JP2003176300A - Ｍｈｃ−分子のペプチドモチーフ - Google Patents
Ｍｈｃ−分子のペプチドモチーフInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 Ｔ−細胞受容体、ペプチド及びＭＨＣ−分子
からなる３分子複合体の真中のその位置に基づいて、Ｔ
−細胞エピトープは、特異的免疫系の中心点であり、従
って、その発生の法則性の理解並びに決定法に対する多
くの必要性がある 【解決手段】 （ａ）ＭＨＣ−分子を含有する細胞の細
胞溶解により細胞抽出物を得、（ｂ）ＭＨＣ−分子を、
その上に存在するペプチド混合物と共に、免疫沈降によ
り細胞抽出物から分離し、（ｃ）ＭＨＣ−分子及び他の
タンパク質成分からのペプチド混合物を分離し、（ｄ）
個々のペプチド又は／及びその混合物を配列決定し、
（ｅ）得られた配列決定情報から対立遺伝子特異的ペプ
チドモチーフを導き出し、及び（ｆ）対立遺伝子特異的
ペプチドモチーフに従ってペプチドを合成する、ことよ
りなる方法により得られ、その際、前記のＭＨＣ−分子
は、Ｈ−２Ｋｄ、Ｈ−Ｋｂ、Ｈ−２Ｄｂ、Ｈ−２Ｋｋ、
Ｈ−２Ｋｍ′又はＨＬＡ＊０２０１又はＨＬＡ−Ａ＊０
２０５からなる群から選択されペプチドモチーフを含有
するペプチド。
からなる３分子複合体の真中のその位置に基づいて、Ｔ
−細胞エピトープは、特異的免疫系の中心点であり、従
って、その発生の法則性の理解並びに決定法に対する多
くの必要性がある 【解決手段】 （ａ）ＭＨＣ−分子を含有する細胞の細
胞溶解により細胞抽出物を得、（ｂ）ＭＨＣ−分子を、
その上に存在するペプチド混合物と共に、免疫沈降によ
り細胞抽出物から分離し、（ｃ）ＭＨＣ−分子及び他の
タンパク質成分からのペプチド混合物を分離し、（ｄ）
個々のペプチド又は／及びその混合物を配列決定し、
（ｅ）得られた配列決定情報から対立遺伝子特異的ペプ
チドモチーフを導き出し、及び（ｆ）対立遺伝子特異的
ペプチドモチーフに従ってペプチドを合成する、ことよ
りなる方法により得られ、その際、前記のＭＨＣ−分子
は、Ｈ−２Ｋｄ、Ｈ−Ｋｂ、Ｈ−２Ｄｂ、Ｈ−２Ｋｋ、
Ｈ−２Ｋｍ′又はＨＬＡ＊０２０１又はＨＬＡ−Ａ＊０
２０５からなる群から選択されペプチドモチーフを含有
するペプチド。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、主要組織適合遺伝
子複合体（ＭＨＣ）の分子のペプチドモチーフもしくは
−エピトープの決定法、並びに、これにより決定された
ペプチドモチーフ、及び診断薬又は治療薬を製造するた
めのその使用に関する。 【０００２】 【従来の技術】細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、Ｍ
ＨＣ−コードされた分子と結合した抗原ペプチドエピト
ープを認識する。この現象を、ＭＨＣ−拘束(MHC-Restr
iktion)という（文献；１〜５）。ヒトＭＨＣクラスＩ
−分子、ＨＬＡ−２Ａｗ６８の結晶学は、重鎖のα１−
及びα２−ドメインにより形成されるスリット(Spalt)
を生じた（文献；３、６）。このスリットは、抗原ペプ
チドエピトープに関する結合部位であると思われる。そ
れというのも、この双方の結晶は、ＭＨＣ−配列と適合
せずに、このスリットに接して存在している大きさのペ
プチドの構造を有するからである（文献；６）。 【０００３】これらのペプチドが細胞内タンパク質に由
来し、かつ細胞表面に存在しているので、細胞障害性Ｔ
リンパ球が、異常な特徴に関して細胞を試験することが
できると考えられている。Ｔ−細胞エピトープを表出す
る、予めＭＨＣ−会合された（assoziierte）ペプチド
を、普通の又はウイルス感染した細胞から抽出した（文
献；２、４、５、７、８）。相当する方法で、ＭＨＣク
ラスＩＩ拘束Ｔ細胞により認識される抗原も、合成ペプ
チドにより模倣され得（文献；９）、ＭＨＣ−会合され
た抗原ペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩ−分子から溶離し
た（文献；１０）。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】Ｔ−細胞受容体、ペプ
チド及びＭＨＣ−分子からなる３分子複合体（文献；１
１）の真中のその位置に基づいて、Ｔ−細胞エピトープ
は、特異的免疫系の中心点であり、かつ従って、その発
生の法則性の理解並びに決定法に対する多くの必要性が
ある（文献；１２〜１５）。 【０００５】 【課題を解決するための手段】本発明による課題は、
（ａ）ＭＨＣ−分子を含有する細胞の溶解により細胞抽
出物を得、（ｂ）ＭＨＣ−分子を、その上に存在するペ
プチド混合物と共に、免疫沈降により細胞抽出物から分
離し、（ｃ）ペプチド混合物を、ＭＨＣ−分子及びその
他のタンパク質成分から分離し、（ｄ）個々のペプチド
又は／及びその混合物を配列決定し、かつ（ｅ）得られ
た、殊に混合物の配列決定又は一連の個々のペプチドの
配列決定の情報から、対立遺伝子特異性ぺプチドモチー
フ(allelspezifische Peptidmotiv)を引き出すことを特
徴とする、クラスＩ又はＩＩの主要組織適合遺伝子複合
体（ＭＨＣ）の対立遺伝子特異性ペプチドモチーフを決
定する方法により解決される。 【０００６】本発明方法により、ＭＨＣ−分子がそれに
従ってペプチドを選択しかつ提示する法則性を有する、
ペプチドモチーフが決定される。 【０００７】本発明の方法は、クラスＩのＭＨＣ−分子
を用いても、クラスＩＩのＭＨＣ−分子を用いても実施
することができ、その際、クラスＩのＭＨＣ−分子が有
利である。Ｈ−２Ｋｄ−、Ｈ−Ｋｂ−、Ｈ−２Ｄｂ−、
Ｈ−２Ｋｋ、Ｈ−２Ｋｍ′又はＨＬＡ−Ａ＊０２０１又
はＡ＊０２０５−分子は、殊に有利である。 【０００８】本発明方法によるＭＨＣ−分子の免疫沈降
の際に、それぞれ、所望のＭＨＣ−分子に関して特異的
である適当な抗体を使用する。本発明の使用のために有
利なＭＨＣ−クラスＩ−分子は、分子Ａ１、Ａ２、Ａ
３、Ａ９、Ａ１０、Ａ１１、Ａ２８、Ａ２９、Ａｗ１
９、Ｂ５、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１２〜Ｂ１８、Ｂ２１、Ｂ３
５及びＢ３７を包含するが、これらに限定されない。本
発明による使用のために有利なＭＨＣ−クラスＩＩ−分
子は、分子ＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、
ＤＲｗ６、ＤＲ７、Ｄｗ１、Ｄｗ２及びＤｗ３を包含す
るが、これらに限定されない。Ｈ−２Ｋｄ−又はＨ−２
Ｄｂ−分子の決定のためには、例えば、Ｋｄ−特異性抗
体（文献；２５）又はＤｂ−特異性抗体（文献；２６）
を使用する。有利には、モノクローナル抗体を使用する
が、相当する精製したポリクローナル抗血清の使用も可
能である。本発明により使用することができる抗体は、
当業者によく知られた標準技術を用いて、新たに製造す
ることができる。本発明で使用することができる抗体の
例は、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection、
12301 Parklawn Drive,Rockville、MD20852)の「カタロ
グ・オブ・セル・ラインズ・ハイブリドーマス(Catalog
ue of Cell Lines and Hydridomas)」中に記載されてい
るＨＬＡ−抗原に対する全ての抗体を包含するが、これ
らに限定されない。 【０００９】有利な例（ＡＴＣＣ−命名法）は、ＨＢ８
２、１１７、１６６、５４、１２２、１６４、９５、１
２０、１１６、１１８、９４、１５２、１７８、５６、
１１５、１５７、１１９、５９、１０５、１６５、１４
