ES2709623T3 - Composiciones y métodos para separar, caracterizar y administrar selenoglicoproteínas solubles - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende selenoglicoproteínas solubles, donde las selenoglicoproteínas solubles contienen dos o más fracciones de las selenoglicoproteínas dependientes del pH, donde las selenoglicoproteínas solubles se obtienen mediante extracción ácida de las selenoglicoproteínas solubles a partir de levadura enriquecida con selenio y después de exponer la levadura enriquecida con selenio a condiciones ácidas, mediante precipitación secuencial dependiente del pH a dos o más valores de pH diferentes de las selenoglicoproteínas solubles, donde las selenoglicoproteínas solubles se generan con un método que comprende: a) proporcionar levadura enriquecida con selenio; b) exponer la levadura enriquecida con selenio a condiciones ácidas seguido de centrifugación para generar i) un microgránulo que comprende material insoluble ácido; y ii) una fase líquida que comprende el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble en las condiciones ácidas; c) precipitar selenoglicoproteínas de la fase líquida que comprende el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble en las condiciones ácidas mediante un aumento del pH de la fase líquida de 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0 o 6,0; y d) separar las selenoglicoproteínas precipitadas de la fase líquida.

Description

DESCRIPCION

Composiciones y metodos para separar, caracterizar y administrar selenoglicoprotemas solubles

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a composiciones de selenio solubles y metodos de produccion, separacion y purificacion de las mismas. En particular la presente invencion proporciona metodos para preparar selenoglicoprotemas solubles en agua (por ejemplo, mediante extraccion de selenoglicoprotemas de levadura enriquecida con selenio), metodos para suplementar una composicion con deficiencia de selenio mediante la mezcla de selenoglicoprotemas solubles en agua con la composicion con deficiencia de selenio, composiciones que comprenden las selenoglicoprotemas solubles en agua y metodos para la administracion de las mismas.

Antecedentes de la invencion

El selenio es un elemento traza importante para un funcionamiento fisiologico apropiado en seres humanos. El selenio se ingiere a traves de la dieta que puede tener un contenido variable de selenio.

El selenio desempena un papel fundamental en el mantenimiento del metabolismo fisiologico, crecimiento, salud reproductora, e inmunidad. El selenio se incorpora en diferentes moleculas organicas que incluyen, por ejemplo, aminoacidos tales como 1-selenometionina, selenocistema, y selenocistina. Por lo tanto, el selenio puede ser una parte componente de protemas, muchas de las cuales son de importancia estructural para el organismo. Ademas, el selenio es un ingrediente importante en un numero de enzimas que influyen en el metabolismo, reproduccion, la prevencion de cancer, y defensa inmunitaria en seres humanos (Vease, por ejemplo, Rayman, M Lancet 356: 233­ 241 (2000)).

Multiples estudios han intentado revelar los beneficios de salud potenciales que resultan de la ingesta de niveles bajos de selenio. Por ejemplo, bajas concentraciones de una forma inorganica de selenio, han mostrado ciertos beneficios de salud potenciales (Vease, por ejemplo, Furnsinn et al., Int. J of Obesity and Related Metab. Dis., 19, 458-463 (1995)). Sin embargo, a niveles de dosificacion elevados, los efectos beneficiosos se invierten y se manifiesta una toxicidad peligrosa.

La investigacion durante las ultimas dos decadas ha sugerido que el selenio es eficaz en la reduccion de la incidencia del cancer cuando se proporciona a animales a dosis de solamente 5 a 10 veces por encima de los requisitos nutricionales (Vease, por ejemplo, El-Bayoumy, The role of selenium in cancer prevention, Philadelphia, Lippincott, 1-15, 1991). Los estudios de quimioprevencion con selenio en sistemas de modelo animal han indicado que este elemento es eficaz para la mayona de los sistemas, si no todos los sistemas organicos, y protege contra efectos carcinogenicos (Vease, por ejemplo, El-Bayoumy, The role of selenium in cancer prevention, Philadelphia, Lippincott, 1-15, 1991. tanto los estudios epidemiologicos como los ensayos de suplementa accion tambien han apoyado su eficacia en la disminucion de la incidencia de canceres del tngado, colon, prostata y pulmon (Veanse, por ejemplo, Yu et al., Biol Trace Elem Res, 56: 117-124 (1997); Clark et al., J Am Med Assoc, 276: 1957-1963 (1996); Yoshizawa et al., J Natl Cancer Inst, 90: 1219-1224, (1998); Brooks, et al., J Urol, 166: 2034-2038, (2001)). Otros estudios no han demostrado efecto beneficioso para la reduccion de canceres con selenio (Vease, por ejemplo, Garland et al., J. Am. Coll Nutr., 12: 400-11 (1993); Ghadirian et al., Cancer Detect Prev, 24: 305-13 (2000)).

Se han examinado multiples formas de selenio. Estas incluyen selenio inorganico tal como selenito sodico, y fuentes organicas, incluyendo levadura de selenio. Hay una diferencia significativa entre la toxicidad del selenio inorganico y el organico, los compuestos inorganicos siendo normalmente absorbidos y usados de forma menos eficaz y tambien siendo mas toxicos que las fuentes organicas de selenio.

S. Mc Sheehy et al., Anal. Chem. 2005, 77, 344-349; L. Yang et al., Journal of Chromatography A, 1055 (2004), 177­ 184; K. Wrobel et al., Anal. Bioanal. Chem (2003), 375, 133-138; C. A. Ponce de Leon et al., Journal of Applied Microbiology 2002, 92, 602-610; y M. P. Rayman, British Journal of Nurtition (2004), 92, 557-573 describen extracciones de selenometionina en levaduras. S. Kwiatkowski et al., Journal of the Institue of Brewing, Vol. 115, N.°2, 2009, 151-158 describen la extraccion de glucanos de levadura. El documento US 2009/0214419 divulga polimersomas biodegradables.

Sumario de la invencion

La presente invencion se refiere a composiciones de selenio solubles y metodos de produccion, separacion y purificacion de las mismas.

En particular la presente invencion proporciona una composicion que comprende selenoglicoprotemas solubles, donde las selenoglicoprotemas solubles contienen dos o mas fracciones de las selenoglicoprotemas dependientes del pH, donde las selenoglicoprotemas solubles se obtienen mediante extraccion acida de las selenoglicoprotemas solubles de levadura enriquecida con selenio y despues de exponer la levadura enriquecida con selenio a condiciones acidas, mediante precipitacion secuencial dependiente del pH a dos o mas valores de pH diferentes de las selenoglicoprotemas solubles, donde las selenoglicoprotemas solubles se generan con un metodo que comprende: a) proporcionar levadura enriquecida con selenio; b) exponer la levadura enriquecida con selenio a condiciones acidas seguido de centrifugacion para generar i) un microgranulo que comprende material insoluble acido; y ii) una fase lfquida que comprende el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble en las condiciones acidas; c) precipitar selenoglicoprotemas de la fase lfquida que comprende el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble en las condiciones acidas mediante un aumento del pH de la fase lfquida de 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0 o 6,0; y d) separar las selenoglicoprotemas precipitadas de la fase lfquida.

La presente invencion tambien proporciona un metodo para la preparacion de selenoglicoprotemas solubles que comprende: a) proporcionar levadura enriquecida con selenio; b) exponer la levadura enriquecida con selenio a condiciones acidas seguido de centrifugacion para generar i) un microgranulo que comprende material insoluble acido; y ii) una fase lfquida que comprende el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble en las condiciones acidas; c) precipitar selenoglicoprotemas de la fase lfquida que comprende el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble en las condiciones acidas mediante un aumento del pH de la fase lfquida de 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0 o 6,0; y d) separar las selenoglicoprotemas precipitadas de la fase lfquida.

