MX2013010684A - Composiciones y metodos para separar, caracterizar y administrar selenoglicoproteinas solubles. - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona con composiciones de selenio solubles y métodos de producción, separación y purificación de las mismas. Particularmente la presente invención proporciona métodos para preparar selenoglicoproteínas solubles en agua (por ejemplo, a través de extracción de selenoglicoproteínas de levadura enriquecida con selenio), métodos para suplementar una composición deficiente en selenio a través de la combinación de selenoglicoproteínas solubles en agua con la composición deficiente en selenio, composiciones que comprenden selenoglicoproteínas solubles en agua y métodos para administrar la misma.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA SEPARAR, CARACTERIZAR Y ADMINISTRAR SELENOGLICOPROTEíÑAS SOLUBLES Esta solicitud es una continuación-en-parte de, y reivindica prioridad de la solicitud de patente de Estados Unidos con núm. de serie 13/051,646 presentada el 18 de marzo de 2011, la cual reivindica prioridad de solicitud de patente provisional de Estados Unidos con núm. de serie 61/315,265 presentada el 18 de marzo de 2010, las que se incorporan por este medio como referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con composiciones de selenio solubles y métodos de producción, separación y purificación de las mismas. Particularmente la presente invención proporciona métodos para preparar selenoglicoproteinas solubles en agua (por ejemplo, a través de extracción de selenoglicoproteinas de levadura enriquecida con selenio) , métodos para suplementar una composición deficiente en selenio a través de la combinación de selenoglicoproteinas solubles en agua con la composición deficiente en selenio, composiciones que comprenden selenoglicoproteinas solubles en agua y métodos para administrar la misma.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El selenio es un importante oligoelemento para la función fisiológica apropiada en humanos. El selenio se ingiere a través de la dieta que puede tener un contenido diverso de selenio.

Se conoce que el selenio juega un papel critico en el metabolismo fisiológico sustentador, crecimiento, salud reproductiva, e inmunidad. El selenio se incorpora en moléculas orgánicas diferentes que incluyen, por ejemplo, aminoácidos tales como 1-selenometionina, selenocisteina, y selenocistina . Asi, el selenio puede ser una parte componente de proteínas, muchas de las que son de importancia estructural para el cuerpo. Además, el selenio es un ingrediente importante en un número de enzimas que influencian el metabolismo, reproducción, la prevención de cáncer, y la defensa inmune en los humanos (Ver, por ejemplo, Rayman, M, Lancet 356:233-241 (2000)) .

Múltiples estudios han intentado revelar los beneficios potenciales en la salud que resultan de la ingestión de niveles bajo de selenio. Por ejemplo, bajas concentraciones de una forma inorgánica de selenio, han demostrado algún potencial beneficioso en la salud (Ver, por ejemplo, Furnsinn y otros, Int. J of Obesity and Related Metab. Dis., 19, 458- 463 (1995)). Sin embargo, en niveles elevados de dosificación, los efectos beneficiosos se invierten y se manifiesta toxicidad peligrosa.

La investigación durante las últimas dos décadas ha sugerido que el selenio es eficaz en la reducción de la incidencia de cáncer cuando se proporciona a los animales en dosis solamente de 5 a 10 veces por encima del requisito nutricional (Ver, por ejemplo, El-Bayoumy, The role of selenium in cáncer prevention, Filadelfia, Lippincott, 1-15, 1991) . Los estudios de quimioprevención con selenio en los sistemas de modelo animal han indicado que este elemento es eficaz para la mayoría, si no todos los sistemas de órganos y es protector contra los efectos carcinogénicos (Ver, por ejemplo, El-Bayoumy, The role of selenium in cáncer prevention, Filadelfia, Lippincott, 1-15, 1991. Tanto los estudios epidemiológicos como los ensayos de suplementación han soportado también su eficacia para disminuir la incidencia de cánceres del hígado, colon, próstata y pulmón (Ver, por ejemplo, Yu y otros Biol Trace Elem Res, 56: 117-124 (1997); Clark y otros, J Am Med Assoc, 276: 1957-1963 (1996); Yoshizawa y otros, J Nati Cáncer Inst, 90: 1219-1224, (1998); Brooks, y otros, J Urol, 166: 2034-2038, (2001)). Otros estudios no mostraron efecto beneficioso del selenio en la reducción de cánceres (Ver, por ejemplo, Garland y otros, J. Am. Coll Nutr., 12: 400-11 (1993); Ghadirian y otros, Cáncer Detect Prev, 24: 305-13 (2000)).

Se han examinado múltiples formas de selenio. Estas incluyen selenio inorgánico tal como selenito sódico, y fuentes orgánicas, que incluyen levadura de selenio. Existe una diferencia significativa entre la toxicidad de selenio inorgánico y orgánico, los compuestos inorgánicos usualmente se absorben y se utilizan menos eficazmente y además son más tóxicos que las fuentes orgánicas de selenio.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con composiciones de selenio soluble y métodos de producción, separación y purificación de las mismas. Particularmente la presente invención proporciona métodos para preparar selenoglicoproteinas solubles en agua (por ejemplo, a través de la extracción de selenoglicoproteinas de levadura enriquecida con selenio), métodos para suplementar una composición deficiente en selenio a través de la combinación de selenoglicoproteinas solubles en agua con la composición deficiente en selenio, composiciones que comprenden las selenoglicoproteinas solubles en agua y métodos para administrar las mismas.

Como consecuencia, en algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para la preparación de selenoglicoproteinas solubles que comprende: proporcionar levadura enriquecida con selenio, exponer la levadura enriquecida con selenio a condiciones ácidas seguido por centrifugación para generar i) una perla que comprende material insoluble ácido; y ii) una fase liquida que comprende el extracto de la levadura enriquecida con selenio soluble en las condiciones ácidas; precipitar las selenoglicoproteinas de la fase liquida que comprende el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble en las condiciones ácidas a través de la elevación del pH de la fase liquida, y (d) separar las selenoglicoproteinas precipitadas de la fase liquida. En algunas modalidades, exponer la levadura enriquecida con selenio a las condiciones ácidas ocurre a una temperatura mayor que la temperatura ambiente (por ejemplo, mayor de aproximadamente 20-25°C). La presente invención no se limita por la temperatura mayor que la temperatura ambiente en que la levadura enriquecida con selenio se expone a las condiciones ácidas. Claramente, puede usarse una variedad de temperaturas que incluyen, pero sin limitarse a, aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 90, 95, 97, 99°C, o más caliente) . De mismo modo, la invención no se limita por las condiciones ácidas en que se expone la levadura enriquecida con selenio. En algunas modalidades, la levadura enriquecida con selenio se expone a condiciones en donde el pH es aproximadamente 6.5 , aproximadamente 6, aproximadamente 5 • 5, aproximadamente 5, aproximadamente 4 .5, aproximadamente 4, aproximadamente 3.5 , aproximadamente 3, aproximadamente 2 .5, aproximadamente 2, aproximadamente 1. 5, aproximadamente 1 , o menos. En una modalidad preferida, exponer la levadura enriquecida con selenio a condiciones ácidas comprende la exposición de la levadura enriquecida con selenio a un pH de 1.5. En algunas modalidades, exponer la levadura enriquecida con selenio a las condiciones ácidas tiene lugar por un cierto periodo de tiempo. La invención no se limita por la cantidad de tiempo en que la levadura enriquecida con selenio se expone a las condiciones ácidas. En algunas modalidades, la levadura enriquecida con selenio se expone a condiciones ácidas por aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o más horas. En algunas modalidades, la levadura enriquecida con selenio se expone a condiciones ácidas por entre una y veinticuatro horas. En algunas modalidades, la levadura enriquecida con selenio se expone a condiciones ácidas por entre cinco y diez horas. En una modalidad preferida, la levadura enriquecida con selenio se expone a condiciones ácidas por aproximadamente ocho horas.

En algunas modalidades, las condiciones ácidas se crean y/o mantienen utilizando tampón ácido y/o la adición de un ácido. La invención no se limita por el tipo de ácido utilizado. Claramente, se puede usar cualquier ácido. En algunas modalidades, el ácido es ácido clorhídrico, aunque puede usarse cualquier ácido. En algunas modalidades, las selenoglicoproteínas se precipitan de la fase líquida que comprende el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble en las condiciones ácidas a través de la elevación del pH de la fase líquida. En algunas modalidades, las selenoglicoproteínas precipitadas se separan de la fase líquida a través de la centrifugación para formar un precipitado de las selenoglicoproteínas precipitadas seguido por la eliminación de la fase líquida de las selenoglicoproteínas precipitadas. La invención no se limita por la cantidad o el grado al que se eleva el pH del extracto para precipitar las selenoglicoproteínas de la fase líquida. En algunas modalidades, el pH de la fase líquida se eleva hasta 1.85. En algunas modalidades, el pH de la fase líquida se eleva hasta 3.0. En algunas modalidades, el pH de la fase líquida se eleva hasta 4.0. En algunas modalidades, el pH de la fase líquida se eleva hasta 6.0. En algunas modalidades, las selenoglicoproteínas se precipitan y separan de la fase líquida en una variedad de condiciones de pH para generar múltiples fracciones dependientes de pH de selenoglicoproteinas solubles. Por ejemplo, en algunas modalidades, una sola fase liquida que comprende el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble en condiciones acidas se usa para crear una primera fracción de selenoglicoproteinas solubles precipitadas a un primer pH (por ejemplo, pH de 1.85), una segunda fracción de selenoglicoproteinas solubles precipitadas a un segundo pH (por ejemplo, pH de 3.0), una tercera selenoglicoproteinas solubles precipitadas a un tercer pH (por ejemplo, pH de 4.0), y una cuarta fracción de selenoglicoproteinas solubles precipitadas a un cuarto pH (por ejemplo, pH de 6.0). En algunas modalidades, precipitar las selenoglicoproteinas de la fase liquida a través de la elevación del pH de la fase líquida comprende reacciones de precipitación dependientes del pH múltiples, secuenciales de la fase líquida. En algunas modalidades, una composición que comprende selenoglicoproteinas solubles contiene una sola fracción de las selenoglicoproteinas dependiente de pH (por ejemplo selenoglicoproteinas solubles de la fase líquida que comprenden el extracto de la levadura enriquecida con selenio soluble en condiciones ácidas precipitada a pH 4.0). En algunas modalidades, una composición que comprende selenoglicoproteinas solubles contiene dos o más fracciones de selenoglicoproteínas dependientes del pH (por ejemplo, selenoglicoproteinas solubles de la fase liquida que comprende el extracto de la levadura enriquecida con selenio soluble en condiciones ácidas precipitada a dos o más valores de pH diferentes) .

En algunas modalidades, las levaduras enriquecidas con selenio son levaduras secas enriquecidas con selenio, no viables que contienen 2 % o menos de selenio inorgánico.

La invención proporciona además composiciones que comprenden selenoglicoproteinas solubles preparadas de acuerdo con la invención. Por ejemplo, en algunas modalidades, la invención proporciona una composición deficiente en selenio que comprende selenoglicoproteinas solubles de la invención. En algunas modalidades, las selenoglicoproteinas solubles de la invención se adicionan a y/o mezclan con una composición deficiente en selenio. La invención no se limita por el tipo de composición deficiente en selenio o material al que las selenoglicoproteinas solubles de la invención se añaden a o mezclan con, tales composiciones o materiales que incluyen, pero sin limitarse a, suplementos dietéticos, fármacos, productos farmacéuticos, productos alimenticios, alimentos para animales, y otros tipos de materiales. En algunas modalidades, añadir o mezclar (por ejemplo, combinar) selenoglicoproteina comprende combinar selenoglicoproteína y uno o más de otros tipos de selenio en la composición. En algunas modalidades, las selenoglicoproteíñas solubles de la invención se añaden a y/o mezclan con composiciones que contienen selenio (por ejemplo, para aumentar y/o suplementar la cantidad total de selenio) .

La invención proporciona además una composición que comprende selenoglicoproteínas solubles y un portador. En algunas modalidades, las selenoglicoproteínas son una fracción de selenoglicoproteínas dependiente de un pH específico. La invención no se limita por el tipo de portador utilizado. Claramente una variedad de portadores pueden usarse incluyendo, pero sin limitarse a, dendrímeros, polimerosomas , nanopartículas, polímeros de liberación lenta, nanocápsulas , y/o polímeros de impresión molecular. En una modalidad preferida, el portador es un polímero de liberación lenta. En otra modalidad preferida, el portador es un polímero de impresión molecular. En aún otra modalidad preferida, el portador es un polimersoma usado para encapsular selenoglicoproteína. La invención no se limita por el tipo de polimersona usado. Claramente, puede utilizarse cualquier polimersoma conocido en la técnica. En algunas modalidades, el polimersoma comprende el copolímero de bloque poli (óxido de etileno) (PEO) . Sin embargo, la invención no se limita a eso. Cualquier copolímero de bloque conocido puede ser utilizado, incluyendo, por ejemplo, poli (etiletileno) (PEE), poli (butadieno) (PB o PBD) , poli (estireno) (PS), y poli (isopreno) (PI). En algunas modalidades, el polímero comprende el copolímero dibloque poli (D-caprolactona) (PCL) . En algunas modalidades, el polimersoma comprende copolímeros dibloque basados en poli (óxido de etileno) -bloque-poli (D-caprolactona) (PEO-b-PCL) . En algunas modalidades, el polimersoma comprende un copolímero de bloque que es un tribloque, tetrabloque, pentabloque, o al menos un copolímero de seis bloques. En algunas modalidades, el polimersoma se deriva del acoplamiento de poli (ácido láctico) , poli (glicólido) , poli (ácido láctico-coglicólico) y/o o poli ( 3-hidroxibutirato) con PEO. La invención no se limita por el tamaño de una selenoglicoproteína encapsulada en polimersoma. Una variedad de tamaños encuentran uso en las composiciones y métodos de la invención que incluyen, pero sin limitarse a, selenoglicoproteínas encapsuladas en polimersoma que son aproximadamente, 50-300 nm de diámetro aunque pueden usarse más grandes (por ejemplo, aproximadamente 350 nm, 400 nm, 500 nm o mayores) y menores (por ejemplo, aproximadamente 40 nm, 30 nm. 20 nm, o menores) selenoglicoproteínas encapsuladas en polimersoma .

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra la preparación secuencial de selenoglicoproteinas solubles (SGPs) a partir de SEL-PLEX por la extracción ácida y las precipitaciones posteriores de una modalidad de la invención.

La Figura 2 muestra un proceso de precipitación dependiente de pH de las selenoglicoproteinas de una modalidad de la invención.

La Figura 3 muestra un mapa de calor que representa los efectos de tratamientos diferentes suplementados con selenio descritos en las Tablas 3 y 4 del Ejemplo 3 sobre los niveles de expresión génica en el músculo esquelético de la pechuga de pollo relativo a un control basal.

La Figura 4 muestra el diagrama Venn que representa los efectos diferentes de la fracción de SGP pH 4.0 y SEL-PLEX en la expresión génica perfilada en el músculo de la pechuga.

La Figura 5 muestra genes ilustrativos identificados que están comúnmente regulados por selenito sódico (SS) , SEL-PLEX (SP) y fracción de selenoglicoproteina (SGP) pH 4.0.

La Figura 6 muestra genes ilustrativos identificados que están comúnmente regulados por SEL-PLEX (SP) y fracción de selenoglicoproteina (SGP) pH 4.0, pero no por selenito sódico (SS) .

La Figura 7 muestra genes ilustrativos identificados que están únicamente regulados por la fracción de selenoglicoproteina (SGP) pH 4.0 y no regulado por selenito sódico (SS) o SEL-PLEX (SP) .

La Figura 8 muestra un gen ilustrativo identificado que está únicamente regulado por la fracción de selenoglicoproteina (SGP) pH 4.0 y no regulado por selenito sódico (SS) o SEL-PLEX (SP) .

La Figura 9 muestra un gen ilustrativo identificado que está únicamente regulado por la fracción de selenoglicoproteina (SGP) pH 4.0 y no regulado por selenito sódico (SS) o SEL-PLEX (SP) .

La Figura 10 muestra un gen ilustrativo identificado que está únicamente regulado por la fracción de selenoglicoproteina (SGP) pH 4.0 y no regulado por selenito sódico (SS) o SEL-PLEX (SP) .

La Figura 11 muestra un mapa de calor que representa los efectos de tratamientos diferentes suplementados con selenio descritos en las Tablas 3 y 4 del Ejemplo 3 sobre los niveles de expresión génica en el tejido de hígado relativo a un control basal.

La Figura 12 representa la liberación de SGP a partir de nanocápsulas a pH 5.1 y pH 7.4 durante un período de dos semanas .

La Figura 13 muestra imágenes de Microscopio Electrónico de efecto túnel Criogénico (cryo-TEM) de selenoglicoproteína encapsulada en polimersomaa pH 7.4.

DEFINICIONES Para facilitar una comprensión de la presente invención, una serie de términos y frases se definen más abajo: Como se usa en este documento, los términos "péptidos", "polipéptido" y "proteína" se refieren a una secuencia primaria de aminoácidos que se unen por "enlaces peptídicos" covalentes." En general, un péptido consiste de unos pocos aminoácidos, típicamente de 2-50 aminoácidos, y es más corto que una proteína. El término "polipéptido" abarca los péptidos y las proteínas.

El término "glicoproteína ( s ) " o "glicopéptidos ( s ) " se refiere a una proteína o péptido que contiene uno o más residuos de carbohidrato covalentemente unidos a la cadena del polipéptido. El término "selenoproteína ( s ) " o "selenopéptido (s ) " se refiere a una proteína o péptido que contiene uno o más átomos de selenio. Típicamente, los átomos de' selenio se incorporan en las proteínas dentro de los aminoácidos que contienen selenio que incluyen selenocisteína y selenometionina .

El término "selenoglicoproteína (s) , " "selenoglicopéptido (s) " o "SGP(s)" se refiere a una glicoproteina o glicopéptidos que incorporan uno o más átomos de selenio. Típicamente, las "selenoglicoproteínas" comprenden uno o más aminoácidos que contienen selenio. Las "selenoglicoproteínas" pueden comprender un número de carbohidratos en cualquier número de formas diferentes.

Los términos "muestra" y "espécimen" se usan en su más amplio sentido y abarcan las muestras o especímenes obtenidos de cualquier fuente. Como se usa en la presente, el término "muestra" se usa para referir a las muestras biológicas obtenidas a partir de animales (que incluyen humanos), y abarca fluidos, sólidos y tejidos. En algunas modalidades de esta invención, las muestras biológicas incluyen fluido cerebroespinal (CSF) , fluido seroso, orina y saliva, sangre, y productos de sangre tales como plasma, suero y similares. Sin embargo, estos ejemplos no deben interpretarse como limitantes de los tipos de muestras que encuentran uso con la presente invención.

Como se usa en la presente, el término "levadura" y "células de levadura" se refiere a microorganismos eucarióticos , clasificados en el reino Fungi, que tienen una pared celular, membrana celular y componentes intracelulares . Las levaduras no forman una agrupación taxonómica o filogenética específica. Actualmente aproximadamente 1,500 especies se conocen; se estima que solamente y 1% de todas las especies de levadura se han descrito. El término "levadura" se toma frecuentemente como un sinónimo de S. cerevisiae, pero la diversidad filogenética de las levaduras se muestra por su colocación en divisiones tanto Ascomycota como Basidiomycota . El término "levadura" abarca la levadura de cerveza, levadura de destilador y levaduras de panadero. Las levaduras en gemación ("verdaderas levaduras) se clasifican en el orden de Saccharomycetales . La mayoría de especies de levadura se reproducen asexualmente por gemación, aunque algunas se reproducen por fisión binaria Las levaduras son unicelulares, aunque algunas especies se convierten en multicelulares a través de la formación de una cuerda de células en gemación conectadas conocidas como pseudohifa, o falsa hifa. El tamaño de la levadura puede variar grandemente dependiendo de las especies, midiendo típicamente 3-4 µp? de diámetro, aunque alguna levadura puede alcanzar hasta 40 µ??.

Como se usa en la presente, los términos "levadura enriquecida con selenio" y "levadura selenizada" se refiere a cualquier levadura (por ejemplo, Saccharomycés cerevisiae) que se cultiva en un medio que contiene sales inorgánicas de selenio .La presente invención no se limita por la sal de selenio usada. Claramente, una variedad de sales de selenio se contemplan por ser útiles en la presente invención que incluyen, pero sin limitarse a, selenito sódico, o seleniato sódico. La selenometionina libre (por ejemplo, no asociada con una célula o levadura) puede usarse además como la fuente de selenio para la levadura enriquecida con selenio como levadura que incorpora esta forma de selenio. Durante el cultivo, debido a la similitud química entre el selenio y el azufre, la levadura incorpora selenio en lugar de azufre en los que son normalmente compuestos orgánicos que contienen azufre dentro de la célula. Un compuesto que contiene selenio en tales preparaciones de levadura es selenometionina que se incorpora en polipéptidos/proteínas . La cantidad de selenio celular total presente en la forma de selenometionina en tales preparaciones podrá variar, pero puede estar entre 10 y 100 %, 20-60 %, 50-75 %, y entre 60 y 75%. El resto del selenio orgánico en preparaciones de levadura selenizada está predominantemente compuesto de intermedios de la ruta para la biosíntesis de selenometionina. Estos incluyen, pero sin limitarse a, selenocisteína, selenocistationina, selenohomocisteína y seleno-adenosilselenometionina . La cantidad de sal de selenio inorgánico residual en el producto terminado es generalmente muy baja (por ejemplo, <2%) .

