JPH07509319A - Ｍｈｃ分子上のペプチドモチーフの決定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＭＨＣ分子上のペプチドモチーフの決定本発明は、主要組織適合遺伝子複合体（ ＭＨＣ）の分子上のペプチドモチーフもしくは一エピトープの決定法並びに決定 されたペプチドモチーフ、及び診断剤又は治療剤を製造するためのその使用に関 する。

細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、抗原ペプチドエピトープを、ＭＨＣ−コー ドされる分子と結合して認識する。この現象は、ＭＨＣ拘束と称される（文献； １〜５）。ヒトＭＨＣクラヌＩ分子、ＨＬＡ−２及びＡ　ｗ　６８の結晶学は、 重鎖のα１−及びα２−ドメインによって形成されるスリット　（Ｓｐｉｌ＋） を生じる（文献：３．６）。このスリットは、抗原ペプチドエピトープの結合部 位であると思われている。それというのも、双方の結晶は、ＭＨＣ配列と適合せ ず、かつこのスリットに接して存在している大きさのペプチド構造を有するから である（文献、６）。

これらのペプチドは細胞内タンパク質に由来し、かつ細胞表面に存在しているの で、細胞障害性Ｔリンパ球が異常な特徴に関して細胞を試験することを可能にす ると考えられている。Ｔ細胞エピトープを表出する、予めＭＨＣ＝会合された（ ａｓｓｏｚ　ｉｉｅ＋ｌｅ）ペプチドを、普通の又はウィルス感染した細胞から 抽出した（文献。

２．４，５．７．８）、相当する方法で、ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞により認 識される抗原も、合成ペプチドにより模倣され得（文献；　９）、ＭＨＣ−会合 された抗原ペプチドを、ＭＨＣクラスＩＩ分子がら溶離したく文献５１０）。Ｔ 細胞受容体、ペプチド及びＭＨＣ分子からなる３分子複合体く文献：１１）の真 中のその位置に基づいて、Ｔ細胞エピトープは、特異的免疫系の中心点であり、 かつ従って、その発生の法則性の理解並びに決定法に対する多くの必要性がある （文献、１２〜１５）。

本発明による課題は、 （ａ）ＭＨＣ分子を含有する細胞の溶解により細胞抽出物を得、 （ｂ）ＭＨＣ分子を、その上に存在するペプチド混合物と共に、免疫沈降により 細胞抽出物から分離し、（ｃ）ペプチド混合物を、ＭＨＣ分子及びその他のタン パク質成分から分離し。

（ｄ）個々のペプチド又は／及びその混合物を配列決定し、かつ （ｅ）殊に混合物の配列決定又は一連の個々のペプチドの配列決定からの得られ た情報から、対立遺伝子特異性ゝブチドモチーフ（ａｌｌｅｌｓｐｅｚｉｆｉｓ ｃｈｅ　Ｐｅｐ＋ｉｄｍｏｌｉＶ）を引き出す、 クラスＩ又はＩＩの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の対立遺伝子特異性ペ プチドモチーフの決定法により解決され、その際、次のものからなる群から選択 される分子上のペプチドモチーフ。

を決定することを特徴とする。

本発明方法により、ＭＭＣ分子がそれに従ってペプチドを選択しかつ提示する法 則性を有する、ペプチドモチーフが決定される。

本発明方法は、クラスＩのＭＨＣ分子を用いても、クラスＩＩのＭＨＣ分子を用 いても実施することができ、その際、クラスｌのＭＭＣ分子が有利である。ペプ チドモチーフ　ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃは、クラスＩのＭＨＣ分 子のリガンドである。ペプチドモチーフ　ＨＬＡ−ＤＲ，ＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬ Ａ−ＤＰは、クラスＩＩのＭＨＣ分子のリガンドである。

本発明方法によるＭ）（Ｃ分子の免疫沈降の際に、それぞれ所望のＭＨＣ分子に 特異的である適当な抗体を使用する。Ｈ−２に’−又はＨ−２Ｄゝ−分子の決定 のために１例えばに１特異性抗体（文献、２５）又はＤｂ特異性抗体（文献、２ ６）を使用する。有利には、モノクローナル抗体を使用するが、相当する精製さ れたポリクローナル抗血清の使用も可能である。本発明により使用することがで きる抗体は、当業者によく知られた標準技術を用いて新たに製造することができ る。

本発明で使用することができる抗体の例は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅ「１ｃａｎ　Ｔｙ ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　＋２３０１　Ｐａ＋ｋｌｓｖ ｎ　Ｄ＋ｉｖｅ、Ｒｏｅｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ２０８５２）の「カタログ・オプ ・セル・ライング・バイブリド−マス（Ｃａｌｓｌｏｇｏｃ　ｏｉ　ＣｅＩｆ　 Ｌｉｎｅ＋　ａｎｄ　Ｈｙｄ＋ｉｄｏｍａｓ）Ｊ中に記載されているＨＬＡ抗原 に対する全ての抗体を包含するが、これらに限定されない。有利な例（ＡＴＣＣ 命名法）は、ＨＢ８２．１１７．１６６．５４．１２２．１６４．９５．１．２ ０．１１６．１１８．９４，１５２．１７８．５６．１１５．１５７．１１９． ５９．１０５．１６５．１４１４．１８０．１０３．１１０．１０９．１５１及 び１０４を包含する。カタログ中に記載されているマウス−Ｈ−２抗原に対する 全ての抗体は、同様に、本発明で使用することができる。固相に結合された抗体 による免疫沈降は、殊に有利に行なわれる。固相に結合された抗体は、当業者に 公知の方法で、例えば抗体と、ブロムシアン活性化されたセファロース４Ｂ（フ ァルマシア（Ｐｈａ＋ｍａｃｉａ）　Ｌ　Ｋ　Ｂ　）とを結合させることにより 製造することができる。本発明で使用するための抗体に結合させることができる 他の固相の例は、アガロース、セルロース、セファデックス、プロティンＡ−セ ファロース及びプロティン−Ｇ−セファロースを包含するが、これらに限定され ない。免疫沈降の有利な方法は、臭化シアン活性化されたセファロース４Ｂ（例 １参照）から製造された小球に結合している抗体を用いる、吸着クロマトグラフ ィーである。

ＭＨＣ分子及びその他のタンパク質成分からの、決定すべきペプチド混合物の分 離は、クロマトグラフィー法により、特に逆相ＨＰＬＣにより行なうのが有利で ある。その際、トリフルオロ酢酸／Ｈ２Ｏ−トリフルオロ酢酸／アセトニトリル −勾配で分離を行なうことは、有利であることが判明した。ＭＨＣ分子からペプ チド混合物を分離するための本発明により使用することができる他の方法は、イ オン交換、ゲル濾過、電気焦点泳動、高性能毛管電気泳動（ＨＰＣＢ）及びゲル 電気泳動を包含するが、これらに限定されない。分離を実施するためのもう１つ の方法は超遠心分離であり、その際、３０００　Ｄ　ａ又は５０００Ｄａ又は１ ００００Ｄａの透過性を有する膜を使用する。　ＨＰＬ、Ｃを用いる分離が、有 利に実施される。

ペプチド混合物のクロマトグラフィー分離の際に、多くの場合に、単独のペプチ ド種を単離することができる。従って、本発明方法の工程（ｄ）は、ペプチド混 合物の配列決定（これにより、それぞれのＭＨＣ分子上に存在するペプチドモチ ーフに関する共通配列が決定される）又は／及び明確なペプチドの配列決定より なる。