En algunas realizaciones, la exposicion de la levadura enriquecida con selenio a condiciones acidas se produce a una temperatura superior a la temperatura ambiente (por ejemplo, superior a 20-25 °C). De hecho, se puede usar una diversidad de temperaturas que incluyen 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 90, 95, 97, 99 °C, o mas elevadas). En algunas realizaciones, las levaduras enriquecidas con selenio se exponen a condiciones donde el pH es 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5, 1, o inferior. En una realizacion preferente, la exposicion de la levadura enriquecida con selenio a condiciones acidas comprende la exposicion de la levadura enriquecida con selenio a un pH de 1,5. En algunas realizaciones, la exposicion de la levadura enriquecida con selenio a condiciones acidas se produce durante un cierto periodo de tiempo. En algunas realizaciones, las levaduras enriquecidas con selenio se exponen a condiciones acidas durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o mas horas. En algunas realizaciones, las levaduras enriquecidas con selenio se exponen a condiciones acidas entre una y veinticuatro horas. En algunas realizaciones, las levaduras enriquecidas con selenio se exponen a condiciones acidas entre cinco y diez horas. En una realizacion preferente, las levaduras enriquecidas con selenio se exponen a condiciones acidas durante ocho horas. En algunas realizaciones, las condiciones acidas se crean y/o se mantienen usando tampon acido y/o la adicion de un acido. Se puede usar cualquier acido. En algunas realizaciones, el acido es acido clorhudrico, aunque se puede usar cualquier acido. En algunas realizaciones, las selenoglicoprotemas se hacen precipitar desde la fase lfquida que comprende el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble en las condiciones acidas mediante aumento del pH de la fase lfquida. En algunas realizaciones, las selenoglicoprotemas precipitadas se separan de la fase lfquida mediante centrifugacion para formar un microgranulo de las selenoglicoprotemas precipitadas seguido de retirada de la fase lfquida de las selenoglicoprotemas precipitadas. En algunas realizaciones, el pH de la fase lfquida se eleva a 1,85. En algunas realizaciones, el pH de la fase lfquida se eleva a 3,0. En algunas realizaciones, el pH de la fase lfquida se eleva a 4,0. En algunas realizaciones, el pH de la fase lfquida se eleva a 6,0. En algunas realizaciones, las selenoglicoprotemas se hacen precipitar y se separan de la fase lfquida en una diversidad de condiciones de pH para generar multiples fracciones de selenoglicoprotemas solubles dependientes del pH. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una sola fase lfquida que comprende el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble en condiciones acidas se usa para crear una primera fraccion de selenoglicoprotemas solubles que precipita a un primer pH (por ejemplo, pH de 1,85), una segunda fraccion de selenoglicoprotemas solubles que precipita a un segundo pH (por ejemplo, pH de 3,0), una tercera fraccion de selenoglicoprotemas solubles que precipita a un tercer pH (por ejemplo, pH de 4,0), y una cuarta fraccion de selenoglicoprotemas solubles que precipita a un cuarto pH (por ejemplo, pH de 6,0). En algunas realizaciones, la precipitacion de las selenoglicoprotemas de la fase lfquida mediante aumento del pH de la fase lfquida comprende multiples reacciones de precipitacion secuencial dependiente del pH de la fase lfquida. Una composicion que comprende selenoglicoprotemas solubles contiene dos o mas fracciones dependientes del pH de selenoglicoprotemas (por ejemplo, selenoglicoprotemas solubles de fase lfquida que comprenden el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble en condiciones acidas que se hace precipitar a dos o mas valores de pH diferentes). En algunas realizaciones, las levaduras enriquecidas con selenio son levaduras enriquecidas con selenio no viables, secas que contienen un 2 % o menos de selenio inorganico.

La invencion tambien proporciona composiciones que comprenden selenoglicoprotemas solubles preparadas de acuerdo con la invencion. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la invencion proporciona una composicion con deficiencia de selenio que comprende selenoglicoprotemas solubles de la invencion. En algunas realizaciones, las selenoglicoprotemas solubles de la invencion se anaden a y/o se mezclan con una composicion con deficiencia de selenio. En algunas realizaciones, la adicion o la mezcla (por ejemplo, combinacion) de selenoglicoprotemas comprende la combinacion de selenoglicoprotema y uno u otros tipos mas de selenio en la composicion. En algunas realizaciones, las selenoglicoprotemas solubles de la invencion se anaden a y/o se mezclan con composiciones que contienen selenio (por ejemplo, para aumentar y/o suplementar la cantidad total de selenio).

La invencion tambien proporciona una composicion que comprende selenoglicoprotemas solubles y un vehmulo. En algunas realizaciones, las selenoglicoprotemas son una fraccion espedfica de selenoglicoprotemas dependientes del pH. De hecho se puede usar una diversidad de vehmulos que incluyen dendnmeros, polimersomas, nanopartmulas, poUmeros de liberacion lenta, nanocapsulas, y/o poKmeros con impresion molecular. En una realizacion preferente, el vehmulo es un poUmero de liberacion lenta. En otra realizacion preferente, el vehmulo es un polfmero con impresion molecular. Ademas en otra realizacion preferente, el vehmulo es un polimersoma usado para encapsular selenoglicoprotema. De hecho, se puede usar cualquier polimersoma conocido en la tecnica. En algunas realizaciones, el polimersoma comprende copolfmero de bloque de poli(oxido de etileno) (PEO). Se puede usar cualquier copolfmero de bloque, incluyendo, por ejemplo poli(etiletileno) (PEE), poli(butadieno) (PB o PBD), poli(estireno) (PS), y poli(isopreno) (PI). En algunas realizaciones, el polfmero comprende copolfmero de dibloque de poli(£-caprolactona) (PCL). En algunas realizaciones, el polimersoma comprende copolfmeros de dibloque a base de poli(oxido de etileno)-bloque-poli(£-caprolactona) (PEO-b-PCL). En algunas realizaciones, el polimersoma comprende un copolfmero de bloque que es un copolfmero tribloque, tetrabloque, pentabloque, o al menos de seis bloques. En algunas realizaciones, el polimersoma se obtiene a partir del acoplamiento de poli(acido lactico), poli(glicolido), poli(acido lactico-coglicolico) y/o poli(3-hidroxibutirato) con PEO. Una diversidad de tamanos encuentran su uso en las composiciones y metodos de la invencion incluyendo selenoglicoprotemas encapsuladas con polimersoma que tienen un diametro de aproximadamente 50-300 nm aunque se pueden usar selenoglicoprotemas encapsuladas con polimersoma con un diametro mayor (por ejemplo, aproximadamente 350 nm, 400 nm, 500 nm o mayor) y menor (por ejemplo, aproximadamente 40 nm, 30 nm, 20 nm, o menor).

Descripcion de las figuras

La Figura 1 muestra la preparacion secuencial de selenoglicoprotemas solubles (SGPs) de SEL-PLEX mediante extraccion acida y posteriores precipitaciones de una realizacion de la invencion.

La Figura 2 muestra un proceso de precipitacion de selenoglicoprotemas dependiente del pH de una realizacion de la invencion.

La Figura 3 muestra un mapa de calor que representa los efectos de diferentes tratamientos suplementados con selenio que se describen en las Tablas 3 y 4 del Ejemplo 3 en niveles de expresion genetica en musculo esqueletico de pechuga de pollo con respecto a un control basal.

La Figura 4 muestra un diagrama de Venn que representa a los diferentes efectos de la fraccion de SGP a pH 4,0 y SEL-PLEX en la formacion de perfiles de expresion genetica en musculo del pecho.

La Figura 5 muestra genes a modo de ejemplo identificados como regulados comunmente con selenito sodico (SS), SEL-PLEX (SP) y fraccion de selenoglicoprotema (SGP) a pH 4,0.

La Figura 6 muestra genes a modo de ejemplo identificados como regulados comunmente con SEL-PLEX (SP) y fraccion de selenoglicoprotema (SGP) a pH 4,0, pero no con selenito sodico (SS).

La Figura 7 muestra genes a modo de ejemplo identificados como regulados unicamente con la fraccion de selenoglicoprotema (SGP) a pH 4,0, y no regulados con selenito sodico (SS) o SEL-PLEX (SP).

La Figura 8 muestra un gen a modo de ejemplo identificado como regulado unicamente con la fraccion de selenoglicoprotema (SGP) a pH 4,0, y no regulado con selenito sodico (SS) o SEL-PLEX (SP).

La Figura 9 muestra un gen a modo de ejemplo identificado como regulado unicamente con la fraccion de selenoglicoprotema (SGP) a pH 4,0, y no regulado con selenito sodico (SS) o SEL-PLEX (SP).