４、１８０、１０３、１１０、１０９、１５１及び１０
４を包含する。カタログ中に記載されているマウス−Ｈ
−２−抗原に対する全ての抗体は、同様に、本発明で使
用することができる。固相結合した抗体による免疫沈降
は、殊に有利に行なわれる。固相結合した抗体は、当業
者に公知の方法で、例えば抗体と、ブロムシアン活性化
されたセファロース４Ｂ（ファルマシア(Pharmacia)Ｌ
ＫＢ）とを結合させることにより製造することができ
る。本発明で使用するための抗体に結合させることがで
きる他の固相の例は、アガロース、セルロース、セファ
デックス、プロテインＡ−セファロース及びプロテイン
−Ｇ−セファロースを包含するが、これらに限定されな
い。免疫沈降の有利な方法は、臭化シアン活性化された
セファロース４Ｂ（例１参照）から製造された小球に結
合している抗体を用いる、吸着クロマトグラフィーであ
る。 【００１０】ＭＨＣ−分子及びその他のタンパク質成分
からの、決定すべきペプチド混合物の分離は、クロマト
グラフィー法により、特に逆相−ＨＰＬＣにより行なう
のが有利である。その際、トリフルオロ酢酸／Ｈ２Ｏ−
トリフルオロ酢酸／アセトニトリル−勾配で分離を行な
うことは、有利であることが判明した。ＭＨＣ−分子か
らペプチド混合物を分離するための本発明により使用す
ることができる他の方法は、イオン交換、ゲル濾過、電
気焦点泳動、高性能毛管電気泳動（ＨＰＣＥ）及びゲル
電気泳動を包含するが、これらに限定されない。分離を
実施するためのもう１つの方法は、超遠心分離であり、
その際、３０００Ｄａ又は５０００Ｄａ又は１００００
Ｄａの透過性を有する膜を使用する。ＨＰＬＣを用いる
分離が、有利に実施される。 【００１１】ペプチド混合物のクロマトグラフィー分離
の際に、多くの場合に、単独のペプチド種を単離するこ
とができる。従って、本発明方法の工程（ｄ）は、ペプ
チド混合物の配列決定（これにより、それぞれのＭＨＣ
−分子のペプチドモチーフに関する共通配列が決定され
る）又は／及び明確なペプチドの配列決定よりなる。 【００１２】ペプチドモチーフの決定に関する出発物質
として、正常細胞、腫瘍細胞も、ウイルス又はこのよう
な病原体により感染した細胞も、並びに試験管内で培養
したヒト又は動物の細胞も使用することができる。本発
明で使用することができる正常細胞は、新しい細胞、例
えば抹消血液リンパ球、脾臓、肺、胸腺の細胞又はＭＨ
Ｃ−分子を表現する他の組織の細胞を包含するが、これ
らに限定されるものではない。本発明で使用した腫瘍細
胞系には、腫瘍細胞ＥＬ４及びＰ８１５を包含するが、
同様に、これらに限定されるものではない。本発明によ
り使用することができるウイルス感染した細胞は、これ
らに限定されるものではないが、エプスタイン−バール
−ウイルス(Epstein-Barr-Virus)により形質転換された
ヒトＢ−細胞であるＪＹ−細胞を包含する。本発明方法
により決定されたペプチドモチーフは、次の基本原理に
相当する：ａ）これらは、ＭＨＣ−クラスＩ−分子の場
合には、アミノ酸８、９、１０又は１１個、並びにＭＨ
Ｃ−クラスＩＩ−分子の場合には、アミノ酸８〜１５個
の対立遺伝子特異性ペプチドの長さを有する。 【００１３】ｂ）これらは、２個のアンカー位置(Anker
position)（「アンカー位置」なる名称は、位置が単独
のアミノ酸残基の強いシグナルを示すか、又は位置が非
常によく類似した側鎖を有する僅かなアミノ酸残基で占
められる場合に使用する）を有し、そのうち、１個のア
ンカー位置は、常にＣ−末端に存在し、かつしばしば脂
肪性であり、かつｃ）ペプチドは、もちろん、正常の、
ウイルス感染した、他の方法で感染した、又は遺伝子を
用いて形質転換したか、又は抗原を負荷した細胞のＭＨ
Ｃ−分子上に提示される。 【００１４】ＭＨＣ−クラスＩ−分子Ｈ２Ｋｄ、Ｈ２Ｋ
ｂ、Ｈ２Ｄｂ及びＨＬＡ−Ａ２からの自己ペプチド混合
物の配列決定は、クラスＩ−分子のそれぞれにより提示
される、それぞれ異なる対立遺伝子特異性ペプチドモチ
ーフを示す。Ｋｄ、Ｄｂ及びＡ２により提示されたペプ
チドは、９量体である一方、Ｋｂ−提示ペプチドは８量
体であり、その際、相当するペプチドモチーフは、固有
のアミノ酸残基又はよく類似した側鎖を有する僅かな数
のアミノ酸残基で占められている、２個のアンカー位置
を含有する。これらのアンカー位置は、異なるモチーフ
の場合には、同じ位置に存在せず、これらは、例えば位
置５及び９（Ｄｂ）又は位置２及び８（Ｋｄ、Ａ２）又
は位置５及び８（Ｋｂ）に存在しうる。全てのモチーフ
のＣ−末端アンカー基は、疎水性アミノ酸である。アン
カー位置に存在しないアミノ酸残基は、かなり可変性で
あってよいが、いくつかは特に特定のアミノ酸で占めら
れ、例えば、Ｋｄ−モチーフの位置４にＰｒｏ、Ｋｂ−
モチーフの位置３にＴｙｒが見られ、かつ疎水性基は、
Ｄｂ−モチーフの位置３及びＡ２モチーフの位置６で優
勢である。Ｈ−２Ｌｄのためには、アンカー基は、位置
２のプロリンであった。 【００１５】本発明方法により得られた結果は、ＭＨＣ
−クラスＩ−分子で結晶学的に見られたスリットの構造
に非常に良好に相当する（文献；３、６）。異なるＭＨ
Ｃ−クラスＩ−対立遺伝子は、このスリットのところ
の、異なるポケット(Taschen)の存在により異なってい
る。このことは、おそらく、ポケットが、それぞれ異な
るアミノ酸を収容しうることに起因する。従って、ＭＨ
Ｃ−結晶中の対立遺伝子特異性ポケットと対立遺伝子特
異性アンカー基の側鎖とは、おそらく相補的構造を示
す。 【００１６】本発明のもう１つの課題は、診断薬又は治
療薬の製法における、本発明によるペプチドモチーフの
使用である。このペプチドモチーフの可能な使用範囲
は、ＭＨＣ−分子の診断学的証明である。ＭＨＣ−分子
は、ペプチドのその個々の特異な結合により特徴付けら
れるので、標識基のペプチドを介しての結合証明を行な
うことができ、その際、標識基として、例えばビオチン
基又は蛍光基をペプチドと結合させる。当業者に公知の
他の標識は、同様に、本発明で使用することができる。
この標識は、これらに限定されるものではないが、例え
ばペプチドのチロシン基に結合した１３１Ｉ又は１２５
Ｉ、又は３Ｈ又は１４Ｃ（双方は、合成の間にペプチド
中に取り込まれる）のような放射性標識を包含する。標
識のペプチドへの結合は、当業者に公知の方法により達
成することができる。標識は、非−アンカー位置で行な
うのが有利である。このような方法で分かった、自己免
疫疾患の発生と、疾病特異性ペプチドモチーフを有する
ＭＨＣ−分子の表現との間の相関関係を、診断学的に使
用することができる。本発明のペプチド配列の試験管内
での診断学的使用の例は、これらに限定されないが、次
のものを包含する；ＭＨＣ−分子の結合特異性の測定、
ＭＨＣ−分子の結合特異性と疾病との相関関係付け、及
び興味深いＭＨＣ−分子をペプチド−バンク（試験した
モチーフに合うペプチドの混合物）のＨＰＬＣ−フラク
ションで表現する、適当な細胞のインキュベーションに
よる未知の起源のＴ−細胞エピトープの配列の決定、及
び天然のＴ−細胞エピトープとＴ−細胞エピトープとし
て認識された合成ペプチドとのクロマトグラフィー比較
により行なわれる、Ｔ−細胞により認識されたペプチド
の決定(Nature 348:252〜254(1990))。 【００１７】本発明のもう１つの課題は、免疫系の障害
又は腫瘍疾病を治療するための医薬の製法における本発
明によるペプチドモチーフの使用である。殊に、本発明
のペプチドモチーフは、自己免疫疾患における干渉（予
防及び治療）のために、例えば一定のＭＨＣ−分子の遮
断並びにＴ−細胞のペプチド特異的非−反応性の誘導に
より使用することができる。更に、移植拒絶反応及び移
植片対宿主反応(Graft-versus-Host-Reaktionen)におけ