Como se usa en la presente, el término "SEL-PLEX" se refiere a una levadura enriquecida con selenio no viable, seca (por ejemplo Sacchoromyces cerevisiae de número de acceso CNCM 1-3060, Colección Nacional de Cultivo de Microorganismos (CNCM) , Instituto Pasteur, París, Francia) cultivada en una fermentación semicontinua que proporciona cantidades crecientes de melaza de caña y sales de selenio de manera que minimiza los efectos perjudiciales de las sales de selenio en la velocidad de crecimiento de la levadura y permite la incorporación óptima del selenio inorgánico en el material celular orgánico. El selenio inorgánico residual se elimina (por ejemplo, usando un proceso riguroso de lavado) y no excede 2 % del contenido total de selenio.

Como se usa en la presente, el término "selenio orgánico" se refiere a cualquier compuesto orgánico en donde el átomo de selenio se conecta directamente a un átomo de carbono.

Como se usa en la presente, el término "selenio inorgánico" generalmente se refiere a cualquier sal de selenio (por ejemplo, selenito sódico, selenato sódico) en la que el selenio está en un estado de oxidación -2, +4 y +6.

Como se usa en la presente, los términos "huésped," "sujeto" y "paciente" se refieren a cualquier animal, que incluyen pero sin limitarse a, humanos y animales (por ejemplo, primates, perros, gatos, vacas, caballos, ovejas, aves de corral, pescado, crustáceos, etc.) que se estudia, analiza, prueba, diagnostica o trata. Como se usa en la presente, los términos "huésped," "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente, a menos que se indique de cualquier otra forma.

Como se usa en la presente, el término "p/p" ("peso/peso") se refiere a la cantidad de una sustancia dada en una composición en base al peso. Por ejemplo, un alimento para animales que comprende 0 . 02 % p/p de suplemento alimenticio dietético significa que la masa del suplemento alimenticio dietético es 0 . 02 % de la masa total de la alimentación animal (por ejemplo, 200 gramos de la composición de suplemento alimenticio dietético en 999 , 800 gramos de la alimentación animal) .

Como se usa en la presente, el término "purificado" o "purificar" se refiere a la eliminación de componentes de la muestra. Por ejemplo, las paredes de la célula de levadura se purifican por la eliminación de los componentes que no son de la pared celular de la levadura (por ejemplo, membrana plasmática y/o componentes intracelulares de levadura); ellos se purifican además por la eliminación de los contaminantes u otros agentes aparte de la pared celular de la levadura. La eliminación de los componentes que no son de la pared celular de levadura y/o contaminantes que no son de la pared celular de levadura resulta en un incremento en el por ciento de pared celular de levadura o componentes de la misma en una muestra .

Como se usa en la presente, el término "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de una composición (por ejemplo, que comprende selenoglicoproteinas de la presente invención suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones, aplicaciones o dosificaciones y sin pretender estar limitada a una formulación particular o ruta de administración.

Como se usa en la presente, el término "biodisponibilidad" se refiere a la fracción de una molécula o componente que está disponible para un organismo o alcanza la circulación sistémica. Cuando una molécula o componente se administra por vía intravenosa, su biodisponibilidad es realmente alta. Sin embargo, cuando una molécula o componente se administrada a través de otras rutas (tal como oralmente) , su disponibilidad disminuye (debido a la absorción incompleta y metabolismo de primer paso) . En un marco nutricional, la biodisponibilidad se refiere a las velocidades de absorción y utilización de un nutriente. Diferentes formas del mismo nutriente, por ejemplo, pueden tener diferentes biodisponibilidades .

Como se usa en la presente, los términos "alimentación", "productos alimenticios", "alimento para animal", y "pienso" se refiere a material (es) que se consumen por los animales y aportan energía y/o nutrientes a una dieta del animal. Los ejemplos incluyen, pero sin limitarse a, Proporción Mixta Total (TMR) , forraje (s), perla (s), concentrado ( s ) , premezcla(s) coproducto (s) , grano (s) , grano (s) del destilador, melaza, fibra (s), pienso(s), pasto(s), heno, semilla (s), hojas, harina, soluble (s), y suplemento ( s ) .

Como se usa en la presente, los términos "suplemento alimenticio", "suplemento dietético" , "composición del suplemento dietético", y similares se refieren a un producto alimenticio formulado como un suplemento dietético o nutricional que se usa como parte de una dieta humana o animal, por ejemplo como una adición al alimento para los animales .

Como se usa en la presente, los términos "administración" y "administrar" se refieren al acto de suministrar un fármaco, profármaco, u otro agente, o tratamiento terapéutico (por ejemplo, composiciones de la presente invención) a un sujeto (por ejemplo, un sujeto o células in vivo, in vitro, o ex vivo, tejidos, y órganos). Rutas ilustrativas de administración al cuerpo humano pueden ser a través de los ojos (oftálmica), boca (oral), piel (tópica o transdérmica) , nariz (nasal), pulmones (inhalante), mucosa oral (bucal) , oreja, rectal, vaginal, por inyección (por ejemplo por via intravenosa, vía subcutánea, vía intratumoral , via intraperitoneal , etc.) y similares.

Como se usa en la presente, los términos "co-administración" y "co-administrar" se refieren a la administración de al menos dos agente (s) (por ejemplo, composición que comprende selenoglicoproteinas de la invención y uno o más de otros agentes - por ejemplo, un antibiótico, un terapéutico (por ejemplo, fármaco o producto farmacéutico) , u, otro compuesto biológicamente activo) o terapias a un sujeto. En algunas modalidades, la coadministración de dos o más agentes o terapias es simultánea. En otras modalidades, un primer agente/terapia se administra antes de un segundo agente/terapia. Aquellos con experiencia en la técnica entienden que pueden cambiar las formulaciones y/o rutas de administración de los agentes o terapias diversas usadas. La dosificación adecuada para la coadministración puede ser fácilmente determinada por una persona con experiencia en la técnica. En algunas modalidades, cuando los agentes o terapias se co-administran, los agentes o terapias respectivas se administran en dosificaciones inferiores que la adecuada para su administración sola. Asi, la co-administración es especialmente deseada en las modalidades donde la coadministración de los agentes o terapias baja la dosificación requerida de un agente (s) potencialmente dañino (por ejemplo, tóxico) , y/o cuando la co-administración de dos o más agentes resulta en sensibilización de un sujeto para efectos beneficiosos de uno de los agentes a través de la coadministración del otro agente.

Como se usa en la presente, el término "tratamiento" o los equivalentes gramaticales abarcan la mejoría y/o inversión de los síntomas de la enfermedad (por ejemplo, enfermedad neurodegenerativa) . Un compuesto que causa una mejoría en cualquier parámetro asociado con la enfermedad cuando se usa en los métodos de tamizaje de la presente invención puede identificarse de ese modo como un compuesto terapéutico. El término "tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como profiláctico o medidas preventivas. Por ejemplo, aquellos que pueden beneficiarse a partir del tratamiento con composiciones y métodos de la presente invención incluyen aquellos ya con una enfermedad y/o trastorno (por ejemplo, enfermedad neurodegenerativa, diabetes o falta de o pérdida de función cognitiva) así como aquellos en los que una enfermedad y/o trastorno debe ser prevenida (por ejemplo usando un tratamiento profiláctico de la presente invención) .

Como se usa en la presente, el término "en riesgo de la enfermedad" se refiere a un sujeto (por ejemplo, un humano) que está predispuesto a experimentar una enfermedad particular. Esta predisposición puede ser genética (por ejemplo, una tendencia genética particular para experimentar la enfermedad, tal como desórdenes hereditarios) o debido a otros factores (por ejemplo, edad, peso, condiciones ambientales, exposiciones a compuestos perjudiciales presentes en el medio ambiente, etc.) Asi, no se pretende que la presente invención este limitada a cualquier riesgo particular, ni se pretende que la presente invención este limitada a ninguna enfermedad particular.

Como se usa en la presente, el término "que sufre de la enfermedad" se refiere a un sujeto (por ejemplo, un humano) que está experimentando una enfermedad particular. No se pretende que la presente invención esté limitada a cualquier signo o síntomas, particulares, ni enfermedad. Así, se pretende que la presente invención abarque sujetos que están experimentando cualquier variedad de la enfermedad (por ejemplo, a partir de la manifestación subclínica hasta la enfermedad en toda la extensión de la palabra) en donde los sujetos presentan al menos alguna de las marcas distintivas (por ejemplo, signos y síntomas) asociados con la enfermedad particular .

Como se usa en la presente, los términos "enfermedad" y "afección patológica" se usan indistintamente para describir un estado, signos, y/o síntomas que se asocian con cualquier deterioro del estado normal de un animal vivo o de cualquiera de sus órganos o tejidos que interrumpen o modifican el desempeño de las funciones normales, y pueden ser una respuesta a los factores ambientales (tales como radiación, desnutrición, riesgos industriales, o clima) , a los agentes infecciosos específicos (tales como gusanos, bacterias, o virus) , a defecto inherente del organismo (tales como diversas anomalías genéticas), o a las combinaciones de estos y otros factores.

El término "compuesto" se refiere a cualquier entidad química, producto farmacéutico, fármaco, y similares que puede usarse para tratar o prevenir una enfermedad, mal, dolencia, o trastorno de la función corporal. Los compuestos comprenden tanto los compuestos terapéuticos conocidos como los potenciales. Un compuesto puede determinarse que es terapéutico por tamizaje usando los métodos de tamizaje de la presente invención. Un "compuesto terapéutico conocido" se refiere a un compuesto terapéutico que mostró (por ejemplo, a través de los ensayos en animal o experiencia anterior con administración a humanos) ser eficaz en tal tratamiento. En otras palabras, un compuesto terapéutico conocido no se limita a un compuesto eficaz en el tratamiento de la enfermedad (por ejemplo, cáncer, enfermedad neurodegenerativa, etc.).

Como se usa en la presente, el término "estuche" se usa en referencia a una combinación de reactivos y otros materiales. Se contempla que el estuche puede incluir reactivos tales como nutrientes y fármacos asi como los medios de administración. No se pretende que el término "estuche" esté limitado a una combinación particular de reactivos y/o otros materiales.

Como se usa en la presente, el término "tóxico" se refiere a cualquier efecto perjudicial o dañino en un sujeto, una célula, o un tejido en comparación con la misma célula o tejido antes de la administración del tóxico.

Como se usa en la presente, el término "composición farmacéutica" se refiere a la combinación de un agente activo (por ejemplo, composición que comprende selenoglicoproteinas) con un portador, inerte o activo, haciendo la composición especialmente adecuada para el uso diagnóstico, preventivo y/o terapéutico in vítro, in vivo o ex vivo.

Los términos "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable," como se usan en la presente, se refieren a las composiciones que sustancialmente no producen reacciones adversas, por ejemplo, reacciones tóxicas, alérgicas, o inmunológica, cuando se administran a un sujeto.

Como se usa en la presente, el término "en forma tópica" se refiere a la aplicación de las composiciones de la presente invención a la superficie de la piel y las células de la mucosa y tejidos (por ejemplo, alveolar, bucal, lingual, masticatorio, o mucosa nasal, y otros tejidos y células que recubren los órganos huecos o cavidades del cuerpo) .

Como se usa en la presente, el término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquiera de los portadores farmacéuticos estándar que incluyen, pero sin limitarse a, solución salina regulada con fosfato, agua, emulsiones (por ejemplo, tal como unas emulsiones aceite/agua o agua/aceite) , y diversos tipos de agentes humectantes, cualesquier solventes, cualquier y todos los solventes,' medios de dispersión, recubrimientos, lauril sulfato sódico y agentes que atrasan la absorción, desintegrantes (por ejemplo, almidón de la papa o glicolato sódico de almidón) , y similares. Las composiciones pueden incluir además estabilizadores y conservantes. Los ejemplos de portadores, estabilizadores y adyuvantes se describen, por ejemplo, en Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15ta Ed. , Mack Publ. Co., Easton, Pa . (1975), se incorpora como referencia en la presente) . En algunas modalidades, un producto alimenticio (por ejemplo, material dietético y/o tratamiento) actúa como un portador (por ejemplo, de una composición de selenoglicoproteina de la invención) .

Como se usa en la presente, el término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquier sal (por ejemplo, obtenida por la reacción con un ácido o una base) de un compuesto de la presente invención que es fisiológicamente tolerada en el sujeto objetivo (por ejemplo, un sujeto mamífero, y/o in vivo o ex vivo, células, tejidos, u órganos) . Las "sales" de los compuestos de la presente invención pueden derivarse de bases y ácidos orgánicos e inorgánicos. Los ejemplos de ácidos incluyen, pero sin limitarse a, ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, fumárico, maleico, fosfórico, glicólico, láctico, salicílico, succínico, tolueno-p-sulfónico, tartárico, acético, cítrico, metanosulfónico, etanosulf nico, fórmico, benzoico, malónico, naftaleno-2- , bencenosulfónico, y similares. Otros ácidos, tales como el oxálico, aún cuando no sean farmacéuticamente aceptables por sí mismos, se pueden emplear en la preparación de sales útiles como intermediarios en la obtención de compuestos de la invención y sus sales de adición ácida farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de bases incluyen, pero sin limitarse a, hidróxidos de metales alcalinos (por ejemplo, sodio) , hidróxidos de metales alcalinotérreo (por ejemplo magnesio), amoniaco, y compuestos de fórmula NW4+, en donde W es alquil Ci_4 , y similares. Los ejemplos de sales incluyen, pero sin limitarse a: acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, citrato, camforato, camforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, flucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, cloruro, bromuro, yoduro, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, oxalato, palmoato, pectinato, fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato, undecanoato, y similares. Otros ejemplos de sales incluyen aniones de los compuestos de la presente invención combinados con un catión adecuado tal como Na +, NH4+, y NW4+ (en donde W es un grupo alquil Ci-4) , y similares. Para uso terapéutico se contemplan que las sales de los compuestos de la presente invención son farmacéuticamente aceptable. No obstante, pueden encontrar uso también las sales de ácidos y bases que no son farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, en la preparación o purificación de un compuesto farmacéuticamente aceptable. Para uso terapéutico, las sales de los compuestos de la presente invención que se contemplan son farmacéuticamente aceptables. No obstante, pueden encontrar uso también las sales de ácidos y bases que no son farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, en la preparación o purificación de un compuesto farmacéuticamente aceptable.

Como se usa en la presente, el término "secar" se refiere al secado por aspersión, secado por congelación, secado con aire, secado al vacio o cualquier otro tipo de proceso que reduce o elimina liquido en una sustancia.

Como se usa en la presente, el término "secado por aspersión" se refiere a un método comúnmente usado para secar una sustancia que contiene liquido usando gas caliente para evaporar el líquido para reducir o eliminar liquido en la sustancia. En otras palabras, el material se seca a modo de pulverización o atomización en una corriente de aire seco caliente .

Como se usa en la presente, el término "secado por congelación" y el término "liofilización" y el término "criodesecación" se refiere a la eliminación de un disolvente de la materia en un estado congelado por sublimación. Esto se alcanza congelando el material que se seca por debajo de su punto eutéctico y proporcionando después el calor latente de sublimación. El control preciso del vacío y entrada de calor permiten secar desde el estado congelado sin fundir de nuevo el producto. En la aplicación práctica, el proceso se acelera y precisamente controla en condiciones de presión reducida.

Como se usa en la presente, el término "polvo libre suelto seco" se refiere a un polvo libre suelto seco, por ejemplo un polvo que se puede verter de un envase, bolsa, recipiente etc. sin dificultad de aglomeraciones grandes.

Como se usa en la presente, el término "triturar" se refiere a reducir el tamaño de partícula por impacto, corte, o desgaste.

Como se usa en la presente, el término "lavar" se refiere a la eliminación o limpieza (por ejemplo, usando cualquier tipo de soluto (por ejemplo agua destilada, tampón, o solvente) o mezcla) de impurezas o componente soluble no deseado de una preparación (por ejemplo, una pared celular de levadura) que puede lavarse para eliminar los componentes que no son de la pared celular de levadura a partir de la muestra) .

Como se usa en la presente, el término "polimersoma" se refiere a las vesículas que se ensamblan a partir de polímeros sintéticos en la solución acuosa (por ejemplo, que puede utilizarse para encapsular un material) . Los polimersomas pueden prepararse usando copolímeros de bloques sintéticos anfifílicos para formar la membrana de vesícula, y tiene radios con intervalo de 50 nm a 5 µ?? o más. La mayoría de los polimersomas contienen una solución acuosa en su núcleo y son útiles para encapsular y proteger moléculas sensibles, tales como fármacos, enzimas, otras proteínas y péptidos así como fragmentos de ADN y ARN . La membrana de polimersoma proporciona una barrera física que aisla el material encapsulado de los materiales externos, tales como aquellos encontrados en los sistemas biológicos. Los ejemplos de polimersomas que encuentran uso en las modalidades de la invención, así como su síntesis, pueden encontrarse, por ejemplo en las patentes de Estados Unidos con núms . 7,867,512, 7,682,603, y 6,835,394, las que se incorporan por este medio como referencia en su totalidad.

Como se usa en la presente, el término "residual" se refiere a materiales no deseados o inútiles.

Como se usa en la presente, el término "agua residual" es cualquier agua que se ha afectado adversamente en la calidad por la influencia antropogénica .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I . Introducción El selenio es un oligoelemento involucrado en regular aspectos del mecanismo de defensa antioxidante en todos los tejidos vivos interactuando con el glutatión del cuerpo (GSH) y sus enzimas antioxidantes principales que contienen Se, glutatión peroxidasa (GPX) y tiorredoxina reductasa (Ver, por ejemplo, Goehring y otros, J. Anim. Sci. 59, 725-732 (1984); Gerloff y otros, J. Anim. Sci. 70, 3934-3940 (1992); incorporadas completamente en la presente como referencia). El glutatión y GPX tienen la capacidad de proteger la integridad de los enlaces no saturados de fosfolípidos de membrana por extinción de los ataques de radicales libres capaces de iniciar y propagar la oxidación de lipido (Ver, por ejemplo, Meister and Anderson, Annu. Rev. Biochem. 52, 711-760 (1983); Deleve and Kaplowitz, Pharm. Ther. 52, 287-305 (1991); Palmer and Paulson, Nutr. Rev. 55, 353-361 (1997); incorporadas completamente en la presente como referencia) .

El selenio se ha asociado además con el riesgo reducido de cáncer en varios estudios epidemiológicos (Ver, por ejemplo, Salonen y otros, Es. J. Epidemiol. 120: 342-349 (1984); Willett y otros, Lancet 2: 130-134 (1983); Virtamo y otros, Cáncer 60: 145-148 (1987); incorporadas completamente en la presente como referencia) . Los diversos compuestos de selenio de origen natural y sintético mostraron inhibir el desarrollo del tumor en los estudios con animales en una amplia variedad de dosificaciones (Ver, por ejemplo, Ip, . J. Nutr. 128: 1845-1854 (1998); incorporadas completamente en la presente como referencia) . Aunque la mayoría de los estudios con animales han empleado dosis farmacológicas de selenio (>2 mg/kg) en la quimioprevención del cáncer (Ver, por ejemplo, Ip, . J. Nutr. 128: 1845-1854 (1998)), la deficiencia de selenio mostró además mejorar el mamario (Ver, por ejemplo, Ip and Daniel, Cáncer Res. 45: 61-65 (1985) ; incorporadas completamente en la presente como referencia) y carcinogénesis de piel inducida por UVB (Ver, por ejemplo, Pence y otros, 102: 759-761 (1994); incorporadas completamente en la presente como referencia) .

Las proteínas de la pared celular de levadura se conectan a polisacáridos de la pared celular por ' enlace químico, y para liberar la proteína de la pared celular de levadura en la solución, estos enlaces necesitan que se rompan. La práctica estándar para la extracción de proteína de la pared celular de levadura es romper los enlaces usando hidrólisis alcalina (pH 11.5, 80° C) antes de centrifugar para separar las proteínas a partir de polisacáridos glucano que son insolubles en agua.