La Figura 10 muestra un gen a modo de ejemplo identificado como regulado unicamente con la fraccion de selenoglicoprotema (SGP) a pH 4,0, y no regulado con selenito sodico (SS) o SEL-PLEX (SP).

La Figura 11 muestra un mapa de calor que representa los efectos de diferentes tratamientos suplementados con selenio que se describen en las Tablas 3 y 4 del Ejemplo 3 en niveles de expresion genetica en tejido hepatico con respecto a un control basal.

La Figura 12 representa a la liberacion de SGP de nanocapsulas a pH 5,1 y pH 7,4 durante un periodo de dos semanas.

La Figura 13 muestra imagenes de Microscopfa Electronica Criogenica de Efecto Tunel (cryo-TEM) de selenoglicoprotema encapsulada con polimersoma a pH 7,4.

Definiciones

Para facilitar una comprension de la presente invencion, un numero de terminos y expresiones se definen a continuacion: Como se usa en el presente documento, todos los terminos "peptido", "polipeptido" y "protema" se refieren a una secuencia de aminoacidos primaria que se un mediante "enlaces peptfdicos" covalentes. En general, un peptido consiste en unos pocos aminoacidos, por lo general de 2-50 aminoacidos, y es mas corto que una protema. El termino "polipeptido" incluye peptidos y protemas.

El termino "glicoprotema(s)" o "glicopeptido(s)" se refiere a una protema o peptido que contiene uno o mas restos de carbohidrato unidos con enlace covalente a la cadena polipeptfdica. El termino "selenoprotema(s)" o "selenopeptido(s)" se refiere a una protema o peptido que contiene uno o mas atomos de selenio. Por lo general, los atomos de selenio se incorporan en protemas dentro de aminoacidos que contienen selenio incluyendo selenocistema y selenometionina.

El termino "selenoglicoprotema(s)", "selenoglicopeptido(s)" o "SGP(s)" se refiere a una glicoprotema o glicopeptidos que incorporan uno o mas atomos de selenio. Por lo general, las "selenoglicoprotemas" comprenden en uno o mas aminoacidos que contienen selenio. Las "selenoglicoprotemas" pueden comprender un numero de carbohidratos en cualquier numero de diferentes formas.

Los terminos "muestra" y "muestra de ensayo" se usan en su sentido mas amplio e incluye muestras o muestras de ensayo obtenidas a partir de cualquier fuente. Como se usa en el termino "muestra" se usa para hacer referencia a muestras biologicas obtenidas a partir de animales (incluyendo seres humanos), e incluye fluidos, solidos y tejidos. En algunas realizaciones de la presente invencion, las muestras biologicas incluyen fluido cerebroespinal (CSF), fluidos seroso, orina y saliva, sangre, y productos de sangre tales como plasma, suero.

Como se usa en el presente documento, los terminos "levadura" y "celulas de levadura" se refieren a microorganismos eucariotas clasificados en el reino Hongos, que tienen una pared celular, membrana celular y componentes intracelulares. Las levaduras no forman un agrupamiento taxonomico o filogenetico espedfico. En la actualidad se conocen aproximadamente 1.500 especies; se calcula que se ha descrito solamente un 1 % de todas las especies de levaduras. El termino "levadura" a menudo se toma como un sinonimo para S. cerevisiae, pero la diversidad filogenetica de las levaduras se muestra mediante su colocacion en las divisiones tantos Ascomycota como Basidiomycota. El termino "levadura" incluye levadura de cervecena, levadura de destilena y levaduras de panadena. Las levaduras de gemacion ("levaduras verdaderas") se clasifican en el orden Saccharomycetales. La mayona de las especies de levaduras se reproducen asexualmente mediante gemacion, aunque algunas se reproducen mediante fision binaria. Las levaduras son unicelulares, aunque algunas especies llegan a ser multicelulares a traves de la formacion de una cuerda de celulas de gemacion conectadas conocidas como pseudohyphae, o false hyphae. El tamano de la levadura puede variar en gran medida dependiendo de la especie, midiendo por lo general 3-4 micrometros de diametro, aunque algunas levaduras deben alcanzar mas de 40 pm. Como se usa en el presente documento, las expresiones "levadura enriquecida con selenio" y "levadura selenizada" se refieren a cualquier levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) que se cultiva en un medio que contiene sales inorganicas de selenio. De hecho, se contempla que la diversidad de sales de selenio son utiles en la presente invencion incluyendo, selenito sodico, o seleniato sodico. La selenometionina libre (por ejemplo, no asociada con una celula o levadura) tambien se puede usar como la fuente de selenio para la levadura enriquecida con selenio ya que la levadura si incorpora esta forma de selenio. Durante el cultivo, debido a la similitud qmmica entre el selenio y el azufre, la levadura incorpora selenio en lugar de azufre en lo que normalmente son compuestos organicos que contienen azufre dentro de la celula. Un compuesto que contiene selenio en tales preparaciones de levadura es la selenometionina que se incorpora en polipeptidos/protemas. La cantidad de selenio celular total presente en forma de selenometioninas en las preparaciones de ese tipo variara, pero puede estar entre un 10 y un 100 %, 20-60 %, 50-75 % y entre un 60 y un 75 %. El resto del selenio organico en las preparaciones de levadura selenizada esta constituido predominantemente por compuestos intermedios en la ruta para la biosmtesis de selenometionina. Estos incluyen selenocistema, selenocistationina, selenohomocistema y seleno-adenosilselenometionina. La cantidad de sal de selenio inorganico residual en el producto acabado es generalmente bastante baja (por ejemplo, < 2 %). Como se usa en el presente documento, el termino "SEL-PLEX" se refiere a una levadura enriquecida con selenio no viable, seca (por ejemplo, Sacchoromyces cerevisiae de numero de registro CNCM 1-3060, Coleccion Nacional De Cultivos De Microorganismos (CNCM), Institut Pasteur, Paris, Francia) cultivada en un sistema de cultivos semicontinuo que proporciona cantidades crecientes de molasas de cana y sales de selenio de una manera que minimizar los efectos perjudiciales de las sales de selenio sobre la tasa de crecimiento de la levadura y permite una incorporacion optima de selenio inorganico el material organico celular. El selenio inorganico residual se elimina (por ejemplo, usando un proceso de lavado riguroso) y no supera un 2 % del contenido de selenio total.

Como se usa en el presente documento, la expresion "selenio organico" se refiere a cualquier compuesto organico donde el atomo de selenio se conecta directamente a un atomo de carbono.

Como se usa en el presente documento, el termino "selenio inorganico" generalmente se refiere a cualquier sal de selenio (por ejemplo, selenito sodico, seleniato sodico) en la que el selenio esta en un estado de oxidacion -2, 4 y 6.

Como se usa en el presente documento, los terminos "hospedador", "sujeto" y "paciente" se refieren a cualquier animal humano y animales (por ejemplo, primates, perros, gatos, vacas, caballos, ovejas, aves, pescados, crustaceos) que se estudia, analiza, somete a ensayo, diagnostica o se trata. Como se usa en el presente documento, los terminos "hospedador", "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente, a menos que se indique de otro modo.

Como se usa en el presente documento, el termino "p/p" ("peso/peso") se refiere a la cantidad de una sustancia dada en una composicion en una base de peso. Por ejemplo, una alimentacion para animales que comprende un 0,02 % en p/p de suplemento alimentario dietetico se refiere a que la masa suplemento alimentario dietetico es de un 0,02 % de la masa total de la alimentacion para animal (por ejemplo, 200 gramos de composicion de suplemento alimentario dietetico en 999,800 gramos de alimentacion para animal).

Como se usa en el presente documento, el termino "purificado" o "purificar" se refiere a la retirada de componentes de una muestra. Por ejemplo, las paredes de la celula de levadura se purificaron mediante la retirada de los componentes de la pared celular de un componente que no es levadura (por ejemplo, componentes de la membrana plasmatica y/o componentes intracelulares de la levadura); tambien se purifican mediante la retirada de contaminantes u otros agentes distintos a la pared celular de la levadura. la retirada de componentes de la pared celular de un componente que no es levadura y/o contaminantes de la pared celular de un componente que no es levadura da como resultado un aumento del porcentaje de la pared celular de la levadura o componentes de la misma en una muestra.

