 항체들은 당업자들에 널리 공지된 표준 기술들로 새로 제조할 수 있다. 본 발명에 사용가능한 항체들의 보기들은 HLA 항원에 대한 모든 항체들을 포함하며, ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklaum Drive, Rockville, MD 20852) 의 Catalogue of cell Lines and Hybridomas 에 언급되어 있으나 여기에 한하지는 않는다. 바람직한 보기로는 ( ATCC 의 명명법으로 ) HB82, 117, 166, 54, 122, 164, 95, 120, 116, 118, 94, 152, 178, 56, 115, 157, 119, 59, 105, 165, 144, 180, 103, 110, 109, 151 및 104 가 있다. 상기 카탈로그에 언급된 마우스 H-2 항원에 대한 모든 항체들 또한 본 발명에 사용가능하다. 면역침강은 고체상 - 결합된 항체들로 수행하는 경우에 특히 바람직하다. 고체상 - 결합된 항체는 예를들면 항체를 시아노겐 브로마이드 - 활성화된 세파로스 4B (Sepharose 4B ) ( Pharmacia LKB ) 에 커플링시키는 것과 같은 당업자들에 널리 공지된 방식으로 제조할 수 있다. 본 발명용으로 사용하기 위해서 항체가 결합할 수 있는 고체상들의 보기로는 아가로스, 셀룰로스, 세파덱스 ( Sephadex ), 프로테인 - A - 세파로스 및 프로테인 - G - 세파로스가 있으나 이에 한정되지는 않는다. 면역침강의 바람직한 방법은 시아노겐 브로마이드 - 활성화된 세파로스 4B 로 제조한 비드에 커플링되는 항체들에 의한 흡착 크로마토그래피이다. (실시예 1을 참조하시오)

측정하기 위하여 MHC 분자들과 다른 단백질 성분들로부터 펩티드 혼합물을 분리시키는 것은 크로마토그래피방법으로, 바람직하게는 역상 HPLC에 의해 수행하는 것이 유리하다. 이와 관련하여, 트리플루오로아세트 산/H₂O - 틀리플루오로아세트산/아세토니트릴 그레이디언트내에서 분리시키는 것이 유리함이 입증되었다. 본 발명에 따라 MHC 분자들에서 펩티드 혼합물을 분리시키는데 이용할 수 있는 다른 방법들로는 이온 교환법, 겔 여과법, 등전점전기이동법, 고성능 모세관 전기이동법 ( HPCE ) 및 겔 전기이동법이 있으나 이에 한정되지는 않다. 분리를 수행하는 다른 방법은 투과성 3000 또는 5000 또는 10000 Da의 맴브레인이 사용되는 한외여과법이다.

펩티드 혼합물의 크로마토그래피 분리시 몇몇 경우에 단일 펩티드 종을 분리시킬 수 있다. 결과적으로, 본 발명 방법의 단계 (d) 는 교감배열이 각각의 MHC 분자상에 위치한 펩티드 모티프에 대하여 측정가능하도록 펩티드 혼합물을 배열하거나 또는/ 및 한정된 펩티드를 배열시키는 것으로 구성된다.

인간 또는 동물의 체외 배양된 세포 및 바이러스 또는 기타 병원균에 감염된 세포뿐 아니라 종양세포, 정상세포도 펩티드 모티프 측정용의 출발물질로 사용할 수 있다. 본 발명에 사용가능한 정상 세포는 예를들면 말초 림프구, 비장, 허파, 흉선세포 또는 MHC 분자들을 나타내는 기타 다른 조직들의 세포와 같은 신선한 세포를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에 사용된 세포계통은 종양세포 EL4 및 P815 이나 또한 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 사용가능한 바이러스에 감염된 세포는 Epstein -Barr 바이러스에 의해 변환된 인간 B 세포인 JY 세포를 포함하나 이에 한하지는 않는다. 본 발명 방법으로 측정된 펩티드 모티프는 a) MHC I 군 분자들내 8, 9, 10 또는 11 아미노산 및 MHC II 군 분자들내 8-15 아미노산 길이의 대립유전자 - 특이 펩티드를 갖고 b) 두 개의 앵커 위치 ( 앵커위치 란 어떤 위치가 단일 아미노산 잔기에 대하여 강한 시그널을 나타낼 때 매우 밀접하게 관련된 측쇄와 함께 몇 개의 아미노산 잔기가 어떤 위치를 차지할 때 사용하는 용어임)를 갖는데 이중 하나의 앵커 위치는 항상 C - 종결 말단에 위치하고 종종 지방족이며 c) 펩티드는 당연히 정상, 바이러스 감염되거나 그렇지 않으면 감염된 세포들 또는 유전자로 트랜스펙션되거나 항원으로 피복된 세포들의 MHC 분자들상에 존재한다는 기본규칙을 따른다.

