KR0137617B1 - B형 간염 바이러스에 대한 인체면역 조절기능을 가진 펩타이드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스에 대한 인체의 면역성 조절기능을 가지는 신규한 일련의 펩타이드군에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 B형 간염 바이러스 단백질항원 중 간염 바이러스에 대한 세포독성 T임파구(cytotoxic T lymphocyte, CTL)를 유도하거나, 그 바이러스에 대해 면역관용(immunological tolerance)을 유도하는 항원의 특정부위(epitope)에 해당하는 펩타이드의 아미노산 서열에 관한 것이다. 본 발명의 P1, P3, P4, P8, P10 및 P11등 6종의 신규한 펩타이드는 인체내에 존재하는 B형 간염 바이러스 항원을 인지하는 CTL을 활성화시키며, 그 CTL에 의해 다시 인지될 수 있는 펩타이드로서, 간염 바이러스 관련 질환의 예방과 치료에 사용될 수 있을 것이다.

Description

B형 간염 바이러스에 대한 인체면역 조절기능을 가진 펩타이드

제1도는 T2세포의 표면에 발현되는 MHC Class Ⅰ 분자의 변화를 형광강도로 나타낸 것이다.

본 발명은 B형 간염 바이러스에 대한 인체의 면역성 조절기능을 가지는 신규한 펩타이드군에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 B형 간염 바이러스 단백질항원 중 간염 바이러스에 대한 세포독성 T임파구(cytotoxic T lymphocyte, 이하 'CTL'이라 함)를 유도하건, 그 바이러스에 대해 면역관용(immunological tolerance)을 유도하는 항원의 특정부위(epitope)에 해당하는 펩타이드의 아미노산 서열 및 그를 이용하여 B형 간염 바이러스에 특이성을 가지는 세포독성 T임파구를 유도하는 방법에 관한 것이다.

인체에 B형 간염 바이러스가 감염이 되면, 인체내에서는 이 바이러스를 제거할 목적으로 여러 가지 생리현상이 일어나는데, 그 중 가장 중요한 것 중의 하나는 이미 감염된 세포를 파괴하여 제거하는 일이며, 이러한 과정을 통하여 궁극적으로 바이러스 감염으로부터 회복될 수 있다.

이러한 감염세포의 파괴는 세포살해능(cytotoxicity)을 가진 또 다른 종류의 세포에 의해 이루어지는데, 이 세포는 '세포독성 T임파구(CTL)'라 불리워진다. 이 CTL이 자신이 갖고 있는 세포살해능을 발휘하기 위해서는 감염된 바이러스를 구성하는 단백질의 일부를 먼저 인지하는 과정을 거쳐야 한다. 일반적으로 바이러스 단백질은 감염된 세포내에서 합성되어진 후, 세포내 분해과정을 통하여 8 내지 15개의 아미노산으로 구성된 짧은 펩타이드 형태로 전환된다. 이렇게 생성된 펩타이드 중의 일부가 세포내에 있는 주조직 적합분자(major histocompatibility complex molecule, 이하 'MHC'라 함)와 결합한 형태로 세포표면에 나타나게 되면 CTL이 이를 인지하여 감염된 세포를 파괴하게 된다. 한편, MHC는 제1군(Class Ⅰ)과 제2군(Class Ⅱ)의 두 종류로 나뉘어지는데, 이들 중 제1군(Class Ⅰ)이 CTL의 유도에 더욱 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나, CTL이 인지하는 단백질의 부위(펩타이드)는 바이러스 단백질의 분해결과로 일어난 펩타이드 중 반드시 특정한 아미노산 서열을 갖고 있는 경우에 한정되는 것으로 알려지고 있다[참조 : Fremont, D. et al., Science, 257 : 919-926(1992); Matsumura, M. et al., Science, 257 : 929-934(1992)].

따라서, 이러한 특정한 부위의 아미노산 서열을 알게 되면 그 아미노산 서열에 상응하는 펩타이드를 화학적 방법으로 합성, 생산할 수 있게 되고, 이를 이용하면 인체내에 간염 바이러스를 특이적으로 인지하는 CTL을 인위적으로 유도해내거나 면역억제 등 다른 면역반응을 조절함으로써, 간염이나 기타 간염 바이러스에 의해 유발되는 질환의 예방과 치료효과를 거둘 수 있게 된다.