Como se usa en el presente documento, la expresion "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de una composicion (por ejemplo, que comprende selenoglicoprotemas de la presente invencion eficiente para proporcionar resultados beneficiosos o deseados. Una cantidad eficaz se puede administrar en una o mas administraciones, aplicaciones o dosificaciones.

Como se usa en el presente documento, el termino "biodisponibilidad" se refiere a la fraccion de una molecula o componente que esta disponible para un organismo que alcanza la circulacion sistemica. Cuando una molecula o componente se administra por via intravenosa, su biodisponibilidad es bastante elevada. Sin embargo, cuando una molecula o componentes se administra a traves de otras rutas (tal como por via oral), su biodisponibilidad disminuye (debido a una absorcion incompleta y metabolismo del primer paso). En un entorno nutricional, biodisponibilidad se refiere a las tasas de absorcion y uso de un nutriente. Por ejemplo, diferentes formas del mismo nutriente pueden tener diferentes biodisponibilidades.

Como se usa en el presente documento, los terminos " alimentacion", "productos alimentarios", "alimentacion para animal", y "piensos" se refieren a material o materiales que son consumidos por animales y proporcionan energfa y/o nutrientes a la dieta de un animal. Los ejemplos incluyen Racion Total Mixta (TMR), forraje(s), microgranulo(s), concentrado(s), mezcla o mezclas previa(s) coproducto(s), grano(s), grano de destileria(s), molasas, fibra(s), cereal(es) en silo(s), hierba(s), heno, grano(s), hojas, harina, compuesto o compuestos soluble(s), y suplemento(s). Como se usa en el presente documento, las expresiones "suplemento alimentario", "suplemento dietetico", "composicion para suplemento dietetico", se refieren a un producto alimentario formulado como un suplemento dietetico o nutricional que se va a usar como parte de una dieta humana o animal, por ejemplo como una adicion a la alimentacion para animal.

Como se usa en el presente documento, los terminos "administracion" y "administrar" se refieren al acto de administrar un farmaco, profarmaco, u otro agente, o tratamiento terapeutico (por ejemplo, composiciones de la presente invencion) a un sujeto (por ejemplo, un sujeto o celulas in vivo, in vitro, o ex vivo, tejidos y organos). Las vfas de y saquen a modo de ejemplo para el cuerpo humano pueden ser a traves de los ojos (oftalmica), boca (oral), piel (topica o transdermica), nariz (nasal), pulmones (inhalador), mucosa oral (bucal), ofdo, rectal, vaginal, mediante inyeccion (por ejemplo, por via intravenosa, podfa subcutanea, por via intratumoral, por via intraperitoneal).

Como se usa en el presente documento, los terminos "co-administracion" y "co-administrar" se refieren a la administracion de al menos dos agente(s) (por ejemplo, composicion que comprende selenoglicoprotemas de la invencion y uno u otros agentes mas -- por ejemplo, un antibiotico, un agente terapeutico (por ejemplo, farmaco o agente farmaceutico), u, otro compuesto biologicamente activo) o terapias para un sujeto. En algunas realizaciones, la co-administracion de dos o mas agentes o terapias es simultanea. En otras realizaciones, un primer agente/terapias se administra antes de un segundo agente/terapia. Los expertos en la materia entienden que las formulaciones y/o vfas de administracion de los diversos agentes o terapias usadas pueden variar. La dosificacion apropiada para la co-administracion la puede determinar facilmente alguien con experiencia en la materia. En algunas realizaciones, cuando se co-administran agentes o terapias, los respectivos agentes o terapias se administran a dosificaciones mas bajas que las que son apropiadas para su administracion solos. Por lo tanto, la coadministracion es especialmente deseable en realizaciones en las que la co-administracion de los agentes o terapias disminuye la dosificacion necesaria de un agente o agentes potencialmente nocivos (por ejemplo, toxico), y/o cuando la co-administracion de dos o mas agentes da como resultado la sensibilizacion de un sujeto a efectos beneficiosos de uno de los agentes a traves de co-administracion del otro agente.

Como se usa en el presente documento, el termino "tratamiento" o equivalentes gramaticales incluye la mejora y/o reversion de los smtomas de la enfermedad (por ejemplo, enfermedad neurodegenerativa). Un compuesto que causa una mejora en cualquier parametro asociado con enfermedad cuando se usa en los metodos de identificacion sistematica de la presente invencion se puede identificar de ese modo, un compuesto terapeutico. El termino "tratamiento" se refiere tanto tratamiento terapeutico como profilactico o medidas preventivas. Por ejemplo, los sujetos que se pueden beneficiar del tratamiento con composiciones y metodos de la presente invencion incluyen los que ya tienen una enfermedad y/o trastorno (por ejemplo, enfermedad neurodegenerativa, diabetes o faltare o perdida de funcion cognitiva) asf como aquellos en los que se va a prevenir una enfermedad y/o trastorno (por ejemplo, usando un tratamiento profilactico de la presente invencion).

Como se usa en el presente documento, la expresion "en riesgo de enfermedad" se refiere a un sujeto (por ejemplo, un ser humano) que esta predispuesto a experimentar una enfermedad en particular. Esta predisposicion puede ser genetica (por ejemplo, una tendencia genetica en particular a experimentar la enfermedad, tal como trastornos hereditarios), o debido a otros factores (por ejemplo, edad, peso, condiciones ambientales, exposiciones a compuestos perjudiciales presentes en el entorno).

Como se usa en el presente documento, la expresion "que padece la enfermedad" se refiere a un sujeto (por ejemplo, un ser humano) que esta experimentando una enfermedad en particular. La presente invencion incluye sujetos que esta experimentando cualquier gama de enfermedades (por ejemplo, desde manifestacion sub-clmica la enfermedad en estado avanzado) donde el sujeto presenta al menos alguno de los indicios (por ejemplo, signos y smtomas) asociados con la enfermedad en particular.

Como se usa en el presente documento, los terminos " enfermedad" y "afeccion patologica" se usan indistintamente para describir un estado, signos, y/o smtomas que estan asociados con cualquier alteracion del estado normal de un animal vivo o de cualquiera de sus organos o tejidos que interrumpe o modifica el remito de las funciones normales, y puede ser una respuesta a factores ambientales (tales como (radiacion, malnutricion, riesgos industriales, o clima), a agentes infecciosos espedficos (tales como gusanos, bacterias, o virus), a defecto inherente del organismo (tal como diversas anomalfas geneticas), o a combinaciones de estos y otros factores.

El termino "compuesto" se refiere a cualquier entidad qmmica, farmaceutica, farmaco que se puede usar para tratar o prevenir una enfermedad, dolencia, nauseas, o trastorno de la funcion corporal. Los compuestos comprenden compuestos terapeuticos tanto conocidos como potenciales. Se puede determinar que un compuesto es terapeutico mediante identificacion sistematica usando los metodos de identificacion sistematica de la presente invencion. Un "compuesto terapeutico conocido" se refiere a un compuesto terapeutico que se ha mostrado (por ejemplo, a traves de ensayos en animales o experiencia anterior con administracion a seres humanos) que es eficaz en un tratamiento de este tipo.

Como se usa en el presente documento, el termino "kit" se usa en referencia a una combinacion de reactivos y otros materiales. Se contempla que el kit puede incluir reactivos tales como nutrientes y farmacos asf como medios de administracion.

Como se usa en el presente documento, el termino "toxico" se refiere a cualquier efecto perjudicial o nocivo en un sujeto, una celula, o un tejido en comparacion con la misma celula o tejido antes de la administracion del agente toxico.

Como se usa en el presente documento, la expresion "composicion farmaceutica" se refiere a la combinacion de un agente activo (por ejemplo, composicion y comprende selenoglicoprotemas) con un vehmulo, inerte o activo, que hace que la composicion sea especialmente adecuada para uso en diagnostico, preventivo y/o terapeutico in vitro, in vivo o ex vivo.

Las expresiones "farmaceuticamente aceptable" o "farmacologicamente aceptable", como se usa en el presente documento, se refieren a composiciones que no producen esencialmente reacciones adversas, por ejemplo, reacciones toxicas, alergicas, o inmunologicas, cuando se administran a un sujeto.