ペプチドモチーフの決定に関する出発物質として、正常細胞、腫瘍細胞も、ウィ ルス又は他の病原体により感染した細胞も、並びに試験管内で（ｉｎ　ｖｉｌｌ ａ）培養したヒト又は動物の細胞も使用することができる。本発明で使用するこ とができる正常細胞は、新しい細胞、例えば抹消血液リンパ球、肺臓、肺、胸腺 の細胞又はＭＨＣ分子を発現する他の組織の細胞を包含するが、これらに限定さ れるものではない。本発明で使用した腫瘍細胞系は、腫瘍細胞ＥＬ４及びＰ８１ ５を包含するが、同様に、これらに限定されるものではない。本発明で使用する ことができるウィルス感染した細胞は、これらに限定されるものではないが、エ プスタイン−バール−ウィルス（Ｅｐｓｌｅｉｎ−Ｂｇ＋＋−Ｖｉｒｕｓ）によ り形質転換されたヒトＢ細胞であるＪＹ細胞を包含する。本発明方法により決定 されたペプチドモチーフは、次の基本原理に相当する： ａ）これらは、ＭＨＣクラス１分子の場合には、アミノ酸８．９．１０又は１１ 個、並びにＭＨＣクラスＩＩ分子の場合には、アミノ酸８〜１５個の対立遺伝子 特異性ペプチドの長さを有し、 ｂ）これらは、２個のアンカー位置（Ａｎｋｅ＋ｐｏｓｉｌｉｏｎ）（「アンカ ー位置」なる呼称は１位置が単独のアミノ酸残基の強いシグナルを示すか、又は 位置が非常によく類似した側鎖を有する僅かなアミノ酸残基で占められる場合に 使用する）を有し、そのうち、１個のアンカー位置は、常にＣ末端に存在し、か つしばしば脂肪性であり、かつ Ｃ）ペプチドは、もちろん、正常の、ウィルス感染した、他の方法で感染した、 又は遺伝子を用いて形質転換された、又は抗原を負荷した細胞のＭＨＣ分子上に 提示される。

ＭＨＣクラス■分子８２に’、Ｈ２にゝ、）（２Ｄ’及びＨＬＡ−Ａ２からの自 己ペプチド混合物の配列決定は、クラス１分子のそれぞれにより提示される、そ れぞれ異なる対立遺伝子特異性ペプチドモチーフを示す。

Ｋ’、Ｄゝ及びＡ２により提示されたペプチドは９量体である一方、Ｋ′提示ペ プチドは８量体であり、その際、相当するペプチドモチーフは、単独のアミノ酸 残基又はよく類似した側鎖を有する僅かな数のアミノ酸残基で占められている、 ２個のアンカー位置を含有する。これらのアンカー位置は、異なるモチーフの場 合には、同じ位置に存在せず、これらは、例えば位置５及び９　（Ｄ’）又は位 置２及び８（Ｋ’、Ａ２）又は位置５及び８　（Ｋ’）に存在しうる。全てのモ チーフのＣ末端アンカー残基は、疎水性アミノ酸である。アンカー位置に存在し ないアミノ酸残基は、かなり可変性であってよいが、いくつかは特に特定のアミ ノ酸で占められ、例えば、Ｋ′モチーフの位置４にＰｒｏ、に’モチーフの位置 ３にＴｙｒが見られ、かつ疎水性残基は、Ｄ１モチーフの位置３及びＡ２モチー フの位置６で使勢である。Ｈ２−Ｌ″のためには、アンカー残基は、位置２のプ ロリンであった。

本発明方法により得られた結果は、ＭＨＣクラスＩ分子で結晶学的に見られたス リットの構造に非常に良好に相当する（文献：３．６）。異なるＭＨＣクラスＩ 対立遺伝子は、このスリットのところの、異なるポケット（Ｔａ＋ｃｈｅｎ）の 存在により異なっている。このことは、おそらく、ポケットが、それぞれ異なる アミノ酸を収容しうろことに起因する。従って、ＭＨＣ結晶中の対立遺伝子特異 性ポケットと対立遺伝子特異性アンカー残基の側鎖とは、おそらく相補的構造を 示す。

本発明のもう１つの課題は、診断剤又は治療剤の製法における、本発明によるペ プチドモチーフの使用である。このペプチドモチーフの可能な使用範囲は、ＭＨ Ｃ分子の診断学的証明である。ＭＨＣ分子は、ペプチドのその個々の特異な結合 により特徴付けられるので、け識基（Ｍａ＋ｋｉｅ＋ｕｎｇｓｇ＋ｕＰＰｅ）の ペプチドによる結合証明を行なうことができ、その際、標識基として、例えばビ オチン基又は蛍光基をペプチドに結合させる。

当業者に公知の他の標識を、同様に、本発明で使用することができる。この標識 は、これらに限定されるものではないが、例えばペプチドのチロシン残基に結合 した】３１１又は＋２５１、又は３Ｈ又は１４Ｃ（双方は、合成の間にペプチド 中に取り込まれる）のような放射性標識を包含する。標識のペプチドへの結合は 、当業者に公知の方法により達成することができる。標識は、特に、非アンカー 位置（Ｎｉｃｈｌ−＾ｎｋｅｒｐｏｓｉｌｉｏｎｅｎ）で行なう。このような方 法で分かった、自己免疫疾患の発生と、疾病特異性ペプチドモチーフでのＭＨＣ 分子の発現との間の相関関係を、診断学的に使用することができる。本発明のペ プチド配列の試験管内での診断学的使用の例は、これらに限定されないが、次の ものを包含する＋ＭＨＣ分子の結合特異性の測定、Ｍ）（Ｃ分子の結合特異性と 疾病との相関関係付け、及び興味深いＭＨＣ分子をペプチド−バンク（試験した モチーフに合うペプチドの混合物）のＨＰＬＣ−フラクションで発現する。適肖 な細胞のインキュベーションによる未知の起源のＴ細胞エピトープの配列の決定 、及び天然のＴ細胞エピトープと、Ｔ細胞エピトープとして認識された合成ペプ チドとのクロマトグラフィー比較により行なわれる。Ｔ細胞により認識されたペ プチドの決定（Ｎａｔｕ「ｅ　３４８：２５２−２５４（１９９０））。