이러한 배경아래, 여러 연구자들에 의해 간염 바이러스 단백질의 아미노산 서열 가운데서 CTL에 의해 인지되는 펩타이드의 아미노산 서열을 알아내기 위한 노력이 기울여져 왔으며, 그 결과 이미 몇 개의 특정 아미노산 서열이 보고되었고, 앞으로도 몇종류가 더 발견되리라고 기대되고 있다.

그러나, 간염 바이러스 관련 질환의 예방과 치료에 이와 같은 펩타이드를 사용하려면 되도록 많은 종류의 펩타이드를 동시에 사용하는 것이 필요할 뿐만 아니라, 펩타이드의 종류에 따라 그 효능이 달라질 수 있기 때문에, 새로이 발견되는 펩타이드의 아미노산 서열은 매우 중요한 의미를 갖게 되는 것이다.

본 발명의 발명자들은 상기와 같이 CTL에 의해 인지되어지는 B형 간염 바이러스의 펩타이드중 지금까지 보고된 적이 없는 일련의 펩타이드군을 발견하고 아미노산 서열을 결정하였는 바, 놀라웁게도 신규한 것을 알아내고 본 발명을 완성하게 되었다.

* 본 발명에서 사용된 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 다음과 같이 약어로 기재하였다 :

본 발명의 신규한 펩타이드의 아미노산 서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

표 1 : B형 간염 바이러스 단백질 중 CTL에 의해 인지되어지는

펩타이드의 아미노산 서열 및 단백질내의 위치

* 아미노산 서열은 IUPAC-IUB의 명명법에 따라 기재하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 따라 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

B형 간염 바이러스 펩타이드의 발견 및 아미노산 서열의 결정

본 발명에서 사용한 펩타이드는 MHC 제1군(Class Ⅰ) 분자와 결합할 수 있는 펩타이드가 특정 아미노산 서열을 가진다는 사실 및 MHC 제1군(Class Ⅰ) 분자가 갖는 구조적 특성에 착안하여, B형 간염 바이러스 항원 단백질의 전체 아미노산 서열로부터 MHC Class Ⅰ 분자와 결합할 가능성이 있는 펩타이드의 아미노산 서열을 결정하였다. 즉, 사람의 MHC 제1군(Class Ⅰ) 분자인 HLA-A2와 결합할 수 있는 펩타이드는 N말단으로부터 두 번째 위치의 아미노산과 C말단의 아미노산이 루신(leucine), 발린(valine), 혹은 이소루신(isoleucine) 등으로 이루어진다는 사실을 근거로 하여(Matsumura, M. et al., Science, 257 : 929-934(1992)), 이러한 조건을 충족시키는 아미노산 서열을 B형 간염 바이러스 항원 단백질의 전체 아미노산 서열로부터 여러개를 찾아내고, 이들 중 HLA-A2 분자의 3차구조에 적합하게 결합될 가능성이 가장 높은 것들을 선택하여 이들의 아미노산 서열에 따라 화학적으로 합성하였다.

[실시예 2]

펩타이드의 합성 및 MHC 분자와의 결합도 측정

B형 간염 바이러스 단백질의 아미노산 서열로부터 상기 표 1에 표기한 바와 같은 펩타이드를 포함하여 서로 다른 아미노산 서열을 가진 12종의 펩타이드를 화학적 방법으로 합성하고, 이들을 인산완충용액(phosphate buffered saline, 이하 'PBS'라 함)에 용해시켰다. 이들 펩타이드가 MHC분자, 그중에서도 CTL의 유도와 관계가 있는 제1군(Class Ⅰ) 분자와 결합할 수 있는지의 여부를 추정하기 위하여, 이들 펩타이드를 T2 세포주에 10㎍/㎖의 농도가 되도록 각각 넣어 주고 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, PBS로 세척하여 미반응 펩타이드를 제거하고, 이 세포를 사람 MHC 제1군(Class Ⅰ) 분자의 일종인 HLA-A2.1에 대한 항체(anti-HLA-A2.1 antibody) BB7.2를 가해주고 다시 1시간 동안 4℃에서 반응시켰다. 이 세포를 다시 PBS로 세척하고 여기에 플루오르신 이소치오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC)를 부착한 항마우스 면역글로블린 항체(anti-mouse immunoglobulin antibody)를 가하여 1시간 동안 4℃에서 반응시킨 후, 이 세포들이 띠고 있는 형광강도를 플로우사이토미터(Flow Cytometer)를 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 제1도에 나타내었다. 제1도에서 보듯이, P1, P2, P3, P4, P5, P8, P10, P11 및 P12 등 9종류의 펩타이드가 T2 세포의 표면에 있는 MHC 제1군(Class Ⅰ) 분자와의 결합력이 양호한 것으로 나타났다. 또한 본 실험에 사용된 펩타이드의 종류는 하기 표 2에 나타난 바와 같다.