Como se usa en el presente documento, la expresion "por via topica" se refiere a aplicacion de las composiciones de la presente invencion a la superficie de la piel y celulas y tejidos mucosales (por ejemplo, mucosa alveolar, bucal, lingual, masticatoria, o nasal, y otros tejidos y celulas que revisten los organos huecos o cavidades corporales). Como se usa en el presente documento, la expresion "vehmulo farmaceuticamente aceptable" se refiere a cualquiera de los vehmulos farmaceuticos convencionales que incluyen solucion salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones (por ejemplo, tal como en forma de emulsiones de aceite/agua o agua/aceite), y diversos tipos de agentes humectantes, todos y cada uno de disolventes, medios de dispersion, revestimientos, lauril sulfato sodico, agentes isotonicos y de retardo de la absorcion, agentes disgregantes (por ejemplo, almidon de patata o glicolato sodico de almidon). Las composiciones tambien pueden incluir estabilizantes y conservantes. Los ejemplos de vehmulos, estabilizantes y adyuvantes se describen, por ejemplo, en Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, Pa. (1975). En algunas realizaciones, un producto alimentario (por ejemplo, material y/o tratamiento dietetico) actua como un vehmulo (por ejemplo, de una composicion de selenoglicoprotema composition de la invencion).

Como se usa en el presente documento, la expresion "sal farmaceuticamente aceptable" se refiere a cualquier sal (por ejemplo, obtenida por reaccion con un acido o una base) de un compuesto de la presente invencion que es fisiologicamente tolerada por el sujeto diana (por ejemplo, un sujeto mairnfero, y/o celulas, tejidos u organos in vivo o ex vivo). Las "sales" de los compuestos de la presente invencion se pueden obtener a partir de acidos y bases inorganicos u organicos. los ejemplos de acidos incluyen los acidos clorlddrico, bromtndrico, sulfurico, fumarico, maleico, fosforico, glicolico, lactico, salidlico, sucdnico, tolueno-p-sulfonico, tartarico, acetico, dtrico, metanosulfonico, etanosulfonico, formico, benzoico, malonico, naftaleno-2-sulfonico, acido bencenosulfonico. Otros acidos, tales como oxalico, o que por sf mismos no sean farmaceuticamente aceptables, se pueden usar en la preparacion de sales utiles como compuestos intermedios para obtener los compuestos de la invencion sales de adicion de acido farmaceuticamente aceptables. Los ejemplos de bases incluyen hidroxidos de metal alcalino (por ejemplo, sodio), hidroxidos de metal alcalinoterreo (por ejemplo, magnesio), amoniaco, y compuestos de formula NW⁴+, donde W es alquilo C^1-4. Los ejemplos de sales incluyen: acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, flucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, cloruro, bromuro, yoduro, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, oxalato, palmoato, pectinato, fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato, undecanoato. Otros ejemplos de sales incluyen aniones de los compuestos de la presente invencion combinados con un cation adecuado tal como Na+, NH⁴+, y NW⁴+ (donde W es un grupo alquilo C^1-4). Para uso terapeutico, se contempla que las sales de los compuestos de la presente invencion son farmaceuticamente aceptables. Sin embargo, las sales de acidos y bases que no son farmaceuticamente aceptables tambien encuentran uso, por ejemplo, en la preparacion o purificacion de un compuesto farmaceuticamente aceptable. Para uso terapeutico, se contempla que las sales de los compuestos de la presente invencion son farmaceuticamente aceptables. Sin embargo, las sales de acidos y bases que no son farmaceuticamente aceptables tambien pueden encontrar uso, por ejemplo, en la preparacion o purificacion de un compuesto farmaceuticamente aceptable.

Como se usa en el presente documento, el termino "secar" se refiere a secar por pulverizacion, liofilizar, secar al aire, secar a vado o cualquier otro tipo de proceso que reduzca o elimine el lfquido en una sustancia.

Como se usa en el presente documento, la expresion "secar por pulverizacion" se refiere a un metodo usado comunmente para secar una sustancia que contienen lfquido usando gas caliente para evaporar el lfquido para reducir o eliminar lfquido en la sustancia. En otras palabras, el material se seca por medio de pulverizacion o atomizacion en una corriente de aire seco calentado.

Como se usa en el presente documento, el termino "liofilizar" y el termino "liofilizacion" y el termino "criodesecacion" se refieren a la retirada de un disolvente de la materia en un estado congelado mediante sublimacion. Esto se consigue congelando el material que se va a secar por debajo de su punto eutectico y a continuacion proporcionando el calor latente de sublimacion. El control preciso de vado y entrada de calor permite el secado desde el estado congelado sin retrofusion del producto. En la aplicacion practica, el proceso se acelera se controla de forma precisa en condiciones de presion reducida.

Como se usa en el presente documento, la expresion "polvo de flujo libre seco" se refiere a un polvo seco de flujo libre, por ejemplo un polvo que se puede verter en un contenedor, bolsa, recipiente, etc, sin impedimento de grumos grandes.

Como se usa en el presente documento, el termino "moler" se refiere a reducir el tamano de partfcula por impacto, cizallamiento, o desgaste por frotamiento.

Como se usa en el presente documento, el termino "lavar" se refiere a la retirada o limpieza (por ejemplo, usando cualquier tipo de soluto (por ejemplo, agua destilada, tampon, o disolvente) o mezcla) de impurezas o componente no deseado soluble de una preparacion (por ejemplo, una pared celular de levadura) se puede lavar para retirar los componentes de la pared celular que no es de levadura de la muestra).

Como se usa en el presente documento, el termino "polimersoma" se refiere a vesfculas que se ensamblan a partir de polfmeros sinteticos en solucion acuosa (por ejemplo, que se pueden usar para encapsular un material). Los polimersomas se pueden preparar usando copolfmeros de bloque sintetico anfifflico para formar la membrana de la vesfcula, y tienen radios que vanan de 50 nm a 5 pm o mas. La mayona de los polimersomas contienen una solucion acuosa en su nucleo y son utiles para encapsular y proteger moleculas sensibles, tales como farmacos, enzimas, otras protemas y peptidos asf como fragmentos de ADN y ARN. La membrana del polimersoma proporciona una barrera ffsica que afsla el material encapsulado de materiales externos, tales como los que se encuentran en sistemas biologicos. Los ejemplos de polimersomas que encuentran usan realizaciones de la invencion, asf como sus smtesis, se pueden encontrar, por ejemplo, en los documentos de Patente de Estados Unidos N.os 7.867.512, 7.682.603, y 6.835.394.

Como se usa en el presente documento, el termino "residuo" se refiere a materiales no deseados o que no se usan. Como se usa en el presente documento, la expresion "agua residual" es cualquier agua cuya calidad se ha visto afectada de forma adversa por influencia antropogenica.

Descripcion detallada de la invencion

I. Introduccion

El selenio es un elemento traza implicado en la regulacion de aspectos del mecanismo de defensa antioxidante en todos los tejidos vivos por interaccion con el glutation (GSH) del organismo y sus enzimas antioxidantes que contienen Se principales, glutation peroxidasa (GPX) y tiorredoxina reductasa (Vease, por ejemplo, Goehring et al., J. Anim. Sci. 59, 725-732 (1984); Gerloff et al., J. Anim. Sci. 70, 3934-3940 (1992)). El glutation y la GPX tienen la capacidad de proteger la integridad de enlaces insaturados de fosfoUpidos de membrana mediante la extincion de ataques de radicales libres capaces de iniciar y propagar la oxidacion de los Ifpidos (Vease, por ejemplo, Meister y Anderson, Annu. Rev. Biochem. 52, 711-760 (1983); Deleve y Kaplowitz, Pharm. Ther. 52, 287-305 (1991); Palmer y Paulson, Nutr. Rev. 55, 353-361 (1997)).