本発明のもう１つの課題は、免疫系の障害又は腫瘍疾病を治療するための医薬の 製法における本発明によるペプチドモチーフの使用である。殊に、本発明のペプ チドモチーフは、自己免疫疾患における干渉（予防及び治療）のために１例えば 一定のＭＭＣ分子の遮断並びにＴ細胞のペプチド特異的非反応性（Ｎｉｃｈｌ− Ｒｅｓｋｌ目１１ｉｅｌ）の誘導により使用することができる。更に、移植拒絶 反応及び移植片対宿主反応（Ｇｒｉ日−ｖｅｚｕｓ−１−１０＋１−Ｒｅｓｋ＋ １ｏｎｅｎ）における干渉が、同様の方法で可能である。更に１本発明によるペ プチドは、腫瘍細胞に対するＴ細胞の誘導又は強化もしくは増強のために、殊に 腫瘍疾病に対するワクチン化及び存在する腫瘍疾病の治療のために、試験管内及 び生体内で（ｉｎ　ｖｉｖｏ）使用することができ、その際、殊に、いわゆる移 植片対白血病作用（Ｇ＋ａｌｌ−ｖｅＩｓｕｓ−Ｌｅｕｋａｅｍｉｉ−Ｅｌｆｅ ｋｌ）　（Ｓｕｌｌ　ｉｖ！ｎ等、Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、３２０：８２８ 〜８３４）を利用することができる。本発明によるペプチドは、同様に、感染方 法（ｉｎｆｅｋｌｉｏｅｓｅ　Ｍｉ口ｅｌ）又は腫瘍に関して特異的であるＭ） ｌ　０ｇ合ペプチドを生体内で使用することにより、感染性又は悪性疾病に対す るＴ細胞応答を強化するために使用することができる。二者選択的に、Ｔ細胞は 、患者から得ることができ、その数を、試験管内で、ペプチドの使用及びサイト カイン、例えばインターロイキン２、インターロイキン４又はインターロイキン ６を包含する適当な成長条件の使用により増加させ、かつ引き続き、患者に戻す ことができる。本発明によるペプチドは、更に、Ｔ細胞により攻撃可能な抗原を 発現する、次のものを包含するがこれらに限定されない全ての腫瘍、黒色腫、乳 癌、ウィルス起源の腫瘍、例えばバーキットリンパ腫（Ｂｕ＋ｋｉｌ＋ｓｌｙｍ ｐｈｏｍ）、及びヒト乳頭腫ウィルスによるような腫瘍、例えば頚部ガン腫及び 他の生殖器（ａｎｏｇｅｎｉｌａｌｅ）腫瘍を治療するために使用することがで きる。Ｔ細胞受容体分子又は抗体分子に起因するペプチドは、更に、免疫ｙ４節 釣機構の目的とする処置のために、殊に、自己免疫疾病及び移植拒絶反応並びに 移植片対宿主反応の治療のために使用することができる。予防のための、本発明 によるタンパク質の生体内使用において、その使用は、これらに限定されるもの ではないが、次のものを包含する；感染性又は悪性疾病に対するペプチドワクチ ンとして、及び組換え接種物質（ウィルス、例えばワクシニア菌又はバクテリア 、例えばサルモネラ又はマイコバクテリアを含む）及び組換えバクテリア（例え ばＥ、コリ）又は他の細胞（酵母−２昆虫−、マウス−又はヒト細胞を含む）の 使用により製造されたタンパク質を含む他の全ての種類の接種物質中への本発明 によるタンパク質の導入のための適当なＴ細胞エピトープに関する本発明で集め られた情報の使用。

本発明のペプチドの用量又は濃度は、当業者により常法で決めることができる。

これらは、生体内で、１０μｇ〜１ｇの範囲で予想することができる。試験管内 濃度は、１フ工ムトモル〜１マイクロモルの範囲で予想することができる。生体 内投与は、これらに限定されないが、皮下、筋向、静脈内、腸管内及び経口法を 包含する。

治療的使用において、本発明によるペプチドモチーフにｔ目当し、Ｎ−又は／及 びＣ−末端で親油性もしくは両親媒性基、殊に親油性ペプチド−へリンクスと共 有結合するペプチドが有利である。このような基の例は、トリバルミトイル−５ −グリセリルシステイニル−セリルセリンである。

本発明を、次の例により、図１及び図２と結び付けて明らかにする。

図は、次のものを表す： 図１８は、Ｐ８１５ライゼート（Ｌｙｓｓａ＋）からなる抗に１抗体を用いて分 離した物質のＨＰＬＣ特徴、図１ｂは、１ａからのクロマトグラムの一部拡大部 分（フラクション１５〜３５）。

図１ｃは、１ｂ中の矢印を付した部分の自己ペプチドの再クロマトグラフィー。

図２は、Ｍ　Ｍ　Ｃ分子及びそのリガンド。

例Ｉ Ｐ８１５腫瘍細胞（Ｈ−２に″）１０〜２０Ｘ１０９をベレット化し、かつ０． ５％ノニデソト（Ｎｏｎｉｄｅ＋）Ｐ２Ｏ２５０ｍ１と共に、フェニルメチルス ルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ＞０．１ミリモル／１を有するリン酸塩緩衝され た塩溶液（ＰＢＳ）中で、３０分間、４℃で撹拌した。上澄を、２５０ｇで５分 間及び１、５００００　ｇ及び４℃で３０分間で遠心分離し、次いで、吸着クロ マトグラフィー装置に導いた。この吸着クロマトグラフィー装置は、それぞれ約 １　ｍ　ｌの層容量を有するカラム３ｍからなった。カラム物質は、製造元の記 録によりブロムシアン活性化されたセファロース４　Ｂ　（Ｐｈａ＋ｍａｃｉｉ 　ＬＫＢ）から製造された、抗体に結合したもしくはグリシンに結合した小粒か らなった。

抗体とシテ、Ｋ１特異性抗体２０２０−８−４３（Ｉ　２ａ、ｋａｐｐａ：２５ ）又はＤ１特異性抗体Ｂ２Ｂ２２−２４９（Ｉ　２ｓ、ｋａｐｐａ；２６）それ ぞれ５ｍｇを小球１ｍｌに結合させた。

細胞抽出物の上澄を、先ず、グリシンに結合した小球を有するカラムに、次いで 、抗に″小球を有する相当するカラムに、かつ次いで、偽沈降（Ｓｃｈｅｉｎｐ ＋ａｅ＋ｉｐｉ＋ａｌｉｏｎ）のために抗り′小球上に導いた。

小球を、全ての３つのカラムから除去し、かつ０゜１％トリフルオロ酢酸と共に １５分間渦動させた（文献、７）、上ｚ■を真空遠心分離により乾燥させ、かっ 逆相ＨＰＬＣにより、スーパーパック（Ｓｕｐｅ＋ｐａｃ）ＰｅｐＳカラム（Ｃ ２／Ｃ１８；　５ｐｍ粒子、４．０Ｘ２５０　ｍ　ｍ、ファルマシア（Ｐｈａ＋ ｍａｃｉａ）　Ｌ　Ｋ　Ｂ　）及びファルマシアＬＫＢ装置の使用下で分離した （文献、４）。溶離剤　溶液Ａ　Ｈ２Ｏ中の０．１％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ ）、溶液Ｂ　アセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸。

図１８及びｂ中に示したクロマトグラフィー分離のために、次の勾配を使用した ０〜５分、Ａ１００％ ５〜４０分、３６０％まで直線的に増大４０〜４５分、Ｂ６０％ ４５〜５０分、ＢＯ％まで減少 流速　１ｍ１／分、フラクション量：　１　ｍ　ｌや個々のフラクションを集め 、かつ真空遠心分離により乾燥させた。

図１は、免疫沈降され、かつトリフルオロ酢酸処理されたに′分子のＨＰＬＣ分 離を示す。図１ａは、抗に’　（実線）もしくは抗Ｄｈ（点線）を用いてＰ８１ ５−ライゼートから沈降させた、ＴＦＡ処理した物質のＨＰＬＣ特徴を示す。フ ラクション２０〜２８の間で、目標対立遺伝子特異性ペプチド混合物である不均 一物質が、僅かな量溶離する。