MHC I 군 분자들 H2K^d, H2K^b, H2D^b및 HLA-A2 로부터 얻은 자체 - 펩티드 혼합물을 배열시키면 I 군 분자들 각각에 의해 제공되는 각각의 경우의 상위한 대립유전자 - 특이 펩티드 모티프를 보여준다. K^d, D^b및 A2 로 나타낸 펩티드는 9 량체인 반면 K^b- 표시된 펩티드는 8 량체이고 당해 펩티드 모티프는 단일 아미노산 잔기에 의해 또는 밀접하게 관련된 측쇄와 함께 다소의 아미노산 잔기에 의해 차지되는 두 개의 앵커 위치를 갖는다. 이러한 앵커위치는 다양한 모티프에서 동일한 부위에 위치하는 것은 아니고, 예를들면 5 및 9 (D^b) 또는 2 및 8 ( K^d, A2 ) 또는 5 및 8 ( K^b) 위치에 존재할 수 있다. 모든 모티프의 C - 종결 앵커 잔기는 소수성 아미노산이다. 앵커 위치에 위치하지 않는 아미노산 잔기는 아주 가변적이나, 몇몇은 주로 특정 아미노산에 의해 차지되며 예를들면 Pro 는 종종 K^d모티프의 4 위치에서 발견되고, Tyr 는 K^b모티프의 3위치에서 발견되며 소수성 잔기들은 D^b모티프의 3 위치 및 A2 모티프의 6 위치에 많이 존재한다. 프롤린 앵커 잔기는 H - 2L^d의 2 위치에서 발견되었다.

본 발명 방법에 의해 얻어진 결과들은 결정학 (3, 6) 에 의해 발견된 MHC I 군 분자들내 그루브의 구조와 매우 일치한다. 추측컨대 포켓이 각각의 경우의 상위한 아미노산을 축적시킬 수 있다는 사실에 기인한 것으로 상위한 포켓이 존재함으로써 상기 그루브에서의 상위한 MHC I 군 대립유전자는 상위하다. 따라서 MHC 결정내 대립유전자 - 특이 포켓과 대립유전자 - 특이 앵커 잔기의 측쇄는 아마도 상보적 구조를 나타낼 것이다.