る干渉が、同様の方法で可能である。更に、本発明によ
るペプチドは、腫瘍細胞に対するＴ−細胞の誘導又は強
化もしくは増強のために、殊に腫瘍疾病に対するワクチ
ン化及び存在する腫瘍疾病の治療のために、試験管内及
び生体内で使用することができ、その際、殊に、いわゆ
る移植片対白血病作用(Graft-versus-Leukaemia-Effek
t)(Sullivan等,N.Engl.J.Med.320:828〜834)を利用する
ことができる。本発明によるペプチドは、同様に、感染
方法(infektioese Mittel)又は腫瘍に関して特異的であ
るＭＨＣ−結合ペプチドを生体内で使用することによ
り、感染性又は悪性疾病に対するＴ−細胞応答を強化す
るために使用することができる。二者選択的に、Ｔ−細
胞は、動物から得ることができ、その数を、試験管内
で、ペプチドの使用及びサイトカイン、例えばインター
ロイキン２、インターロイキン４又はインターロイキン
６を包含する適当な成長条件の使用により増加させ、か
つ引き続き、患者に戻すことができる。本発明によるペ
プチドは、更に、Ｔ−細胞により攻撃可能な抗原を発現
する、次のものを包含するがこれらに限定されない全て
の腫瘍；黒色腫、乳癌、ウイルス起源の腫瘍、例えばバ
ーキットリンパ腫(Burkittslymphom)、及びヒト乳頭腫
ウイルスによるような腫瘍、例えば頸部ガン腫及び他の
生殖器(anogenitale)腫瘍を治療するために使用するこ
とができる。Ｔ−細胞受容体−分子又は抗体分子に起因
するペプチドは、更に、免疫調節的機構の、目的とする
処置のために、殊に、自己免疫疾病及び移植拒絶反応並
びに移植片対宿主反応の治療のために使用することがで
きる。予防のための、本発明によるタンパク質の生体内
使用において、その使用は、これらに限定されるもので
はないが、次のものを包含する；感染性又は悪性疾病に
対するペプチドワクチンとして、及び組換え接種物質
（ウイルス、例えばワクシニア菌又はバクテリア、例え
ばサルモネラ又はマイコバクテリアを含む）及び組換え
バクテリア（例えばＥ．コリ）又は他の細胞（酵母−、
昆虫−、マウス−又はヒト細胞を含む）の使用により製
造されたタンパク質を含む他の全ての種類の接種物質中
への本発明によるタンパク質の導入のための適当なＴ−
細胞エピトープに関する本発明で集められた情報の使
用。 【００１８】本発明のペプチドの用量又は濃度は、当業
者により常法で決めることができる。これらは、生体内
で、１０μｇ〜１ｇの範囲で予想することができる。試
験管内濃度は、１フェムトモル〜１マイクロモルの範囲
で予想することができる。生体内投与は、これらに限定
されないが、皮下、筋内、静脈内、腸管内及び経口法を
包含する。 【００１９】治療的使用において、本発明によるペプチ
ドモチーフに相当し、Ｎ−又は／及びＣ−末端で親油性
もしくは両親媒性基、殊に親油性ペプチド−ヘリックス
と共有結合するペプチドが有利である。このような基の
例は、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニル
−セリルセリンである。 【００２０】本発明を、次の例により、図１と結び付け
て、明らかにする。 【００２１】次のものを示す；図１ａは、Ｐ８１５ライ
ゼート(Lyssat)からの抗−Ｋｄ−抗体を用いて分離した
物質のＨＰＬＣ−特徴、図１ｂは、１ａからのクロマト
グラムの１部拡大部分（フラクション１５〜３５）、図
１ｃは、１ｂ中の矢印を付した部分の自己ペプチドの再
クロマトグラフィー。 【００２２】例１ Ｐ８１５−腫瘍細胞（Ｈ−２Ｋｄ）１０〜２０×１０９
をペレット化し、かつ０．５％ノニデット(Nonidet)Ｐ
４０ ２５０ｍｌと共に、フェニルメチルスルホニルフ
ルオリド（ＰＭＳＦ）０．１ミリモル／ｌを有するリン
酸塩緩衝された塩溶液（ＰＢＳ）中で、３０分間、４℃
で撹拌した。上澄を、２５０ｇで５分間及び１５０００
０ｇ及び４℃で３０分間で遠心分離し、次いで、吸着ク
ロマトグラフィー装置に導いた。この吸着クロマトグラ
フィー装置は、それぞれ約１ｍｌの層容量を有するカラ
ム３個からなった。カラム物質は、製造元の記録により
ブロムシアン−活性化されたセファロース４Ｂ(Pharmac
ia LKB)から製造された、抗体−結合したもしくはグリ
シン−結合した小粒からなった。抗体としては、Ｋｄ−
特異性抗体２０−８−４Ｓ(IgG 2a、kappa;25)又はＤｂ
−特異性抗体Ｂ２２−２４９それぞれ５ｍｇを小球１ｍ
ｌに結合させた。細胞抽出物の上澄を、先ず、グリシン
−結合した小球を有するカラムに、次いで、抗−Ｋｄ−
小球を有するカラムに、かつ次いで、偽沈降(Scheinpra
ezipitation)のために抗−Ｄｂ−小球上に導いた。 【００２３】小球を、全ての３個のカラムから除去し、
かつ０．１％トリフルオロ酢酸と共に１５分間渦動させ
た（文献；７）。上澄を真空遠心分離により乾燥させ、
かつ逆相ＨＰＬＣにより、スーパーパック(Superpac)Pe
p S カラム（Ｃ２／Ｃ１８；５μｍ粒子、４．０×２５
０ｍｍ、ファルマシア(Pharmacia) ＬＫＢ）及びファ
ルマシアＬＫＢ−装置の使用下で分離した（文献；
４）。溶離剤：溶液Ａ Ｈ２Ｏ中の０．１％トリフルオ
ロ酢酸（ｖ／ｖ）、溶液Ｂ アセトニトリル中の０．１
％トリフルオロ酢酸。 【００２４】図１ａ及びｂ中に示したクロマトグラフィ
ー分離のために、次の勾配を使用した： ０〜５分、Ａ１００％ ５〜４０分、Ｂ６０％まで直線的に増大 ４０〜４５分、Ｂ６０％ ４５〜５０分、Ｂ０％まで減少 流速：１ｍｌ／分、フラクション量：１ｍｌ。 【００２５】個々のフラクションを集め、かつ真空遠心
分離により乾燥させた。 【００２６】図１は、免疫沈降され、かつトリフルオロ
酢酸処理されたＫｄ−分子のＨＰＬＣ−分離を示す。図
１ａは、抗−Ｋｄ（実線）もしくは抗−Ｄｂ（点線）を
用いてＰ８１５−ライゼートから沈降させた、ＴＦＡ処
理した物質のＨＰＬＣ−特徴を示す。フラクション２０
〜２８の間で、目標対立遺伝子特異性ペプチド混合物で
ある不均一物質が、僅かな量溶離する。 【００２７】フラクション２０〜２８は、Ｋｄ−バッチ
(Ansatz)からも、偽沈降によっても集められた。双方の
バッチを、エドマン分解法の使用下で自動的に配列決定
した（Edmann等、Eur.J.Biochem.1:80〜91(1967)）。こ
のエドマン分解を、オンラインＰＴＨ−アミノ酸分析機
１２０Ａ(Applied Biosystems,Foster City,CA,94404,U
SA）を備えたタンパク質シークエンサー４７７Ａ中で実
施した。ガラス繊維フィルターを、バイオプレーン・プ
ラス(BioPrene Plus)１ｍｇで被覆し、かつ前循環(prae
zyklisiert)させなかった。この配列決定を、標準プロ
グラム ＢＥＧＩＮ−１及びＮＯＲＭＡＬ−１(Applied
Biosystems)の使用下に実施した。システインは修飾さ
れず、かつ従って確認されなかった。 【００２８】エドマン法は、それぞれクロマトグラフィ
ーにより同定されるＮ−末端の逐次誘導体化及びアミノ
酸除去を包含する。ペプチドの錯体混合物を配列決定す
ることは異例であるので、配列決定装置から直接得られ
たデータを提示する。第１ａ表及びｂは、Ｋｄ−溶離し
たペプチドに関する、２種の配列決定試験からの結果を
示す。第１ｃ表は、Ｐ８１５−ライゼートのＤｂ−特異
性抗体での偽溶離の配列決定結果を示す。Ｋｄ−溶離し
たペプチドは、１〜９の各位置に明らかなアミノ酸形を
１個有し、偽溶離した物質は、それぞれの基の吸収量を
減少しながら、それぞれのサイクルにおいて、例外な
く、同じ形のアミノ酸形を示している。Ｋｄ−溶離した
ペプチドにおいては、前又は前の前のサイクルと比較し
て５０％より多いピークが絶対量で示され、重要とみな