フラクション２０〜２８は、Ｋ１バッチ（＾ｎ５ｉＮ）からも、偽沈降によって も集められた。双方のバンチを、エドマン分解法の使用下で自動的に配列決定し た（Ｅｄｍａｎｎ等、Ｅｕ＋、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｉ：８Ｏ−９１（１９６７ ））　、このエドマン分解を、オンラインＰＴＨ−アミノ酸分析機１２ＯＡ（Ａ ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｌｅｍｘ、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、ＣＡ、９４４ ０４．ＬＩＳ＾）を備えたタンパク質ンークエンサー４７７人中で実施した。ガ ラス繊維フィルターを、バイオプレーン・プラス（ＢｉｏＰ＋ｅｎｅ　Ｐｌｕｓ ）　１　ｍ　ｇで被覆し、かつ前循環（ｐｔａｅ＋ｙｋ１口ｉｅ＋ｌ）させなか った。この配列決定を、標準プログラム　ＢＥＧＩＮ−１及びＮＯＲＭＡＬ−１ （Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｉｙ＋＋ｅｍｓ）の使用下に実施した。システィンは 修飾されず、かつ従って確認されなかった。

エドマン法は、それぞれクロマトグラフィーにより同定されるＮ末端の逐次誘導 体化及びアミノ酸除去（＾ｍｉｎｏｓａｕｒｅｎｅｎｔｌｅｒｎｕｎｇ）を包含 する。ペプチドの錯体温合物を配列決定することは異例であるので、配列決定装 置から直接得られたデータを提示する。第１８及びｂ表は、Ｋ′から溶離したペ プチドに関する、２種の配列決定試験からの結果を示す。第１ｃ表は、Ｐ８１５ −ライゼートのＤ１特異性抗体での偽溶離の配列決定結果を示す。Ｋ１から溶離 したペプチドは、１〜９の各位置にはっきりとしたアミノ酸型を１個有する一方 、偽溶離した物質は、それぞれの残基の吸収量を減少しながら、それぞれのサイ クルにおいて、例外なく、同じ形のアミノ酸型を示す。Ｋ′がら溶離したペプチ ドにおいては、前又は前の前のサイクルと比較して５０％より多いピークが絶対 量で示され、重要とみなされ、かつ下線を引いた。最初の位置は、評価すること が困難である。それというのも、前のサイクルが存在せず、かつ更に、ＨＰＬＣ −プール（Ｐｏｏ　ｌ）中に存在する、全ての遊離アミノ酸がこの位置で確認さ れるからである。第２の位置に関して、以前のサイクルと比較してその頻度が明 らかに高い単独の残基は、チロシン（例えば第１ａ表で６０．９ｐｍｏｌから８ ７５゜６ｐｍｏｌに）である。（僅かな）ピークを示す他の単独の残基は、Ｔｙ ｒに類似した側鎖を有するフェニルアラニンである。このことは、位置２のチロ シン残基を考慮して、天然のに′拘束インフルエンザーエピトープ（ＴＹＱＲＴ ＲＡＬＶの配列を有する）と他のに′拘束ペプチドとを比較することから得られ る仮定を裏付けする。これに反して、続く位置３〜８に関して特徴的である、定 義されたアミノ酸残基は存在しない。個々の位置において、１４個までの種々異 なる残基が見つけられる。位置９には、Ｉｌｅ及びＬｅｕが見つけられる。位置 １０にシグナルピークはなく、このことは、大抵のに′−結合した自己ペプチド が９個より長い残基でないことを示唆している。従って、天然のに′拘束インフ ルエンザーペプチドは、ノナペプチド（Ｎｏｎａｐｅｐ＋ｉｄ）　（文献、４〉 である。この結果から由来する共通配列型を、第１ｃ表中に示す。大抵、目に付 くのは、位置２のＴｙ　ｒ、及び位置９のＩｌｅ又はＬｅｕであり、他の全ての 位置には、より多数の残基が見られる。このモチーフと、Ｋ４拘束エピトープを 含有するペプチド配列との比較は、そのほとんどかに″拘束共通モノマーモチー フに良好に合致することを示す（第１ｄ表）。

図１ｂのフラクション２９中で矢印を付したピーク及び偽沈降の相当するフラク ションを、高い溶解性下に新たにクロマトグラフィーにかけたが、その際、フラ クション容量は０５ｍｌであった（図１ｃ）。急激な特異的ピークは、直接配列 決定により決定されたアミノ酸配列５ＹＦＰＥＩＴＨＩを有するペプチドであっ た。合成５ＹＦＰＥＩＴＨＩペプチドとの天然細胞ペプチドの同一性は、共溶能 （Ｃｏｅｌｕｔｉｏｎ）によりＨＰＬＣでｉｔ明された（図１ｃ）。この配列は 、フラクション２０〜２８のプールからの共通モチーフに合致しく図１ａ、ｂ） 、このことにより、特異なに１拘束ペプチドモチーフ（第１ｄ表）の存在が証明 される。

リ　＝＝四Ｓｉばヨ五：　を劃を千ヨ＝；　荘＝ニス＝二＝二＝とパｔドＥｌ” ：”ｌ”’　”ｉｉｌ菟に不一＝＝＝；スにコ窩；１　北矧＝ミ贈：＋；；：　 民；芯ヨ六ロミに　勢８２＝器２二ω屓　；＝９１本；、ｌドＣＴ、２其園コヨ ＝七　雲二に；二＝警コニ、ｒ　ｐ−、ｑ旺ミｔミニ；ｉ＝：線；　ｖ２１：； ：　；、；ニドＩ＝ロス第１ｄ表 優性アンカー残基　Ｙ　Ｉ 弱イＫ　Ｆ　Ａ　Ａ　Ｖ　ＨＰ　Ｈ Ａ　ＨＥＮＩ）（Ｅ ＲＶＳＤＭＤＫ Ｓ　ＲＤＩＹＥＶ 公知のエピトープ＊　タンパク質源　文献箇所ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ　インフルエ ンザ　ＰＲ８ＮＰ　１４７−１５４　４，２９ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ　自己ペプチ ド　Ｐ８１５ＩＹＡＴＶＡＧＳＬ　インフルエンザ　ＪＡＰ　ＨＡ　５２３−５ ４９　３０，３１ＶＹＱＩＬＡＩＹＡ　インフルエンザ　ＪＡＰ　ＨＡ　５２３ −５４９　３０，３１ＴＹＳＴＶＡ３ＳＬ　インフルエンザ　ＰＨ１）１＾　５ １８−５２８　３２ＬＹＱＮｖＧＴＹｖ　インフルエンザ　ＪＡＦ　）ＩＡ　２ ０２−２２１　３０，３１ＲＹＬＥＮＧＫＥＴＬ　ＨＬＡ−＾２４１７０−＋８ ２３３　３３ＲＹＬＫＮＧＫＥＴＬ　ＨＬＡ−Ｃｗ３１７０−１８６　３４＊■ （１拘束Ｔ細胞エピトープを含有することで知られているペプチドは、そのＴｙ ｒ残基により一致された。

１評にブロヤシングされろことが知られているペプチドには下線を引いた。

例２ に″及びＤ１分子からのペプチドの溶離Ｅ　Ｌ　４−Ｉｔ！瘍細胞（ト（−２’ ）かものデタージエントーライゼー）　（Ｄｅ＋ｅ＋ｇｔｎｔ−Ｌｙｓａｔｅ） を、例えば例１で記載したようなにゝ特異性及びＤゝ特異性抗体を用し＼て免疫 沈降させた。Ｄｌ−抗体としてはＢ２２−２４９（例１参照）を、及びに１−抗 体としてはＫ　９−１７８（ＩｇＧ　２ａ、Ｋ、２７）を使用した。ＭＨＣ分子 から解離したペプチドを、逆相ＨＰ　ＬＣにより分離した。Ｋゝ−もＤ′−物質 も、例１からのに６−物質ｌこいくらか相当する特徴を有して溶離されたが、そ の際。