부가적으로 본 발명은 진단 또는 치료제 제조용 공정에 본 발명에 따른 펩티드 모티프를 사용하는 것에 관한다. 펩티드 모티프를 적용가능한 분야는 HMC 분자의 진단 검출이다. MHC 분자들은 펩티드의 개별적 특이 결합에 의해 특징지워지므로, 결합 테스트는 예를들면 비오틴 또는 형광 그룹이 표지그룹으로서 펩티드에 커플링되는 표지그룹을 가진 펩티드에 의해 수행될 수 있다. 당업자들에 공지된 다른 라벨들 또한 본 발명에 사용할 수 있다. 이러한 라벨들은 예를들면 펩티드의 티로신 잔기에 결합된¹²⁵I, 또는¹³¹I, 또는³H 또는¹⁴C ( 이 둘은 합성시 펩티드에 합체됨) 가 있으나 이에 한정되지는 않는다. 펩티드에 라벨들을 결합시키는 것은 당업자들에 널리 공지된 방법들에 의해 수행할 수 있다. 라벨링은 바람직하게는 비앵커위치에서 수행된다. 자가면역병과, 상기 방식에서 발견되는 질병 - 특이 펩티드 모티프를 지닌 MHC 분자들의 발현 사이의 상호 의존관계는 진단학적으로 활용할 수 있다. 본 발명에 따른 펩티드 배열의 체외 진단용도의 보기는 MHC 분자들의 결합 특이성, 질병에 대한 MHC 분자들의 결합 특이성의 상호관계 측정 및 펩티드 라이브러리 (조사될 모티프에 고정된 펩티드들의 혼합물) 의 HPLC 분획을 지닌 중요한 MHC 분자들을 나타내는 적당한 세포들을 인큐베이트시키고 T 세포에 의해 인지된 펩티드를 측정한 다음, 천연 T 세포 에피토프와 T 세포 에피토피로서 인지된 합성 펩티드의 크로마토그래피를 비교하는 미지 기원의 T 세포 에피토피로서 인지된 합성 펩티드의 크로마토그래피를 비교하는 미지 기원의 T 세포 에피토프의 배열의 측정 (Nature 348 : 252 - 254 (1990) )을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명은 부가적으로 면역 시스템의 장애 또는 종양 질병의 치료용 치료제를 제조하는 공정에 본 발명에 따른 펩티드 모티프를 사용하는 것에 관한다. 특히 본 발명에 따른 펩티드 모티프는 예를들면 펩티드 - 특이 비활성의 T 세포를 유도시키고 혹종의 MHC 분자들을 차단시킴으로써 자가 면역병내에서의 간섭 (예방조치 및 치료)용으로 사용할 수 있다. 부가적으로 이식거부 및 이식조직 - 대 - 숙주의 반응내에서의 간섭 또한 유사방식으로 가능하다. 부가적으로 본 발명에 따른 펩티드는 종양세포에 대한 T 세포의 유도 또는 증폭 또는 증식용으로 특히 종양 질병에 대한 예방 접종용, 및 특히 소위 이식조직 - 대 - 백혈병 효과 (Sullivan 등, N. Engl. J. Med. 320 : 828 - 834 ) 가 활용될 수 있는 현존하는 종양 질병의 치료용으로 체내 및 체외 할 수 있다. 본 발명에 따른 펩티드는 또한 전염 병원체 또는 종양에 대해 특이성을 지닌 체내 MHC 결합하는 펩티드를 사용하여 전염병 또는 악성 질병에 대한 T 세포 반응을 증폭시키는데 사용할 수 있다. 이와는 다르게 T 세포는 환자로부터 얻어서 예를들면 인터류킨 2, 인터류킨 4 또는 인터류킨 6 와 같은 싸이토킨을 포함한 펩티드 및 적당한 생장조건을 사용하여 체외에서 T 세포수를 증대시킨다음 다시 환자들에게 투여시킬 수 있다. 부가적으로 본 발명에 따른 펩티드는 흑색종, 유방암, 예를들면 버킷트 림프 종과같은 바이러스 기원의 종양들과 자궁경부암과 같은 인간 유두종 바이러스에 의해 유발되는 종양들과 기타 상생식기 종양을 포함하나 이에 한정되지는 않는, T 세포에 의해 공격받을 수 있는 항원으로 나종 바이러스에 의해 유발되는 종양들과 기타 상생식기 종양을 포함하나 이에 한정되지는 않는, T 세포에 의해 공격받을 수 있는 항원으로 나타내어지는 모든 종양들을 치료하는데 사용할 수 있다. T 세포 수용체 분자들 또는 항체 분자들로부터 유도된 펩티드는 또한 면역조정 메카니즘의 타겟화된 촉진용으로, 특히 자가면역병 및 이식거부뿐 아니라 이식조직 - 대 - 숙주의 반응 조절용으로 사용할 수 있다. 예방용으로 본 발명에 따른 단백질의 체내에서의 용도는 전염병 또는 악성질병에 대한 펩티드 백신으로서의 용도에 한정되지 않고 재조합형 백신 (살모넬라 또는 마이코박테리아와 같은 박테리아 또는 우두와 같은 바이러스를 포함하여)을 포함한 모든 다른 형태의 백신 및 재조합형 박테리아 (예를들면 E. Coli ) 또는 이스트, 곤충, 뮤라인 또는 인간세포를 포함한 기타 세포를 사용하여 얻어진 단백질에 합체할 적당한 T 세포 에피토프에 대하여 본 발명에 따른 정보의 사용을 포함한다.

본 발명에 따른 펩티드의 투여량 또는 농도는 당업자들에 의해 일상적으로 결정될 수 있다. 체내에서는 10 ㎍ - 1 g 의 범위일 것으로 추측할 수 있다. 체외농도는 1펨토몰 - 1 마이크로몰 범위내일 것으로 추측할 수 있다. 체내 투여는 피하, 근육내, 정맥내, 피내 및 경구적으로 투여할 수 있으나 이에 한정되지는 않느다.

치료적 용도에서, 본 발명에 따른 펩티드 모티프에 해당하는 펩티드는 바람직하게는 N - 또는/ 및 C - 말단에서 친유성 또는 양친매성 그룹과, 특히 친유성 펩티드 헬릭스와 공유결합한다. 이러한 그룹의 예로는 트리팔미토일 - S - 글리세릴시스테이닐 - 세릴세린이 있다.

본 발명은 제1도와 함께 다음 실시예들에 의해 보다 더 잘 설명되어질 것이다.

제1(a)도는 항 - Kd 항체를 사용하여 P815 용균액으로부터 분리된 물질의 HPLC 프로파일을 나타낸다.

제1(b)도는 제1(a)도의 크로마토그램에서 연장된 부분 1 분획 (5-35)을 나타낸다.

제1(c)도는 제1(b)도의 화살표로 표시된 자체 펩티드의 재크로마토그래피를 나타낸다.

제2도는 MHC 분자 및 이의 리간드를 나타낸다.