El selenio tambien se ha asociado con una reduccion del riesgo de cancer en varios estudios epidemiologicos (Vease, por ejemplo, Salonen et al., Am. J. Epidemiol. 120: 342-349 (1984); Willett et al., Lancet 2: 130-134 (1983); Virtamo et al., Cancer 60: 145-148 (1987)). Se ha mostrado que diversos compuestos de selenio de origen natural y sintetico inhiben el desarrollo tumoral en estudios con animales en una amplia gama de dosificaciones (Vease, por ejemplo, Ip,. J. Nutr. 128: 1845-1854 (1998)). Aunque la mayona de los estudios con animales han usado dosis farmacologicas de selenio (>2 mg/kg) en la quimioprevencion del cancer (Vease, por ejemplo, Ip,. J. Nutr. 128: 1845­ 1854 (1998)), tambien se ha mostrado que la deficiencia de selenio aumentar la carcinogenesis de mama (Vease, por ejemplo, Ip y Daniel, Cancer Res. 45: 61-65 (1985) y de piel inducida por UVB (Vease, por ejemplo, Pence et al., 102: 759-761 (1994)).

Las protemas de la pared celular de la levadura se conectan a polisacaridos de la pared celular mediante enlace qmmico, y en un orden para liberar protemas de la pared celular de la levadura en solucion, y es necesario romper estos enlaces. La practica convencional para extraccion de protemas de la pared celular de la levadura es romper los enlaces usando hidrolisis alcalina (pH 11,5, 80 °C) antes de centrifugar para separar protemas de polisacaridos de glucano que son insolubles en agua.

Los experimentos realizados durante el desarrollo de realizaciones de la invencion se realizaron en un intento de extraer selenoglicoprotemas usando la practica convencional de hidrolisis alcalina. Estos intentos para extraer selenoglicoprotemas de la pared celular de la levadura usando hidrolisis alcalina fracasaron. Mas tarde se supo que el fallo en la extraccion de selenoglicoprotemas de la pared celular de la levadura usando hidrolisis alcalina se debio a la destruccion de las selenoglicoprotemas. Los intentos posteriores de extraccion de selenoglicoprotemas se realizaron mediante un procedimiento de hidrolisis alcalina modificada (pH 11,5, 60 °C). Estos intentos tampoco lograron extraer selenoglicoprotemas de la pared celular de la levadura. Los metodos habituales de extraccion de protema de levadura alcalina no funcionaron al intentar extraer selenoglicoprotemas de la levadura. Por lo tanto, se realizaron experimentos adicionales durante el desarrollo de realizaciones de la invencion que intentaron extraer selenoglicoprotemas mediante una extraccion acida (pH 5, 80 °C). Como se describe en el presente documento, el metodo de extraccion acida fue satisfactorio; las selenoglicoprotemas no se destruyeron y la extraccion fue posible.

Por lo tanto, en algunas realizaciones, la invencion proporciona nuevos metodos para obtener selenoglicoprotemas (SGPs), composiciones de selenoglicoprotema (SGP) (por ejemplo, obtenidas mediante metodos de extraccion acida (por ejemplo, fracciones de selenoglicoprotema dependientes de pH), composiciones que comprenden selenoglicoprotemas encapsuladas (SGP's). En particular, los experimentos realizados durante el desarrollo de realizaciones de la invencion demuestran que las composiciones (por ejemplo, que comprenden SGP (por ejemplo, aisladas mediante un metodo de la invencion)) y metodos de la invencion se pueden usar para proporcionar selenio biologicamente disponible a un sujeto (por ejemplo, aumentando de ese modo el contenido de selenio del tejido y/o musculo dentro del sujeto (por ejemplo, conduciendo de ese modo a una estabilizacion y/o mejora de la salud de un sujeto))). En algunas realizaciones, la invencion proporciona metodos para obtener SGP's, composiciones que comprenden SGP's encapsuladas (por ejemplo, polimersoma encapsulado). En algunas realizaciones, la invencion proporciona composiciones que comprenden SGPs y metodos para preparar, producir, purificar, aislar, extraer, y/o caracterizar las mismas.

La invencion tambien proporciona composiciones de selenio soluble (por ejemplo, SGPs) y metodos de produccion, y purificacion de las mismas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la invencion proporciona SGPs solubles (Veanse, por ejemplo, los Ejemplos 1-2 que describen la generacion de (por ejemplo, separacion y caracterizacion de) fracciones de SGP dependientes del pH) (Veanse, por ejemplo, los Ejemplos 3-4). En algunas realizaciones, la invencion proporciona selenio (por ejemplo, selenio organico (por ejemplo, fraccion de SGP dependiente del pH de SEL-PLEX u otra levadura enriquecida con selenio)) en una forma soluble. En algunas realizaciones, la invencion proporciona una composicion de selenio soluble (por ejemplo, selenio organico) con bajo contenido de fibra. En algunas realizaciones, la invencion proporciona composiciones y metodos para sistemas de administracion de selenio organico solubles (por ejemplo, selenoglicoprotemas encapsuladas con polimersoma, nanocapsulas, polfmeros).

La levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae), que crece en medio que contienen selenio (por ejemplo, selenio inorganico (por ejemplo, selenito sodico (Na²SeO³))) metabolica de selenio (por ejemplo, selenio inorganico) e incorpora selenio en lugar de azufre en cistema y metionina, proporcionando protemas que contienen selenoaminoacidos (SeCys y SeMet) (Demirci et al., J. Agric. Food Chem. 47, 2496-2500 (1999)., Demirci & Pometto. J. Agric. Food Chem. 47, 2491-2495 (1999), Ouerdane & Mester. J. Agric. Food Chem. 56,11792-11799, (2008)). ALLTECH, Inc. (Nicholsville, KY, USA) produce levadura enriquecida con selenio secada por pulverizacion comercializad con el nombre SEL-PLEX como un suplemento nutricional alimenticio y alimentario, que contiene "selenio organico" (Vease, por ejemplo, Korhola et al., Res. 18, 65-68, (1986).). La concentracion minima de selenio en SEL-PLEX es de 1500 ppm y las protemas son los vehmulos exclusivos del mismo (Vease, por ejemplo, Surai.

Nottingham University Press 2002, 234-236 (2002), Kelly & Power. J. Dairy Sci. 78, 237-242 (1995), McSheehy et al., Analyst 130, 35-37 (2005)). En la levadura existen dos combinaciones de protemas: protemas presentes dentro de la celula de levadura y protemas asociadas con el manano de la pared celular de la levadura (Vease, por ejemplo, Sedmak. Publicacion de Sol. de Patente de Estados Unidos Pub. N.°: US 2006/0263415.). Aproximadamente un 17,0 % en peso de SEL-PLEX comercial es soluble en agua, y este material contiene menos de un 6,5 % del selenio total que esta presente en SEL-PLEX. Los estudios de alimentacion de pollos en los que se usaron SEL-PLEX y selenito sodico como las fuentes de selenio, indicaron una transferencia de selenio mucho mejor en un musculo de pechuga de pollo con SEL-PLEX. Para administracion oral de SEL-PLEX se descubrieron una diversidad de bioactividades (Vease, por ejemplo, Rayman. The Lancet 356, 233-241 (2000), McKenzie Trends in Immunology 19, 342-345 (1998), Tapiero. Biomedicine & Pharmacotherapy 57, 134-144 (2003), Combs & Grey Pharmacol. Ther. 79, 179-192 (1998), Clark et al., J. Am. Med. Assoc. 276, 1957-1963 (1996)).

En algunas realizaciones, la invencion proporciona separacion, y caracterizacion ffsica y qmmica de selenoglicoprotemas solubles (SGP's) de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) que crece en medio que contienen selenio (por ejemplo, selenio inorganico (por ejemplo, selenito sodico)), y su participacion activa en el suministro de "selenio organico" a los tejidos (por ejemplo, human o, animal, pollo, etc.), mediante alimentacion del sujeto con alimento (por ejemplo, pienso) suplementado con o que de otro modo contiene la SGP de la invencion (Veanse, por ejemplo los Ejemplos 1-4). La invencion proporciona administracion dirigida al tejido, por via intravenosa, oral, y/o transdermica de componentes de selenio soluble, activos (por ejemplo, fracciones de SGP dependientes del pH de una levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX)). En algunas realizaciones, la invencion proporciona formas de liberacion lenta de sistemas de suministro de "selenio organico" (por ejemplo, nanocapsulas, esferas de polfmero, y SGPs encapsuladas con polimersoma) (Veanse, por ejemplo los Ejemplos 5­ 9). En algunas realizaciones, la invencion proporciona una composicion que comprende SGP's encapsulada con polimersoma. En algunas realizaciones la invencion proporciona un aumento del suministro y mejora de la biodistribucion de SGP's al encapsular SGP's dentro de polimersomas a base de poli(oxido de etileno)-bloque-poli(£-caprolactona) (PEO-b-PCL).