フラクション２０〜２８の間で溶離された不均一物質は明らかな相違を生じた。

Ｄ″拘束ペプチドモチーフ Ｄ’バッチからの集めたフラクション２０〜２８を配列決定した（第２ａ、ｂ表 ）。位置２〜４１ま、多くの残基を含有した。これに反して、サイクル５１ま、 Ａｓｎに関する強いシグナルを示した。従って、Ｄ′カ）ら溶離された自己ペプ チドの位置５の優勢残基１ま、Ａｓｎである６Ａｓｐに関する弱いシグナルは、 配列決定条件下でＡｓｎがＡｓｐへ加水分解すること；こ起因する。位置６〜８ は、異なる証明可能な残基５〜１４個を含有した。位置９は、Ｍｅｔに関する強 いシグナルを有し、ＩＩｅに関する中間のシグナル及びＬｅｕに関する弱いシグ ナルを有した（全て疎水性）。（Ｄゝ拘束エピトープ中のＭｅｔ又はｌｉｅの条 件は、既に記載されている。１７参照。）位置１０にはシグナルがなく、このこ とは、Ｄレー提示された自己ペプチドがノナペプチドでおることを示唆している 。この結果により決定された共通モチーフを第２Ｃ表中に示す。

このモチーフと、天然のＤｂ拘束ペプチド及びＤ−拘束エピトープを含有する他 のペプチドとの比較は、位置５のＡｓｎが、Ｄ１拘束ペプチドモチーフの不変の アンカー残基でありうることを示す、Ｄゝ拘束エピトープの他の残基は、２つめ のアンカー位置のように見える位置９（Ｍｅｔ、ＩＩｅヌはＬ　ｅ　’ｕを有す る）以外、著しく異なっている。

＞　Ｅ　ｉ；昂丁畦１トコ　！を回を発＝次＞　ミ　ニ器：口；に１ヨ：：　： 　Ｆ２二＝にｌ：ｌ　ＥココＨと　ぎ＝；矧：市ｌス芯　まス孫１孔■Ｅ七の３ 　＝北：に１モ七　ｉ読畦ｚ７コ担：：゛よト韮■貴：＝＝　４＝牙旺北；； 、ζ　ト黛：丁七＝　８゜−ｒ　＃　＋ｍ　：Ｉ。、。。

＋１ｑｌｑη〜−１Φ−Ｏ− 第２Ｃ表 Ｄゝ拘束ペプチドモチーフ 位　置 優性アンカー残基　Ｎ　Ｍ 強い　ＭＩＫ　Ｌ　Ｉ ＬＥ　Ｆ Ｑ ｖ　■ 弱い　ＡＡＧＤ　ＡＤＦＬ ＮＱ　Ｔ　ＹＥＨ ＩＤ　ＴＱＫ 公知のエピトープ　タンパク質源　文献箇所ＡＳＮＥＮＭＥＴＭ　インフルエン ザＮＰ　３６６−３７４１５４　４，２ＳＧＰＳＮＴＰＰＥ　Ｉ　アデノウィル ス（＾ｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）　ＥＩＡ　３８ＳＧＶＥＮＰＧＧＹＣＬ　リンパ球 性脈絡髄膜炎ウィルス（Ｌｙｍｐｈｏｚｙｔｅｎ（、ｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉ ｔｉｓ　Ｖｉｒｕｓ）　ＧＰ　２７２−２９３　３９ＳＡＩＮＮＹ、、、　シミ アンウィルス（Ｓｉｍｉａｎ　Ｖｉｒｕｓ）４０　Ｔ　１９３−２１１　４０ Ｋｈ拘束ペプチドモチーフ に’バッチからの集めたフラクション２０〜２８を配列決定した（第３ａ、ｂ表 ）。位置３は、Ｔ　”／　ｒに関する強いシグナル及びＰｒｏに関する弱いシグ ナルを有する。位置４は、５個の残基に関する弱いシグナルを示した。Ｐｈｅ及 びＴｙｒに関する強いシグナルが、これらの双方の残基を位置５で優勢にする。

次の双方の位置は、５個もしくは３個のシグナルを含有する。位置８はＬｕｅに 関する強いシグナル、Ｍｅｔに関する中間のシグナル及びＩｌｅ及びＶａｌに関 する弱いシグナルを示した。位置９は、何かの残基に関するピークは示さず、こ のことは、８量体である（文献；５）公知のに′拘束天然のペプチドの長さと一 致する。

Ｋ”拘束共通モチーフの分析及びエピトープとの比較は、２個のアンカー位置を 示す：位置５のＴｙｒ又はＰｈｅ　（双方とも類似の芳香族ｇＩｌ＋鎖を有する ）及び位置８のＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ又はＶａｎ（全て同様の疎水性側鎖を有 する）。

＞エ　雲’？”ｌ旺１器＝−こ　器≦１”−ｉ：’！＝：：、＝　２ｉｉ”ｉ” ：ｌミ；＝＝＝器ス１ミ＝１１−；；言言コ四二；：； の戊　＝さ１ゞ　１− Ｉ！、ｉ　：；ｉｊス鼾ＯＨ：：：　：冊＝姥コニ：ニーｉ　、ｉ　陳ド：５　 ：：：コ１０＝　■：ｆ＝；北：第３Ｃ表 Ｋｂ拘束ペプチドモチーフ 位　置 １２３４５６７Ｂ 優性アンカー残基　Ｆ　Ｌ 強い゛　Ｙ　“ 公知のエピトープ　タン）＜り質源　文献箇所ＲＧＹＶＹＱＧ°　ｙｋ（ｌａｏ 　ｎ＊”）−４／ｌ／Ｘ　（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ５Ｖｉ ｒｕｓ）　Ｎｌ’　５２−５９ ＳＩＩＮＦＥＫＬ　オノ（ルブミン　（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）　２５８−２７６ 　４１例３ ＨＬＡ−Ａ２．１拘束ペプチドモチーフＨＬＡ−Ａ２．１−ＭＨＣ分子（文献； ４５）を有するヒトＪＹ細胞のデタージェントーライゼートを、Ａ２特異性抗体 （ＢＨ３，２、Ｉ　ｇＧ２ｂ、文献箇所２８）を用いて免疫沈降させた。Ａ２分 子から解離されたペプチドを、ＨＰＬＣにより分離した。フラクション２０〜２ ８を集め、かつ前記のように配列決定した（第４表）。２つめの位置は、Ｌｅｕ に関する強いシグナル及びＭｅｔに関する中間のシグナルを有した。

位置３〜５には、それぞれ６〜８個の残基が見られた。

位置６は、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ｌｉｅ及びＴｈｒを有した。引き続く２つの位置は 、それぞれ３個のシグナルを示した。位置９は、強いＶａｌ−及び弱いＬｅｕ− シグナルを示した。位置１０は、１つの残基のピークも示さず、このことは、Ａ ２拘束エピトープがノナペプチドであることを示唆している。位置２のＬｅｕ又 はＭｅｔ及び位置９のＶａｌ又はＬｅｕは、アンカー残基であるように見える。

Ａ２拘束エピトープを有する公知のペプチドのいくつかが、モチーフと一致しう る一方、これは、他のものにおいては部分的に可能であるに過ぎない（第４ｃ表 ）。Ａ２分子の多くの変法の現存は、いくつかのペプチドとモチーフとのこの劣 悪な一致の原因である。