10 - 20 × 10⁹P815 종양세포 ( H-2K^d)를 펠릿으로 만들어 0.1 mmol/1 의 페닐메틸설포닐 플루오라이드 ( PMSF ) 를 함유한 포스페이트 - 버퍼된 살린 용액 ( PBS ) 내 250 ml 의 0.5 % 노니데트 P40 와 함께 4℃에서 30분동안 교반시켰다. 이 상청액을 4℃에서 250 g에서 5 분동안 또 150000 g에서 30 분동안 원심분리시킨다음 흡착 크로마토그래피용 장치를 통과시켰다. 흡착 크로마토그래피용 장치는 각각 약 1 ml 의 충체적을 갖는 세 개의 칼럼으로 이루어져 있다. 칼럼물질은 제작자의 계획안에 따라 시아노겐브로마이드 - 활성화된 세파로스 4B ( Pharmacia LKB )에서 제조된 항체 - 커플된 또는 글리신 - 커플된 비드로 구성되었다. 각각의 경우 1 ml 의 비드에 커플된 5 mg 의 K^d- 특이 항체 20 - 8 - 4S (IgG 2a, kappa ; 25 ) D^b- 특이항체 B22 - 249 (IgG 2a, kappa ; 26)를 항체로서 사용하였다. 세포추출물의 상청액을 처음에는 글리신 - 커플된 비드의 칼럼을 통과시킨다음 항 - K^d비드의 당해 칼럼을 통과시킨후 허위참강용 항 - D⁶비드를 통과시켰다.

상기 비드를 상기의 세 칼럼 전부에서 제거하여 0.1 % 트리플루오로아세트산으로 15 분동안 회전혼합시켰다 (7). 상청액을 진공 원심분리시켜 건조시키고 슈퍼팩 펩 S 칼럼 ( C2/C18 ; 5 ㎛ 입자, 4.0 × 250 ㎜, Pharmacia LKB ) 및 Pharmacia LKB 장치 (4) 를 사용하여 역상 HPLC 에 의해 분리시켰다. 용리제는 H₂O 내 0.1 % 의 트리플루오로아세트산 용액 ( v/v), 아세토니트릴내 0.1 % 의 트리플루오로아세트산 용액을 사용하였다 :

제1(a)도 및 1(b)도에 나타낸 크로마토그래피 분리에 다음의 그레이디언트를 사용하였다.

0 -5 분, A 100 %

5 - 40 분, B 가 60 % 될 때까지 선형 증대

40 - 45 분, B 60 %

45 - 50 분, B 가 0 % 될 때까지 감소

유량 : 1 ml/분, 분획크기 1 ml

개개의 분획들을 수거하여 진공 원심분리시켜 건조시켰다.

제1도는 트리플루오로아세트산으로 처리되어 면역침강한 K^d분자들의 HPLC 분리를 나타낸다. 제1(a)도는 P815 용균액으로부터 항 - K^d(실선) 또는 항 - D^b(점선) 로 침강된 TFA - 처리시킨 물질의 HPLC 프로파일을 나타낸다. 목적하는 대립유전자 - 특이 펩티드 혼합물을 나타내는 이종의 물질이 분획 20 - 28 에서 소량 용리되어 나온다.

분획 20 - 28 은 K^d침강물 및 허위침강물로부터 수거하였다. 이 두 침강물은 Edman 분해방법 (Edman 등, Eur. J. Biochem. 1 : 80 - 91 (1967) ) 을 이용하여 자동 시퀀싱되었다. Edman 분해법은 온 - 라인 PTH 아미노산 분석기 120A 가 장착된 단백질 시퀀서 477A (미합중국, 캘리포니아 94404, 포스터 시티에 소재하는 Applied Biosystems) 내에서 수행하였다. 유리섬유 필터를 1 ㎎ 의 BioPrene Plus 로 피복시키고 미리 순환시키지 않았다. 시스테인은 수식되지 않았으므로 검출될 수 없었다.