Los experimentos conducidos durante el desarrollo de las modalidades de la invención se realizaron en un intento de extraer selenoglicoproteínas usando la práctica estándar de hidrólisis alcalina. Estos intentos de extraer selenoglicoproteínas a partir de la pared celular de levadura usando hidrólisis alcalina fracasaron. Más tarde se supo que el fracaso para extraer selenoglicoproteinas de la pared celular de levadura usando hidrólisis alcalina fue debido a la destrucción de las selenoglicoproteinas. Los posteriores intentos para extraer selenoglicoproteinas se condujeron usando un procedimiento de hidrólisis alcalina modificado (pH 11.5, 60° C) . Estos intentos también fracasaron para extraer selenoglicoproteinas de la pared celular de levadura. Los métodos de extracción de proteina de levadura alcalinos, típicos, no funcionaron al intentar extraer selenoglicoproteinas a partir de levadura. Así, se realizaron experimentos adicionales durante el desarrollo de las modalidades de la invención que intentaron extraer selenoglicoproteinas usando una extracción ácida (pH 5, 80° C) . Como se describió en la presente, el método de extracción ácida fue exitoso; las selenoglicoproteinas no se destruyeron y fue posible la extracción.

Así, en algunas modalidades, la invención proporciona nuevos métodos para obtener composiciones de selenoglicoproteinas (SGPs), selenoglicoproteína (SGP), (por ejemplo, obtenidas usando métodos de extracción ácida (por ejemplo, fracciones de selenoglicoproteína dependiente de pH) , composiciones que comprenden selenoglicoproteinas encapsuladas (SGP's) y métodos para usar las mismas (por ejemplo, proporcionar beneficio in vivo (por ejemplo, cambios en los perfiles de expresión génica) , a un sujeto (por ejemplo humano, animal, etc.))- Particularmente, los experimentos conducidos durante el desarrollo de las modalidades de la invención demuestran que las composiciones (por ejemplo que comprenden SGP (por ejemplo, aisladas a través de un método de la invención) ) y métodos de la invención pueden usarse para proporcionar el selenio biológicamente disponible a un sujeto (por ejemplo aumentando de ese modo el . contenido de selenio del tejido y/o músculo dentro de sujeto (por ejemplo, llevando de ese modo a la estabilización y/o aumento de la salud de un sujeto))). En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para obtener SGP's, composiciones que comprenden SGP's encapsuladas (por ejemplo, polimersoma encapsulado) y los métodos para usar las mismas para alterar la función celular (por ejemplo, proporcionando de ese modo efectos beneficiosos a un sistema de un sujeto (por ejemplo, que incluyen pero sin limitarse a, sistema musculoesquelético, el sistema neurológico, el sistema nervioso, el sistema endocrino, el sistema metabólico, y/o el sistema inmunológico) . La invención proporciona además métodos para usar SGPs solo o en combinación con uno o más de otros agentes activos para tratar o prevenir la enfermedad (por ejemplo, crecimiento de cáncer y/o metástasis) . La invención proporciona además métodos para usar SGPs para mejorar la salud animal (por ejemplo ganado) . En algunas modalidades, las composiciones de la invención se utilizan para suplementar, potenciar y/o mejorar la salud y/o el valor nutricional de los productos alimenticios (por ejemplo carne, productos lácteos, huevos, etc.) En algunas modalidades, la invención proporciona composiciones que comprenden SGPs y métodos para usar la misma tal como un suplemento terapéutico, nutricional, y/o tratamiento profiláctico (por ejemplo, para la salud general, para estimular el sistema inmunológico, para enfermedad neurodegenerativa, para mejorar la función cognitiva, para el tratamiento o prevención de cáncer, crecimiento del tumor y/o metástasis, etc.), y métodos para preparar, producir, purificar, aislar, extraer, y/o caracterizar las mismas. La invención proporciona además SGPs y métodos para usar SGPs para alimentar animales y/o suplementar el alimento · para animales .

La invención proporciona además composiciones de selenio solubles (por ejemplo SGPs) y métodos de uso, producción, y purificación de estas. Por ejemplo, en algunas modalidades, la invención proporciona SGPs solubles (Ver, por ejemplo, Ejemplos 1-2 que describen la generación de (por ejemplo, separación y caracterización de) fracciones de SGP dependiente pH) , y composiciones y métodos para administrar los mismos (Ver, por ejemplo, Ejemplos 3-4). En algunas modalidades, la invención proporciona selenio (por ejemplo, selenio orgánico (por ejemplo, fracción de SGP dependiente de pH de SEL-PLEX u otra levadura enriquecida con selenio) ) en una forma soluble que se administra a un sujeto a través de una variedad de rutas (por ejemplo, oral, tópica, intravenosa, etc.)- En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de selenio soluble con bajo contenido de fibra (por ejemplo selenio orgánico). En algunas modalidades, la invención proporciona composiciones y métodos para sistemas de suministro de selenio orgánico soluble (por ejemplo, selenoglicoproteinas encapsuladas en polimersoma, nanocápsulas, polímeros, etc.).

La levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) , que se cultiva en un medio que contiene selenio (por ejemplo, selenio inorgánico (por ejemplo, selenito sódico (Na 2Se03) ) ) metaboliza el selenio (por ejemplo, selenio inorgánico) e incorpora el selenio en lugar de azufre en la cisteína y metionina, produciendo proteínas que contienen selenoaminácidos (SeCys y Se et) (Demirci y otros. J. Agrie. Food Chem. 47, 2496-2500 (1999), Demirci & Pometto. J. Agrie. Food Chem. 47, 2491-2495 (1999), Ouerdane & Mester. J. Agrie. Food Chem. 56,11792-11799, (2008), cada una de las cuales se incorpora completamente en la presente como referencia) . ALLTECH, Inc. (Nicholsville , KY, Estados Unidos) produce levadura enriquecida con selenio secado por aspersión vendida bajo el nombre de SEL-PLEX como un suplemento nutricional de piensos y alimentos, que contiene "selenio orgánico" (ver, por ejemplo, Korhola y otros. Res. 18, 65-68, (1986), incorporada completamente en la presente como referencia) . La concentración mínima de selenio en SEL-PLEX es 1500 ppm y las proteínas son los portadores exclusivos de este (Ver, por ejemplo, Surai. Nottingham University Press 2002, 234-236 (2002), Kelly & Power. J. Dairy Sci. 78, 237-242 (1995), McSheehy y otros Analyst 130, 35-37 (2005) , incorporadas completamente en la presente como referencia) . Existen dos mezclas de proteínas en la levadura: proteínas presentes en el interior de la célula de levadura y proteínas asociadas con los mananos de la pared celular de levadura (Ver, por ejemplo, Sedmak. Publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos. núm. US 2006/0263415, incorporada completamente en la presente como referencia) . Aproximadamente 17.0 % en peso de SEL-PLEX comercial es soluble en agua, y este material contiene menos de 6.5 % de selenio total que está presente en SEL-PLEX Estudios de alimentación con pollo en el que se usaron SEL-PLEX y selenito sódico como las fuentes de selenio, indicaron una transferencia de selenio mucho mejor por SEL-PLEX en un músculo de la pechuga de pollo. Una variedad de bio-actividades se descubrieron para la administración oral de SEL-PLEX, (Ver, por ejemplo, Rayman. The Lancet 356, 233-241 (2000), McKenzie Trends in Immunology 19, 342-345 (1998), Tapiero. Biomedicine & Pharmacotherapy 57, 134-144 (2003), Combs & Grey Pharmacol. Ther. 79, 179-192 (1998), Clark y otros J. Am. Med. Assoc. 276, 1957-1963 (1996) , incorporadas completamente en la presente como referencia) .

En algunas modalidades, la invención proporciona la separación, y caracterización física y química de selenoglicoproteínas (SGP's) a partir de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) que crece en medio que contiene selenio (por ejemplo, selenio inorgánico (por ejemplo, selenito sódico)), y su participación activa en el suministro de "selenio orgánico" a los tejidos (por ejemplo, humano, animal, pollo, etc. ) , por ingestión del alimento objeto (por ejemplo, alimentación), suplementado con o de cualquier otra forma que contiene SGP's de la invención (Ver, por ejemplo, Ejemplos 1-4) . La invención proporciona un suministro tejido-específico, intravenoso, oral, y/o' transdérmico de componentes de selenio soluble activo (por ejemplo, fracciones de SGP dependientes del pH de una levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) ) .

En algunas modalidades, la invención proporciona formas de liberación lenta de los sistemas de suministro de "selenio orgánico" (por ejemplo, nanocápsulas, esferas de polímeros, y SGPs encapsulados en polimersoma) (Ver, por ejemplo Ejemplos 5-9) . En algunas modalidades, la invención proporciona una composición que comprende SGP' s encapsulado en polimersoma. En algunas modalidades, la invención proporciona el suministro potenciado y biodistribución mejorada de SGP's por la encapsulacion de SGP' s en el interior de polimersomas basados en poli (óxido etileno) -bloque-poli (D-caprolactona) (PEO-b-PCL) .

Se describió la separación de diversos componentes celulares de levadura por la extracción de la pared celular a partir de los componentes intracelulares de las células de levadura (Ver, por ejemplo, Otero y otros. J. Chem. Tech. Biotechnol. 66, 67-71 (1996), incorporada completamente en la presente como referencia) . Estas técnicas de separación no se han aplicado para la extracción de levadura de selenio secada por aspersión. Las condiciones alcalinas, convencionales (pH 9.0-14.0) usadas en la técnica en la extracción de las glicoproteínas a partir de levadura (Ver, por ejemplo, Roberge y otros, J. Agrie. Food Chem. 51, 4191-4197 (2003) , incorporadas completamente en la presente como referencia) fracasaron debido a que se eliminaron los sustituyentes SeH o SeMe de los aminoácidos selenocisteina o selenometionina . En otras palabras, los sustituyentes deseados descompuestos y como resultado el selenio que estaba presente en el SGP's original se perdió durante el intento de extracción en condiciones alcalinas cuando se aplicó para la extracción de la levadura que contiene selenoproteinas (Ver, por ejemplo, Tabla 12 del Ejemplo 8) .

Como consecuencia, en algunas modalidades, la invención proporciona composiciones de selenoglicoproteinas (por ejemplo, que comprende una fracción de selenoglicoproteinas dependiente de pH descrita en la presente) y métodos de utilización de las mismas. En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para producir, purificar, aislar, extraer, separar, precipitar, y/o caracterizar selenoglicoproteinas (por ejemplo, a partir de levadura enriquecida con selenio) . En algunas modalidades, la invención proporciona composiciones y métodos para el suministro de composiciones de selenio soluble (por ejemplo, SGPs (por ejemplo, fracciones SGP dependientes del pH) ) a un sujeto, que incluyen composiciones de suplementos dietéticos (por ejemplo, que comprenden SGPs (por ejemplo, productos farmacéuticos, nutracéuticos , suplementos, productos alimenticios, etc.)). En algunas modalidades, la invención proporciona composiciones y métodos para el suministro avanzado (por ejemplo, suministro dirigido, suministro de liberación prolongada, etc.) de selenio (por ejemplo, SGPs (por ejemplo, polimersomas , nanocápsulas , nanoparticulas , polímeros, etc.))- Las composiciones y métodos de la invención encuentran uso en una variedad de aplicaciones, que incluyen pero sin limitarse a, aplicaciones dietéticas (por ejemplo, combinación con piensos o de cualquier otra forma alimentación para los animales) preventivas, terapéuticas así como de investigación. Como consecuencia, en algunas modalidades, la invención proporciona composiciones de alimento para animales (por ejemplo, que comprenden SGPs (por ejemplo, SGPs soluble (por ejemplo, selenio orgánico soluble) ) ) , métodos de fabricación de las composiciones y métodos para proporcionar nutrición (por ejemplo, que comprenden SGPs (por ejemplo, SGPs soluble (por ejemplo selenio orgánico soluble) ) ) para animales que comprenden proporcionar las composiciones a los animales.

II. Extracción, separación, purificación y uso En algunas modalidades de la invención, se obtiene selenio soluble en la forma de selenoglicoproteí as (SGPs) . En algunas modalidades, las SGPs se extraen de una fuente general de selenoproteínas (por ejemplo, levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) ) . En algunas modalidades, la extracción y/o purificación de las SGPs comprende uno o más de etapas de precipitación/extracción dependientes de pH (por ejemplo, como se describió en los Ejemplos 1 y 2). En algunas modalidades, la extracción y/o purificación de SGPs comprende una o más etapas de fraccionamiento dependientes del pH. En algunas modalidades la invención proporciona una extracción ácida de la levadura enriquecida con selenio (por ejemplo. SEL-PLEX) para solubilizar SGP' s (por ejemplo, sin desnaturalizar y/o destruir las SGPs). En algunas modalidades, la invención proporciona que la precipitación dependiente del pH de SGPs a partir de un extracto ácido (por ejemplo, como se describió en los Ejemplos 1-2) produce un contenido aumentado de selenoglicoproteinas, disminuye el contenido de fibras no digeribles, y una alta concentración de selenio (por ejemplo, una concentración de selenio que es más alta que la presente en SEL-PLEX). Asi, en algunas modalidades, la invención proporciona SGP extraída de la levadura enriquecida con selenio en donde el contenido de selenio de SGP es mayor que el contenido de selenio en el material del que se extrajo SGP (por ejemplo, en % en peso/peso, ppm, etc.). En algunas modalidades, la invención proporciona selenio en forma de una fracción de SGP dependiente del pH (por ejemplo, fracciones de pH 4.0 o pH 6.0) de levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) que muestra el mismo nivel de biodisponibilidad o muy similar cuando se administra a un sujeto en comparación con la biodisponibilidad de selenio a partir de la fuente parental de levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) (Ver, por ejemplo, Ejemplo 3, Tabla 5) .

En algunas modalidades, SGPs se extraen de una fuente general de selenoproteínas (por ejemplo, células de levadura enriquecida con selenio (por ejemplo células enriquecidas con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) ) . En algunas modalidades, una porción de las selenoproteínas en una fuente de selenoproteína comprende SGPs (por ejemplo. 0.1%... 0.2% ...0.5% ... 1.0%... 2.0%... 5.0%... 10%... 20%... 50% o más SGP) . En algunas modalidades, una fuente de selenoproteína comprende células (por ejemplo células de levadura) que se cultivaron en presencia de medio que contiene Se (por ejemplo medio rico en Se) . En algunas modalidades, las células que contienen Se (por ejemplo, células de levadura) se procesan para extraer, aislar, y/o purificar selenoproteínas que resultan en una fuente de selenoproteína o composición rica en selenoproteína (por ejemplo composición rica en SGP) . En algunas modalidades, una muestra que comprende selenoproteínas y SGPs se enriquece por SGPs.

En algunas modalidades, una fuente de selenoproteína o composición rica en selenoproteína (por ejemplo, fuente de levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) ) se somete a una o más etapas para producir SGPs aisladas, purificadas, separadas, y/o extraídas. En algunas modalidades, una fuente de selenoproteína se mezcla (por ejemplo, en un portador líquido (por ejemplo, agua, tampón, sal, etc.)) para producir una suspensión de proteína, mezcla, lisado, y/o solución. En algunas modalidades, la fuente de selenoproteína (por ejemplo, fuente de levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX)) se mezcla a alta temperatura (por ejemplo por encima de la congelación, por encima de la temperatura ambiente, 30°C... 40°C... 50°C... 60°C... 70°C... 80°C... 90°C o superior) . En algunas modalidades, la fuente de selenoproteína (por ejemplo, fuente de levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) ) se mezcla a pH bajo (por ejemplo, condiciones ácidas (por ejemplo, pH de aproximadamente 0.5, aproximadamente 1.0, aproximadamente 1.5, aproximadamente 2.0, aproximadamente 3.0, aproximadamente 4.0, aproximadamente 4.5, aproximadamente 5.0, aproximadamente 5.5, aproximadamente 6.0 o aproximadamente 6.5) . En algunas modalidades, la fuente de selenoproteína (por ejemplo, fuente de levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) ) se mezcla suavemente, rápidamente, bien mezclado, mezclado vigorosamente, etc. En algunas modalidades, ' la fuente de selenoproteina (por ejemplo, fuente de' levadura enriquecida- con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) ) se mezcla a pH bajo (por ejemplo, condiciones ácidas (por ejemplo pH de aproximadamente 0.5, aproximadamente 1.0, aproximadamente 1.5, aproximadamente 2.0, aproximadamente 3.0, aproximadamente 4.0, aproximadamente 4.5, aproximadamente 5.0, aproximadamente 5.5, aproximadamente 6.0 o aproximadamente 6.5) y alta temperatura (por ejemplo por encima de la temperatura de congelación, por encima de la temperatura ambiente, 30 °C... 40°C... 50°C... 60°C... 70°C... 80 °C... 90°C, o superior)). En algunas modalidades el pH de las mezclas se mantiene por medio de la adición de ácido o base.

En algunas modalidades, la mezcla de selenoproteina que contiene se centrifuga para separar las fases de liquido/soluble y sólido/insoluble . En algunas modalidades, se selecciona una velocidad centrifuga que es suficiente para separar las fases. En algunas modalidades, la fase liquida comprende SGPs soluble. En algunas modalidades, el pH de la fase liquida se ajusta (por ejemplo, eleva) para precipitar una porción de las SGPs. En algunas modalidades el pH de la fracción liquida se eleva ligeramente a moderadamente (por ejemplo, el pH se eleva aproximadamente 0.1...0.2...0.5...1.0...2.0 ) para precipitar SGPs que eran solubles al pH original, pero no al pH elevado. En algunas modalidades el pH de la fracción liquida se eleva significativamente (por ejemplo, el pH se eleva aproximadamente 1.0...2.0...3.0...4.0...5.0...6.0 ) para precipitar una gran porción de las SGPs que eran solubles al pH original. En algunas modalidades, las selenoglicoproteinas se precipitan y separan de la fase líquida en una variedad de condiciones de pH para generar múltiples fracciones dependientes del pH de selenoglicoproteinas solubles. Por ejemplo, en algunas modalidades, una sola fase líquida que comprende el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble en condiciones ácidas se usa para crear una primera fracción de selenoglicoproteinas solubles precipitadas a un primer pH (por ejemplo, pH de 1.85), una segunda fracción de selenoglicoproteinas solubles precipitadas a un segundo pH (por ejemplo, pH de 3.0), una tercera fracción de selenoglicoproteinas solubles precipitadas a un tercer pH (por ejemplo, pH de 4.0), y una cuarta fracción de selenoglicoproteinas solubles precipitadas a un cuarto pH (por ejemplo, pH de 6.0). En algunas modalidades, precipitar las selenoglicoproteinas de la fase líquida a través de la elevación del pH de la fase líquida comprende reacciones de precipitación secuenciales , múltiples dependientes del pH de la fase liquida.

En algunas modalidades, las SGPs precipitadas se separan por centrifugación de la fracción liquida de pH ajustado (por ejemplo, a una velocidad suficiente para producir las fases separadas liquida y sólida) . En algunas modalidades, las SGPs que se separan de la fase liquida se liofilizan para producir una fracción SGP sólida. En algunas modalidades, el proceso para elevar el pH de la fase liquida y centrifugar para aislar la fracción de SGP se repite para producir fracciones de SGP de diferente solubilidad (por ejemplo, soluble más abajo de pH 1.5 ... soluble más abajo de pH 2 ... soluble más abajo de pH 3 ... soluble más abajo de pH 4 soluble más abajo de pH 5 ... soluble más abajo de pH 6 , etc ) En algunas modalidades, un solo ajuste del pH y las etapas de centrifugación se realizan para producir una fracción que contiene SGPs de un solubilidad deseada ( por ejemplo, soluble más abajo de pH 1.5 ... soluble más abajo de pH 2 ... soluble más abajo de pH 3 ... soluble más abajo de pH 4 ... soluble más abajo de pH 5 ... soluble más abajo de pH 6 , etc.) . En algunas modalidades, la fase liquida que permanece después de la eliminación de la fracción final de SGP encuentra utilidad como un componente de medios de cultivo para las células usadas en la producción adicional de selenoproteínas o SGPs . En algunas modalidades, una composición que comprende selenoglicoproteínas solubles contiene solamente una fracción de selenoglicoproteínas única, dependiente de pH (por ejemplo, selenoglicoproteínas solubles de fase líquida que comprende el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble en condiciones ácidas precipitadas a pH 4.0) . En algunas modalidades, una composición que comprende selenoglicoproteínas solubles contiene dos o más fracciones de selenoglicoproteínas dependientes del pH (por ejemplo, selenoglicoproteínas solubles de la fase líquida que comprende el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble en condiciones ácidas precipitadas a dos o más valores de pH diferentes) .