표 2 : 합성 펩타이드의 아미노산 서열

* 아미노산 서열은 IUPAC-IUB의 명명법에 의하여 기재하였다.

본 실시예에서 사용한 T2세포주는 세포내 펩타이드의 이동경로에 이상이 생겨 MHC 제1군(Class Ⅰ) 분자가 펩타이드와 적절히 결합할 수 없게 되고 분자구조의 불안정화를 초래하게 되어, 결과적으로 정상 생육온도인 37℃에서 배양하면 MHC 분자의 발현정도가 낮은 상태를 유지하게 된다. 그러나, T2 세포의 배양시에 MHC 분자와 결합할 수 있는 펩타이드가 배양액 가운데 존재할 경우에는 그 펩타이드가 T2세포표면의 MHC 분자와 결합하게 되고, 그 결과로 MHC 분자의 분자적 안정성이 증가함에 따라 MHC 분자의 발현이 증가하게 되는 특성을 갖고 있어, 이를 이용하면 특정 펩타이드가 T2세포표면의 MHC 분자와 결합하는 정도를 BB7.2 항체가 세포표면에 결합되는 정도를 측정함으로써 정량할 수 있었다.

[실시예 3]

펩타이드와 CTL 간의 인지도 측정

어떤 특정 펩타이드가 MHC 분자와 결합한다는 사실이 곧 CTL에 의해 인지된다고는 할 수 없으므로, 표 1에 표시된 펩타이드 중 T2세포 표면의 MHC 분자와의 결합력이 비교적 높다고 판단되는 펩타이드가 실제적으로 인체내에 존재하는 B형 간염 바이러스를 인지하는 CTL에 의해 실제로 인지되는지를 알아보기 위해 다음의 실험을 수행하였다. 즉, 일반 헌혈자들로부터 수집된 혈액 중 간염 바이러스 항원이 양성으로 판정된 혈액의 세포들을 모아, 원심분리하여 혈액세포로부터 적혈구를 제거하고 남은 백혈구에 상기의 펩타이드를 각각 10㎍/㎖ 농도가 되도록 넣어 준 다음, 37℃에서 5%의 이산화탄소를 함유하고 있는 배양기(CO₂incubator)에서 배양하였다. 배양 시작 2일 후 10단위(unit)의 인터루킨-2(interleukin-2)를 배양액에 첨가해 주고 3일간 추가 배양한 다음, 자극세포로서 동일한 MHC의 혈구세포를 미토마이신 C(mitomycin C)로 불활성화시켜 넣어 주고, 펩타이드와 인터루킨-2를 추가하였다. 이들을 7일간 더 배양한 다음 이들 혈구세포가 특정 펩타이드를 표면에 결합시킨 T2세포를 인지하여 파괴하는지를 측정하여, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