Edman 방법은 연속적 유도체 합성 및 각각이 크로마토그래피로 동정된 N - 말단에서 출발한 아미노산 제거를 포함한다. 펩티드의 착물 혼합물을 시퀀싱하는 것은 비정상적이므로 시퀀싱 장치로부터 직접 얻은 데이터가 제공되어져야 한다. 하기표 1a 및 1b는 K^d- 용리된 펩티드에 대한 두 번의 시퀀싱 실험에서 얻은 결과들을 나타낸다. 표 1c 는 P815 용균액상의 D^b- 특이항체로 행한 허위용리에 대한 시퀀싱결과를 나타낸다. K^d- 용리된 펩티드는 1 - 9 각각의 위치에 대하여 명확한 아미노산 패턴을 갖는 반면 허위 - 용리된 물질은 시종 각 싸이클내 각 잔기의 절대량이 감소하는 가운데 균일한 아미노산 패턴을 갖는다. K^d- 용리된 펩티드에서, 이전 싸이클 또는 마지막전의 싸이클과 비교할 때 절대량의 50 % 이상 증가함을 나타내는 잔기들만이 중요한 의미를 지니며 밑줄을 그어 표시하였다. 첫 번째 위치는 이전 싸이클이 없고 더욱이 HPLC 풀 내 존재하는 모든 유리 아미노산이 이 위치에서 검출되기 때문에 판단하기가 어렵다. 이런 싸이클에 비하여 빈도가 명백하게 증가한 두 번째 위치에서 유일한 잔기는 티로신 (예를들면 표 1a에서 60.9 - 875.6 pmol ) 이다. 증가 (소량의) 를 나타내는 유일한 다른 잔기는 Tyr 에 유사한 측쇄를 갖는 페닐알라닌이다. 이는 2 위치의 티로신 잔기에 대하여 다른 K^d- 제한된 인플루엔자 에피토프 (TYQRTRALV 의 시퀀싱을 갖는 ) 를 비교하여 얻어진 가정을 확인시켜 준다. 대조적으로 3 - 8 위치에 대해 특징적인 명확한 아미노산 잔기들은 없다. 최대 14 개의 다른 잔기들이 개개의 위치에서 발견된다. Ile 및 Leu 는 P 위치에서 발견된다. 10 위치에서 시그널에 증가하지 않는데 이는 대부분의 K^d- 결합된 자체 펩티드가 9 개의 잔기보다 더 길지않음을 나타낸다. 따라서 천연 K^d- 제한된 인플루엔자 펩티드는 노나펩티드 (4) 이다. 이러한 결과로부터 유도된 공통 서열(consensus sequence) 패턴을 표 1c에 나타내었다. 가장 현저한 특색은 Tyr 은 2 위치이고 Kle 또는 Leu 는 9 위치인 반면 다수개의 잔기는 기타 모든 위치에서 발견된다는 점이다. 이 모티프와 K^d- 제한된 에피토프를 함유하는 펩티드 시퀀싱을 비교하면 이들의 대부분은 K^d- 제한된 공통 단량체 모티프와 잘 매치되는 것을 알 수 있다 (표 1d).

분획부피 0.5 ml 인 고분해능을 사용하여 화살표로 표시된 제1(b)도의 분획 29 의 피크와 허위침강의 당해 분획은 또다시 크로마토그래피시켰다 (제1(c)도). 샤프한 특정 피크는 직접 시퀀싱하여 측정된 아미노산 배열 SYFPEITHI를 갖는 펩티드를 나타낸다. HPLC 상에서 동시용리시켜 (제1(c)도), 상기 천연 세포펩티드가 합성 SYFPEITHI 펩티드와 동일함을 확인하였다. 이 서열은 20 - 28 분획의 풀로부터 얻어진 공통모티프와 매치되므로 특이 K^d- 제한된 펩티드 모티프의 존재를 확인할 수 있다 (표 1d).

* K- 제한된 T 세포 에피토프를 함유하는 것으로 알려진 펩티드를 Tyr 잔기에 대하여 정렬시켰다. 원래부터 처리된 것으로 알려진 펩티드는 밑줄을 그어 표시하였다.

[실시예 2]

K및 D분자들로부터 펩티드 용리 ;

ELA 종양세포 (H - 2) 로부터 얻은 청정제 용균액을 실시예 1에서 기술한 바와같이 K- 특이 및 D- 특이 항체로 면역침강시켰다. D항체로는 B22 - 249 (실시예 1 참조) 를 사용하고 K- 항체로는 K9 - 179 (IgG 2a, K, 27)을 사용하였다. MHC 분자들로부터 해리된 펩티드를 역상 HPLC 로 분리시켰다. 대략 실시예 1에서 얻은 K물질에 해당하나 20 - 28 분획에서 용리된 이종물질내에 차이점을 갖는 프로파일로 K물질 및 D물질을 용리시켰다.