En una modalidad preferida, el proceso de extracción de SGP a partir de una fuente de selenoproteína (por ejemplo levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) ) y el fraccionamiento dependiente del pH de la mezcla de SGP's (Ver, por ejemplo, las Figuras 2 y 3) comprende dos etapas (Ver, por ejemplo, Ejemplos 1-2, las Figuras 1 y 2) . En la primera etapa, una suspensión de levadura enriquecida con selenio en HC1 0.3N (pH 1.5) se agita y calienta a 80 °C por 8 horas. El pH de la mezcla se mantiene a pH 1.5 por la adición de HC1 concentrado durante la primera hora de extracción. Después de ocho horas la mezcla se centrifuga y la fase líquida se separa. El pH de la solución se ajusta a 1.85, por la adición de 2.0 N NaOH y las SGP' s que tienen solubilidad limitada a este pH precipitan de la solución y se separan de los líquidos (pH 1.85) por la segunda centrifugación y se liofilizan después para producir la fracción SGP sólida de pH 1.85. En algunas modalidades, los líquidos (pH 1.85) se mezclan con los sólidos (pH 1.5) de la primera centrifugación, lo que resulta en el cambio del pH de la mezcla a pH 1.6. La mayoría de las SGP' s soluble a pH 1.6, se transfieren en la fase líquida, sin aumentar los volúmenes de los flujos residuales creados dentro de esta etapa del proceso. El subproducto principal de esta etapa del proceso son sólidos a partir de la segunda centrifugación. La corriente de sólidos residuales constituye aproximadamente 56.5 % en peso de la levadura enriquecida con selenio tomada para la extracción y contiene material valioso de la pared celular de la levadura de selenio que contiene: 38.91 % de proteína y 2477 ppm de selenio. En algunas modalidades, se utilizan estos sólidos (por ejemplo, sólo o en combinación con otro material (por ejemplo, levadura enriquecida con selenio) ) como un suplemento nutricional acorde con el medio ambiente en las dietas para los animales. En la segunda etapa (Ver, por ejemplo, la Figura 3) , la fase líquida (pH 1.6) de la segunda centrifugación (VER la FIG. 2) se transfiere a un mezclador y el pH se ajusta a pH 3.0 por la adición de 2.0 N NaOH y las SGP's que tienen una solubilidad limitada a este pH precipitan de la solución y se separan de los líquidos (pH 3.0) por la tercera centrifugación y finalmente se liofilizan para producir la fracción de SGP sólida de pH 3.0 (Ver, por ejemplo, Ejemplos 1-2 y las Figuras 2 y 3) . La fase líquida (pH 3.0) de la tercera centrifugación se transfiere a un mezclador y el pH se ajusta a pH 4.0 por la adición de 2.0N NaOH y las SGP's que tienen solubilidad limitada a este pH precipitan de la solución y se separan de los líquidos (pH 4.0) por la cuarta centrifugación y finalmente se liofilizan para producir la fracción de SGP sólida de pH 4.0. La fase líquida (pH 4.0) de la cuarta centrifugación se transfiere a un mezclador y el pH se ajusta a pH 6.0 por la adición de 2.0 N NaOH y las SGP's que tienen solubilidad limitada a este pH precipitan de la solución y se separan de los líquidos (pH 6.0) por la quinta centrifugación y se liofilizan después para producir la fracción de SGP sólida de pH 6.0. La corriente de residuales producidas solamente en la segunda etapa del proceso es la corriente de agua residual, que contiene 13.4 % en peso de sólidos (en comparación con el peso de la levadura enriquecida con selenio usada en la extracción) de los que la fracción de proteína constituye aproximadamente 13.3 % en peso, cloruro de sodio de 3.6 % en peso y la glucosa y mañosa mono- y oligosacáridos constituyen aproximadamente 80 % en peso. Esta corriente de "agua residual" de pH 6.0 y la concentración de selenio de 242 ppm pueden reciclarse o reusarse de cualquier otra forma para la preparación de un nuevo lote de levadura de selenio (por ejemplo, utilizado en medios de crecimiento) .

En algunas modalidades, las SGP's precipitadas a pH 4.0 presentan suministro de selenio superior (por ejemplo, al tejido muscular), en comparación con la levadura enriquecida con selenio (por ejemplo SEL-PLEX) y entrega superior a distancia en comparación con las formas inorgánicas de selenio (por ejemplo, selenito sódico (Ver, por ejemplo. Ejemplo 3) . Además, las fracciones de selenoglicoproteinas dependientes del pH (por ejemplo, pH 6.0 ) son de composición diferente de la levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) y permiten la liberación de cantidades similares de selenio mientras que requieren mucho menos de la materia prima (por ejemplo, levadura enriquecida con selenio) .

En algunas modalidades, un procedimiento de extracción de SGP comprende 4 o menos de ajuste del pH y las etapas centrifugación del procedimiento anterior (por ejemplo 1 ajuste de pH y etapa de centrifugación, 2 ajuste de pH y etapas de centrifugación, 3 ajuste de pH y etapas de centrifugación, 4 ajuste de pH y etapas de centrifugación) .

III. Alimentación animal La alimentación animal se refiere a cualquier producto alimenticio usado para alimentar el ganado doméstico (por ejemplo, vacas, cabras, ovejas, caballos, aves, búfalos, alpacas, llamas, burros, muías, conejos, pollos, gansos, pavos o cerdos). Los alimentos para los animales frecuentemente incluyen heno, paja, forraje, piensos granulados y comprimidos, aceites y raciones mixtas y además granos germinados y legumbres. La industria mundial para la alimentación animal consumió 635 millones de toneladas de alimentos en el 2006, con una velocidad de crecimiento anual de aproximadamente 2 %. El uso de las tierras agrícolas para cultivar alimentos en lugar de alimentos para consumo humano puede ser controvertido; algunos tipos de alimentos, tal como el maíz (trigo de las Indias) , pueden servir además como alimento humano, mientras que otros tal como pasto no puede. Adicionalmente para proporcionar una fuente de energía a los animales, los alimentos para animales proporcionan además nutrientes (por ejemplo, selenio) utilizados por el cuerpo.

En algunas modalidades, la invención proporciona composiciones nutricionales (por ejemplo, composiciones de selenio solubles (por ejemplo SGPs) que permiten la generación de composiciones de alimentos para animales que comprenden selenio (por ejemplo, concentraciones elevadas de selenio sobre composiciones de alimentación estándar (por ejemplo selenio soluble)) que disminuyen los costos generales, aumentan la conversión del alimento y mantienen y/o mejoran la calidad de los productos de origen animal (por ejemplo, carne, huevos, productos lácteos, etc.) derivados del ganado que recibe las mismas en comparación con los alimentos convencionales para animales.

Por ejemplo, en algunas modalidades, la invención proporciona una composición de suplemento dietético que comprende las SGPs que pueden combinarse con y/o incorporarse en un alimento para animales y administrarse a (por ejemplo, alimentado a) un animal para proporcionar efectos equivalentes o superiores sobre el rendimiento del crecimiento en el animal (por ejemplo, en comparación con los animales alimentados con dietas con otras formas de selenio suplementario (por ejemplo, levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) ) . En algunas modalidades, una composición de suplemento dietético de la invención aumenta la cantidad de selenio circulante (por ejemplo, localizado en la sangre y/o suero) en un sujeto (por ejemplo, humano o animal) que recibe la composición. En algunas modalidades, una mayor proporción de selenio administrado está biodisponible en las composiciones de selenio soluble de la invención (por ejemplo, SGPs) que en otras formulaciones de selenio (por ejemplo, selenito sódico o levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) ) . Es decir, en algunas modalidades, la invención proporciona composiciones que comprenden selenoglicoproteinas que contienen una proporción superior y/o relación de selenio que se hace disponible (por ejemplo, biodisponible) a un sujeto en comparación con otras formas de selenio (por ejemplo, levadura enriquecida con selenio) lo que significa que se necesitan cantidades menores de una composición que comprende selenoglicoproteina de la invención (por ejemplo, para obtener cantidades de biodisponibilidad similar) . En algunas modalidades, una composición de suplemento dietético de la invención (por ejemplo, que comprende SGPs de la invención) aumenta la cantidad de selenio (por ejemplo, localizado en el músculo u, otro tejido) en un sujeto (por ejemplo, humano o animal) que recibe la composición. En algunas modalidades, las SGPs y/o la administración de selenio soluble resulta en biodisponibilidad de selenio aumentada para el suero, tejido adiposo, tejido muscular, etc.

En algunas modalidades, la invención proporciona un método para aumentar la eficacia por la que un animal utiliza los nutrientes en un alimento de dieta para el animal, que comprende proporcionar al animal una dieta que comprende una composición de suplemento dietético de la invención, en donde la composición del suplemento potencia la capacidad del animal para procesar y utilizar los nutrientes presentes en su dieta. En algunas modalidades, una composición de suplemento dietético de la invención aumenta la cantidad de antioxidantes circulantes (por ejemplo, selenio localizado en la sangre y/o suero) en un sujeto que recibe la composición. En algunas modalidades, una composición de suplemento dietético de la invención aumenta la cantidad de antioxidantes (por ejemplo, selenio localizado en el tejido adiposo, músculo, etc.) en un sujeto que recibe la composición .

IV. Productos farmacéuticos, nutraceuticos y suplementos Los niveles de selenio nutricional se establecieron por la FDA (Ver 21 C.F.R. 101.9 (c) ( 8 ) ( iv) , Enero 1994). Los humanos y animales pueden metabolizar de forma segura cantidades limitadas de formas de selenio tanto inorgánicas como orgánicas y pueden convertir el selenio no metilado a derivados mono- o di- o trimetilados , de los que los derivados monometilados son más tóxicos. (Ver, por ejemplo, Bedwal, R. S., y otros, Medical Hypotheses, 41 (2):150-159 (agosto 1993)). La FDA aprobó la Ingesta Diaria de Referencia (RDIs) de 70 microgramos de selenio para las mujeres lactantes y RDI de 55 microgramos para los adultos no lactantes. La dosificación de selenio de 600 microgramos por día se reportó como segura. (Ver, por ejemplo Ferris G. M. Lloyd, y otros, App. Clin. Biochem. , 26: 83-88 (1989). En aproximadamente esta dosificación, la actividad normal de la enzima glutatión reductasa convierte con seguridad selenoglutatión a seleniuro de hidrógeno en el hígado y los eritrocitos y finalmente se excreta. Así, en tales dosificaciones inferiores, el cuerpo es capaz de metabolizar y excretar con seguridad el selenio que está presente en una forma metálica libre. Sin embargo, al igual que con muchos elementos traza (por ejemplo, selenio), en niveles de dosificación o concentraciones superiores los efectos beneficiosos se invierten y se manifiesta una toxicidad peligrosa. (Ver, por ejemplo, Furnsinn, C. y otros, Internat'l J. of Obesity and Related Metab. Dis., 19(7): 458-463 (1995) ) .

La administración de selenio en forma natural involucra un intercambio científico y médico debido a que, cuando se administra en concentraciones relativamente bajas, el selenio proporciona efectos beneficiosos para la salud, sin embargo, a concentraciones superiores, el selenio presenta una toxicidad dramática de manera que se pierden el potencial beneficioso en la salud y la toxicidad se convierte en la principal preocupación.

Como se describió anteriormente, la invención proporciona ciertas formas de selenio (por ejemplo, SGPs, selenio soluble en agua) que proporcionan efectos beneficiosos a un sujeto. La evidencia mostró que las formas orgánicas de selenio (por ejemplo, levadura enriquecida con selenometionina y selenio) pueden ser menos tóxicas y mejor absorbidas que las formas inorgánicas (Ver, por ejemplo, Manan, Proceedings of the 15th Annual Symposium Nottingham University Press, Nottingham, Reino Unido, págs. 523-535 (1999). Sin embargo, en algunas modalidades, las múltiples formas de selenio se usan en combinación una con otra (por ejemplo, para proporcionar efectos beneficiosos para la salud a un sujeto) . Las fuentes naturales de selenio incluyen, pero sin limitarse a, levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, selenizada) . La cepa de levadura usada no es limitante .

En ciertas modalidades preferidas de la invención, SGPs (por ejemplo derivadas de la levadura enriquecidas con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) , como se describe en los Ejemplos 1-2) es la forma de selenio de selección para las formulaciones y composiciones de la invención. En algunas modalidades, las composiciones que comprenden selenio soluble en agua y/o SGPs proporcionan una forma más biológicamente disponible de selenio en comparación con otras formas de selenio. Sin embargo, otras formas de selenio pueden además encontrar uso en la invención, que incluyen derivados o modificaciones de selenio soluble en agua y/o SGPs, SEL-PLEX , u otras formas de levadura enriquecida con selenio, selenomet ionina, selenocisteina, un compuesto selenito, un compuesto selenato, o derivados, sales, o modificaciones de estas Asi, en algunas modalidades preferidas, cada una de estas formas de selenio pueden usarse como un componente de una formulación. Alternativamente, cada una de las formas de selenio descritas anteriormente pueden enlazarse (por ejemplo, químicamente o físicamente) a un fármaco o terapéutico para formar un derivado selenio-fármaco . Además, las composiciones y formulaciones no están limitadas a una forma de selenio. Claramente, una composición o formulación puede comprender múltiples formas de selenio (por ejemplo, SGPs y SEL-PLEX , o Sod-sel y selenio soluble en agua) .

Otras formas del selenio que encuentran uso en varias modalidades de la presente invención se describen en las patentes de Estados Unidos con núms . 6,911,550, 6,197,295, 5,221,545, y 6,576,233, y las solicitudes de patente de Estados Unidos núms. 20010043925, 20050069594, 20050089530, y 20080107755, incorporadas completamente en la presente como referencia .

Como consecuencia, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas, nutracéuticas , y/o de suplemento (por ejemplo, productos alimenticios y/o composición o tratamiento dietético) que comprende una o más formas de selenio (por ejemplo, SGPs, selenio soluble (por ejemplo, selenio soluble en agua), etc.), solo o en combinación con al menos otro agente, tal como un compuesto estabilizante, otro terapéutico (s) , nutriente (s) , y/o minerales; y pueden administrarse en cualquier, portador biocompatible, estéril, que incluye pero sin limitarse a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, etc.

Los métodos de la presente invención encuentran uso para tratar (por ejemplo, profilácticamente o terapéuticamente) enfermedades (por ejemplo, enfermedad neurodegenerativa, cáncer, etc.) o alterar estados fisiológicos. El selenio (por ejemplo, selenio soluble (por ejemplo, selenio soluble en agua), SGPs))) puede administrarse a un sujeto (por ejemplo, un paciente) por vía intravenosa en un portador farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina fisiológica. Los métodos estándar para el suministro intracelular de compuestos pueden usarse (por ejemplo, suministro a través de liposoma) . Tales métodos son bien conocidos por los expertos en la materia. Las formulaciones de esta invención son útiles para la administración parenteral, tal como intravenosa, subcutánea, intramuscular, e intraperitoneal . En algunas modalidades, las composiciones (por ejemplo, SGPs y/o formulaciones farmacéuticas que comprenden las mismas) se administran por vía oral.

Como es bien conocido en las técnicas médicas, las dosificaciones para cualquier sujeto puede depender de muchos factores, que incluyen el tamaño del paciente, área de superficie corporal, edad, el compuesto particular que se administra, sexo, tiempo y ruta de administración, salud general, e interacción con otros fármacos que se administran simultáneamente .

Como consecuencia, en algunas modalidades las composiciones y/o formulaciones que comprenden selenio (por ejemplo, selenio soluble (por ejemplo, selenio soluble en agua), SGPs, etc.) se administran a un sujeto solo, o en combinación con otras formas de selenio, fármacos, moléculas pequeñas, o en composiciones farmacéuticas donde estas se mezclan con excipiente (s) u otros portadores farmacéuticamente aceptables. En algunas modalidades, el portador farmacéuticamente aceptable es farmacéuticamente inerte. En otras modalidades, las composiciones que comprenden selenio (por ejemplo, selenio soluble (por ejemplo, selenio soluble en agua), SGPs, etc.) se administran solo a los sujetos individuales que sufren de una enfermedad o afección. En otras modalidades de la presente invención, las composiciones que comprenden selenio (por ejemplo, selenio soluble (por ejemplo, selenio soluble en agua) , SGPs, etc.) se administran solo a los sujetos individuales para la promoción de la salud general o la salud de un sistema corporal. Las composiciones que comprenden selenio (por ejemplo, selenio soluble (por ejemplo, selenio soluble en agua), SGPs, etc.) solo o en combinación con una o más formas distintas de selenio pueden añadirse a una bebida o alimento nutricional (por ejemplo, ENSURE, PO ERBAR, o similar) , un multivitaminicos , productos nutricionales , ¦ productos alimenticios, etc. para el consumo diario.

Dependiendo del objetivo buscado que se altera por el tratamiento (por ejemplo, expresión génica asociada con el enve ecimiento, y/o la regulación de la expresión génica asociada con el cáncer y/o el crecimiento del tumor o metástasis), estos productos farmacéuticos, suplemento, y/o composiciones nutracéuticas se formulan y administran sistémicamente o localmente. Las técnicas para la formulación y administración pueden encontrarse en la última edición de "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Publishing Co, Easton Pa. ) . Las rutas adecuadas pueden, por ejemplo, incluir la administración oral o transmucosa; asi como el suministro parenteral, que incluyen administración intramuscular, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular , intravenosa, intraperitoneal, o intranasal.

Para la inyección, las composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio soluble (por ejemplo selenio soluble en agua), SGPs, etc.) se formulan en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer, o solución salina fisiológicamente tamponada. Para la administración a tejido o células, se usan en las formulaciones penetrantes adecuados para la barrera particular que se debe penetrar. Tales penetrantes generalmente se conocen en la técnica.

En otras modalidades, las composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio soluble (por ejemplo selenio soluble en agua), SGPs, etc.) se formulan usando portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica en dosificaciones adecuadas para administración oral. Tales portadores permiten que se formulen las composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio soluble (por ejemplo, selenio soluble en agua), SGPs, etc.) como comprimidos, pildoras, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y similares, para la ingestión oral o nasal para un paciente a tratar.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en la presente invención incluyen composiciones en donde los ingredientes activos (por ejemplo, composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio soluble (por ejemplo, selenio soluble en agua), SGPs, etc.) están contenidos en una cantidad eficaz para lograr el objetivo pretendido. Por ejemplo, una cantidad eficaz del agente farmacéutico puede ser aquella cantidad que altera la expresión de un gen especifico (por ejemplo, KTLG, GRB2, DNAJ3, TGFB1, MAPK8, C1R, UBE4A, SMPX, USP22, y/o PTP4A1 ) . La determinación de ciertas cantidades efectivas está dentro de la capacidad de aquellos con experiencia en la técnica.

La invención proporciona además SGPs dependientes del pH y composiciones que comprenden las mismas para el uso en la prevención y/o tratamiento terapéutico del cáncer (por ejemplo, para prevenir o retrasar el cáncer/progresión del tumor y/o metástasis) . Por ejemplo, en una modalidad preferida, una fracción SGP dependiente del pH de una levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) se administra a un sujeto para regular la expresión (por ejemplo, en una forma deseada) de un gen asociado con el crecimiento del cáncer y/o metástasis) . Como se describió en la presente, ciertas fracciones, SGP solubles se identificaron que poseen propiedades biológicas (por ejemplo, la capacidad para regular la expresión génica) que el material de origen de la que se deriva la fracción SGP soluble, (por ejemplo, levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) ) no posee (Ver, por ejemplo, el Ejemplo 4 y las Figuras 7-11) . En una modalidad preferida, la fracción SGP dependiente del pH de una levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) es una fracción dependiente de pH 4.0, aunque otras fracciones (por ejemplo, pH 3.0, pH 6.0, etc.) encuentran uso además en las composiciones y métodos de la invención.

Adicionalmente a los ingredientes activos de estas composiciones farmacéuticas que contienen selenio (por ejemplo, selenio soluble (por ejemplo, selenio soluble en agua), SGPs, etc.) pueden contener portadores farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y auxiliares que' facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. Las preparaciones formuladas para la administración oral pueden estar en forma de comprimidos, grageas, cápsulas, o soluciones.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden fabricarse de una manera que se conozca en si (por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, preparación de grageas, levigación, emulsificación, encapsulación, atrapamiento o liofilización) .

Las formulaciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Además, las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse como suspensiones de inyección oleosa apropiadas. Los solventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como etil oleato o triglicéridos , o liposomas. Las suspensiones inyectables acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetil celulosa de sodio, sorbitol, o dextrana. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.

Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener combinando los compuestos activos con un excipiente sólido, opcionalmente triturando una mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir los auxiliares adecuados, si se desea, para obtener el núcleo de las tabletas o grageas. Los excipientes adecuados son rellenos de carbohidratos o proteínas, tales como azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol, almidón de maíz, trigo, arroz, papa, etc.; celulosa tal como metilcelulosa , hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa de sodio; y gomas, que incluyen arábiga y tragacanto; proteínas, tales como gelatina y colágeno. Si se desea pueden añadirse agentes desintegrantes o solubilizadores, tales como el polivinil pirrolidona reticulado, agar, ácido algínico o una sal de éstos tal como alginato sódico.