Se ha descrito la separacion de diversos componentes de las celulas de levadura mediante extraccion de la pared celular de componentes intracelulares de celulas de levadura (Vease, por ejemplo, Otero et al., J. Chem. Tech. Biotechnol. 66, 67-71 (1996)). Estas tecnicas de separacion no se han aplicado a la extraccion de levadura de selenio secada por pulverizacion. Las condiciones alcalinas, convencionales (pH 9,0-14,0) usadas en la tecnica para extraccion de glicoprotemas a partir de levadura (Vease, por ejemplo, Roberge et al., J. Agric. Food Chem. 51,4191­ 4197 (2003)) fallaron porque los sustituyentes de SeH o SeMe se eliminaron de los aminoacidos selenocistina o selenometionina. En otras palabras, los sustituyentes deseados se descompusieron y como resultado el selenio que estaba presente en la SGP original se perdio durante el intento de extraccion en condiciones alcalinas cuando se aplicaba a la extraccion de selenoprotemas que contienen levadura (Vease, por ejemplo, Tabla 12 del Ejemplo 8).

Por consiguiente, en algunas realizaciones, la invencion proporciona composiciones de selenoglicoprotema (por ejemplo, que comprenden una fraccion de selenoglicoprotemas dependiente del pH que se describe en el presente documento). En algunas realizaciones, la invencion proporciona metodos para producir, purificar, aislar, extraer, separar, precipitar, y/o caracterizar selenoglicoprotemas (por ejemplo, de levadura enriquecida con selenio).

II. Extraccion, separacion, purificacion y uso

En algunas realizaciones de la invencion, el selenio soluble se obtiene en forma de selenoglicoprotemas (SGPs). En algunas realizaciones, las SGPs se extraen a partir de una fuente general de selenoprotemas (por ejemplo, levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX)). En algunas realizaciones, la extraccion y/o purificacion de las SGPs comprende una o mas etapas de extraccion/precipitacion dependientes del pH (por ejemplo, como se describe en los Ejemplos 1 y 2). En algunas realizaciones, la extraccion y/o purificacion de las SGPs comprende una o mas etapas de fraccionamiento dependientes del pH. En algunas realizaciones la invencion proporciona extraccion acida de levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) para sutilizar las SGP (por ejemplo, sin desnaturalizar y/o destruirlas SGPs). En algunas realizaciones, la invencion proporciona esa precipitacion de SGPs dependiente del pH a partir de un extracto acido (por ejemplo, como se describe en los Ejemplos 1-2) que produce un aumento del contenido de selenoglicoprotemas, disminucion del contenido de fibras no digeribles, y una concentracion elevada de selenio (por ejemplo, una concentracion de selenio que es mas elevada que la presente en SEL-PLEX). Por lo tanto, en algunas realizaciones, la invencion proporciona SGP extrafdo de levadura enriquecida con selenio donde el contenido de selenio de la SGP es mayor que el contenido de selenio del material a partir del cual se extrajo la SGP (por ejemplo, en % en p/p, ppm). En algunas realizaciones, la invencion proporciona selenio en forma de una fraccion de SGP dependiente del pH (por ejemplo, fracciones a pH 4,0 o pH 6,0) de levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) que presenta el mismo nivel o un nivel altamente similar de biodisponibilidad cuando se administra a un sujeto en comparacion con la biodisponibilidad de selenio a partir de la fuente precursora de levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) (Vease, por ejemplo, Ejemplo 3, Tabla 5).

En algunas realizaciones, las SGPs se extraen a partir de una fuente general de selenoprotemas (por ejemplo, celulas de levadura enriquecidas con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX)). En algunas realizaciones, una parte de las selenoprotemas en una fuente de selenoprotema comprende las SGPs (por ejemplo, 0,1 %... 0,2 %... 0,5%...

1,0 %... 2,0 %... 5,0 %... 10 %... 20 %... 50 % o mas SGPs). En algunas realizaciones, una fuente de selenoprotema Comprende celulas (por ejemplo, celulas de levadura) que se han cultivado en presencia de medios que contienen Se (por ejemplo, medios ricos en Se). En algunas realizaciones, las celulas que contienen Se (por ejemplo, celulas de levadura) se procesan para extraer, aislar, y/o unificar selenoprotemas dando como resultado una fuente de selenoprotema o composicion rica en selenoprotema (por ejemplo, composicion rica en SGP). En algunas realizaciones, una muestra que comprende selenoprotemas y SGPs se enriquece con SGPs.

En algunas realizaciones, una fuente de selenoprotema o composicion rica en selenoprotema (por ejemplo, fuente de levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX)) se somete a una o mas etapas para producir aislar, purificar, separar, y/o extraer las SGPs. En algunas realizaciones, una fuente de selenoprotema se mezcla (por ejemplo, en un vehmulo lfquido (por ejemplo, agua, tampon, sal)) para producir una suspension, mezcla, lisado y/o solucion de protema. En algunas realizaciones, la fuente de selenoprotema (por ejemplo, fuente de levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX)) se mezcla a temperatura elevada (por ejemplo, por encima de la temperatura de congelacion, por encima de la temperatura ambiente, 30 °C... 40 °C... 50 °C... 60 °C... 70 °C...

80 °C... 90 °C o superior). En algunas realizaciones, la fuente de selenoprotema (por ejemplo, fuente de levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX)) se mezcla a pH bajo (por ejemplo, condiciones acidas (por ejemplo, pH 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 3,0, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 o 6,5). En algunas realizaciones, la fuente de selenoprotema (por ejemplo, fuente de levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX)) se mezcla suavemente, se mezcla rapidamente, se mezcla minuciosamente, se mezcla vigorosamente. En algunas realizaciones, la fuente de selenoprotema (por ejemplo, fuente de levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX)) se mezcla pH bajo pH (por ejemplo, condiciones acidas (por ejemplo, pH 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 3,0, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 o 6,5) y temperatura elevada (por ejemplo, por encima de la temperatura de congelacion, por encima de la temperatura ambiente, 30 °C... 40 °C... 50 °C... 60 °C... 70 °C... 80 °C... 90 °C, o superior)). En algunas realizaciones, el pH de la mezcla se mantiene mediante la adicion de acido o base.

En algunas realizaciones, la mezcla que contiene selenoprotema se centrifuga para separar las fases lfquidas/solubles y solidas/insolubles. En algunas realizaciones, se selecciono una velocidad de la centrifugadora que es suficiente para separar las fases. En algunas realizaciones, la fase lfquida comprende SGPs solubles. En algunas realizaciones, el pH de la fase lfquida se ajusta (por ejemplo, se aumenta) para precipitar una parte de las SGPs. En algunas realizaciones, el pH de la fraccion lfquida se aumenta de forma ligera a moderada (por ejemplo, el pH presenta un aumento de 0,1... 0,2... 0,5... 1,0... 2,0) para precipitar las SGPs que eran solubles al pH original, pero no al pH elevado. En algunas realizaciones, el pH de la fraccion lfquida se aumenta de formas significativa (por ejemplo, el pH presenta un aumento de 1 ,0. 2 ,0. 3 ,0. 4 ,0. 5 ,0.6,0) para precipitar una gran parte de las SGPs que eran solubles al pH original. En algunas realizaciones, las selenoglicoprotemas se hacen precipitar y se separan de la fase lfquida en una diversidad de condiciones de pH para generar multiples fracciones de selenoglicoprotemas solubles dependientes del pH. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una sola fase lfquida que comprende el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble en condiciones acidas se usa para crear una primera fraccion de selenoglicoprotemas solubles que precipita a un primer pH (por ejemplo, pH de 1,85), una segunda fraccion de selenoglicoprotemas solubles que precipita a un segundo pH (por ejemplo, pH de 3,0), una tercera fraccion de selenoglicoprotemas solubles que precipita a un tercer pH (por ejemplo, pH de 4,0), y una cuarta fraccion de selenoglicoprotemas solubles que precipita a un cuarto pH (por ejemplo, pH de 6,0). En algunas realizaciones, la precipitacion de las selenoglicoprotemas de la fase lfquida mediante aumento del pH de la fase lfquida comprende multiples reacciones de precipitacion secuencial dependiente del pH de la fase lfquida.