D- 제한된 펩티드 모티프 ;

D프로페레이션으로부터 수거한 분획 20 - 28 을 시퀀싱하였다 ( 표 2a, 2b). 위치 2 - 4 가 몇몇 잔기를 함유하고 있었다. 대조적으로 싸이클 5 는 Asn 에 대한 강한 시그널을 나타내었다. 따라서 D- 용리된 자체 펩티드의 5위치에서의 주된 잔기는 Asn 이다. Asp 에 대한 약한 시그널은 시퀀싱조건하에서 Asn이 Asp로 가수분해됨으로써 일어난다. 6 - 8 위치는 5 - 14 개의 상위하고 검출 가능한 잔기들을 함유한다. 9 위치는 Met 에 대하여 강한 시그널, Ile 에 대하여 중간 시그널 및 Leu 에 대하여 약한 시그널을 나타내었다 (모두 소수성 아미노산) ( D- 제한된 에피토프에서의 Met 또는 Ile 의 중요성은 이미 보고되었다(17 참조)). 10 위치에서는 Db - 제공된 자체 펩티드가 노나펩티드임을 나타내는 시그널이 존재하지 않았다. 이 결과로부터 측정된 공통 모티프는 표 2에서 나타내었다. 이 모티프는 천연 D- 제한된 펩티프와 또 D- 제한된 에피토프를 함유하는 다른 펩티드와 비교하면 5 위치에서 Asn 이 D- 제한된 펩티드 모티프의 불변 앵커 잔기일 수 있음을 알 수 있다. D- 제한된 에피토프의 나머지 잔기는 두 번째 앵커위치와 유사하게 보이는 위치 P 에서의 예외 (Met, Kle 또는 Leu) 와는 상당히 다르다.

K- 제한된 펩티드 모티프 ;

K프레퍼레이션에서 수거한 분획 20 - 28을 시퀀싱하였다 (표 3a, 3b). 위치 3 에서는 Tyr 에 대한 강한 시그널과 Pro 에 대한 약한 시그널이 나타났다. 위치 4 에서는 5 개의 잔기에 대한 약한 시그널이 나타났다. Phe 및 Tyr 에 대한 강한 시그널은 5 위치에서 이 두 잔기가 우세함을 보여준다. 다음번의 두 위치에서는 각각 5 및 3 개의 시그널이 나타났다. 위치 8 에서는 Leu 에 대한 강한 시그널, Met 에 대한 중간 시그널 및 Ile 및 Val 에 대한 더 약한 시그널이 나타났다. 위치 9 에서는 8 량체 (5) 인 공지된 K- 제한된 천연펩티드의 길이와 일치하는 어떠한 잔기에 대한 증가도 나타나지 않았다. K- 제한된 공통 모티프의 분석 및 에피토프와의 비교에서 두 개의 앵커위치가 나타난다 : 5 위치에서 Try 또는 Phe ( 이 둘다 방향족 측쇄와 유사함) 및 8 위치에서 Leu, Met, Ile 또는 Val (모두 소수성 측쇄와 유사함).

[실시예 3]

HLA - A2.1 - 제한된 펩티드 모티프 ;

HLA - A2.1 MHC 분자 (45) 와 함께 인간 JY 세포의 청정제 용균액을 A2 - 특이항체 (BB7.2, IgG2b, 참고문헌 28) 로 면역침강시켰다. A2 분자로부터 해리된 펩티드를 HPLC로 면역침강시켰다. 분획 20 - 28 을 풀 ( pool ) 시키고 전기한 바와같이 배열시켰다 (표 4). 두 번째 위치에서 Leu 에 대한 강한 시그널과 Met 에 대한 중간 시그널이 나타났다. 3 - 5 위치에서 각각 6 - 8 개의 잔기들이 발견되었다. 위치 6 은 Val, Leu, Ile 및 Thr을 함유하였다. 다음번의 두 위치는 각각 세 개의 시그널을 나타냈다. 위치 9 에서는 강한 Val 시그널과 약한 Leu 시그널이 나타났다. 위치 10 에서는 A2 - 제한된 에피토프가 노나펩티드임을 나타내는 잔기에 대한 증가가 없었다. 2 위치에서 Leu 또는 Met 및 9 위치에서의 Val 또는 Leu가 앵커 잔기인 것으로 나타난다. A2-제한된 에피토프와 함께 공지된 몇몇의 펩티드는 모티프로 정렬될 수 있는 반면, 이는 다른 나머지에 대해서는 단지 부분적으로만 가능하다 (표 4c). A2 분자의 몇몇 변형체가 존재하면 모티프와 몇몇 펩티드가 상기와 같이 거의 일치하지 않을 수 있을 것이다.

[실시예 4]

이러한 펩티드 모티프를 실시예 1 - 3 에 따라 측정하였다. 그결과들은 표 8 -24 에 나타내었다.

펩티드 모티프 HLA-A, B 및 C 는 MHC I 군 리간드이다. 펩티드 모티프 HLA-DR, DQ 및 DP 는 MHC II 군 리간드이다.