〉コ　ニ基壮ポ＝慕顕　薯ｔ＝弓市二艶とξ　雲芥１コヨａ礼＝　＝３士；）器 ）３：・と　誓北訃縣＝七　：嬰：；器に２ Ｃ−；＝ミｉ葺草北旺　ｉ本市ミ芸黛：１１　北ヨ芯冗スフ、：　４．　：ヨａ 北舎■：、２証　ｂ芹１ｔｇ二二＝　ユニ　啄！コニ３：：第４Ｃ表 ＨＬＡ−Ａ２．１拘束ペプチド　（ＨＬＡ−Ａ＊　０２０１　）位　置 優性アンカー残基　１．　Ｖ 強い　ＭＥＶＫ 弱い　Ｉ　ＡＧＩＩＡＥＬ Ｌ　ＹＰＫＬＹＳ Ｆ　ＦＤＹＴＨ 公知のエピトープ　タンパク質源　文献箇所Ｉ　ＬＫＥＰＶ）（ＧＶ　１（ＩＶ 　逆転写酵素４６１−４８５　４３ＦＬＱＳＲＰＥＰＴ　ＨＩＶＧａｇタンパク 質　４４６−４６０　４６ＡＭＱＭＬＫＥ、、　）ＩＩＶ　Ｇａｇタンパクｉ　 １９３−２０３　４６Ｐ　Ｉ　ＡＰＧＱＭＲＥ　ＨＩＶ　Ｇａｇタンパク質　２ １９−２３３　４６ＱＭＫＤＣＴＥＲＱ　ＨＩＶＧａｇタンパク質　４１８−４ ４３　４６第　５　表 ＨＬＡ−Ａ＊０２０５拘東ペプチドモチ一フ位　置 ａ）Ａ＊０２０５　１２３４５６７８９優性アンカー残基　Ｌ 他　Ｖ　Ｙ　Ｇ　Ｖ　Ｉ　Ｑ　Ｋ ＩＫＩＬ 第　６　表 Ｈ−２に’拘束ペプチドモチーフ 位　置 優性アンカー残基　Ｅ　１ 強い　Ｋ 弱い　Ｖ　ＱＬＡＮＴ Ｓ 第　７　表 Ｈ−２Ｋ”’拘束ペプチドモチーフ 位　置 優性アンカー残基　工 強い　ＥＫ 弱い　ＱＮＰＡ　Ｒ 例４ 次のペプチドモチーフ。

８誌−Ａｌ、　ＨＬＡ−Ａ３．　ＥＬＡ−Ａｌｌ、　Ｈ助−Ａ２４．　ＨニーＡ ３１゜ＨＬＡ−Ａ３３．　ＥＩＬＡ−Ｂ７．　ＨＬＡ−Ｂ８．　Ｈｌ、Ａ−Ｂ☆ ２７０２．　ＥＬＡ−Ｂ☆３５０１．　ＨＬＡ−Ｂ会３５０３゜ＦＩＬＡ−Ｂ３ ７．　ＨＬＡ−Ｂ３Ｏ，ｌ’１ＬＡ−Ｂ”３９０１．　ＲＬＡ−Ｂ”３９０２． 　ＦＩＬＡ−Ｂ”５１０１゜）ＩＴ、Ａ−Ｂ会５１０２．　ＨＬＡ−Ｂ會５１０ ３．　ＨＬＡ−Ｂ脅５２０１．　ＨＬＡ−Ｂ５Ｏ，ＨＬＡ−Ｂ２Ｏ。

ＨＬＡ−Ｂ６１．　ＨＬＡ−Ｂ６２．　ＨＬＡ−Ｂ７Ｏ，ＨＬＡ−Ｃｗ會０３０ １．　ＨＬＡ−Ｃｗ會０４０１゜ＨＬＡ−Ｃｗ＊０６０２．　ＨＸＪ、−Ｃｗ舎 ０７０２．　ＲＬＡ−Ｃｗ４．　ＨＬＡ−Ｃｗ６．　ＩｌｌムＡ−Ｃｗ７．　Ｈ ＬＡ−ＤＲＢＩ会０１０１．　ＤＲＢＩ會１２０１．　ＦＩＬＡ−ＤＲ４ｗ１４ ．　ＨＬＡ−ＤＲｌ７．　ＨＬＡ−ＤＲｗ５２．　ＨＬＡ−ＤＰ誓２．　ＨＬＡ −ＤＰＢ１壷０４０１．　ＨＬＡ−ＤＱＢＩ☆０３０１．　ＨＬＡ−ＤＱＱ１０ 　！（鳳−ＤＲｌ、　Ｈ詰−ＤＲ３及びＨＬＡ−ＤＲ５ これらのペプチドモチーフの決定を、例１〜３に相当して行なった。第８〜２４ 表中に、結果を記す。

ペプチドモチーフ　ＨＬＡ−Ａ、Ｂ及びＣは、ＭＨＣクラヌＩ−リガンドである 。

ペプチドモチーフ　ＨＬＡ−ＤＲ，ＤＱ及びＤＰは、ＭＨＣクラスＩＩ−リガン ドである。

ＨＬＡクラスＩ−リガンドのエピトープ予測のためのＭＨＣクラスＩ−リガンド において使用される。しかしながら、前記したアンカー残基の他に、同様の特徴 を有するものを使用することもできる（例えば、疎水性アミノ酸を他の疎水性の ものに代替することができる）。アンカーの間のアミノ酸の数は一般的に一定で あるが、１個又は２個の他のアミノ酸が導入されていてもよい。

補助アンカー（Ｈｉｌｌｓａｎｋｅ＋）　：これらは、有利に（しかしながら必 須ではない）使用され；複数の補助アンカーが記載されている場合、一般的に、 少なくともその一部が使用される。

タンパク質配列に関するエピトープ予測の際、有利には次のようにして行なう。

タンパク質配列を、正しい間隔のアンカー残基について探す。こうして見つけら れた部分配列（リガンド候補（Ｋａｎｄｉｄａｔｅｎ）　）を正しい位置の補助 アンカー残基の存在に関して試験し、これによりリガンド候補の数を制限する。

残った候補から、有利なアミノ酸残基の他のものを含有するものを選択する。

ＨＬ　ＡクラスＩＩ−リガンドのエピトープ予測のための注釈 アンカー　ＨＬＡクラスＩＩモチーフは、３個又は４個のアンカーを有する。し かしながら、個々のリガンドは、このアンカーをしばしば２個だけ使用する。お そらく、殊に強く結合するリガンドは全てのアンカーを使用し、かつおそらく、 欠落したアンカー残基は、他の有利な残基における一致により補われうる。

これを明らかにするために、リガンド例において。

適合するアンカー残基に二重の、他の有利な残基に一重の下線を引いた。

第３９〜４７表中の対立遺伝子特異性モチーフは、相対的な位置（第１のアンカ ー＝相対位置１）で示されている。それというのも、アミノ酸残基の数は、クラ ス１１リガンドにおけるＮ末端と第１のアンカーとの間で変化可能であるからで ある（クラスニーリガンドと対比）。第４８〜５０表中、モチーフは、亙互笠久 位置で示されている。

タンパク質配列内のエピトープ予測における処置法は、クラスＩと同様であるが 、最初から、配列を、少なくとも２個のアンカー残基（その内、１つはアンカー １）との一致に関して探す。この方法で、多くのりガント候補が得られる場合、 更に制限するために他の有利な残基を比較し、かつ最後に、（非対立遺伝子特異 性（ｎｉｃｈｌ　１ｌｌｅｌ−ｓｐｅ＋１ｆｉｓｃｈｅｎ））プロセシングモチ ーフ（Ｐｒｏ＋ｃ＋ｓｉｅｒｕｎｇｍｏ＋ｉｖ）　（絶対位１ｆ２もしくは１２ 〜１６からのタンパク質）に関して試験する。