Los núcleos de grageas se proporcionan con recubrimientos adecuados tales como soluciones concentradas de azúcar, que también pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, carbopol gel, polietilenglicol, y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y solventes orgánicos o mezclas de disolventes adecuados. Los colorantes o pigmentos pueden añadirse a los recubrimientos de las grageas o tabletas para la identificación del producto o para caracterizar la calidad del compuesto activo, (es decir, dosificación) .

Las preparaciones farmacéuticas que se pueden usar por vía oral incluyen las cápsulas duras hechas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un revestimiento tal como glicerina o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los ingredientes activos mezclados con un relleno o aglutinantes, tal como lactosa o almidones, lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio, y, opcionalmente, estabilizadores. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida, o polietilenglicol líquido, con o sin estabilizadores .

Las composiciones que comprenden un compuesto de la invención formulado se pueden preparar en un portador farmacéutico aceptable, colocar en un recipiente adecuado, y etiquetar para el tratamiento de una condición indicada. Para las composiciones o formulaciones que comprenden selenio, las condiciones indicadas en la etiqueta pueden incluir el tratamiento de condiciones relacionadas con el tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad o condición (por ejemplo, cáncer, enfermedad neurodegenerativa y/o la función cognitiva) .

La composición farmacéutica puede proporcionarse como una sal y puede ser formada con muchos ácidos, que incluyen, pero sin limitarse a clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en solventes acuosos u otros solventes protónicos que son las formas de base libre correspondientes.

En otros casos, la preparación preferida puede ser un polvo liofilizado en 1 mM-50 mM de histidina, 0.1%-2% de sacarosa, 2%-7% de manitol a un intervalo de pH de 4.5 a 5.5 que se combina con el tampón antes del uso.

Para cualquier compuesto usado en los métodos de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Después, preferentemente, la dosis puede formularse en modelos animales (particularmente modelos murinos) para lograr un intervalo de concentración circulante deseable.

Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a aquella cantidad que mejora o previene los síntomas de un estado o condición de la enfermedad (por ejemplo, alterando la expresión génica) . La toxicidad y la eficacia terapéutica de estos compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o en animales de experimentación, por ejemplo, para calcular la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y el DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) . La proporción de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como el cociente DL50/DE50. Se prefieren los compuestos que exhiben grandes índices terapéuticos. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo de células y estudios en animales adicionales pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en humanos. La dosis de estos compuestos se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación varia dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada, la sensibilidad del paciente, y la ruta de administración.

La dosificación exacta puede elegirse por un sujeto o por un médico considerando el paciente que se trata. La dosificación y administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes de la porción activa o para mantener el efecto deseado (por ejemplo, alteración de la expresión génica en un sujeto) . Los factores adicionales que se pueden tomar en cuenta incluyen la gravedad del estado de enfermedad, edad, peso, y género del paciente, dieta, tiempo y frecuencia de la administración, combinación (es) de fármaco (s), sensibilidad a reacciones, y tolerancia/respuesta a la terapia. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada pueden administrarse cada 3 a 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas o una vez cada mes dependiendo de la vida media y tasa de eliminación de la formulación particular .

En algunas modalidades, el selenio (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, etc.) se administra a una dosis diaria de entre 25 y 600 µg por día (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, y/o SGP se administra a un sujeto de manera de proporcionar entre 25 y 600 g de selenio al sujeto cada día) . En modalidades preferidas, el selenio se administra en una dosis diaria de entre 50 y 200 µ? por día. En otras modalidades preferidas, el selenio se administra en una dosis diaria de entre 100 y 200 µg por día. Pueden usarse dosis fuera de 25 y 600 g. En algunas modalidades, una sola dosis de selenio (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, etc.) se administra una vez al día. En otras modalidades, 2, 3, 4, o más dosis pueden administrase cada día (por ejemplo, una vez en la mañana y una vez en la noche, o una vez cada 4 a 6 horas) . Por ejemplo, en algunas modalidades, selenio (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, etc.) se administra a un sujeto en tres dosis separadas, más de tres dosis separadas, dos dosis separadas, o menos de dos dosis separadas. En algunas modalidades preferidas, la dosis diaria se administra en una cápsula de liberación prolongada. En algunas modalidades preferidas, la dosis diaria es entre 25-75 xq de selenio (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGPs, etc.) . En otras modalidades preferidas, la dosis diaria es 200 g de selenio (por ejemplo, selenio orgánico, levadura selenizada, SEL-PLEX, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGPs, etc.).

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse en un número de formas dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y del área a tratar. La administración puede ser tópica (que incluye, oftálmica y a las membranas mucosas que incluyen, suministro vaginal y rectal), pulmonar (por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, que incluyen por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica) , oral o parenteral. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intraventricular . Las composiciones y formulaciones que comprenden selenio se cree que sean particularmente útiles para la administración oral.

Las composiciones y formulaciones farmacéuticas, nutracéuticos y/o suplementos que contienen selenio (por ejemplo que contienen SGP) para administración tópica pueden incluir parches transdérmicos , pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, líquidos y polvos. Los portadores farmacéuticos convencionales, acuosos, en polvo o bases oleosas, espesantes y similares pueden ser necesarios o deseables .

Las composiciones y formulaciones para la administración oral incluyen polvos o gránulos, suspensiones o soluciones acuosas o medios no acuosos, cápsulas, sobres o tabletas. Los espesantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, agentes de dispersión o aglutinantes pueden ser deseables.

Las composiciones y formulaciones para la administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero sin limitarse a, potenciadores de penetración, compuestos portadores y otros portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Así, en algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas, nutracéuticos, y/o suplementos de la presente invención incluyen, pero sin limitarse a, soluciones, emulsiones, y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones se pueden generar a partir de una variedad de componentes que incluyen, pero sin limitarse a, líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes .

Las formulaciones farmacéuticas, nutracéuticos, y/o suplementos de la presente invención, que pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria, se pueden preparar de acuerdo con técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Tales técnicas incluyen la etapa de asociación de los ingredientes activos con el portador(es) farmacéutico ( s ) o excipiente ( s ) . En general, las formulaciones se preparan mediante la asociación intima y uniforme de los ingredientes activos con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y después, si es necesario, conformar el producto.

En algunas modalidades, las composiciones que contienen selenio (por ejemplo selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP) de la presente invención pueden formularse en cualquiera de muchas formas de dosificación posibles tales como, pero sin limitarse a, tabletas, cápsulas, jarabes líquidos, geles blandos, supositorios, y enemas. Las composiciones de la presente invención se pueden formular además como nanopartículas de liberación prolongada (por ejemplo, nanocápsulas ) , vesículas, liposomas, polímeros (por ejemplo, polímeros de impresión molecular (MIPs) , polímeros biodegradables de liberación lenta, polímeros policatiónicos, etc. Las composiciones de la presente invención se pueden formular también en forma de suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener además sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. La suspensión puede además contener estabilizadores. En una modalidad de la presente invención, las composiciones farmacéuticas y/o suplementos se pueden formular y usar como espumas. Las espumas incluyen formulaciones tales como, pero sin limitarse a, emulsiones, microemulsiones, cremas, gelatinas y liposomas. Aunque básicamente similares en naturaleza estas formulaciones varían en los componentes y la consistencia del producto final.

Las composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, etc.) de la presente invención pueden contener además otros componentes adicionales convencionalmente encontrados en las composiciones farmacéuticas. Así, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales adicionales, compatibles, farmacéuticamente activos, tales como, por ejemplo, antipruríticos , astringentes, agentes anestésicos locales o antiinflamatorios, o pueden contener materiales adicionales útiles para formular físicamente diversas formas de dosificación de las composiciones de la presente invención, tales como colorantes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espesantes y estabilizantes. Sin embargo, tales materiales, cuando se añaden, no deberían interferir indebidamente con las actividades biológicas de los componentes de las composiciones de la presente invención. Las formulaciones se pueden esterilizar y, si se desea, mezclar con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, colorantes, aromatizantes y/o sustancias aromáticas y similares que no interactúan perj udicialmente con el (los) ácido (s) nucleico (s) de la formulación.

En algunas modalidades, la invención proporciona composiciones farmacéuticas, nutracéuticos , y/o suplementos que contienen (a) una o más formas de selenio (por ejemplo, SGP (por ejemplo, fracción SGP dependiente del pH) , selenio soluble, selenio soluble en agua, SEL-PLEX) y (b) uno o más de otros agentes (por ejemplo, nutrientes, minerales, agentes terapéuticos, etc.).

La presente invención incluye también métodos descritos en la presente que involucran la administración de manera conjunta de los compuestos que comprenden selenio (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, etc.) con uno o más agentes activos adicionales (por ejemplo, un agente terapéutico (por ejemplo, agente terapéutico para el cáncer, agente terapéutico para la enfermedad de Alzheimer) , antioxidante, etc.). Claramente, un aspecto adicional invención es proporcionar métodos para mejorar las terapias y/o composiciones farmacéuticas, nutracéuticos , y/o suplementos mediante la administración de manera conjunta de una composición que comprende el selenio (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP (por ejemplo, fracción SGP dependiente del pH) , etc.) de esta invención con una composición farmacéutica preventiva o terapéutica, nutracéutico y/o suplemento. En los procedimientos de administración de manera conjunta, los agentes se pueden administrar simultáneamente o secuencialmente . En una modalidad, los compuestos descritos en la presente se administran antes que el (los) otro(s) agente (s) activo (s). Las formulaciones y modos de administración pueden ser cualquiera de los descritos anteriormente. Adicionalmente, dos o más agentes administrados de manera conjunta pueden administrarse cada uno usando diferentes modos o diferentes formulaciones. En algunas modalidades, una composición de la invención se administra de manera conjunta con un tratamiento para el cáncer.

Como consecuencia, en algunas modalidades, una composición que contiene una o más formas de selenio (por ejemplo, SGP (por ejemplo, fracción SGP dependiente del pH) , selenio soluble, selenio soluble en agua, SEL-PLEX) se administra sistémicamente o localmente para inhibir la proliferación celular del tumor y angiogenésis, y/o inducir la muerte celular del tumor en pacientes con cáncer. Por ejemplo, en algunas modalidades, una composición que comprende una fracción SGP dependiente del pH (pH 4.0) de una levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) se administra a un sujeto en condiciones tales que la expresión de uno o más genes asociados con el cáncer/crecimiento del tumor y/o metástasis se regula (por . ejemplo, regulada positivamente o regulada negativamente) de una manera beneficiosa para el sujeto (Ver, por ejemplo, Ejemplo 4) . Las composiciones se pueden administrar por vía intravenosa, intratecal, intraperitoneal asi como oralmente. Además, estas pueden administrarse solas o en combinación con fármacos antiproliferativos .

Donde se contemplan las combinaciones, no se pretende que la presente invención sea limitada por la naturaleza particular de la combinación. La presente invención contempla combinaciones como mezclas simples asi como híbridos químicos. Un ejemplo de lo último es cuando una composición que contiene una o más formas de selenio se enlaza covalentemente a un portador dirigido o a un producto farmacéutico activo. La unión covalente se puede realizar con cualquiera de los muchos compuestos de reticulación comercialmente disponibles.

No se pretende que la presente invención sea limitada por la naturaleza particular de la preparación terapéutica. Por ejemplo, tales composiciones pueden proporcionarse junto con portadores, diluyentes, adyuvantes y excipientes líquidos, en gel o sólidos tolerables fisiológicamente.

Estas preparaciones terapéuticas pueden administrarse a mamíferos para uso veterinario, tales como animales domésticos o criados en granja, y uso clínico en seres humanos de una manera similar a otros agentes terapéuticos. Generalmente, la dosificación requerida para la eficacia terapéutica variará de acuerdo con el tipo de uso y modo de administración, así como los requisitos específicos de los huéspedes individuales.

Tales composiciones se preparan típicamente como soluciones o suspensiones, o en formas sólidas. Las formulaciones orales para el cáncer generalmente incluirán aquellos aditivos empleados normalmente tales como aglutinantes, rellenos, portadore's, conservantes, agentes estabilizantes, emulsionantes, tampones y excipientes como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, y similares. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida, o polvos, y contienen típicamente 1% -95% de ingrediente activo, preferentemente 2% -70%.

Las composiciones se preparan además como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; se pueden preparar también formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, líquido antes de la inyección.

Las composiciones de la presente invención se mezclan frecuentemente con diluyentes o excipientes que son compatibles y tolerables fisiológicamente. Los diluyentes o excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, o similares, y combinaciones de los mismos. Adicionalmente, si se desea, las composiciones pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes estabilizantes o amortiguadores del pH.

Una amplia variedad de agentes terapéuticos encuentra uso con la presente invención. Por ejemplo, cualquier agente terapéutico que se puede administrar de conjunto con una composición que contiene una o más formas de selenio de la invención es adecuado para su uso en la presente invención.

Algunas modalidades de la presente invención proporcionan administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que contiene una o más formas de selenio y al menos un agente contra el cáncer (por ejemplo, un agente anticancerígeno convencional, tales cómo, fármacos quimioterapéuticos, y/o terapia de radiación) .

Los mecanismos adecuados de agentes contra el cáncer para su uso con la presente invención incluyen, pero sin limitarse a, agentes que inducen la apoptosis, agentes que inducen/causan daños en el ácido nucleico, agentes que inhiben la síntesis del ácido nucleico, agentes que afectan la formación de microtúbulos y agentes que afectan la síntesis o estabilidad de las proteínas.

Las clases de agentes anticancerígenos adecuados para su uso en las composiciones y métodos de la presente invención incluyen, pero sin limitarse a: 1) alcaloides, incluyendo, inhibidores de microtúbulos (por ejemplo, Vincristina, Vinblastina, y Vindesina, etc. ) , estabilizadores de microtúbulos (por ejemplo, Paclitaxel (Taxol), y Docetaxel, etc.), e inhibidores de la función de la cromatina, incluyendo, inhibidores de la topoisomerasa, tales como, epipodofilotoxinas (por ejemplo, etopósido (VP-16) , y Teniposido (VM-26) , etc.), y agentes que focalizan la topoisomerasa I (por ejemplo, Camptotecina e Isirinotecan (CPT-11), etc.); 2) agentes de unión covalente al ADN (agentes alquilantes), incluyendo, mostazas nitróogenadas (por ejemplo, Mecloretamina , Clorambucil, Ciclofosfamida, Ifosfamida, y Busulfán (Myleran) , etc.), nitrosoureas (por ejemplo, Carmustina, Lomustina, y Semustina, etc.), y otros agentes alquilantes (por ejemplo, Dacarbazina, Hidroximetilmelamina, Tiotepa, y Mitocina, etc.); 3) agentes de unión no-covalente al ADN (antibióticos antitumorales) , incluyendo, inhibidores de ácido nucleico (por ejemplo, Dactinomicina (Actinomicina D) , etc.), antraciclinas (por ejemplo, Daunorubicina ( Daunomicina, y Cerubidina) , Doxorrubicina (Adriamicina) , y Idarubicina (Idamicina), etc.), antracenodionas (por ejemplo, análogos de la antraciclina, tales como, (Mitoxantrona) , etc.), bleomicinas (Blenoxano) , etc., y plicamicina (Mitramicina) , etc.; 4) antimetabolitos, incluyendo, antifolatos (por ejemplo, Metotrexato, Folex, y Mexato, etc.), antimetabolitos de la purina (por ejemplo, 6-Mercaptopurina (6-MP, Purinetol), 6-Tioguanina (6-TG), Azatioprina, Aciclovir, Ganciclovir, Clorodeoxiadenosina, 2-Clorodeoxiadenosina (CdA) , y 2'-Deoxicoformicina ( Pentostatina ) , etc.), antagonistas de la pirimidina (por ejemplo, fluoropirimidinas (por ejemplo, 5-fluorouracilo (Adrucilo) , 5-fluorodeoxiuridina (FdUrd) ( Floxuridina) ) etc.), y arabinósidos de la citosina (por ejemplo, Citosar (ara-C) y Fludarabina, etc.); 5) enzimas, incluyendo, L-asparaginasa, e hidroxiurea, etc.; 6) hormonas, incluyendo, glucocorticoides , tales como, antiestrógenos (por ejemplo, Tamoxifeno, etc.), antiandrógenos no-esteroideos (por ejemplo, Flutamida, etc.), e inhibidores de la aromatasa (por ejemplo, anastrozol (Arimidex) , etc.); 7) compuestos de platino (por ejemplo, Cisplatino y Carboplatino, etc.); 8) anticuerpos monoclonales conjugados con fármacos contra el cáncer, toxinas, y/o radionúclidos, etc.; 9) modificadores de la respuesta biológica (por ejemplo, interferones (por ejemplo, IFN-D, etc.) e interleuquinas (por ejemplo, IL-2, etc.), etc.); 10) inmunoterapia adoptiva; 11) factores de crecimiento hematopoyético; 12) agentes que inducen diferenciación de la célula tumoral (por ejemplo, ácido todo-trans-retinoico, etc.); 13) técnicas de terapia de genes; 14) técnicas de terapia antisentido; 15) vacunas tumorales; 16) terapias dirigidas contra las metástasis del tumor (por ejemplo, Batimistat, etc.); y 17) otros inhibidores de la angiogénesis .

En modalidades preferidas, la presente invención proporciona la administración de una cantidad eficaz de una composición que contiene una o más formas de selenio de la invención y al menos un agente anticancerígeno convencional que induce apoptosis y/o previene la proliferación celular del cáncer en un sujeto. En algunas modalidades preferidas, el sujeto tiene una enfermedad caracterizada por la metástasis. En aún otras modalidades preferidas, la presente invención proporciona la administración de una cantidad eficaz de unas composiciones que contienen una o más formas de selenio y un taxano (por ejemplo, Docetaxel ) a un sujeto que tiene una enfermedad caracterizada por la sobreexpresión de la(s) proteína (s) de la familia de Bcl-2 (por ejemplo, Bcl-2 y/o BCI-XL) .

Los taxanos (por ejemplo, Docetaxel) son una clase efectiva de agentes quimioterapéuticos contra el cáncer. (Ver, por ejemplo, K. D. iller y G. W. Sledge, Jr. Cáncer Invest igation, 17:121-136 (1999)) . Aunque la presente invención no pretende estar limitada por ningún mecanismo particular, se cree que la muerte celular mediada por taxano procede por medio de la estabilización de los microtúbulos intercelulares y subsiguiente inducción de la vía apoptótica. (Ver, por ejemplo, S. Haldar y otros, Cáncer Research, 57:229-233 (1997)) . En algunas otras modalidades, cisplatino y taxol se contemplan específicamente para su uso con una composición que contiene una o más formas de selenio de la presente invención. En algunas modalidades, cualquier producto farmacéutico que se usa rutinariamente en el contexto de la terapia del cáncer encuentra uso en la presente invención. Los agentes contra el cáncer convencionales son adecuados para la administración con las composiciones descritas que contienen una o más formas de selenio incluyen, pero sin limitarse a, adriamicina, 5-fluorouracilo, etopósido, camptotecina , metotrexato, actinomicina-D, mitomicina C, o con mayor preferencia, cisplatino. En algunas modalidades de la presente invención, los tratamientos terapéuticos comprenden además uno o más agentes que reticulan directamente los ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN) para facilitar el daño del ADN que conduce a unos agentes sinérgicos, antineoplásicos de la presente invención. Por ejemplo, se pueden usar los agentes tales como el cisplatino, y otros agentes alquilantes de ADN. Los agentes que dañan el ADN incluyen además compuestos que interfieren con la replicacion del ADN, mitosis y segregación cromosómica. Tales compuestos quimioterapéuticos incluyen, pero sin limitarse a, adriamicina, también conocida como doxorrubicina, etopósido, verapamilo, podofilotoxina, y similares. Estos compuestos son ampliamente usados en escenarios clínicos para el tratamiento de las neoplasias, y se administran a través de inyecciones en bolo por la vía intravenosa en dosis que oscilan de 25-75 M/2 a intervalos de 21 días para la adriamicina, de 35-50 Mg/M2 para el etopósido por vía intravenosa o el doble de la dosis intravenosa por vía oral.

Los agentes que alteran la síntesis y fidelidad de los precursores y subunidades de los ácidos nucleicos conducen además al daño del ADN y encuentran uso como agentes quimioterapéuticos en la presente invención. Se han desarrollado un número de precursores de ácidos nucleicos. Particularmente útiles son agentes que se sometieron a extensas pruebas y se encuentran fácilmente disponibles. Mientras que, los agentes tales como el 5-fluorouracilo (5-FU) se usan preferentemente por el tejido neoplásico, haciendo este agente particularmente útil para enfocar a las células neoplásicas. Las dosis suministradas pueden estar en el intervalo de 3 a 15 mg/kg/dia, aunque otras dosis pueden variar considerablemente de acuerdo con varios factores, incluyendo la etapa de la enfermedad, susceptibilidad de las células a la terapia, cantidad de resistencia a los agentes y similares .