HLA I 군 리간드에 대한 에피토프 예측 설명

앵커 : 모든 앵커는 통상 모든 천연 MHC I 군 리간드에 사용한다. 그러나, 또한 기술한 것 외의 다른 앵커 잔기들, 즉 유사 특성을 갖는 잔기들 (예를들면, 어떤 소수성 아미노산을 다른 소수성 아미노산으로 치환시킬 수 있을 것이다) 또한 사용가능하다. 앵커들간의 아미노산의 수는 일반적으로 일정하나, 하나 또는 두 개의 아미노산을 추가로 삽입시킬 수 있을 것이다.

보조적 앵커 : 이는 바람직하게는 사용하나 필수적인 것은 아니다 : 몇 개의 보조적 앵커가 언급되는 경우 통상 이들중 최소한 몇 개가 사용된다.

단백질 서열에 대한 에피토프 예측에 있어서, 다음과 같이 처리하는 것이 편리하다 ;

단백질 서열은 정확한 간격으로 앵커 잔기에 대하여 스크린한다. 이 방식에서 발견되는 부분적 서열들 (리간드 캔디데이트) 은 정확한 위치에서 리간드 캔디데이트의 수를 감소시키는 보조적 앵커 잔기가 존재하는지 조사한다. 이러한 캔디데이트는 부가적으로 추가의 바람직한 아미노산 잔기를 함유하는 나머지 캔디데이트로부터 선택된다.

HLA II군 리간드에 대한 에피토프 예측설명

앵커 : HLA II 군 모티프는 3 또는 4 개의 앵커를 갖는다. 그러나 개개의 리간드는 종종 이들 앵커들중 단지 2 개만을 사용한다. 아마도 특히 강하게 결합하는 리간드는 모든 앵커를 사용하고 소실된 앵커잔기는 아마도 다른 바람직한 잔기에 대하여 일치시킴으로써 보충시킬 것이다.

이를 예증하기 위해서, 매칭 앵커 잔기가 리간드의 보기에서 밑줄을 두 번 그어 표시하였고 기타 바람직한 잔기는 단순히 밑줄을 그었다.

표 39 - 47 의 대립유전자 - 특이 모티프는 II 군 리간드의 경우 ( I 군 리간드와 비교할 때 ) N - 말단과 첫 번째 앵커간의 아미노산 잔기의 수가 가변적이므로 상대적 위치 형태로 기술하였다 (첫번째 앵커는 상태적 위치 1 임). 표 48 - 50에서 모티프는 절대적 위치로서 주어졌다.

단백질 서열내 에피토프 예측에 대한 절차는 처음부터 서열이 최소한 2개의 앵커잔기 (이중 하나는 앵커 1) 와의 일치성에 대하여 조사된 점을 제외하고는 I 군의 절차와 유사하게 진행된다. 이 방식으로 몇몇 리간드 캔디데이트가 얻어질 경우, 기타 바람직한 잔기들은 추가의 제한에 대하여 비교하고 (비 - 대립유전자 - 특이) 처리 모티프 (절대적 위치 2 및 12에서 16 까지의 단백질) 와의 일치성에 대하여 최종적으로 테스트하였다.

매우 강한 Pro 시그널이 조사된 HLA II 군 리간드의 절대위치 2에서 나타났다. 추가의 Pro 시그널은 C - 말단 영역에서 보여진다. 이러한 Pro 시그널은 천연 II 군 리간드의 바람직한 특색으로 사료되어진다. 따라서 HLA II 군 리간드에 대한 처리 모티프는 다음과 같다.

절대적 위치

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

P P P P P P

표 39 - 47 에서 첫 번째 앵커는 일반적으로 절대적 위치 3 - 5 또는 4 - 6 의 영역내이다.

제2도의 상단은 II 군의 I 군 리간드의 단순화시킨 비교를 보여준다. II 군 리간드 (왼쪽) 는 대립유전자 - 특이 포켓에 의해 MHC 클레프트내에 고정된다. 클레프트의 양단은 개방되어 있다. 즉 리간드가 돌출가능하다 (12 - 25 개의 잔기, 평균 15 - 16 개의 잔기). N - 말단후의 두 번째 잔기는 아마도 아미노펩티다제 활성의 결과인 듯 종종 Pro 이다. 제2도에서 볼 수 있는 바와같이, 이러한 Pro 잔기는 MHC 클레프트에의 결합과 관련이 없다. 즉 합성 MHC II - 결합 펩티드 모티프는 필수적으로 Pro 잔기를 함유해야 하는 것은 아니다. 바람직하게는 첫 번째 앵커 잔기와 함께 시작한다. N - 말단과 첫 번째 앵커간의 거리는 대부분의 리간드에 있어서 5 ± 1 개의 리간드이다. 마지막 앵커와 C - 말단 간의 거리는 일정하지 않다. I 군 리간드 (오른쪽)에서 주요 차이점은 클레프트내 펩티드 말단의 견고한 결합과 리간드의 더 한정된 길이이다.