표 3 : 합성 펩타이드로 감작시킨 표적 세포에 대한

펩타이드 특이성 T세포의 세포살해능

* ND : 측정하지 않음

배양된 혈구 세포에 의한 T2세포의 파괴를 측정하는 방법은 다음과 같았다 : T2세포에 10μ/㎖의 펩타이드를 가하여 3시간 동안 37℃에서 반응시킨 다음 그 세포를 충분히 세척하여 미반응 펩타이드를 제거하고, 그 T2세포에 다시 옥타데카노일아미노프루오르신(octadecanoylaminofluorescein, 이하 'OAF'라 함)을 100ng/㎖ 농도로 넣어 주고 30분간 37℃에서 반응시켰다. 반응이 끝나면 미반응 OAF를 PBS로 충분히 세척해 내고, PBS로 세척된 혈구세포를 일정비율로 넣어 주어 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 이 세포 혼합액에 프로피디움 이오다이드(propidium iodide, 이하 'PI'라 함)를 3㎍/㎖의 농도로 넣어 주어 30분간 반응시킨 다음, 미반응 PI를 PBS로 충분히 세척해 내고, 이 세포가 띠고 있는 형광강도를 측정함으로써 파괴된 T2세포의 양을 결정하였다. 이때 살아있는 T2세포는 OAF에 의해서만 형광을 띠게 되고, 파괴된 T2세포는 OAF와 PI 모두에 의해 형광을 띠게 되며, 혈구세포는 아무런 형광을 띠지 않는다.

상기 표 3에서 보는 바와 같이, P1, P3, P4, P5, P8, P10 및 P11의 경우는 배양한 혈구세포에 의해 인지됨을 알 수 있었는데, 이들 중 P5는 이미 공지된 것들로서 [참조 : Nayersina, R. et al., J. Immunol., 150 : 4659-4671(1993)], 본 실시예에서 사용한 실험방법들이 적절하다는 것을 보여주는 양성대조군의 역할을 하고 있음을 확인하였다. 표 3의 제1차 실험과 제2차 실험에서의 결과가 부분적으로 다른 것은 각각의 실험이 서로 다른 헌혈자의 혈액세포로 수행된 것이기 때문에 헌혈자의 유전학적 차이에 기인하는 것이며, 유전학적 배경이 다른 개체에서는 CTL에 의해 인지되는 펩타이드의 종류가 부분적으로 다를 수 있다는 것은 이미 공지된 사실이다[참조 : Nayersina, R. er al., J. Immunol., 150 : 4659-4671(1993)].

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명의 P1, P3, P4, P8, P10 및 P11등 6종의 펩타이드군은 인체내에 존재하는 B형 간염 바이러스 항원을 인지하는 CTL을 활성화시키며, 그 CTL에 의해 다시 인지될 수 있는 펩타이드로서, 간염 바이러스 관련 질환의 예방과 치료에 사용될 수 있을 것이다.

Claims (6)

1. 세포독성 T임파구(CTL)에 의해 인지되어 바이러스에 의해 세포 살해능을 나타내는 B형 간염 바이러스 펩타이드.

   LLDPRVRGL

   (상기에서, 아미노산 서열은 IUPAC-IUB의 명명법에 따라 기재하였다)
2. 세포독성 T임파구(CTL)에 의해 인지되어 바이러스에 의해 세포 살해능을 나타내는 B형 간염 바이러스 펩타이드.

   LVLLDYQGML

   (상기에서, 아미노산 서열은 IUPAC-IUB의 명명법에 따라 기재하였다)
3. 세포독성 T임파구(CTL)에 의해 인지되어 바이러스에 의해 세포 살해능을 나타내는 B형 간염 바이러스 펩타이드.

   VLLDYQGML

   (상기에서, 아미노산 서열은 IUPAC-IUB의 명명법에 따라 기재하였다)
4. 세포독성 T임파구(CTL)에 의해 인지되어 바이러스에 의해 세포 살해능을 나타내는 B형 간염 바이러스 펩타이드.

   FLPSDFFPSI

   (상기에서, 아미노산 서열은 IUPAC-IUB의 명명법에 따라 기재하였다)
5. 세포독성 T임파구(CTL)에 의해 인지되어 바이러스에 의해 세포 살해능을 나타내는 B형 간염 바이러스 펩타이드.

   CLTFGRETV

   (상기에서, 아미노산 서열은 IUPAC-IUB의 명명법에 따라 기재하였다)
6. 세포독성 T임파구(CTL)에 의해 인지되어 바이러스에 의해 세포 살해능을 나타내는 B형 간염 바이러스 펩타이드.

   VLEYLVSFGV

   (상기에서, 아미노산 서열은 IUPAC-IUB의 명명법에 따라 기재하였다)