En modalidades preferidas, los agentes contra el cáncer (por ejemplo, factores anti-angiogénicos se discuten en la presente) usados en la presente invención son aquellos que son susceptibles a la administración en conjunto con una composición que contiene una o más formas de selenio o se asocian de cualquier otra forma con la composición que contiene uno o más formas de selenio tal que se pueden entregar en un sujeto, tejido, o célula sin pérdida de fidelidad del efecto contra el cáncer. Para una descripción más detallada de agentes terapéuticos contra el cáncer tales como un complejo de platino, verapamilo, podofilotoxina, carboplatino, procarbazina, mecloretamina, ciclofosfamida, camptotecina, ifosfamida, melfalán, clorambucilo, bisulfán, nitrosurea, adriamicina, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, bleomicina, plicomicina, mitomicina, etopósido (VP16) , tamoxifeno, taxol , transplatino, 5-fluorouracilo, vincristina, vinblastina y metotrexato y otros agentes anticancerigenos similares, aquellos con experiencia en la técnica se referirán a cualquier número de manuales instructivos incluyendo, pero sin limitarse al, Libro de Referencia Médicas y a "Pharmaceutical Basis of Therapeutics" de Goodman y Gilman, novena edición, Eds. Hardman y otros, 1996.

V. Antioxidantes En algunas modalidades de la presente invención, los antioxidantes se administran de manera conjunta con las composiciones o formulaciones de la presente invención. La presente invención no se limita por el tipo de antioxidante utilizado. Claramente, una gran variedad de antioxidantes se contempla siendo útiles en la presente invención incluyendo, pero sin limitarse a, difenilaminas alquiladas, fenilendiaminas N-alquiladas , fenil- . alfa . -naftilamina, fenil alquilada- . alfa . -naftilamina, dimetil quinolinas, trimetildihidroquinolinas y composiciones oligoméricas derivadas de estas, fenólicos impedidos, hidroquinonas alquiladas, tiodifenil éteres hidroxilados, alquilidenebisfenoles , tiopropionatos, ditiocarbamatos metálicos, 1, 3, 4-dimercaptotiadiazol y derivados, compuestos de cobre soluble en aceite, y similares, Naugalube . RTM. 438, Naugalube 438L, Naugalube 640, Naugalube 635, Naugalube 680, Naugalube AMS, Naugalube APAN, Naugard PANA, Naugalube TMQ, Naugalube 531, Naugalube 431, Naugard BHT, Naugalube 403, y Naugalube 420, ácido ascórbico, tocoferoles incluyendo alfa-tocoferol, antioxidantes solubles en agua tales como, compuestos sulfhidrilos y sus derivados (por ejemplo, metabisulfito sódico y N-acetilcisteina) , ácido lipoico y ácido dihidrolipoico, resveratrol, lactoferrina, derivados del ácido ascórbico (por ejemplo, palmitato de ascorbilo y polipéptido de ascorbilo) , hidroxitolueno butilado, retinoides (por ejemplo, retinol y palmitato de retinilo) , tocotrienoles , ubiquinona, extractos que contienen flavonoides e isoflavonoides y sus derivados (por ejemplo, genisteina y diadzeina) , extractos que contienen resveratrol y similares, semilla de uva, té verde, corteza de pino, própolis, IrganoxlOlO, 1035, 1076, 1222 (fabricado por Ciba Specialty Chemicals Co . , Ltd.)/ Antígeno P, 3C, FR, Sumilizer GA-80 (fabricado por Sumitomo Chemical Industries Co . , Ltd.), beta-caroteno, licopeno, vitaminas C, E, y A, y otras sustancias .

Aunque no es necesaria una comprensión del mecanismo para practicar la presente invención y la presente invención no se limita a ningún mecanismo de acción particular, en algunas modalidades, la administración de una composición que contiene selenio (por ejemplo, selenio soluble, SGP) a un sujeto cambia los perfiles de expresión génica (por ejemplo, TGFB1, APK8, C1R, UBE4A, S PX, USP22, y PTP4A1) en el sujeto. En algunas modalidades, administrar una composición que contiene selenio (por ejemplo selenio soluble, SGP) a un sujeto reduce el nivel de daño en el ADN (por ejemplo, en el tejido cerebral (por ejemplo, neocórtex) , tejido muscular, tejido adiposo, etc.) de un sujeto.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para reducir la sensibilidad de las células a la citotoxicidad del H202 que comprende administrar a las células una composición que contiene selenio (por ejemplo selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX, etc. ) .

La invención proporciona además un método para reducir radicales de superóxido en un sujeto (por ejemplo, en un sujeto que experimenta el estrés oxidativo) que comprende administrar una composición (por ejemplo, un suplemento nutricional) que comprende selenio (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX, etc.) al sujeto. Además, en algunas modalidades, la presente invención proporciona que los sujetos que reciben ciertas composiciones que comprenden selenio (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX, etc.) tienen una mayor capacidad para lidiar con el estrés oxidativo. Aunque no es necesaria una comprensión del mecanismo para practicar la presente invención y la presente invención no se limita a ningún mecanismo de acción particular, en algunas modalidades, los sujetos que reciben una composición que comprende selenio (por ejemplo, suplemento dietético que comprende selenio (por ejemplo, un suplemento dietético que comprende selenio (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX, etc.)) tiene una capacidad mejorada para afrontar al estrés oxidativo debido a la capacidad de las formas seleccionadas de selenio (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX, etc.) para alterar (por ejemplo, reducir) el nivel de radicales de superóxido en el sujeto.

Se contempla que las composiciones y métodos de la presente invención encontrarán uso en varios escenarios, incluyendo, pero sin limitarse a, investigación y diagnósticos clínicos.

VI . Portadores En algunas modalidades, la presente invención proporciona el suministro de selenio (por ejemplo, selenoglicoproteínas) a través de uno o más portadores, incluyendo, pero sin limitarse a las nanopartículas (por ejemplo, nanocápsulas ) , vesículas, liposomas, polímeros (por ejemplo, polímeros de impresión molecular (MIPs) , polímeros de liberación lenta, polímeros policatiónicos, y/o polimerosomas . En algunas modalidades, un portador de selenio proporciona la administración, dirección, y/o liberación prolongada de compuestos que contienen selenio (por ejemplo, selenio soluble en agua, SGP) en un sujeto (por ejemplo, humano o animal) . En algunas modalidades, los portadores (por ejemplo polímero de liberación lenta, nanocápsula, MIP, polimerosomas, etc.) mejoran el suministro de compuestos que contienen selenio (por ejemplo, selenio orgánico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX, etc.) a un sujeto. En algunas modalidades, los portadores (por ejemplo polímero de liberación lenta, nanocápsula, MIP, polimerosomas, etc.) aumentan la biodisponibilidad de compuestos que contienen selenio (por ejemplo, selenio orgánico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX, etc.) a un sujeto.

La invención no se limita por el tipo de portador utilizado. Claramente se puede usar una variedad de portadores incluyendo, pero sin limitarse a, dendrimeros, polimerosomas , nanoparticulas, polímeros de liberación lenta, nanocápsulas, polímeros de impresión molecular y/u otro tipo de portador (por ejemplo, uno cualquiera de los portadores descritos en la presente) . En una modalidad preferida, el portador es un polímero de liberación lenta. En otra modalidad preferida, el portador es un polímero de impresión molecular. En aún otra modalidad preferida, el portador es un polimersoma usado para encapsular la selenoglicoproteína . La invención no se limita por el tipo de polimersoma usado. Claramente, puede utilizarse cualquier polimersoma conocido en la técnica. En algunas modalidades, el polimersoma comprende poli (óxido de etileno) (PEO) copolímero de bloque. Sin embargo, la invención no se limita a eso. Cualquier copolímero de bloque puede ser utilizado, incluyendo, por ejemplo, poli (etiletileno) (PEE), poli (butadieno) (PB o PBD) , poli (estireno) (PS), y poli (isopreno) (PI). En algunas modalidades, el polímero comprende el copolímero dibloque poli (D-caprolactona) (PCL). En algunas modalidades, el polimersoma comprende copolímeros dibloque basados en poli (óxido de etileno) -bloque-poli (D-caprolactona) (PEO-b-PCL) . En algunas modalidades, el polimersoma comprende un copolimero de bloque que es un tribloque, tetrabloque, pentabloque, o al menos un copolimero de seis bloques. En algunas modalidades, el polimersoma se deriva del acoplamiento de poli (ácido láctico), poli (glicólido) , poli (ácido láctico-coglicólico) y/o o poli ( 3-hidroxibutirato) con PEO. La invención no se limita por el tamaño de una selenoglicoproteina encapsulada en polimersoma. Una variedad de tamaños encuentran uso en las composiciones y métodos de la invención que incluyen, pero sin limitarse a, selenoglicoproteinas encapsuladas en polimersoma que son aproximadamente, 50-300 nm de diámetro aunque pueden usarse más grandes (por ejemplo, aproximadamente 350 nm, 400 nm, 500 nm o mayores) y menores (por ejemplo, aproximadamente 40 nm, 30 nm. 20 nm, o menores) selenoglicoproteinas encapsuladas en polimersoma .

En algunas modalidades, la presente invención comprende nanocápsulas de liberación controlada de SGP y esferas MIP para proporcionar un suministro constante y seguro de selenio orgánico (por ejemplo, polímeros de impresión molecular (MIPs) , polímeros de liberación lenta, etc.) en comparación con otras formas de selenio (por ejemplo, levadura enriquecida con selenio, SEL-PLEX, o cápsulas o pildoras de selenio inorgánico de dosis única) . En algunas modalidades, el selenio soluble en agua, soluble, y/o los SGPs se utilizan para la encapsulación y suministro de selenio eficiente a través de los métodos avanzados de suministro en la presente (por ejemplo, nanoparticulas (por ejemplo, nanocápsulas ) , vesículas, polímeros (por ejemplo, polímeros de impresión molecular ( IPs), polímeros de liberación lenta, etc. ) , y/o polimerosomas ) . En alguna modalidad, los métodos avanzados de suministro en la presente mejoran la biodisponibilidad del selenio encapsulado (por ejemplo SGPs o selenio soluble) . En algunas modalidades, los métodos avanzados de suministro en la presente proporcionan la liberación lenta (por ejemplo 12 horas, 24 horas, 2 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 10 semanas, etc. ) de selenio en una solución, un sujeto, suero, etc.

En algunas modalidades, la invención proporciona polímeros de liberación lenta como un portador para las composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio orgánico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, etc.) de la presente invención. Los polímeros de liberación lenta, tal como poli (ácido láctico-ácido co-glicólico) (PLGA), o polímeros policatiónicos , tal como, polietilenimina (PEI ), se pueden utilizar como portadores. En algunas modalidades, los polímeros de liberación lenta proporcionan un suministro controlado de selenio que contiene composiciones (por ejemplo, selenio orgánico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX, etc.). En algunas modalidades, el suministro controlado se presenta cuando un polímero (por ejemplo PEI), ya sea natural o sintético, se combina juiciosamente con una composición que contiene selenio (por ejemplo, selenio orgánico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX, etc.) y, opcionalmente., otros agentes activos o inactivos tal que la composición que contiene selenio (por ejemplo, selenio orgánico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX, etc.) se libera a partir del material de una manera concebida con antelación. La liberación de la composición que contiene selenio (por ejemplo, selenio orgánico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX, etc.) puede ser constante durante un largo periodo, puede ser cíclica durante un largo período, o se puede activar por el medio ambiente u otros eventos externos. En algunas modalidades, el suministro controlado proporciona una terapia más eficaz. En algunas modalidades, el suministro controlado elimina el potencial tanto de baja-dosis como sobredosis. Otras ventajas de usar sistemas de suministro controlado pueden incluir el mantenimiento de los niveles de selenio en un intervalo deseado, la necesidad de un menor número de administraciones y capacitancia aumentada del paciente.

En algunas modalidades, la invención proporciona polimerosomas como portadores para las composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio orgánico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX, etc.) de la presente invención. En algunas modalidades, los polimerosomas se elaboran usando copolímeros de bloques sintéticos anfifilicos para formar la membrana de la vesícula, y tienen radios en el intervalo de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 10 µp? o más (Ver, por ejemplo, Discher y otros Journal of Physical Chemistry B (2002), 205(11), 2848-2854,), incorporados en la presente como referencia en su totalidad) . En algunas modalidades, los polimerosomas contienen una solución acuosa en su núcleo y son útiles para encapsular y proteger moléculas, tales como composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio orgánico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX, etc.) y, opcionalmente, uno o más de los fármacos, enzimas, otras proteínas y péptidos, y fragmentos de ADN y ARN . En algunas modalidades, la membrana de polimerosoma proporciona una barrera física que aisla el material de encapsulado de los materiales externos, tales como los que se encuentran en los sistemas biológicos. En algunas modalidades, los polimerosomas permiten la liberación prolongada de los contenidos dentro de su núcleo (por ejemplo, composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio orgánico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX, etc.)). En algunas modalidades, el uso de polímeros sintéticos para construir los polimerosomas permite a los diseñadores manipular las características de la membrana y así la permeabilidad de control, velocidades de liberación, estabilidad y otras propiedades.

En una modalidad, las composiciones que contienen selenio (por ejemplo selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP) de la presente invención pueden encapsularse dentro de polimersomas basados en poli (óxido de etileno)-bloque-poli (G-caprolactona) (PEO-b-PCL) . Aunque no es necesaria una comprensión de un mecanismo para practicar la invención, y la invención no se limita a ningún mecanismo de acción particular, en algunas modalidades, el PEO proporciona el portador resultante de estabilidad química y mecánica in vitro mejorada, biodisponibilidad in vivo aumentada y vida media prolongada en la circulación sanguínea. PCL, un biomaterial de implante bien conocido, forma la membrana del polimersoma, y facilita la degradación completa y segura in vivo del producto resultante de la hidrólisis de sus enlaces En otra modalidad, las composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenoglicoproteinas ) de la presente invención se pueden encapsular en los polimerosomas sintetizados a partir de mezclas o derivados puros de otros polímeros de bloque biodegradables derivados del acoplamiento del poli (ácido láctico), poli (glicólido) , poli (ácido láctico-coglicólico) o poli (3-hidroxibutirato) con PEO.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona nanocápsulas (Couvreur y otros Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 2002 ; 19 (2 ): 99-13 , incorporada completamente como referencia en la presente) como portadores para las composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio orgánico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX, etc.) de la presente invención (Ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos núm. 7,498,045, incorporada completamente como referencia en la presente) . En algunas modalidades, las nanocápsulas proporcionan la liberación controlada de las composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio orgánico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX, etc.) después de la biodegradacion de la nanocápsula. En algunas modalidades, las nanocápsulas tienen una vida media de biodegradacion de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 horas (por ejemplo, aproximadamente 2 horas...4 horas...6 horas...12 horas...24 horas... 48 horas... 96 horas, etc.)- En algunas modalidades, las nanocápsulas biodegradables de la invención se adaptan para la liberación controlada de composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio orgánico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX, etc.) y opcionalmente una variedad de otros agentes terapéuticos encapsulados, incluyendo macromoléculas, en la circulación in vivo de un sujeto tras su administración. Las composiciones de nanocápsulas de la presente invención están adaptadas además para encapsular concentraciones terapéuticamente eficaces de composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio orgánico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, etc.) y suministrar la misma en la circulación en in vivo de un receptor. En algunas modalidades, una nanocápsula que encapsula composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio orgánico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX, etc.) es una membrana que comprende, por ejemplo, un copolimero de polímero de ácido poliláctico y polietilenglicol . En algunas modalidades, las nanocápsulas se forman por la polimerización interfacial de un monómero o la nanodeposición interfacial de un polímero preformado.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona polímeros de impresión molecular como portadores para las composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio orgánico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX, etc.) de la presente invención (Mosbach. Trends in Biochemical Sciences, Vol . 7, págs . 92-96, 1994., Wulff. Trends in Biotechnology, Vol. 11, pp. 85-87, 1993., Andersson, y otros, Molecular Interactions in Bioseparations (Ngo. T. T. ed.), págs. 383-394 , ), patente de los Estados Unidos núm. 5,959,050, incorporadas completamente como referencia en la presente EXPERIMENTAL Los siguientes ejemplos se proporcionan para demostrar e ilustrar adicionalmente ciertas modalidades y aspectos preferidos de la presente invención y no se pretende que sean interpretados como limitantes del alcance de la misma.

EJEMPLO 1 ?. Preparación secuencial de selenoglicoproteinas solvióles a partir de SEL-PLEX mediante la extracción acida y precipitaciones subsiguientes Un reactor de tres cuellos de 4 1 (extractor#l , ver la Figura 1) equipado con un agitador mecánico, un termómetro, y una manta eléctrica se llenó con 3 1 de H20 desionizada y 50 mi de HC1 0.3N. El reactor se calentó por encima de 50°C y 600g de SEL-PLEX a 1600ppm se añadió en porciones mientras se agitaba. Después de aproximadamente una hora, la temperatura alcanzó 80°C y el pH de la mezcla era de 2.23. El pH se redujo hasta 1.5 por la adición de 13.5ml de HC1 0.3N . El recipiente de reacción se mantuvo con calentamiento y agitación por 7 h. El pH de la mezcla se verificó aproximadamente cada hora para garantizar que el nivel del pH se mantuviera a 1.5. La mezcla ácida posterior a la reacción (pH 1.5) se distribuyó en cuatro jarras de centrifuga de 11 y se centrifugó (centrifuga#l , Ver Figura 1) a 4000 RCF por 20 min a 8°C. El sobrenadante (pH 1.5) y las perlas sólidas se recogieron. El sobrenadante se añadió a un reactor de 3-cuellos de 31 (mezclador#l , Ver Figura 1) en un baño de hielo (4°C), y equipó con un embudo de goteo que contiene NaOH 2N, un agitador mecánico y un electrodo de pH. NaOH 2N se añadió en forma de gotas a la solución mientras se agitaba hasta que el pH de la mezcla alcanzó 1.85. Durante la adición de NaOH se formó un precipitado blanco. La agitación continuó por 30 min y la mezcla se centrifugó nuevamente ( centrifuga#2 , ver la Figura 1) formando un sobrenadante y una perla de selenoglicoproteina . La perla de selenoglicoproteina se recogió y se liofilizó (liofilizador #1, ver la Figura 1) produciendo 1.635g de precipitado blanco. El sobrenadante a pH 1.85 y la perla formada a pH 1.5 se añadieron a un recipiente de reacción (mezclador#2 , ver la Figura 1) y se colocó en baño de agua helada (4°C) . La mezcla se agitó durante 30 minutos y centrifugó después (centrífuga#3, Ver Figura 1 y Figura 2), formando residuos sólidos húmedos y un sobrenadante a pH 1.6, usados después para generar los SGP por precipitación subsiguiente dependiente del pH (por ejemplo, pH 3.0, pH 4.0 y pH 6.0 de las fracciones de SGP como se describe más abajo).

B. Precipitación de las selenoglicoprote nas dependiente del pH El sobrenadante de pH 1.6 se colocó en un reactor (mezclador #3, ver la Figura 2) y NaOH 2N se añadió a la solución mientras se agitaba hasta que el pH de la mezcla alcanzó 3.0. La agitación continuó por 30 minutos más y la mezcla se centrifugó (centrifuga# , ver la Figura 2) formando un sobrenadante y una perla de selenoglicoproteína . La perla de selenoglicoproteína a pH3.0 (SGP pH 3.0) se recogió y se liofilizó ( liofilizador#2 , ver la Figura 2) produciendo un precipitado gris claro. El sobrenadante de pH 3.0 se colocó en un reactor (mezclador #4, ver la Figura 2) y NaOH 2N se añadió a la solución hasta que el pH de la solución aumentó hasta 4.0. La agitación continuó por 30 minutos más y la mezcla se centrifugó (centrifuga#5, ver la Figura 2) formando un sobrenadante y una perla de selenoglicoproteína. La perla de selenoglicoproteína a pH 4.0 (SGP pH 4.0) se recogió y se liofilizó (liofilizador#3, ver la Figura 2) produciendo el precipitado gris claro. El sobrenadante de pH 4.0 se colocó en un reactor (mezclador #5, ver la Figura 2) y NaOH 2N se añadió a la solución hasta que el pH de la solución aumentó hasta 6.0. La agitación continuó por 30 minutos más y la mezcla se centrifugó (centrifuga#6, ver la Figura 2) formando un sobrenadante y una perla de selenoglicoproteína. La perla de selenoglicoproteína a pH6.0 (SGP pH 6.0) se recogió y se liofilizó ( liofilizador# , ver la Figura 2) produciendo el precipitado gris claro. Los precipitados subsiguientes que se habían formado se recogieron mediante centrifugación. La corriente de agua residual de pH 6.0 a partir de la última centrifugación contenía algunos seleno-péptidos, oligosacáridos de mañosa y glucosa (por ejemplo, que se pueden utilizar en la preparación de medios de cultivo de levadura u otras materias nutrientes) . El proceso no produjo residuos tóxicos y es cordial con el medio ambiente.