제2도의 하단은 수용체와 II 군 리간드의 이론적 결합을 보여준다. 리간드는 연장된 방향에서 펩티드 골격으로 나타난다. 첫 번째 소수성 앵커는 클레프트의 α - 말단에 위치하고 마지막 앵커는 반대편 말단에 위치한다. 두 번째 앵커는 α 및 β 영역이 만나는 대략 중간쯤에 위치한다. 따라서 첫 번째와 마지막 앵커간의 거리는 클레프트의 길이에 해당한다. 다양한 대립유전자의 첫 번째 앵커 (소수성/방향족) 의 비교적 보존적인 특색은 DNA 유전자내 증가된 다형태성의 부재를 반영하는 반면 두 번째 및 마지막 앵커는 다형태의 β 쇄의 영향을 받는다.

이러한 HLA 에 따르면, Cw4, Cw6 및 Cw7 리간드는 다음과 같은 특성을 지닌다 :

1) 통상 9 개의 아미노산의 길이 (더 길고 또 더 짧은 펩티드도 발생가능하다)

2) 2 위치에서는 주로 방향족 잔기 F 또는 Y

3) 6 위치에서는 주로 소수성 잔기 V, I, L, F, A ( 보조적 앵커 )

4) C - 종결점에서는 소수성 잔기 L, F, Y, M, V.

Cw4, Cw6 및 Cw7 의 리간드 특이성에서 개별적 차이는 표에 나타내었다.

따라서 천연 DR3 리간드는 다음과 같은 특성을 갖는다 :

1) DR1 에서와 같음

2) DR1 에서와 같음

3) 3, 4 또는 5 위치에서는 소수성잔기 L, F, I, Y, M, A

4) 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 위치에서는 극성/전하를 띤 잔기들

5) 11, 12 또는 13 위치에서는 소수성 잔기 L, F, A, Y

따라서 천연 DR5 리간드는 다음과 같은 특성을 갖는다 :

1) DR1 에서와 같음

2) DR1 에서와 같음

3) 2, 3 또는 4 위치에서 극성/주로 음전하를 띤 잔기 N, D, E, H, K

4) 5, 6, 7 또는 8 위치에서 극성/주로 양전하를 띤 잔기 R, K, N, Q

5) 5, 6 또는 7 위치 뿐아니라 3, 4 또는 5 위치에서는 소수성 잔기 L, Y, V, I, M, F, A

6) 10, 11 또는 12 위치에서는 극성/전하를 띤 잔기 N, D, E, H, R, Q

Claims

(a) 적당한 MHC 분자를 함유하는 세포를 용균시켜 세포 추출물을 얻는 단계, (b) MHC 분자 및 그 위에 위치하는 펩티드 혼합물을 면역침강에 의하여 세포추출물로부터 분리시키는 단계, (c) 펩티드 혼합물을 MHC 분자 및 다른 단백질 성분들로부터 분리시키는 단계, (d) 개별적 펩티드 또는/ 및 이의 혼합물을 시퀀싱하는 단계 및 (e) 얻어진 정보로부터, 특히 혼합물의 시퀀싱 또는 다수의 개별적 펩티드의 시퀀싱으로부터 표 8 - 47 중 하나에 따라 대립유전자 - 특이 펩티드 모티프를 유도하는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어질 수 있고,

로 이루어지는 그룹에서 선택되는 I 군 또는 II 군의 주요 조직적합복합체 ( MHC ) 분자상의 대립유전자 - 특이 펩티드 모티프의, 진단제 또는 치료제 제조용 공정에 사용되는 용도.
제1항에 있어서, MHC 분자의 진단적 검출용으로 사용되는 용도.
제2항에 있어서, 펩티드 모티프에 해당하는 펩티드가 표지그룹, 특히 비오틴 또는 형광그룹과 커플된 용도.
제2항에 있어서, 면역시스템의 장애 또는 종양질병의 치료용으로 사용되는 용 도.
제4항에 있어서, 자가면역병, 이식거부 또는/ 및 이식조직 - 대 - 숙주반응의 치료용으로 사용되는 용도.
제1항 또는 제5항에 있어서, 펩티드 모티프에 해당하는 펩티드가 친유성 또는 양친매성 그룹, 특히 또한 친유성 펩티드 헬릭스에 N - 또는/ 및 C - 말단적으로 공유결합된 용도.
제6항에 있어서, 친유성 또는 양친매성그룹이 트리팔미토일 - S - 글리세릴시스테이닐 - 세릴세린인 용도.