試験したＨ　Ｌ　Ａクラス１１−リガンドの長ユ位置２において、一つの非常に 強いＰｒｏ−シグナルが存在する。他のＰｒｏ−シグナルはＣ末端の領域に存在 する。これらのＰｒｏ−シグナルは、天然クラス１１リガンドの有利な標識であ るように思われる。従って、ＨＬ　ＡクラスＩＩ−！Ｊリガンドプロセシングモ チーフは、次のようになる 絶対位置 １２３４５６１Ｂ９１ｏ　１１　１２　１３　１４　１５　１６　１７ｐ　ｐｐ ｐｐｐ 第３９〜４７表中では、一般的に、第１のアンカーは、ＭＭ位置３〜５又は４〜 ６の範囲に存在する。

図２の上部は、クラスＩＩ−及びクラスニーリガンドの簡単な比較を示す。クラ スエニーリガンド（左）は、対立遺伝子特異性ポケットによるＭＨＣ−スリット 中に固定されている。スリットの双方の末端は開いていて、すなわちリガンド（ １２〜２５残基、平均１５〜１６残基）は外側にたれていてよい。Ｎ末端から２ つめの残基は、おそらく、アミノペプチダーゼ活性の結果として、しばしばＰｒ ｏである。図２から分かるように、このＰｒｏ残基は、ＭＨ，Ｃスリットとの結 合に関与しない。すなわち、合成的ＭＨＣＩＩ−結合ベブチドモチーフは、Ｐｒ ｏ残基を含有していなくてもよく、これは、特に、最初のアンカー残基を用いて 初めて開始される。Ｎ末端と最初のアンカーとの間の距離は、多数のリガンドの ための残基５±１個である。、Ｉ＆後のアンカーとＣ末端との間の距離は一定で はない。クラスＩのリガンド（右）に対する主な相違は、スリット内でのペプチ ド末端のしっかりとした結合及び良好に定義されたリガンドの長さである。

図２の下部は、クラス１１リガンドのそのレセプターへの仮説的結合を示す。リ ガンドは、長く延びた方向でのペプチドバンクボーンとして示されている。最初 の疎水性アンカーは、スリットのα−末端に、最後のアンカーは、反対の末端に 存在する。２っめのアンカーは、α−及びβ−ドメインが出会うほぼ真中にある 。従って、最初と最後のアンカーとの開の距離は、スリットの長さに一致する。

種々異なる対立遺伝子における最初のアンカーの相対的に保存された特性（疎水 性／芳香性）は、ＤＮＡ遺伝子における強化された多型性の欠如を再び起こしう る一方、２つめの及び最後のアンカーは、多型性のβ鎖の影響にさらされている 。

第８表 圧にんｊプ丘ヱ 位置 １２３４５６ヱ８９ 他の有利な残基　Ｌ　ＰＧＯ Ｙ１ 位置 １２３４５ｆ１７８９１０ Ｆ 第１０表、　とし駐へｍ力＝２− 位置 １２塁４５６７８９１０１１ Ｆ Ｙ Ｉ 他。有利ｊな残基　Ａ　ＮＰＰＩＬＲＲＲＲＤＧＩ　ＶＩ　ＫＤ ＤＦＭＹＮ リガ７Ｆの例　人　Ｖ　Ｍ　Ｋ　Ｐ　Ｅ　Ａ　ε　ＫＲＫＡＶＩ　ＬＰＰＬＳＰ ＹＦＫ 第１１表：　凪と反１七辷２ 位置 Ｄ　ＱＥ 他の有利な残基　εＰ　ＮＫ 位置 １２３４５旦７８９ 他の有利な残基　ＫＴＫＰＰＮＮＬ 第１６表 −ａ７２モー 位置 他の有利な残基　Ｋ　ＦＧｆ　Ｉ　ＹＫＰＫＶＬＶ ＫＥＹＶＤ ＶＲＴＥ ＭＤＦＲ リガンドの例　５ＲＤＫＴＩ　Ｉ　ＭＷＯＲＬＴＫＨＴＫＦ ＫＲＫＫＡＹＡＤＦ ＫＲＧＩ　ＬＴＬＫＹ ＧＲＦＧＶＯＮＲＹ ＧＲＦＫＬＩ　ＶＬＹ 位置 Ｍ Ｌ Ｉ 　ＯＭＫ 第１８表：一−一 位置 １Ｑ３４５６７８９ ＮＨＶＴ ＨＩ １１９７　工１本り輩ヨユ 位置 位置 アンカー残基　Ｆ ＰＤＰＶＴＮＮ ＷＥＬＡＫ　Ｒ ＹＳＶＥＲＴ 第２１表：０．− 位置 Ｐ １２３４ｆｉ６７８９ ■ ＄２３１！　＋　□ 位置 アンカー残基もしくは　Ａ　Ｆ 補助アンカー残基　Ｐ　Ｉ Ｙ　ＦＫＡＫＥ ■ リガンドの例　ＹＰＦＫＰＰＫＶ ＤＡＨＩ　ＹＬＮＨＩ ＴＧＹＬＮＴＶＴＶ ＸＡＹＡＬＮＨＴＬ 第２４表　ａシュ−ユαヒ艷＝工２− 位置 １２旦４５５７８９ Ｔ 位置 １２旦４５６７ 他の有利な残基　ＦＦＥＧＩ Ｎ ■ 第２６表°　−１千−フ 位置 ＩＱ３４５６７８ 他の有利な残基　ＶＭＩ　ＬＭＫＫ ＬＦＩ、Ｉ　ＦＮＥ リガンドの例　ＴＧＹＬＮＴＶＴＶ ＶＱＴＩ　ＭＰＱＬ 第２７表　風と木１ぢ辷１ 位置 １２３４旦６７８９ Ω 位置 他の有利な残基　人ＰＬＫＬＫ ＶＫＩ　ＮＹＲ ＮＴＩ リガンドの例　ＫＥＳＴＬＨＬ ＥＡＴＬＲ ＹＥＩ　ＨＤＧＭＮＬ 位置 ３Ｍ　Ｗ Ｋ 第３０表：　比ム追越ｊプユヱ 位置 １２３４互６７８９ １ｍの有利なｆｌＭ　Ｉ　ＭＫＰ　ＧＶＶＹＶＡＥＬＴＴＶ ＧＦＧＬＴ ＤＴ１１ 鷹δ旧士二 位置 １２３４５６１旦 ■ 第３２！′″′　Ω２鵠ぶΣ二輩し工Ｚ−位置 １２塁４Ｓｆｉ７８９ 第３３表ニ ーＶ　モチーフ 位置 １２３４５Ω７８９ 第３４表ニ ーＷ６　２モチーフ 位置 １２３４互旦７８９ 池の有利な残基　Ｉ　ＰＰＰＫＡＲＹ 位置 １２３４：Ｌ旦７８９ Ｍ 他の有利な残基　ＲＰＤＴＡＹＥ ＤＯＥ　ＲＭＡ Ｅ 第３８表： 瓜とぐｄ±ゴム 位置 強い　ｐｏ’ｘ”を 弱い　ｐＮ　ＸＴＨ入 特表千７−５０９３１９　（１７） 第３９表 −１モー 相対位置 有利な残基 有利な小さい残基　ＡＡ　５ＡＳＳ ＴＳ　ＴＧＴＴ ＰＳＰ −く とロ　−Ｚ ４　−　口　＝のＡ　＞Ｃ４Ｃ１，、ｗＣＡ　凶＞　（ｂ（：Ｅ　＝四く← 頃　＞−ム　く　トド１ｂ−０α匡Ｈ 昭　−と、、３０Σとくト昂 ト　ω〇二　Ｈｚ＝ｚｕ＞α〉 ０　０　０Ｆ−Ｉ＜Ｅ−４００のム ー　Ｚ　２０（！：Ｇｃ−−ＪＸ の〉錫と＞ＺＪ２ 第４３表ニ ー　Ｗ　モ　−フ 相対位置 一１０１２３４ｂ６７８９１０ Ａ 第４４表 圧ム山す収」ヱニヱ 相対位置 一１０１２３４５６’７８９ Ｍ　ＭＭ ｖ　Ｙ　ｖ ε Ｔ　Ａ 〇 −エロＯ７と匡　←　− （へ）　Ｏ：ＣＺ＊α　くｏ←の　Σ閃く−に４トー二一　４Ｈ目 ０　＜Ｏｆ−の−−〉閃 ″′：ｃｏ關Σ ρ×（ト）ｚｏ ←〉ｆ Ｏの 第４６表 −０−。