され、かつ下線を引いた。最初の位置は、評価すること
が困難である。それというのも、前のサイクルが存在せ
ず、かつ更に、ＨＰＬＣ−プール(Pool)中に存在する、
全ての遊離アミノ酸がこの位置で確認されるからであ
る。第２の位置に関して、以前のサイクルと比較してそ
の頻度が明らかに高い固有の基は、チロシン（例えば第
１ａ表で６０．９ｐｍｏｌから８７５．６ｐｍｏｌに）
である。（僅かな）ピークを示す他の固有の基は、Ｔｙ
ｒに類似した側鎖を有するフェニルアラニンである。こ
のことは、天然のＫｄ−拘束インフルエンザ−エピトー
プ（ＴＹＱＲＴＲＡＬＶの配列を有する）と他のＫｄ−
拘束ペプチドとの比較から、位置２のチロシン基を考慮
した場合に得られる仮定を裏付けする。これに反して、
続く位置３〜８に関して特徴的である、定義されたアミ
ノ酸基は存在しない。個々の位置において、１４個まで
の種々異なる基が見つけられる。位置９には、Ｉｌｅ及
びＬｅｕが見つけられる。位置１０にシグナルピークは
なく、このことは、多くのＫｄ−結合した自己ペプチド
が９個より長い基でないことを示唆している。従って、
天然のＫｄ−拘束インフルエンザ−ペプチドは、ノナペ
プチド(Nonapeptid)（文献；４）である。この結果か
ら、由来する共通配列形を、第１ｃ表中に示す。大抵、
目に付くのは、位置２のＴｙｒ、及び位置９のＩｌｅ又
はＬｅｕであり、他の全ての位置には、より多数の基が
見られる。このモチーフと、Ｋｄ−拘束エピトープを含
有するペプチド配列との比較は、そのほとんどがＫｄ−
拘束共通モノマーモチーフに良好に合致することを示す
（第１ｄ表）。 【００２９】図１ｂのフラクション２９中で矢印を付し
たピーク及び偽沈降の相当するフラクションを、高い溶
解性下に新たにクロマトグラフィーにかけたが、その
際、フラクション容量は０．５ｍｌであった（図１
ｃ）。急な特異的なピークは、直接配列決定により決定
されたアミノ酸配列ＳＹＦＰＥＩＴＨＩを有するペプチ
ドであった。合成ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ−ペプチドとの天
然細胞ペプチドの同一性は、共溶離(Coelution)により
ＨＰＬＣで証明された（図１ｃ）。この配列は、フラク
ション２０〜２８のプールからの共通モチーフに合致し
（図１ａ、ｂ）、このことにより、特異なＫｄ−拘束ペ
プチドモチーフ（第１ｄ表）の存在が証明される。 【００３０】 【表１】【００３１】 【表２】【００３２】＊Ｋｄ−拘束Ｔ−細胞エピトープを含有す
ることで知られているペプチドを、そのＴｙｒ−基によ
り合致させた。自然にプロセシングされることが知られ
ているペプチドには下線を引いた。 【００３３】例２ Ｋｂ−及びＤｂ−分子からのペプチドの溶離 ＥＬ４−腫瘍細胞（Ｈ−２ｂ）からのデタージェント−
ライゼート(Detergenz-Lysate)を、例えば例１で記載し
たようなＫｂ−特異性及びＤｂ−特異性抗体を用いて免
疫沈降させた。Ｄｂ−抗体としてはＢ２２−２４９（例
１参照）を、及びＫｂ−抗体としてはＫ９−１７８（Ｉ
ｇＧ ２ａ、Ｋ、２７）を使用した。ＭＨＣ−分子から
解離したペプチドを、逆相ＨＰＬＣにより分離した。Ｋ
ｂ−もＤｂ−物質も、例１からのＫｄ−物質にいくらか
相当する特徴を有して溶離され、その際、しかしなが
ら、フラクション２０〜２８の間で溶離された不均一物
質は明らかな相違を生じた。 【００３４】Ｄｂ−拘束ペプチドモチーフ Ｄｂ−バッチからの集めたフラクション２０〜２８を配
列決定した（第２ａ、ｂ表）。位置２〜４は、多くの基
を含有した。これに反して、サイクル５は、Ａｓｎに関
する強いシグナルを示した。従って、Ｄｂ−溶離された
自己ペプチドの位置５の優勢基は、Ａｓｎである。Ａｓ
ｐに関する弱いシグナルは、配列決定条件下でＡｓｎが
Ａｓｐへ加水分解することに起因する。位置６〜８は、
異なる証明可能な基５〜１４個を含有した。位置９は、
Ｍｅｔに関する強いシグナルを有し、Ｉｌｅに関する中
間のシグナル及びＬｅｕに関する弱いシグナルを有した
（全て疎水性）。（Ｄｂ−拘束エピトープ中のＭｅｔ又
はＩｌｅの条件は、既に記載されている。１７参照）。
位置１０にはシグナルがなく、このことは、Ｄｂ−提示
された自己ペプチドがノナペプチドであることを示唆し
ている。この結果により決定された共通モチーフを第２
ｃ表中に示す。このモチーフと、天然のＤｂ−拘束ペプ
チド及びＤｂ−拘束エピトープを含有する他のペプチド
との比較は、位置５のＡｓｎが、Ｄｂ−拘束ペプチドモ
チーフの不変のアンカー基でありうることを示す。Ｄｂ
−拘束エピトープの他の基は、第２のアンカー位置のよ
うに見える（Ｍｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕを有する）位置
９以外、著しく異なっている。 【００３５】 【表３】【００３６】 【表４】【００３７】Ｋｂ−拘束ペプチドモチーフ Ｋｂ−バッチからの集めたフラクション２０〜２８を配
列決定した（第３ａ、ｂ表）。位置３は、Ｔｙｒに関す
る強いシグナル及びＰｒｏに関する弱いシグナルを有す
る。位置４は、５個の基に関する弱いシグナルを示し
た。Ｐｈｅ及びＴｙｒに関する強いシグナルが、これら
の双方の基を位置５で優勢にする。次の双方の位置は、
５個もしくは３個のシグナルを含有する。位置８はＬｕ
ｅに関する強いシグナル、Ｍｅｔに関する中間のシグナ
ル及びＩｌｅ及びＶａｌに関する弱いシグナルを示し
た。位置９は、何かの基に関するピークは示さず、この
ことは、８量体である（文献；５）公知のＫｂ−拘束天
然のペプチドの長さと合致する。Ｋｂ−拘束共通モチー
フの分析及びエピトープとの比較は、２個のアンカー位
置を示す：位置５のＴｙｒ又はＰｈｅ（双方とも類似の
芳香族側鎖を有する）及び位置８のＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｉ
ｌｅ又はＶａｌ（全て同様の疎水性側鎖を有する）。 【００３８】 【表５】【００３９】 【表６】【００４０】例３ ＨＬＡ−Ａ２．１−拘束ペプチドモチーフ ＨＬＡ−Ａ２．１−ＭＨＣ−分子（文献；４５）を有す
るヒトＪＹ−細胞のデタージェント−ライゼートを、Ａ
２−特異性抗体（ＢＢ７．２、ＩｇＧ２ｂ、文献箇所２
８）を用いて免疫沈降させた。Ａ２−分子から解離され
たペプチドを、ＨＰＬＣにより分離した。フラクション
２０〜２８を集め、かつ前記のように配列決定した（第
４表）。第２の位置は、Ｌｅｕに関する強いシグナル及
びＭｅｔに関する中間のシグナルを有した。位置３〜５
には、それぞれ６〜８個の基が見られた。位置６は、Ｖ
ａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｈｒを有した。引き続く２
個の位置は、それぞれ３個のシグナルを示した。位置９
は、強いＶａｌ−及び弱いＬｅｕ−シグナルを示した。
位置１０は、１個の基のピークも示さず、このことは、
Ａ２−拘束エピトープがノナペプチドであることを示唆
している。位置２のＬｅｕ又はＭｅｔ及び位置９のＶａ
ｌ又はＬｅｕは、アンカー基であるように見える。Ａ２
−拘束エピトープを有する公知のペプチドのいくつか
が、モチーフと合致しうる一方、これは、他のものにお
いては部分的に可能であるに過ぎない（第４ｃ表）。Ａ
２−分子の多くの変法の現存は、いくつかのペプチドと
モチーフとのこの劣悪な合致の原因である。 【００４１】 【表７】【００４２】 【表８】【００４３】 【表９】【００４４】 【表１０】 【００４５】 【外８】【００４６】 【外９】
子複合体（ＭＨＣ）の分子のペプチドモチーフもしくは
−エピトープの決定法、並びに、これにより決定された
ペプチドモチーフ、及び診断薬又は治療薬を製造するた