EJEMPLO 2 Separación y caracterización del SGP soluble La perla que contiene los residuos sólidos a pH 1.5 formados por la extracción ácida de SEL-PLEX se lavó con el sobrenadante a pH 1.85 de la segunda extracción (ver Ejemplo 1) para reducir el volumen de agua usada en el proceso, y para disolver la mayoría del SGP atrapado dentro de la perla. Los residuos sólidos después de la tercera centrifugación a pH 1.6 contienen una cantidad significativa de selenio y se pueden mezclar con un nuevo lote de levadura de selenio antes de ser secada por aspersión, utilizando completamente el material que se tomó para la extracción.

El selenio total, por ciento de concentración de proteína, y el peso de cada una de las fracciones del SGP se promediaron después de tres extracciones subsiguientes de SEL-PLEX (Ver Tabla 1) . Las fracciones SGP extraídas constituyeron del 2.0 al 2.5% en peso de SEL-PLEX y del 4.3 al 5.75% del selenio total, que se presentó en el SEL-PLEX pre-extraído .

Hubo una correlación positiva entre el pH de las fracciones de SGP y el peso de proteínas, siendo cierto lo contrario para la concentración total de selenio (Ver Tabla 1) .

El peso medio de proteínas de las fracciones SGP osciló de aproximadamente 65 a 90 % en peso, y la concentración de selenio para el mismo conjunto de fracciones osciló en el intervalos de aproximadamente 2900ppm a 4900ppm. Las fracciones SGP contenían de 4 a 37% en peso del componente de carbohidrato .

Tabla 1. Los resultados se promediaron de tres extracciones subsiguientes de 600g de SEL-PLEX La electroforesí s en gel de la fracción SGP a pH 1.5 formada por la extracción ácida de SEL-PLEX reveló que las bandas correspondientes a las proteínas de alto peso molecular o proteínas que portan un gran componente de carbohidratos estaban ausentes. La distribución de tamaños similares, con predominio de fracciones de bajo peso molecular, se detectó usando electroforesis capilar y las proteínas de bajo peso molecular a partir de 5.1kDa a 12.2kDa comprendieron más del 90% de las mezclas.

La cromatografía de exclusión por tamaño de tres fracciones SGP a pH 3.0, 4.0, y 6.0 en el gel PIO BIÓ-RAD (tiempos de retención de hasta 6 horas) y en el gel P30 BIO- RAD (menos de una hora del tiempo de retención) , resultó en un pico inicial con tiempo de retención de 5-10 minutos y un pico amplio y tardío, con tiempo de retención de 35-60 minutos. El pico inicial contenía significativamente más proteína: 64.74 a 75.24%, y concentración de selenio significativamente superior: de 2972 a 4252 ppm. El contenido de proteína en el pico tardío fue inferior: 31.66 a 54.95% y la concentración de selenio fue significativamente inferior: de 1193 a 1858 ppm. Este tipo de cromatografía puede producir los SGP con alto contenido de selenio a partir de las fracciones crudas, y demostraron bajo la homogeneidad del componente de carbohidratos en estas mezclas.

La cromatografía de exclusión por tamaño en la resina Superdex Peptide 10/300 GL (A ERSHAM Biosciences; intervalo de fraccionamiento 7.0-100kDa) usando 0.1M AcONH4 (pH 7.5) de diversos péptidos a partir de la digestión tríptica de SEL-PLEX, produjo similar conjunto de picos para las muestras de SGP (10-100kDa y >100kDa) y el patrón de elución completamente diferente para la muestra de SEL-PLEX. Sólo los picos "iniciales", con el tiempo de elución menor que 20 min, contenían selenio. Se recogieron los eluyentes que contenían selenio, liofilizaron y analizaron usando las técnicas SEC ICP MS, MALDI TOF MS y nano ESI MS/MS de las técnicas. Los resultados fueron complementarios y permitieron la detección, identificación y secuenciación de péptidos que contenían selenio. La identificación de proteínas detectadas se obtuvo mediante la búsqueda en la base de datos SwissProt (Ver Tabla 2) .

Tabla 2. Seleno-péptidos y selenoproteínas identificadas a partir de la digestión tríptica del extracto de SEL-PLEX.

Lo más sorprendente de la naturaleza de este método fue que la composición de proteínas de varias fracciones obtenidas por separaciones cromatográficas (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño) de diferentes fracciones de SGP a partir de la precipitación dependiente del pH, fue la misma o muy similar, de acuerdo con los métodos electroforéticos (electroforesis en gel y electroforesis capilar) que se aplicaron. Como se describió en la presente, la extracción de selenoglicoproteínas a partir de levadura enriquecida con selenio fue exitosa a un pH bajo (por ejemplo, 1.5) . Aunque no es necesaria una comprensión de un mecanismo para practicar la invención y la invención no se limita a ningún mecanismo de acción particular, en algunas modalidades, bajo las condiciones ácidas usadas para la extracción de SGP, los núcleos de proteínas no se hidrolizan de manera significativa y sobreviven la mayoría en su forma original. En algunas modalidades, las fracciones de selenoglicoproteínas dependientes del pH (por ejemplo, SGP pH 3.0, SGP pH 4.0, SGP pH 6.0) se generan y administran (por ejemplo, por sí mismos o en conjunto con otro agente) a un sujeto (por ejemplo, para suministrar selenio orgánico a un sujeto (por ejemplo, a través de una vía oral) ) .

EJEMPLO 3 Comparación de biodisponibilidad Los polluelos se alimentaron durante dieciocho días con siete tratamientos dietéticos diferentes (Ver Tablas 3 y 4) para comparar la biodisponibilidad de selenio a partir de la precipitación dependiente del pH de los SGP del extracto ácido de SEL-PLEX midiendo el contenido de selenio en el músculo de la pechuga de pollo: Tabla 3. Composición y especificación de nutrientes de la dieta basal Ingrediente % Maíz 57.80 Torta de habas de soja (48%) 35.00 Aceite de maíz 3.20 Caliza 1.30 Fosfato dicálcico 1.80 Sal 0.45 Mezcla Vit-Min (sin Se) 0.25 DL-metionina 0.20 Total 100 Nutriente ME, kcal/kg 300 CP, % 21.5 Ca, % 1.00 P disponible, % 0.45 Lisina, % 1.21 Metionina, % 0.54 Met + Cys, % 0.89 Na, % 0.20 Tabla 4. Tratamientos dietéticos Como se muestra en la Tabla 5, los pollos alimentados con dietas suplementadas con la fracción SGP de pH 4.0 o pH 6.0 acumularon casi la misma cantidad de deposición de selenio en el tejido muscular de la pechuga en comparación con los pollos alimentados con la dieta suplementada con SEL- PLEX (SP) . En comparación con el control, el nivel de Se fue más del doble en el tejido de los pollos alimentados con la dieta SP y los alimentados con la dieta suplementada con la fracción SGP de pH 4.0 o pH 6.0 tan alto como los pollos que recibieron alimentación suplementada con selenito sódico. Asi, la invención proporciona, en algunas modalidades, que SP, asi como las fracciones SGP descendientes de SP (por ejemplo, pH 4.0 y pH 6.0) están biodisponibles cuando se administran a un sujeto (por ejemplo, en algunas modalidades, SP, SGP pH 4.0 o SGP pH 6.0 están más biodisponibles (por ejemplo, 2 veces o más) que el selenio inorgánico (por ejemplo, selenito sódico) cuando se administra a un sujeto (por ejemplo, como se evidencia mediante el suministro de selenio al tejido del sujeto)).

Tabla 5. Efectos de las fuentes dietéticas de Se sobre la concentración muscular de Se El valor con letras diferentes indica que los resultado on estadísticamente significativos (P<0.05).

EJEMPLO 4 A. Efectos de las diferentes fuentes dietéticas de selenio sobre el perfil de expresión génica en el músculo de la pechuga de los pollos Tejido de músculo de pechuga de polluelos hace referencia en el Ejemplo 3 se utilizó para evaluar similitudes y diferencias en los perfiles de expresión de genes producidos por los siguientes tratamientos dietéticos: Tratamiento 1-basal (Control); Tratamiento 2- Control + 0.3 ppm de selenito sódico (SS) ; Tratamiento 3- Control + 0.3 ppm de SEL-PLEX; Tratamiento 6-0.3 ppm de la fracción SGP extraída de SEL-PLEX (SP) a pH 4.0. La fracción SGP de pH 4.0 se analizó debido a que resultó con niveles casi idénticos de deposición de selenio en el tejido de la pechuga comparado a los obtenidos con SP (Ver Tabla 5) . Como tal, se llevaron a cabo experimentos durante el desarrollo de las modalidades de la invención para determinar si los animales que recibieron la fracción SGP de pH 4.0 experimentaron efectos similares in vivo (por ejemplo, cambios en la expresión génica) a los observados en animales alimentados con SP, o si existían diferencias significativas, medibles.

Muestreo de ' animales y tejido: A los 18 días de edad, cinco pollos de cada grupo de tratamiento (descrito anteriormente y en las Tablas 3 y 4) se seleccionaron al azar y se sometieron a eutanasia por asfixia de argón, seguido por la dislocación cervical. Las muestras de tejido muscular de la pechuga (1 gramo) se retiraron rápidamente y congelaron en nitrógeno líquido. Las muestras se almacenaron a -80°C hasta que se analizaron.

Análisis de microarreglos: El ARN total se aisló del tejido congelado usando el reactivo TRIZ0L1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se purificó usando un estuche RNEASY (QIAGEN, Valencia, CA) . El ARN total se cuantificó por absorbancia a 260 nm y la integridad se confirmó por electroforesis en gel de agarosa y coloración con bromuro de etidio de las bandas 28S y 18S.

El perfil de microarreglo se realizó usando la disposición del genoma de pollo en la matriz génica AFFYMETRIX (Santa Clara, CA) siguiendo protocolos sugeridos por el fabricante.

Los datos se procesaron y cada conjunto de sonda se marcó como P (presente) , (marginal) o A (ausente) basado en la relación de señal en resistencia de ruido usando el algoritmo de sumario de expresión AFFYMETRIX MAS5.0.

Análisis Bioinformático : GeneSpring GX 10.0 (Silicon Genetics, Redwood, CA) se usó para calificar y normalizar los datos de microarreglos y realizar la estadística y análisis de patrones de expresión génica .

Para minimizar la posibilidad de resultados engañosos, los conjuntos de sonda con baja intensidad de señal (etiquetado como Ausente' por el algoritmo MAS5.0) se excluyeron del análisis adicional. Los perfiles de expresión génica filtrados se sometieron después al ANOVA de una via para identificar los conjuntos de sonda que se expresaron diferencialmente entre los grupos y se siguieron por una prueba post hoc para determinar los genes que se cambiaron de manera significativa por los tratamientos de selenio en comparación con el control. Sólo los genes que difirieron del control (P = 0.05) y que tenían un cambio doble de intensidad en la señal correspondiente (FC) = 1.2 se estimaron para cambiarse.

Para visualizar los efectos de los tratamientos dietéticos en los perfiles de expresión génica en el tejido muscular de la pechuga, 693 genes que se identificaron siendo diferencialmente expresados (ANOVA, P<0.05) se sometieron al agrupamiento jerárquico sin supervisión basado tanto en matrices como genes. Como se describió en detalle anteriormente, la fracción SGP de pH 4.0 se derivó directamente de SP, y los grupos de tratamiento dietéticos que reciben SP o la fracción SGP de pH 4.0 mostraron niveles casi idénticos de la deposición de selenio (biodisponibilidad) en el tejido muscular de la pechuga de pollo (Ver Tabla 5, anterior) . Asi, se esperó que ambos grupos de tratamiento de selenio (SP y fracción SGP de pH 4.0) hubieran mostrado cambios de expresión génica idénticos o muy similares. Sin embargo, y muy sorprendentemente, un efecto dietético evidente sobre los perfiles de expresión génica se observó entre los dos grupos de tratamiento (Ver Figura 3) . Específicamente, se observaron diferencias dramáticas entre los perfiles de expresión génica del grupo de tratamiento con SP en comparación con el grupo de tratamiento con la fracción SGP de pH 4.0, donde la mayoría de los genes analizados respondieron de manera diferente a los dos grupos de tratamiento. Esta gran variación en los perfiles de expresión génica originada por el tratamiento con SP contra el tratamiento con la fracción SGP de pH 4.0 fue totalmente inesperada y hasta ahora proporciona información detallada no disponibles referentes a la biología de elementos traza.

Por ejemplo, los 693 genes regulados diferencialmente (P<0.05, ANOVA) se sometieron al agrupamiento jerárquico sin supervisión basado tanto en matrices como genes. En el mapa de calor mostrado en la Figura 3, se muestran en colores los perfiles de expresión génica normalizados que reflejan los cambios de expresión en comparación con el valor medio de cada gen; los colores blanco, negro o gris representan disminución, aumento o ningún cambio en el nivel de intensidad de expresión, respectivamente. El dendrograma en la parte superior del mapa de calor refleja el grado de similitud en los perfiles de expresión entre los tratamientos, mientras que el dendrograma en el lado izquierdo representa las diferencias en los patrones de expresión de genes individuales, a lo largo de todos los tratamientos. Las longitudes de los dendrogramas mostrados en la Figura 3 corresponden al nivel de disimilitud entre los salientes del agrupamiento (un dendrograma corto indica un nivel superior de similitud) .

Los diferentes efectos de la fracción SGP de pH 4.0 y SP sobre los perfiles de expresión génica en el músculo de la pechuga se analizaron más aun comparando el número de genes significativamente cambiados (P <0.05, FC >1.2) por la fracción SGP de pH 4.0 (pH 4), SP y selenito sódico (SS) , como se representa en el diagrama de Venn que se muestra en la Figura 4. Hubo genes significativamente cambiados 198, 173, y 283 por SP, pH 4 y SS, respectivamente. Hubo sólo 21 genes normalmente regulados por . los tres grupos de tratamiento de Se, y 46 regulados normalmente tanto por SP como por la fracción SGP de pH 4.0. Hubo 152 y 127 genes modificados únicamente por SP o fracción SGP de pH 4.0, respectivamente .

Por ejemplo, diversos genes identificados que son diferencialmente o comúnmente regulados en el tejido muscular de la pechuga de pollo como resultado de varios tratamientos de selenio se muestran en las Figuras 5-7.

Se cree que el factor de crecimiento transformante, inducido por beta (TGFBI 68 kDa) participa en las interacciones célula-matriz, adhesión celular, migración y diferenciación. Las mutaciones de este gen se vincularon con varias formas de distrofias corneales. La proteina cinasa activada por mitógeno 8, (MAPK8, conocida también como JNK1) es un miembro de la familia MAP cinasa. Las MAP cinasas actúan como un punto de integración para múltiples señales bioquímicas, y se involucran en una amplia variedad de procesos celulares, tales como la proliferación, diferenciación, regulación de la transcripción y desarrollo. La MAPK8 juega además un papel importante en la respuesta celular al estrés oxidativo, respuesta inmune, así como el metabolismo de carbohidratos y proteínas a través de las vías de señalización de insulina. Se sabe que la sobreactivación de APK8 puede inducir resistencia a la insulina a través de la fosforilación del sustrato receptor de insulina 1 (IRS1).

La Figura 5 proporciona ejemplos de genes (por ejemplo, TGFBI y MAPK8) que se regulan normalmente por SS, SP y fracción SGP de pH 4.0. La Figura 6 proporciona ejemplos de genes (por ejemplo, el componente de complemento IR (C1R) , y el factor de ubiquinación E4A (UBE4A) ) normalmente regulado por SP y fracción SGP de pH 4.0, pero no por S$. El componente del complemento IR (C1R) es una proteina involucrada en la cascada del complemento del sistema inmunitario innato y eliminación de patógenos. La modificación de proteínas con ubiquitina es un mecanismo celular importante para dirigir proteínas anormales o de corta duración para la degradación. UBE4A codifica una ubiquitina ligasa e tipo caja U descrita como un factor ubiquitinación E . Se cree que UBE4A tiene papeles en diferentes procesos bioquímicos distintos de la ubiquitinación, incluyendo el crecimiento y/o diferenciación.

La Figura 7 proporciona ejemplos de genes (por ejemplo, la proteína de músculos pequeños, enlazada al cromosoma X (S PX) y peptidasa específica de ubiquitina (USP22)) que se regularon exclusivamente por la fracción SGP pH 4.0. La proteína de músculos pequeños, enlazadas al cromosoma X (SMPX) es una pequeña proteína expresada específicamente en el músculo estriado y juega un papel importante en la contracción muscular. La peptidasa específica a ubiquitina 22 (USP22) es un gen involucrado en los procesos catabólicos de proteína dependiente de ubiquitina. La USP22 demostró que es un regulador positivo del crecimiento tumoral. La expresión aumentada de USP22 está vinculada a la progresión del cáncer. La capacidad para reducir o desmontar la expresión de USP22 puede proporcionar una inhibición del crecimiento tumoral y/o la progresión del cáncer. Por ejemplo, la reducción de la expresión de USP22 puede regular negativamente la expresión de Mdm2 y ciclina E, lo que resulta en la expresión sobreregulada de p53 y p21, conduciendo a la supresión del ciclo celular e inhibición de la proliferación de células tumorales de vejiga humana.

Un examen adicional del único patrón de expresión génica inducido por la fracción de pH 4.0 en el tejido muscular produce evidencia adicional para el uso terapéutico potencial de las formas químicas de selenio en esta fracción (por ejemplo, para prevenir o retardar la progresión del tumor y/o metástasis) .

Por ejemplo, el gen KITLG (ligando c-KIT) codifica el ligando del receptor de la tirosina-cinasa, que es un factor pleiotrópico que actúa en el útero en el desarrollo de células germinales y células neuronales y hematopoyesis; procesos que se creen reflejar un papel en la migración celular. Recientemente, se descubrieron las variaciones en el gen KITLG que se creen estar asociadas con un riesgo aumentado de cáncer testicular (Kanetsky y otros, 2009) . Además, la sobreexpresión del receptor cognado de KITLG, el producto génico del oncogén KIT, se documentó en el carcinoma de células renales cromófobas y la expresión tanto de KITLG como KIT se sabe que se involucran en la transformación de fibroblastos NIH3T3 y la tumorogénesis de cáncer de pulmón de células pequeñas (Yamazaki y otros, 2003).

Sorprendentemente, se observó que el tejido muscular del sujeto administrado con la fracción de pH 4.0 reguló negativamente de manera significativa el gen KITLG pero su nivel de expresión no se afectó con los otros tratamientos de selenio incluyendo SP, el material parental para la fracción de pH 4.0 (Ver, por ejemplo, Figura 8).

La metástasis es la causa principal de muerte en la mayoría de los cánceres humanos y es un proceso de múltiples etapas en el que las células del tumor primario migran a través de la matriz extracelular, entran a la circulación a través de los vasos sanguíneos recién formados (angiogénesis tumoral) y se diseminan a sitios distantes (extravasación), donde la proliferación comienza de nuevo.

La proteína 2 unida al receptor del factor de crecimiento (Grb2) es una molécula clave en la transducción de la señal intracelular . Es crítica para la progresión del ciclo celular y la motilidad basada en la actina y, como consecuencia, los · procesos más complejos, tales como morfogénesis epitelial, angiogénesis y vasculogénesis . Estas funciones importantes hacen de Grb2 una diana terapéutica para las estrategias destinadas a prevenir la propagación de los tumores sólidos a través de la invasión local y metástasis. De hecho, en la actualidad mucho esfuerzo se ¦ dirige a la búsqueda de formas para bloquear o antagonizar Grb2 debido a que se considera que esta puede representar una estrategia anti-metastásis efectiva (Giubellino, Burke y Bottaro, 2008) .

Como se muestra en la Figura 9, la Grb2 se reguló negativamente de manera significativa en animales tratados con pH 4.0 contra el control y otros tratamientos de selenio, incluyendo selenito sódico y el material parental de selenio para pH 4.0; Sel-Plex.

La actividad anti-cancerigena potencial de la fracción de pH 4.0 no se limita a la regulación negativa de los genes importantes asociados con el cáncer. Por ejemplo, se observó la reducción de la expresión de DNAJA3 en las células de cáncer de mama para mejorar su migración permitiendo aumentar los niveles de interleucina-8 (Kim y otros, 2005) . Este y otros resultados sugieren fuertemente que el refuerzo de los niveles de Tidl (DNAJA3) en células cancerígenas regula negativamente su motilidad y capacidad de metastatizar .