相対位置 Ａ　Ａ 有利な小さい残基　Ａ ■ 第４７表ニ ー　Ｗ　モチーフ 相対位置 アンカー残基　ＬＦＬ 第４８ａ表・ −ＤＲ１− ＋２　３　４　５　１ｉ　７　Ｂ　９　＋Ｏ＋＋１２１３＋４１５１６１７１８ ＋９２０非常に強い　。

強い　ε　ＤｒＲＬＲＮ　ＭＴ ｒＴＨＭＮＰ　Ｃ 弱い　ＧＤＰＱＤＮａＳＭＱＲＡＫｒＥＧｔＹＧＭｑＴａＭＱｌ入　Ｑ ｉＮＡＩｓｖＱｓａ　Ｘ ８２Ｎａａｔ、ａｌ　Ｔ 第４８ｂ表、 解釈 回込」８１％力＝１ ＋　２３４５６７１＋　９１０旧２１３ＥＮＤ　Ｍ）４Ｍ ＤＫＱ　Ａ＾ 第４９ａ表。

−ＤＲ− １２３４５６７１１ＱＴｏ＋１１２１コｕ＋５Ｉ６非常に強い　Ｐ 強い　Ａ　ＲＤＤＤＲＱＲＬＬＴｒＦ’Ｓ入工　ＱｒＬＱＤＫＫＮＥＹＬ）ＣＴ Ｐ　ＬＬ５ＫＫｒ５ＫＱＬＹｙＨ Ｖ　ｒＡｔｓＱＤＥ、ｒＧ Ｇ工ｙＹＨＴＹ入 ＨＭＱＭ　ＮＮ ＤＴＩ　Ｐ　Ｅｄ 工ＲＦ　ＧＨ 第４９ｂ表 解釈。

−Ｄ　モチーフ １２コ４５６７Ｉｔ９ｔｏｌ＋１２１３１ｔ１５＋６Ｌ、ｒ　Ｌ　Ｌ　Ｙ　ｒ　 Ｅ’ ｒＬＩ　ＦＬＬＹ ＤＤＤＱＤ ＲＱＫＫＫ）ｌ： Ｅ　ＱＱＲＲ １）ＤＲＩと同様 ２）ＤＲＩと同様 ３）位置３．４又は５に疎水性残基り、Ｆ、■、Ｙ、Ｍ、Ａ４）位置４．５．６ ．７．８又は９に極性の／帯電した残基５）位置１１．１２又は１３に疎水性残 基り、　Ｆ、　Ａ、　Ｙ第５０ａ表 −ＤＲモチーフ １２３４５６７８９Ｔｏｉ＋１２１３１４１５１６１７非常に強い　Ｐ ＥＥＬＱＬＬｖ　εｑＹＹ ＬＧＦＬＡｄＡＭ　ｒＩ’ Ｔ工ｔＫｑ　ＥＹ　Ｖ ＹＬＹＡＭ　ＧＶ　ｐ ＨＸＶＨｖ　ｈｐ 第５０ｂ表。

解釈 圧込」旦し±カニＺ １２３４５６７Ｂ９１０１１１２１３１４１５１６１７１６１９２１１８ＤＤ　 λＲＲＲＮＲ ＥＥＫＮＮＮ　ＤＥ ＮＮｎＱｑｄ　ＥＱ エ　エ 文献箇所 フラクションｎｏ。

手続ネ市正書（自発） 平成７年　５月１１日

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １． （ａ）ＭＨＣ分子を含有する細胞の細胞溶解により細胞抽出物を得、 （ｂ）ＭＨＣ分子を、その上に存在するペプチド混合物と共に、免疫沈降により 細胞抽出物から分離し、（ｃ）ペプチド混合物を、ＭＨＣ分子及びその他のタン パク質成分から分離し、 （ｄ）個々のペプチド又は／及びその混合物を配列決定し、かつ （ｅ）殊に混合物の配列決定又は一連の個々のペプチドの配列決定からの得られ た情報から、対立遺伝子特異性ペプチドモチーフを引き出す、 クラスＩ又はＩＩの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の分子上の対立遺伝子 特異性ペプチドモチーフの決定法において、 【配列があります】及び ＨＬＡ−ＤＲ５ からなる群から選択される分子上のペプチドモチーフを決定することを特徴とす る、ペプチドモチーフの決定法。
2. ２．免疫沈降のために、ＭＨＣ分子に特異な抗体を使用することを特徴とする、 請求項１記載の方法。
3. ３．固相に結合された抗体を使用することを特徴とする、請求項２記載の方法。
4. ４．ＭＨＣ分子及び他のタンパク質成分からのペプチド混合物の分離をクロマト グラフィーにより行なうことを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項 記載の方法。
5. ５．分離を逆相ＨＰＬＣにより行なうことを特徴とする、請求項４記載の方法。
6. ６．分離をトリフルオロ酢酸／Ｈ２Ｏ−トリフルオロ酢酸／アセトニトリルー勾 配で行なうことを特徴とする、請求項５記載の方法。
7. ７．請求項１から６までのいずれか１項記載の方法により得られるペプチドモチ ーフ。
8. ８．診断剤又は活療剤を製造するための方法における請求項７記載のペプチドモ チーフの使用。
9. ９．ＭＨＣ分子の診断証明のための請求項８記載の使用。
10. １０．ペプチドモチーフに相当するペプチドを、標識基、殊にビオチン基又は蛍 光基と結合させる、請求項９記載の使用。
11. １１．免疫系の障害又は腫瘍疾病の治療のための請求項９記載の使用。
12. １２．自己免疫疾患、移植拒絶反応又は／及び移植片対宿主反応の治療のための 請求項１１記載の使用。
13. １３．ペプチドモチーフに相当するペプチドを、Ｎ−又は／及びＣ−末端で親油 性もしくは両親媒性基、殊に更に親油性ペプチド−ヘリックスと共有結合するこ とを特徴とする、請求項８又は１２記載の使用。
14. １４．親油性もしくは両親媒性基はトリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイ ニル−セリルセリンであることを特赦とする、請求項１３記載の使用。