めのその使用に関する。 【０００２】 【従来の技術】細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、Ｍ
ＨＣ−コードされた分子と結合した抗原ペプチドエピト
ープを認識する。この現象を、ＭＨＣ−拘束(MHC-Restr
iktion)という（文献；１〜５）。ヒトＭＨＣクラスＩ
−分子、ＨＬＡ−２Ａｗ６８の結晶学は、重鎖のα１−
及びα２−ドメインにより形成されるスリット(Spalt)
を生じた（文献；３、６）。このスリットは、抗原ペプ
チドエピトープに関する結合部位であると思われる。そ
れというのも、この双方の結晶は、ＭＨＣ−配列と適合
せずに、このスリットに接して存在している大きさのペ
プチドの構造を有するからである（文献；６）。 【０００３】これらのペプチドが細胞内タンパク質に由
来し、かつ細胞表面に存在しているので、細胞障害性Ｔ
リンパ球が、異常な特徴に関して細胞を試験することが
できると考えられている。Ｔ−細胞エピトープを表出す
る、予めＭＨＣ−会合された（assoziierte）ペプチド
を、普通の又はウイルス感染した細胞から抽出した（文
献；２、４、５、７、８）。相当する方法で、ＭＨＣク
ラスＩＩ拘束Ｔ細胞により認識される抗原も、合成ペプ
チドにより模倣され得（文献；９）、ＭＨＣ−会合され
た抗原ペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩ−分子から溶離し
た（文献；１０）。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】Ｔ−細胞受容体、ペプ
チド及びＭＨＣ−分子からなる３分子複合体（文献；１
１）の真中のその位置に基づいて、Ｔ−細胞エピトープ
は、特異的免疫系の中心点であり、かつ従って、その発
生の法則性の理解並びに決定法に対する多くの必要性が
ある（文献；１２〜１５）。 【０００５】 【課題を解決するための手段】本発明による課題は、
（ａ）ＭＨＣ−分子を含有する細胞の溶解により細胞抽
出物を得、（ｂ）ＭＨＣ−分子を、その上に存在するペ
プチド混合物と共に、免疫沈降により細胞抽出物から分
離し、（ｃ）ペプチド混合物を、ＭＨＣ−分子及びその
他のタンパク質成分から分離し、（ｄ）個々のペプチド
又は／及びその混合物を配列決定し、かつ（ｅ）得られ
た、殊に混合物の配列決定又は一連の個々のペプチドの
配列決定の情報から、対立遺伝子特異性ぺプチドモチー
フ(allelspezifische Peptidmotiv)を引き出すことを特
徴とする、クラスＩ又はＩＩの主要組織適合遺伝子複合
体（ＭＨＣ）の対立遺伝子特異性ペプチドモチーフを決
定する方法により解決される。 【０００６】本発明方法により、ＭＨＣ−分子がそれに
従ってペプチドを選択しかつ提示する法則性を有する、
ペプチドモチーフが決定される。 【０００７】本発明の方法は、クラスＩのＭＨＣ−分子
を用いても、クラスＩＩのＭＨＣ−分子を用いても実施
することができ、その際、クラスＩのＭＨＣ−分子が有
利である。Ｈ−２Ｋｄ−、Ｈ−Ｋｂ−、Ｈ−２Ｄｂ−、
Ｈ−２Ｋｋ、Ｈ−２Ｋｍ′又はＨＬＡ−Ａ＊０２０１又
はＡ＊０２０５−分子は、殊に有利である。 【０００８】本発明方法によるＭＨＣ−分子の免疫沈降
の際に、それぞれ、所望のＭＨＣ−分子に関して特異的
である適当な抗体を使用する。本発明の使用のために有
利なＭＨＣ−クラスＩ−分子は、分子Ａ１、Ａ２、Ａ
３、Ａ９、Ａ１０、Ａ１１、Ａ２８、Ａ２９、Ａｗ１
９、Ｂ５、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１２〜Ｂ１８、Ｂ２１、Ｂ３
５及びＢ３７を包含するが、これらに限定されない。本
発明による使用のために有利なＭＨＣ−クラスＩＩ−分
子は、分子ＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、
ＤＲｗ６、ＤＲ７、Ｄｗ１、Ｄｗ２及びＤｗ３を包含す
るが、これらに限定されない。Ｈ−２Ｋｄ−又はＨ−２
Ｄｂ−分子の決定のためには、例えば、Ｋｄ−特異性抗
体（文献；２５）又はＤｂ−特異性抗体（文献；２６）
を使用する。有利には、モノクローナル抗体を使用する
が、相当する精製したポリクローナル抗血清の使用も可
能である。本発明により使用することができる抗体は、
当業者によく知られた標準技術を用いて、新たに製造す
ることができる。本発明で使用することができる抗体の
例は、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection、
12301 Parklawn Drive,Rockville、MD20852)の「カタロ
グ・オブ・セル・ラインズ・ハイブリドーマス(Catalog
ue of Cell Lines and Hydridomas)」中に記載されてい
るＨＬＡ−抗原に対する全ての抗体を包含するが、これ
らに限定されない。 【０００９】有利な例（ＡＴＣＣ−命名法）は、ＨＢ８
２、１１７、１６６、５４、１２２、１６４、９５、１
２０、１１６、１１８、９４、１５２、１７８、５６、
１１５、１５７、１１９、５９、１０５、１６５、１４
４、１８０、１０３、１１０、１０９、１５１及び１０
４を包含する。カタログ中に記載されているマウス−Ｈ
−２−抗原に対する全ての抗体は、同様に、本発明で使
用することができる。固相結合した抗体による免疫沈降
は、殊に有利に行なわれる。固相結合した抗体は、当業
者に公知の方法で、例えば抗体と、ブロムシアン活性化
されたセファロース４Ｂ（ファルマシア(Pharmacia)Ｌ
ＫＢ）とを結合させることにより製造することができ
る。本発明で使用するための抗体に結合させることがで
きる他の固相の例は、アガロース、セルロース、セファ
デックス、プロテインＡ−セファロース及びプロテイン
−Ｇ−セファロースを包含するが、これらに限定されな
い。免疫沈降の有利な方法は、臭化シアン活性化された
セファロース４Ｂ（例１参照）から製造された小球に結
合している抗体を用いる、吸着クロマトグラフィーであ
る。 【００１０】ＭＨＣ−分子及びその他のタンパク質成分
からの、決定すべきペプチド混合物の分離は、クロマト
グラフィー法により、特に逆相−ＨＰＬＣにより行なう
のが有利である。その際、トリフルオロ酢酸／Ｈ２Ｏ−
トリフルオロ酢酸／アセトニトリル−勾配で分離を行な
うことは、有利であることが判明した。ＭＨＣ−分子か
らペプチド混合物を分離するための本発明により使用す
ることができる他の方法は、イオン交換、ゲル濾過、電
気焦点泳動、高性能毛管電気泳動（ＨＰＣＥ）及びゲル
電気泳動を包含するが、これらに限定されない。分離を
実施するためのもう１つの方法は、超遠心分離であり、
その際、３０００Ｄａ又は５０００Ｄａ又は１００００
Ｄａの透過性を有する膜を使用する。ＨＰＬＣを用いる
分離が、有利に実施される。 【００１１】ペプチド混合物のクロマトグラフィー分離
の際に、多くの場合に、単独のペプチド種を単離するこ
とができる。従って、本発明方法の工程（ｄ）は、ペプ
チド混合物の配列決定（これにより、それぞれのＭＨＣ
−分子のペプチドモチーフに関する共通配列が決定され
る）又は／及び明確なペプチドの配列決定よりなる。 【００１２】ペプチドモチーフの決定に関する出発物質
として、正常細胞、腫瘍細胞も、ウイルス又はこのよう
な病原体により感染した細胞も、並びに試験管内で培養
したヒト又は動物の細胞も使用することができる。本発
明で使用することができる正常細胞は、新しい細胞、例
えば抹消血液リンパ球、脾臓、肺、胸腺の細胞又はＭＨ
Ｃ−分子を表現する他の組織の細胞を包含するが、これ
らに限定されるものではない。本発明で使用した腫瘍細
胞系には、腫瘍細胞ＥＬ４及びＰ８１５を包含するが、
同様に、これらに限定されるものではない。本発明によ
り使用することができるウイルス感染した細胞は、これ