DNAJA3 se reguló positivamente de manera robusta en el tejido muscular de los experimentos en respuesta al selenio de pH de 4.0 (Figura 10), pero se mantuvo sin respuesta, en relación con las condiciones de control en el tejido muscular de los animales que recibieron las otras fuentes de selenio.

B . Efectos de diferentes tratamientos de selenio en los perfiles de expresión génica hepática de pollos Intentando caracterizar adicionalmente los efectos inesperados de la expresión génica diferencial de SP y fracción SGP de pH 4.0 y para determinar si la regulación de la expresión se extiende a otros tejidos, se realizaron estudios de expresión génica como se describió anteriormente en el Ejemplo 4 (a) . En vez del tejido de músculo de la pechuga, se recogió tejido hepático y se analizó a partir de los mismos pollos referenciados en el Ejemplo 3. Adicionalmente de los grupos de tratamiento suplementado con SS, SP y la fracción SGP de pH 4.0, los perfiles de expresión génica hepática de los pollos de los grupos de tratamiento adicionales (fracción SGP pH 1.85 (pH 1.85), fracción SGP pH 3.0 (pH 3), y fracción SGP de pH 6.0 (pH 6) se caracterizaron también y se compararon con el grupo de tratamiento control.

Siguiendo el mismo protocolo experimental referenciado en el Ejemplo (A) , el análisis de los perfiles de expresión génica hepática de los sujetos de cada grupo de tratamiento identificó 1520 genes que se cambiaron de manera significativa en los diferentes tratamientos dietéticos (P < 0.01, ANOVA) . Un análisis de agrupamiento jerárquico no supervisado de estos genes se muestra en la Figura 11 y proporciona evidencia adicional de que el tratamiento con diferentes fuentes de selenio induce un amplio grado de variación en la capacidad de regular la expresión génica. El mapa de calor de la Figura 11 muestra los perfiles de expresión génica normalizada en colores que reflejan los cambios de expresión en comparación con el valor medio de cada gen; los colores blanco, negro o gris representan disminución, aumento o ningún cambio en el nivel de intensidad de expresión, respectivamente. El dendrograma en la parte superior del mapa de calor refleja el grado de similitud en los perfiles de expresión entre los tratamientos, mientras que el dendrograma en el lado izquierdo representa las diferencias en los patrones de expresión de los genes individuales, a lo largo de todos los tratamientos. Las longitudes de los dendrogramas que se muestran en la Figura corresponden al nivel de disimilitud entre los salientes del agrupamiento (un dendrograma corto indica un mayor grado de similitud) .

Las diferencias entre SP y fracción SGP de pH 4.0, asi como entre la fracción SGP de pH 3.0 y fracción SGP de pH 6.0, fueron dramáticas, y sólo unos pocos genes fueron normalmente regulados por el tratamiento con cada una de las fuentes de selenio Generalmente, los efectos del tratamiento con la fracción SGP de pH 1.85 sobre la expresión génica caen entre los grupos de tratamiento con SP y los otros grupos de SGP (Ver Figura 11). Asi, en algunas modalidades, la invención proporciona que el tratamiento con (por ejemplo, dietas que contienen y/o la administración de) SEL-PLEX contra el tratamiento con (por ejemplo, dietas que contienen y/o la administración de) fracciones SGP extraídas de SEL-PLEX, resulta en diferentes actividades biológicas, aunque las diferentes fuentes de selenio muestran efectos similares en términos de biodisponibilidad de selenio.

EJEMPLO 5 Encapsulacion del polimerosoma de selenoglicoproteinas Una mezcla 1:1 de los SGP precipitados a pH 4.0 y 6.0 (Ver, por ejemplo, Ejemplos 1 y 2) se encapsuló en polimerosomas . La concentración de selenio de la mezcla fue de 3,054 ppm y contenía 79.96 % de proteína en peso.

Para generar los polimerosomas de selenoglicoproteína encapsulados, la mezcla se disolvió en tampones acuosos de pH 5.1, 6.2 y 7.4, y la suspensión se mezcló toda la noche en una plataforma de agitación. El SGP no disuelto se eliminó por centrifugación. Para preparar los polimerosomas, el copolímero dibloque basado en PEO (2k) -b-PCL (12k) se disolvió en un disolvente orgánico (por ejemplo, cloruro de metileno, tetrahidrofurano, o dimetil sulfóxido) para producir 1 mM de polímero PEO-b-PCL en solución orgánica. La solución se depositó después en una tira de TEFLON rugosa (aproximadamente 1" x 1" x 1/16" de espesor) y colocó en el fondo de un frasco de vidrio, con el lado rugoso hacia arriba. El disolvente se evaporó en un vacío a temperatura ambiente durante 24-48 horas, resultando en una película seca de copolímeros que pesan 1-10 mg.

Estas películas se · hidrataron con 2-3 mi de una solución acuosa que contiene una relación 1:1 de selenoglicoproteínas a pH 4.0 y pH 6.0, y se sometieron después a ultrasonido en un baño de ultrasonido a 20-100 Hz durante 1-2 horas. Después que se completó la sonicación, los frascos se agitaron inmediatamente durante 1-2 minutos para formar polimerosomas que encapsulan las selenoglicoproteínas en el núcleo acuoso de las vesículas del polímero basado en PEO-b-PCL. Los polimerosomas se extruyeron rápidamente después a través de una membrana de policarbonato de tamaño de poro deseado usando un extrusor LIPOSOFAST para obtener un diámetro promedio deseado de los polimerosomas, en este caso, con intervalos de 50 a 300 nm. Los polimerosomas extruidos se inyectan a continuación en un cásete de diálisis para el intercambio de solución frente a un tampón iso-osmótico de pH 7.4 durante 24 horas para que se eliminaran todas las selenoglicoproteinas sin encapsular.

Una muestra de selenoglicoproteina encapsulada en el polimersoma a pH 7.4 se preparó con una concentración inicial de selenoglicoproteina de 10 mg/ml y dializó frente a ampón PBS iso-osmótico. Esta muestra se fotografió por crio-TEM con aumentos de 21,000x y 52,000x para obtener la identificación visual de la exitosa encapsulación de la selenoglicoproteina dentro de los polimerosomas (Ver Figura 13) . Cryo-TE permite la formación de imágen de las muestras a temperaturas criogénicas en sus estados hidratados nativos evitando de ese modo los cambios conformacionales indeseables. Generalmente, se observaron los polimerosomas esféricos uniformes de tamaños de alrededor de 100 nm o ligeramente más pequeños en la muestra de imágenes. En algunos casos, además de los polimerosomas se observaron agregados aproximadamente esféricas de material amorfo. Estos agregados pueden estar compuestos de selenoglicoproteina liberada desde el núcleo del polimerosoma y que precipita adicionalmente debido a la diferencia en el pH desde el interior hacia el exterior del polimerosoma durante el tiempo que se obtuvieron las imágenes de las muestras.

Las selenoglicoproteínas encapsuladas en los polimerosomas a un pH de 5.1, 6.2 y 7.4 se caracterizaron además midiendo la concentración de selenio (Ver Tabla 6) . Un mi de cada muestra de selenoglicoproteína encapsulada en el polimerosoma se liofilizó, formando un precipitado de polvo blanco, que se pesó más tarde e inspeccionó bajo aumento de 20QX. Se disolvieron cantidades enteras de selenoglicoproteínas encapsuladas en los. polimerosomas usando ácidos concentrados: ácidos perclórico, nítrico y clorhídrico, a una temperatura entre 100°C a 175°C. Las soluciones se diluyeron a 50 mi usando agua desionizada (DI) y analizaron usando un instrumento y metodología MILLENIUM EXCALIBUR.

Tabla 6. Resultados de la encapsulacion EJEMPLO 6 Liberación de selenoglicoproteinas de las nanocápsulas : La liberación de selenoglicoproteina (SGP) de las formulaciones de nanocápsulas # 1 y 3 de la Tabla 6 anterior, preparadas con 10 mg/ml de suspensión de SGP y dializadas frente a tampones de pH 7.4 y 5.1, respectivamente, se controló durante un periodo de 14 días a 37 °C. Para controlar la liberación de selenoglicoproteinas de la selenoglicoproteina encapsulada en nanocápsula, suspensiones dializadas se concentraron por centrifugación de membrana (se usaron tubos de centrifuga con corte de peso molecular de 300 kD) . Las suspensiones concentradas se alicuotaron en tampones iso-osmolares (pH de 5.1 o 7.4) y mantuvieron a 37 DC con muestras N = 2 para cada intervalo de tiempo. Para evaluar el % de liberación de selenoglicoproteina a partir de las nanocápsulas, las muestras se centrifugaron para separar las nanocápsulas intactas en cada intervalo de tiempo. Para determinar que las nanocápsulas se separaron de forma efectiva de la muestra de selenoglicoproteina, se realizaron las mediciones dinámicas de dispersión de luz en las vesículas separadas (retenido) y la solución libre (filtrado) para medir los tamaños de partículas. Se midió la absorbancia UV de la solución libre a 280 nm y el % de liberación de selenoglicoproteinas se calculó como (Amuestra- Ainicial) / (Afinal-Ainicial ) , donde Ainicial es la absorbancia en el dia 0, y Afinal es la absorbancia al final del estudio, cuando se solubilizaron las muestras para provocar la liberación completa (Ver Figura 12). Durante un período de 14 días, aproximadamente el 70 % del SGP a pH 5.1 se liberó de las nanocápsulas en el estado estacionario; mientras que aproximadamente 50 % se liberó a pH 7.4. La velocidad inicial de liberación de los SGP a pH inferior se cree que es debido a la hidrólisis catalizada por el ácido de la membrana de las nanocápsulas, seguido por la difusión constante de selenoglicoproteínas través de la membrana de las nanocápsulas. Estos perfiles de liberación son notablemente similares a los de doxorrubicina, un terapéutico contra el cáncer, encapsulado dentro del interior de polimerosomas basados en PEO-b-PCL (Ver, por ejemplo, Ghoroghchian y otros. Macromolecules, 2006, 39 (5), 1673-1675) . Estos datos confirman que la encapsulación de selenoglicoproteínas, incluso a una concentración relativamente alta de carga, no afecta al patrón de liberación de una manera negativa.

EJEMPLO 7 Preparación de polímeros de liberación lenta SelenoGlicoProteínas (SGP) .

Síntesis de polímero A. Una mezcla 1:1 de los SGP precipitados a pH 4.0 y 6.0 (ver Ejemplo 5) se usó en la preparación de polímeros de liberación lenta de SGP. 150 mg de SGP se disolvieron en 2 mi de ácido metacrílico y 1 mi de agua DI. Algo de calentamiento se aplicó para acelerar la disolución. Una muestra de 0.5 mi de la solución se colocó en un frasco de 5 mi que contiene 10 mg de AIBN, agitó durante 1 min y el aire del tubo se eliminó a vacío y sustituyó por nitrógeno. Los contenidos del tubo se polimerizaron al colocar el tubo en un horno de laboratorio calentado hasta 70 °C por 2 h. El tubo se rompió y el polímero se cortó en secciones delgadas y se secó a alto vacío .

Síntesis del polímero B. Una mezcla de.: 0.064ml de ácido metacrílico, 0.091ml de 2-hidroxietil-metacrilato, 1.427ml de etilenglicol dimetacrilato y lOmg de AIBN se colocaron en un frasco de 5 mi y se agitó con una barra de agitación magnética, seguido por 75mg de SGP disuelto en una mezcla de 1.5ml de ácido acético y 0.75ml de agua DI. El aire en el frasco se reemplazó con nitrógeno y el frasco se selló y se colocó en un baño de aceite a 70 °C por cuatro horas. El frasco se rompió y el monolito de polímero se trituró a polvo en un mortero de porcelana. Los volátiles se eliminaron del polímero bajo alta presión.

Tiempo de liberación de SGP. El mismo protocolo de liberación lenta de SGP se aplicó a cada uno de los polímeros (A y B) . 333.7 ± 0.1 mg de polímero se colocó en un tubo de centrífuga de 15 mi que contiene 5 mi de tampón citrato (pH 5.0) y el tubo se agitó suavemente durante cuatro horas. Los tubos se centrifugaron después y se recogió el sobrenadante mientras que la perla de polímero se lavó con dos volúmenes de 8 mi de agua DI y se liofilizó. ~ 21 mg se obtuvieron de la muestra liofilizada para su análisis de Se. Las extracciones de SGP se repitieron dos veces más. Los pesos de las muestras se registraron. Todas las muestras perdieron peso durante estos tratamientos (Ver las Tablas 8 y 9) .

Tabla 8 Tabla 9 Para estimar la concentración del SGP liberado, la absorbancia UV a 280 nm de los sobrenadantes se midió y se comparó con la curva de calibración de SGP preparada en el misino tampón (Ver Tabla 10) .

Tabla 10.

Se aplicó la espectroscopia de absorción atómica (usando el método e instrumento de EXCALIBUR) para medir la concentración de Se residual en el polímero de liberación lenta (Ver Tabla 11) .

Tabla 11.

De acuerdo con las mediciones de concentración de Se en las perlas residuales, 36.08 % de SGP se liberaron de polímero A, después de lavados triples por 4h (12 horas en total). Durante el mismo tratamiento 30.11% de SGP se liberaron del Polímero B.

EJEMPLO 8 Extracción alcalina de proteínas intracelulares de levadura 200. Og de SEL-PLEX se mezclaron con 1 1 de hidróxido de sodio 0.1M a pH 11.5 y se calentaron a 60°C por 8 horas. La mezcla se centrifugó a 14,000x g/10min/10°C formando un sobrenadante y una perla. La perla se lavó dos veces con 400 mi de agua DI y se liofilizó, resultando en un peso de 54.5 g (Ver Tabla 12). El sobrenadante a pH 11.5 y lo lavados que se usaron se mezclaron juntos. El pH se redujo hasta 6.6 por neutralización usando ácido clorhídrico concentrado. Se formaron trazas pequeñas de un precipitado y un sobrenadante claro durante la neutralización. El precipitado se separó por centrifugación y el sobrenadante se concentró usando dispositivos de ultrafiltración A ICON de 10 kDa . El concentrado se lavó con dos porciones de 100ml de agua DI y se liofilizó, produciendo 64. Og de sólido marrón. Los filtrados restantes se combinaron (volumen total de 21) y analizaron para la concentración de selenio. El precipitado separado se analizó para el Selenio y nitrógeno/proteina (Ver Tabla 12) .

Tabla 12 : Extracción alcalina El análisis del filtrado indicó una pérdida de masa de 40.7% y pérdida de 48.7% de selenio que no se recuperó por ultra- filtración a través de la membrana de 10 kDa. Eliminaciones térmicas/p-nucleofilicas de Mese-1 y HSE-1 y las formas oxidadas de estos grupos funcionales a partir de péptidos que contienen selenio, resultaron en la degradación de la estructura química original de los SGP y pérdida de masa y selenio en el filtrado. El proceso de producción normalmente practicado en la técnica genera el volumen aumentado y la concentración elevada de selenio en el filtrado que resulta en una corriente de residuos que pueden tener efectos dañinos o tener efectos perjudiciales (por ejemplo, dañino al medio ambiente) . En contraste, los métodos de la presente invención proporcionan la extracción ácida y el fraccionamiento dependiente del pH de los SGP a partir de levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, en un proceso comercial a gran escala) . Bajo condiciones de temperatura variable, se encontró que la técnica tradicional/ convencional usando la hidrólisis alcalina no trabajó en la extracción de selenoglicoproteínas a partir de las células de levadura. Como se describe en la presente, se descubrió que la extracción de los SGP a partir de células de levadura usando la extracción ácida tiene éxito.

Claims (28)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende selenoglicoproteinas solubles, en donde las selenoglicoproteinas solubles se obtienen a través de la extracción ácida de las selenoglicoproteinas solubles a partir de levadura enriquecida con selenio.

2. La composición de la reivindicación 1, en donde las selenoglicoproteinas solubles se obtienen, posterior a exponer la levadura enriquecida con selenio a condiciones ácidas, a través de precipitación dependiente de pH de las selenoglicoproteinas solubles.

3. La composición de la reivindicación 2, en donde ' precipitación dependiente de pH comprende elevar el pH a un nivel al cual una porción de las selenoglicoproteinas solubles precipitan fuera de la una fase liquida que comprende el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble bajo condiciones ácidas y recoger las selenoglicoproteinas precipitadas.

4. La composición de la reivindicación 3, en donde el nivel de pH se eleva a 4.0.

5. La composición de la reivindicación 3, en donde el nivel de pH se eleva a 6.0.

6. La composición de la reivindicación 1, en donde las selenoglicoproteinas solubles se generan por un método que comprende : a) proporcionar levadura enriquecida con selenio; b) exponer la levadura enriquecida con selenio a condiciones ácidas seguido por centrifugación para generar i) una perla que comprende material ácido insoluble y ii) una fase líquida que comprende el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble bajo las condiciones ácidas; c) precipitar las selenoglicoproteinas de la fase líquida que comprende el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble bajo las condiciones ácidas a través de elevar el pH de la fase líquida; y d) separar las selenoglicoproteinas precipitadas a partir de la fase líquida.

7. Una composición que comprende selenoglicoproteinas solubles y un portador.

8. La composición de la reivindicación 7, en donde el portador es seleccionado del grupo que consiste de un polimersoma, un polímero de liberación lenta, una nanocápsula, y un polímero moleqularmente impreso.

9. La composición de la reivindicación 7, en donde el portador es un polímero de liberación lenta.

10. La composición de la reivindicación 7, en donde el portador es un polimersoma usado para encapsular selenoglicoproteínas .

11. La composición de la reivindicación 10, en donde el polimersoma comprende copolímero de bloque de poli (óxido de etileno) (PEO) .

12. La composición de la reivindicación 10, en donde el polimersoma comprende copolímero dibloque de poli (?-caprolactona) (PCL) .

13. La composición de la reivindicación 10, en donde el polimersoma comprende copolímeros dibloquebasados en poli (óxido de etileno) -bloque-poli (?-caprolactona) (PEO-b-PCL) .

14. La composición de la reivindicación 10, en donde el polimersoma se deriva del acoplamiento de poli (ácido láctico), poli (glicólido) , poli (ácido láctico-coglicólico) o poli ( 3-hidroxibutirato) con PEO.

15. La composición de la reivindicación 10, en donde el diámetro promedio de una selenoglicoproteína encapsulada en polimersoma es 50-300 nm.

16. Un método para la preparación de selenoglicoproteinas solubles que comprende: a) proporcionar levadura enriquecida con selenio; b) exponer la levadura enriquecida con selenio a condiciones ácidas seguido por centrifugación para generar i) una perla que comprende material ácido insoluble; y ii) una fase liquida que comprende el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble bajo las condiciones ácidas; c) precipitar las selenoglicoproteinas de la fase liquida que comprende el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble bajo las condiciones ácidas a través de elevar el nivel de pH de la fase liquida; y d) separar las selenoglicoproteínas precipitadas a partir de la fase liquida.

17. El método de la reivindicación 16, en donde las condiciones ácidas se obtienen usando tampón ácido o la adición de un ácido.

18. El método de la reivindicación 17, en donde el ácido es ácido clorhídrico.

19. El método de la reivindicación 16, en donde exponer la levadura enriquecida con selenio a condiciones ácidas comprende exponer la levadura enriquecida con selenio a un nivel de pH de 1.5.

20. El método de la reivindicación 16, en donde la levadura enriquecida con selenio se expone a condiciones ácidas por entre una y veinticuatro horas.

21. El método de la reivindicación 16, en donde la levadura enriquecida con selenio se expone a condiciones ácidas por aproximadamente 8 horas.

22. El método de la reivindicación 16, en donde exponer la levadura enriquecida con selenio a condicipnes ácidas ocurre a una temperatura mayor que la temperatura ambiente.

23. El método de la reivindicación 22, en donde la temperatura está entre 50 °C y 100 °C.

24. El método de la reivindicación 22, en donde la temperatura es 80 °C.

25. El método de la reivindicación 16, en donde selenoglicoproteinas se precipitan desde la fase liquida a una variedad de condiciones de pH para generar múltiples fracciones dependientes de pH de . selenoglicoproteinas solubles.

26. El método de la reivindicación 25, en donde las múltiples fracciones dependientes de pH de selenoglicoproteinas solubles se generan a valores de pH de 1.85, 3.0, 4.0 y 6.0.

27. El método de la reivindicación 16, en donde separar las selenoglicoproteinas precipitadas de la fase liquida comprende centrif gación para formar una perla de selenoglicoproteínas precipitadas seguido por la eliminación de la fase líquida a partir de las selenoglicoproteínas precipitadas .

28. El método de la reivindicación 16, en donde las levaduras enriquecidas con selenio son levaduras enriquecidas con selenio no viables, secas que contienen 2% o menos de selenio inorgánico.