らに限定されるものではないが、エプスタイン−バール
−ウイルス(Epstein-Barr-Virus)により形質転換された
ヒトＢ−細胞であるＪＹ−細胞を包含する。本発明方法
により決定されたペプチドモチーフは、次の基本原理に
相当する：ａ）これらは、ＭＨＣ−クラスＩ−分子の場
合には、アミノ酸８、９、１０又は１１個、並びにＭＨ
Ｃ−クラスＩＩ−分子の場合には、アミノ酸８〜１５個
の対立遺伝子特異性ペプチドの長さを有する。 【００１３】ｂ）これらは、２個のアンカー位置(Anker
position)（「アンカー位置」なる名称は、位置が単独
のアミノ酸残基の強いシグナルを示すか、又は位置が非
常によく類似した側鎖を有する僅かなアミノ酸残基で占
められる場合に使用する）を有し、そのうち、１個のア
ンカー位置は、常にＣ−末端に存在し、かつしばしば脂
肪性であり、かつｃ）ペプチドは、もちろん、正常の、
ウイルス感染した、他の方法で感染した、又は遺伝子を
用いて形質転換したか、又は抗原を負荷した細胞のＭＨ
Ｃ−分子上に提示される。 【００１４】ＭＨＣ−クラスＩ−分子Ｈ２Ｋｄ、Ｈ２Ｋ
ｂ、Ｈ２Ｄｂ及びＨＬＡ−Ａ２からの自己ペプチド混合
物の配列決定は、クラスＩ−分子のそれぞれにより提示
される、それぞれ異なる対立遺伝子特異性ペプチドモチ
ーフを示す。Ｋｄ、Ｄｂ及びＡ２により提示されたペプ
チドは、９量体である一方、Ｋｂ−提示ペプチドは８量
体であり、その際、相当するペプチドモチーフは、固有
のアミノ酸残基又はよく類似した側鎖を有する僅かな数
のアミノ酸残基で占められている、２個のアンカー位置
を含有する。これらのアンカー位置は、異なるモチーフ
の場合には、同じ位置に存在せず、これらは、例えば位
置５及び９（Ｄｂ）又は位置２及び８（Ｋｄ、Ａ２）又
は位置５及び８（Ｋｂ）に存在しうる。全てのモチーフ
のＣ−末端アンカー基は、疎水性アミノ酸である。アン
カー位置に存在しないアミノ酸残基は、かなり可変性で
あってよいが、いくつかは特に特定のアミノ酸で占めら
れ、例えば、Ｋｄ−モチーフの位置４にＰｒｏ、Ｋｂ−
モチーフの位置３にＴｙｒが見られ、かつ疎水性基は、
Ｄｂ−モチーフの位置３及びＡ２モチーフの位置６で優
勢である。Ｈ−２Ｌｄのためには、アンカー基は、位置
２のプロリンであった。 【００１５】本発明方法により得られた結果は、ＭＨＣ
−クラスＩ−分子で結晶学的に見られたスリットの構造
に非常に良好に相当する（文献；３、６）。異なるＭＨ
Ｃ−クラスＩ−対立遺伝子は、このスリットのところ
の、異なるポケット(Taschen)の存在により異なってい
る。このことは、おそらく、ポケットが、それぞれ異な
るアミノ酸を収容しうることに起因する。従って、ＭＨ
Ｃ−結晶中の対立遺伝子特異性ポケットと対立遺伝子特
異性アンカー基の側鎖とは、おそらく相補的構造を示
す。 【００１６】本発明のもう１つの課題は、診断薬又は治
療薬の製法における、本発明によるペプチドモチーフの
使用である。このペプチドモチーフの可能な使用範囲
は、ＭＨＣ−分子の診断学的証明である。ＭＨＣ−分子
は、ペプチドのその個々の特異な結合により特徴付けら
れるので、標識基のペプチドを介しての結合証明を行な
うことができ、その際、標識基として、例えばビオチン
基又は蛍光基をペプチドと結合させる。当業者に公知の
他の標識は、同様に、本発明で使用することができる。
この標識は、これらに限定されるものではないが、例え
ばペプチドのチロシン基に結合した１３１Ｉ又は１２５
Ｉ、又は３Ｈ又は１４Ｃ（双方は、合成の間にペプチド
中に取り込まれる）のような放射性標識を包含する。標
識のペプチドへの結合は、当業者に公知の方法により達
成することができる。標識は、非−アンカー位置で行な
うのが有利である。このような方法で分かった、自己免
疫疾患の発生と、疾病特異性ペプチドモチーフを有する
ＭＨＣ−分子の表現との間の相関関係を、診断学的に使
用することができる。本発明のペプチド配列の試験管内
での診断学的使用の例は、これらに限定されないが、次
のものを包含する；ＭＨＣ−分子の結合特異性の測定、
ＭＨＣ−分子の結合特異性と疾病との相関関係付け、及
び興味深いＭＨＣ−分子をペプチド−バンク（試験した
モチーフに合うペプチドの混合物）のＨＰＬＣ−フラク
ションで表現する、適当な細胞のインキュベーションに
よる未知の起源のＴ−細胞エピトープの配列の決定、及
び天然のＴ−細胞エピトープとＴ−細胞エピトープとし
て認識された合成ペプチドとのクロマトグラフィー比較
により行なわれる、Ｔ−細胞により認識されたペプチド
の決定(Nature 348:252〜254(1990))。 【００１７】本発明のもう１つの課題は、免疫系の障害
又は腫瘍疾病を治療するための医薬の製法における本発
明によるペプチドモチーフの使用である。殊に、本発明
のペプチドモチーフは、自己免疫疾患における干渉（予
防及び治療）のために、例えば一定のＭＨＣ−分子の遮
断並びにＴ−細胞のペプチド特異的非−反応性の誘導に
より使用することができる。更に、移植拒絶反応及び移
植片対宿主反応(Graft-versus-Host-Reaktionen)におけ
る干渉が、同様の方法で可能である。更に、本発明によ
るペプチドは、腫瘍細胞に対するＴ−細胞の誘導又は強
化もしくは増強のために、殊に腫瘍疾病に対するワクチ
ン化及び存在する腫瘍疾病の治療のために、試験管内及
び生体内で使用することができ、その際、殊に、いわゆ
る移植片対白血病作用(Graft-versus-Leukaemia-Effek
t)(Sullivan等,N.Engl.J.Med.320:828〜834)を利用する
ことができる。本発明によるペプチドは、同様に、感染
方法(infektioese Mittel)又は腫瘍に関して特異的であ
るＭＨＣ−結合ペプチドを生体内で使用することによ
り、感染性又は悪性疾病に対するＴ−細胞応答を強化す
るために使用することができる。二者選択的に、Ｔ−細
胞は、動物から得ることができ、その数を、試験管内
で、ペプチドの使用及びサイトカイン、例えばインター
ロイキン２、インターロイキン４又はインターロイキン
６を包含する適当な成長条件の使用により増加させ、か
つ引き続き、患者に戻すことができる。本発明によるペ
プチドは、更に、Ｔ−細胞により攻撃可能な抗原を発現
する、次のものを包含するがこれらに限定されない全て
の腫瘍；黒色腫、乳癌、ウイルス起源の腫瘍、例えばバ
ーキットリンパ腫(Burkittslymphom)、及びヒト乳頭腫
ウイルスによるような腫瘍、例えば頸部ガン腫及び他の
生殖器(anogenitale)腫瘍を治療するために使用するこ
とができる。Ｔ−細胞受容体−分子又は抗体分子に起因
するペプチドは、更に、免疫調節的機構の、目的とする
処置のために、殊に、自己免疫疾病及び移植拒絶反応並
びに移植片対宿主反応の治療のために使用することがで
きる。予防のための、本発明によるタンパク質の生体内
使用において、その使用は、これらに限定されるもので
はないが、次のものを包含する；感染性又は悪性疾病に
対するペプチドワクチンとして、及び組換え接種物質
（ウイルス、例えばワクシニア菌又はバクテリア、例え
ばサルモネラ又はマイコバクテリアを含む）及び組換え
バクテリア（例えばＥ．コリ）又は他の細胞（酵母−、
昆虫−、マウス−又はヒト細胞を含む）の使用により製
造されたタンパク質を含む他の全ての種類の接種物質中
への本発明によるタンパク質の導入のための適当なＴ−
細胞エピトープに関する本発明で集められた情報の使
用。 【００１８】本発明のペプチドの用量又は濃度は、当業
者により常法で決めることができる。これらは、生体内
で、１０μｇ〜１ｇの範囲で予想することができる。試
験管内濃度は、１フェムトモル〜１マイクロモルの範囲
で予想することができる。生体内投与は、これらに限定
されないが、皮下、筋内、静脈内、腸管内及び経口法を
包含する。 【００１９】治療的使用において、本発明によるペプチ
ドモチーフに相当し、Ｎ−又は／及びＣ−末端で親油性
もしくは両親媒性基、殊に親油性ペプチド−ヘリックス
と共有結合するペプチドが有利である。このような基の
例は、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニル
−セリルセリンである。 【００２０】本発明を、次の例により、図１と結び付け
て、明らかにする。 【００２１】次のものを示す；図１ａは、Ｐ８１５ライ
ゼート(Lyssat)からの抗−Ｋｄ−抗体を用いて分離した
物質のＨＰＬＣ−特徴、図１ｂは、１ａからのクロマト
グラムの１部拡大部分（フラクション１５〜３５）、図
１ｃは、１ｂ中の矢印を付した部分の自己ペプチドの再
クロマトグラフィー。 【００２２】例１ Ｐ８１５−腫瘍細胞（Ｈ−２Ｋｄ）１０〜２０×１０９
をペレット化し、かつ０．５％ノニデット(Nonidet)Ｐ
４０ ２５０ｍｌと共に、フェニルメチルスルホニルフ
ルオリド（ＰＭＳＦ）０．１ミリモル／ｌを有するリン
酸塩緩衝された塩溶液（ＰＢＳ）中で、３０分間、４℃
で撹拌した。上澄を、２５０ｇで５分間及び１５０００
０ｇ及び４℃で３０分間で遠心分離し、次いで、吸着ク
ロマトグラフィー装置に導いた。この吸着クロマトグラ
フィー装置は、それぞれ約１ｍｌの層容量を有するカラ
ム３個からなった。カラム物質は、製造元の記録により
ブロムシアン−活性化されたセファロース４Ｂ(Pharmac
ia LKB)から製造された、抗体−結合したもしくはグリ
シン−結合した小粒からなった。抗体としては、Ｋｄ−
特異性抗体２０−８−４Ｓ(IgG 2a、kappa;25)又はＤｂ
−特異性抗体Ｂ２２−２４９それぞれ５ｍｇを小球１ｍ
ｌに結合させた。細胞抽出物の上澄を、先ず、グリシン
−結合した小球を有するカラムに、次いで、抗−Ｋｄ−
小球を有するカラムに、かつ次いで、偽沈降(Scheinpra
ezipitation)のために抗−Ｄｂ−小球上に導いた。 【００２３】小球を、全ての３個のカラムから除去し、
かつ０．１％トリフルオロ酢酸と共に１５分間渦動させ
た（文献；７）。上澄を真空遠心分離により乾燥させ、
かつ逆相ＨＰＬＣにより、スーパーパック(Superpac)Pe
p S カラム（Ｃ２／Ｃ１８；５μｍ粒子、４．０×２５
０ｍｍ、ファルマシア(Pharmacia) ＬＫＢ）及びファ
ルマシアＬＫＢ−装置の使用下で分離した（文献；
４）。溶離剤：溶液Ａ Ｈ２Ｏ中の０．１％トリフルオ
ロ酢酸（ｖ／ｖ）、溶液Ｂ アセトニトリル中の０．１
％トリフルオロ酢酸。 【００２４】図１ａ及びｂ中に示したクロマトグラフィ
ー分離のために、次の勾配を使用した： ０〜５分、Ａ１００％ ５〜４０分、Ｂ６０％まで直線的に増大 ４０〜４５分、Ｂ６０％ ４５〜５０分、Ｂ０％まで減少 流速：１ｍｌ／分、フラクション量：１ｍｌ。 【００２５】個々のフラクションを集め、かつ真空遠心
分離により乾燥させた。 【００２６】図１は、免疫沈降され、かつトリフルオロ
酢酸処理されたＫｄ−分子のＨＰＬＣ−分離を示す。図
１ａは、抗−Ｋｄ（実線）もしくは抗−Ｄｂ（点線）を
用いてＰ８１５−ライゼートから沈降させた、ＴＦＡ処
理した物質のＨＰＬＣ−特徴を示す。フラクション２０
〜２８の間で、目標対立遺伝子特異性ペプチド混合物で
ある不均一物質が、僅かな量溶離する。 【００２７】フラクション２０〜２８は、Ｋｄ−バッチ
(Ansatz)からも、偽沈降によっても集められた。双方の
バッチを、エドマン分解法の使用下で自動的に配列決定
した（Edmann等、Eur.J.Biochem.1:80〜91(1967)）。こ
のエドマン分解を、オンラインＰＴＨ−アミノ酸分析機
１２０Ａ(Applied Biosystems,Foster City,CA,94404,U
SA）を備えたタンパク質シークエンサー４７７Ａ中で実
施した。ガラス繊維フィルターを、バイオプレーン・プ
ラス(BioPrene Plus)１ｍｇで被覆し、かつ前循環(prae
zyklisiert)させなかった。この配列決定を、標準プロ
グラム ＢＥＧＩＮ−１及びＮＯＲＭＡＬ−１(Applied
Biosystems)の使用下に実施した。システインは修飾さ
れず、かつ従って確認されなかった。 【００２８】エドマン法は、それぞれクロマトグラフィ
ーにより同定されるＮ−末端の逐次誘導体化及びアミノ
酸除去を包含する。ペプチドの錯体混合物を配列決定す
ることは異例であるので、配列決定装置から直接得られ
たデータを提示する。第１ａ表及びｂは、Ｋｄ−溶離し
たペプチドに関する、２種の配列決定試験からの結果を
示す。第１ｃ表は、Ｐ８１５−ライゼートのＤｂ−特異
性抗体での偽溶離の配列決定結果を示す。Ｋｄ−溶離し
たペプチドは、１〜９の各位置に明らかなアミノ酸形を
１個有し、偽溶離した物質は、それぞれの基の吸収量を
減少しながら、それぞれのサイクルにおいて、例外な
く、同じ形のアミノ酸形を示している。Ｋｄ−溶離した
ペプチドにおいては、前又は前の前のサイクルと比較し
て５０％より多いピークが絶対量で示され、重要とみな
され、かつ下線を引いた。最初の位置は、評価すること
が困難である。それというのも、前のサイクルが存在せ
ず、かつ更に、ＨＰＬＣ−プール(Pool)中に存在する、
全ての遊離アミノ酸がこの位置で確認されるからであ
る。第２の位置に関して、以前のサイクルと比較してそ
の頻度が明らかに高い固有の基は、チロシン（例えば第
１ａ表で６０．９ｐｍｏｌから８７５．６ｐｍｏｌに）
である。（僅かな）ピークを示す他の固有の基は、Ｔｙ
ｒに類似した側鎖を有するフェニルアラニンである。こ
のことは、天然のＫｄ−拘束インフルエンザ−エピトー
プ（ＴＹＱＲＴＲＡＬＶの配列を有する）と他のＫｄ−
拘束ペプチドとの比較から、位置２のチロシン基を考慮
した場合に得られる仮定を裏付けする。これに反して、
続く位置３〜８に関して特徴的である、定義されたアミ
ノ酸基は存在しない。個々の位置において、１４個まで
の種々異なる基が見つけられる。位置９には、Ｉｌｅ及
びＬｅｕが見つけられる。位置１０にシグナルピークは
なく、このことは、多くのＫｄ−結合した自己ペプチド
が９個より長い基でないことを示唆している。従って、
天然のＫｄ−拘束インフルエンザ−ペプチドは、ノナペ
プチド(Nonapeptid)（文献；４）である。この結果か
ら、由来する共通配列形を、第１ｃ表中に示す。大抵、
目に付くのは、位置２のＴｙｒ、及び位置９のＩｌｅ又
はＬｅｕであり、他の全ての位置には、より多数の基が
見られる。このモチーフと、Ｋｄ−拘束エピトープを含
有するペプチド配列との比較は、そのほとんどがＫｄ−
拘束共通モノマーモチーフに良好に合致することを示す
（第１ｄ表）。 【００２９】図１ｂのフラクション２９中で矢印を付し
たピーク及び偽沈降の相当するフラクションを、高い溶
解性下に新たにクロマトグラフィーにかけたが、その
際、フラクション容量は０．５ｍｌであった（図１
ｃ）。急な特異的なピークは、直接配列決定により決定
されたアミノ酸配列ＳＹＦＰＥＩＴＨＩを有するペプチ
ドであった。合成ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ−ペプチドとの天
然細胞ペプチドの同一性は、共溶離(Coelution)により
ＨＰＬＣで証明された（図１ｃ）。この配列は、フラク
ション２０〜２８のプールからの共通モチーフに合致し
（図１ａ、ｂ）、このことにより、特異なＫｄ−拘束ペ
プチドモチーフ（第１ｄ表）の存在が証明される。 【００３０】 【表１】【００３１】 【表２】【００３２】＊Ｋｄ−拘束Ｔ−細胞エピトープを含有す
ることで知られているペプチドを、そのＴｙｒ−基によ
り合致させた。自然にプロセシングされることが知られ
ているペプチドには下線を引いた。 【００３３】例２ Ｋｂ−及びＤｂ−分子からのペプチドの溶離 ＥＬ４−腫瘍細胞（Ｈ−２ｂ）からのデタージェント−
ライゼート(Detergenz-Lysate)を、例えば例１で記載し
たようなＫｂ−特異性及びＤｂ−特異性抗体を用いて免
疫沈降させた。Ｄｂ−抗体としてはＢ２２−２４９（例
１参照）を、及びＫｂ−抗体としてはＫ９−１７８（Ｉ
ｇＧ ２ａ、Ｋ、２７）を使用した。ＭＨＣ−分子から
解離したペプチドを、逆相ＨＰＬＣにより分離した。Ｋ
ｂ−もＤｂ−物質も、例１からのＫｄ−物質にいくらか
相当する特徴を有して溶離され、その際、しかしなが
ら、フラクション２０〜２８の間で溶離された不均一物
質は明らかな相違を生じた。 【００３４】Ｄｂ−拘束ペプチドモチーフ Ｄｂ−バッチからの集めたフラクション２０〜２８を配
列決定した（第２ａ、ｂ表）。位置２〜４は、多くの基
を含有した。これに反して、サイクル５は、Ａｓｎに関
する強いシグナルを示した。従って、Ｄｂ−溶離された
自己ペプチドの位置５の優勢基は、Ａｓｎである。Ａｓ
ｐに関する弱いシグナルは、配列決定条件下でＡｓｎが
Ａｓｐへ加水分解することに起因する。位置６〜８は、
異なる証明可能な基５〜１４個を含有した。位置９は、
Ｍｅｔに関する強いシグナルを有し、Ｉｌｅに関する中
間のシグナル及びＬｅｕに関する弱いシグナルを有した
（全て疎水性）。（Ｄｂ−拘束エピトープ中のＭｅｔ又
はＩｌｅの条件は、既に記載されている。１７参照）。
位置１０にはシグナルがなく、このことは、Ｄｂ−提示
された自己ペプチドがノナペプチドであることを示唆し
ている。この結果により決定された共通モチーフを第２
ｃ表中に示す。このモチーフと、天然のＤｂ−拘束ペプ
チド及びＤｂ−拘束エピトープを含有する他のペプチド
との比較は、位置５のＡｓｎが、Ｄｂ−拘束ペプチドモ
チーフの不変のアンカー基でありうることを示す。Ｄｂ
−拘束エピトープの他の基は、第２のアンカー位置のよ
うに見える（Ｍｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕを有する）位置
９以外、著しく異なっている。 【００３５】 【表３】【００３６】 【表４】【００３７】Ｋｂ−拘束ペプチドモチーフ Ｋｂ−バッチからの集めたフラクション２０〜２８を配
列決定した（第３ａ、ｂ表）。位置３は、Ｔｙｒに関す
る強いシグナル及びＰｒｏに関する弱いシグナルを有す
る。位置４は、５個の基に関する弱いシグナルを示し
た。Ｐｈｅ及びＴｙｒに関する強いシグナルが、これら
の双方の基を位置５で優勢にする。次の双方の位置は、
５個もしくは３個のシグナルを含有する。位置８はＬｕ
ｅに関する強いシグナル、Ｍｅｔに関する中間のシグナ
ル及びＩｌｅ及びＶａｌに関する弱いシグナルを示し
た。位置９は、何かの基に関するピークは示さず、この
ことは、８量体である（文献；５）公知のＫｂ−拘束天
然のペプチドの長さと合致する。Ｋｂ−拘束共通モチー
フの分析及びエピトープとの比較は、２個のアンカー位
置を示す：位置５のＴｙｒ又はＰｈｅ（双方とも類似の
芳香族側鎖を有する）及び位置８のＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｉ
ｌｅ又はＶａｌ（全て同様の疎水性側鎖を有する）。 【００３８】 【表５】【００３９】 【表６】【００４０】例３ ＨＬＡ−Ａ２．１−拘束ペプチドモチーフ ＨＬＡ−Ａ２．１−ＭＨＣ−分子（文献；４５）を有す
るヒトＪＹ−細胞のデタージェント−ライゼートを、Ａ
２−特異性抗体（ＢＢ７．２、ＩｇＧ２ｂ、文献箇所２
８）を用いて免疫沈降させた。Ａ２−分子から解離され
たペプチドを、ＨＰＬＣにより分離した。フラクション
２０〜２８を集め、かつ前記のように配列決定した（第
４表）。第２の位置は、Ｌｅｕに関する強いシグナル及
びＭｅｔに関する中間のシグナルを有した。位置３〜５
には、それぞれ６〜８個の基が見られた。位置６は、Ｖ
ａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｈｒを有した。引き続く２
個の位置は、それぞれ３個のシグナルを示した。位置９
は、強いＶａｌ−及び弱いＬｅｕ−シグナルを示した。
位置１０は、１個の基のピークも示さず、このことは、
Ａ２−拘束エピトープがノナペプチドであることを示唆
している。位置２のＬｅｕ又はＭｅｔ及び位置９のＶａ
ｌ又はＬｅｕは、アンカー基であるように見える。Ａ２
−拘束エピトープを有する公知のペプチドのいくつか
が、モチーフと合致しうる一方、これは、他のものにお
いては部分的に可能であるに過ぎない（第４ｃ表）。Ａ
２−分子の多くの変法の現存は、いくつかのペプチドと
モチーフとのこの劣悪な合致の原因である。 【００４１】 【表７】【００４２】 【表８】【００４３】 【表９】【００４４】 【表１０】 【００４５】 【外８】【００４６】 【外９】
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】図１ａは、Ｐ８１５ライゼートからの抗−Ｋ
ｄ−抗体を用いて分離した物質のＨＰＬＣ−特徴をグラ
フで示す図。 【図１ｂ】図１ｂは、１ａからのクロマトグラムの１部
拡大部分図。 【図１ｃ】図１ｃは、１ｂ中の矢印を付した部分の自己
ペプチドの再クロマトグラフィーをグラフで示す図。
ｄ−抗体を用いて分離した物質のＨＰＬＣ−特徴をグラ
フで示す図。 【図１ｂ】図１ｂは、１ａからのクロマトグラムの１部
拡大部分図。 【図１ｃ】図１ｃは、１ｂ中の矢印を付した部分の自己
ペプチドの再クロマトグラフィーをグラフで示す図。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 キルステン ファルク
ドイツ連邦共和国 Ｄ−7400 チュービン
ゲン フンツカプフクリンゲ 42
(72)発明者 オーラフ レチュケ
ドイツ連邦共和国 Ｄ−7400 チュービン
ゲン フンツカプフクリンゲ 42
(72)発明者 シュテファン ステファノヴィッチ
ドイツ連邦共和国 Ｄ−7400 チュービン
ゲン シュールシュトラーセ 18
(72)発明者 ギュンター ユング
ドイツ連邦共和国 Ｄ−7400 チュービン
ゲン オプ デア グラーフェンハルデ
５
Ｆターム(参考） 4H045 AA10 BA15 BA16 BA17 CA40
DA86 EA20 EA60 FA72 GA22
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 （ａ）ＭＨＣ−分子を含有する細胞の細
胞溶解により細胞抽出物を得、（ｂ）ＭＨＣ−分子を、
その上に存在するペプチド混合物と共に、免疫沈降によ
り細胞抽出物から分離し、（ｃ）ＭＨＣ−分子及び他の
タンパク質成分からのペプチド混合物を分離し、（ｄ）
個々のペプチド又は／及びその混合物を配列決定し、
（ｅ）得られた配列決定情報から対立遺伝子特異的ペプ
チドモチーフを導き出し、及び（ｆ）対立遺伝子特異的
ペプチドモチーフに従ってペプチドを合成する、ことよ
りなる方法により得られ、その際、前記のＭＨＣ−分子
は、Ｈ−２Ｋｄ、Ｈ−Ｋｂ、Ｈ−２Ｄｂ、Ｈ−２Ｋ ｋ、
Ｈ−２Ｋｍ′又はＨＬＡ＊０２０１又はＨＬＡ−Ａ＊０
２０５からなる群から選択され、その際、前記Ｈ−２Ｋ
ｄモチーフは、 【外１】 で示され、前記Ｈ−Ｋｂモチーフは 【外２】 で示され、前記Ｈ−２Ｄｂモチーフは 【外３】で示され、前記Ｈ−２Ｋｋモチーフは 【外４】 で示され、前記Ｈ−２Ｋｍ′モチーフは 【外５】で示され、前記ＨＬＡ＊０２０１モチーフは 【外６】 で示され、前記ＨＬＡ−Ａ＊０２０５モチーフは 【外７】 で示されるペプチドモチーフを含有するペプチド。
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