En algunas realizaciones, las SGPs precipitadas se separan de la fraccion lfquida con el pH ajustado por centrifugacion (por ejemplo, a una velocidad suficiente como para producir fases lfquidas y solidas separadas). En algunas realizaciones, las SGPs que se han separado de la fase lfquida se liofilizan para producir una fraccion solida de SGP. En algunas realizaciones, el proceso para aumentar el pH de la fase lfquida y centrifugacion para aislar la fraccion de SGP se repite para producir fracciones de SGP de diferentes solubilidades (por ejemplo, soluble por debajo de pH 1,5... soluble por debajo de pH 2... soluble por debajo de pH 3... soluble por debajo de pH 4... soluble por debajo de pH 5... soluble por debajo de pH 6). En algunas realizaciones, la fase lfquida que permanece despues de la retirada de la fraccion final de SGP encuentra utilidad como un componente de medios de crecimiento para celulas usadas en produccion adicional de selenoprotemas o SGPs. La lista inicial la composicion que comprende selenoglicoprotemas solubles contiene dos o mas fracciones dependientes del pH de selenoglicoprotemas (por ejemplo, selenoglicoprotemas solubles de fase lfquida que comprenden el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble en condiciones acidas que precipitan a dos o mas valores de pH diferentes).

En una realizacion preferente, el proceso de extraccion de SGP a partir de una fuente de selenoprotema (por ejemplo, levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX)) y fraccionamiento dependiente del pH de la mezcla de SGP's (Veanse, por ejemplo, las Figuras 2 y 3) comprende dos etapas (Veanse por ejemplo, los Ejemplos 1-2, Figuras 1 y 2). En la primera etapa, una suspension de levadura enriquecida con selenio en HCl 0,3 N (pH 1,5) se agita y se calienta a 80 °C durante 8 horas. El pH de la mezcla se mantiene a pH 1,5 por adicion de HCl concentrado durante la primera hora de la estacion. Despues de ocho horas, la mezcla se centrifuga, y la fase lfquida se separa. El pH de la solucion se ajusta a 1,85, mediante la adicion de NaOH 2,0 N y las SGP's que tienen solubilidad limitada a este pH precipitan a partir de la solucion y se separan de los lfquidos (pH 1,85) con la segunda centrifugacion y a continuacion se liofilizan para producir una fraccion solida de SGP de pH 1,85. En algunas realizaciones, los Mquidos (pH 1,85) se mezclan con los solidos (pH 1,5) a partir de la primera centrifugacion, que da como resultado un cambio del pH de la mezcla a pH 1,6. La mayona de las SGP's solubles a pH 1,6, se transfieren a la fase Mquida, sin aumento de los volumenes de las corrientes residuales creadas dentro de esta etapa del proceso. El producto secundario principal de esta etapa del proceso son solidos de la segunda centrifugacion. La corriente de solidos residuales constituye aproximadamente un 56,5 % en peso de la levadura enriquecida con selenio tomara para extraccion y contiene material valioso de pared celular de levadura de selenio que contiene: un 38,91 % de protema y 2477 ppm de selenio. En algunas realizaciones, estos solidos se usan (por ejemplo, solos o en combinacion con otro material (por ejemplo, levadura enriquecida con selenio)) como un suplemento nutricional ecologico en dietas para animales. En la segunda etapa (Vease, por ejemplo, la Figura 3), la fase lfquida (pH 1,6) de la segunda centrifugacion (VEASE FIG. 2) se transfiere a una mezcladora y el pH se ajusta a pH 3,0 mediante la adicion de NaOH 2,0 N y las SGP's que tienen solubilidad limitada a este pH precipitan a partir de la solucion y se separan de los lfquidos (pH 3,0) con la tercera centrifugacion y por ultimo se liofiliza para producir una fraccion solida de SGP de pH 3,0 (Veanse, por ejemplo, los Ejemplos 1-2 y las Figuras 2 y 3). La fase lfquida (pH 3,0) de la tercera centrifugacion se transfiere a una mezcladora y el pH se ajusta a pH 4,0 mediante la adicion de NaOH 2,0 N y las SGP's que tienen solubilidad limitada a este pH precipitan a partir de la solucion y se separan de los lfquidos (pH 4,0) mediante la cuarta centrifugacion y por ultimo se liofiliza para producir una fraccion solida de SGP de pH 4,0. La fase lfquida (pH 4,0) de la cuarta centrifugacion se transfiere a una mezcladora y el pH se ajusta a pH 6,0 mediante la adicion de NaOH 2,0 N y las SGP's que tienen solubilidad limitada a este pH precipitan a partir de la solucion y se separan de los lfquidos (pH 6,0) mediante la quinta centrifugacion y a continuacion se liofiliza para producir una fraccion solida de SGP de pH 6,0. la unica corriente residual producida en la segunda etapa del proceso es la corriente de agua residual, que contiene un 13,4 % en peso de solidos ( en comparacion con el peso de la levadura enriquecida con selenio usada en la estacion) fuera de lo cual la fraccion de protema constituye aproximadamente un 13,3% en peso, de cloruro sodico para un 3,6% en peso y los mono- y oligosacaridos glucosa y manosa constituyen mas de un 80 % en peso. Esta corriente de "agua residual" de pH 6,0 y concentracion de selenio de 242 ppm se puede reciclar o de otro modo volver a usar para la preparacion de un nuevo lote de levadura de selenio (por ejemplo, usada en medios de crecimiento).

En algunas realizaciones, las SGP's precipitadas a pH 4,0 presentan un suministro de selenio superior (por ejemplo, para tejido muscular) en comparacion con la levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) y un suministro muy superior cuando se compara con formas inorganicas de selenio (por ejemplo, selenito sodico) (Vease, por ejemplo el Ejemplo 3). Ademas, las fracciones de selenoglicoprotema dependientes del pH (por ejemplo, pH 6,0) tienen una composicion diferente a la de la levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) y permiten el suministro de cantidades similares de selenio aunque requiere una cantidad mucho menor de material de partida (por ejemplo, levadura enriquecida con selenio).

En algunas realizaciones, un procedimiento de extraccion de SGP comprende 4 o menos etapas de ajuste de pH y centrifugacion del procedimiento que se ha mencionado anteriormente (por ejemplo, 1 etapa de ajuste del pH y centrifugacion, 2 etapas de ajuste del pH y centrifugacion, 3 etapas de ajuste del pH y centrifugacion, 4 pH etapas de ajuste del pH y centrifugacion).

MI. Alimentacion para animales

Alimentacion para animales se refiere a cualquier producto alimentario usado para alimentar a ganado domesticado (por ejemplo, vacuno, cabras, ovejas, caballos, aves, bufalos, alpacas, llamas, burros, mulas, conejos, pollos, gansos, pavos o cerdos). Los alimentos para animales a menudo incluyen heno, paja, cereales en silos, piensos comprimidos y granulados, aceites y relaciones mixtas, y tambien granos y legumbres germinados. La industria mundial de alimentacion para animal consumio 635 millones de toneladas de pienso en 2006, con una tasa anual de crecimiento de aproximadamente un 2 %. El uso del campo agncola para cultivar productos alimentarios en lugar de alimento para seres humanos puede ser controvertido; algunos tipos de alimentacion, tal como mafz (Mafz), tambien pueden servir como alimento humano, aunque otros tales como la hierba no pueden servir. Ademas de proporcionar una fuente de energfa a los animales, los piensos para animales tambien proporcionan nutrientes (por ejemplo, selenio) usados por el cuerpo.

Las composiciones nutricionales (por ejemplo, composiciones de selenio soluble (por ejemplo, SGPS) permiten una generacion de composiciones para alimentacion para animal que comprenden selenio (por ejemplo, concentraciones elevadas de selenio con respecto a las composiciones de pienso convencionales (por ejemplo, selenio soluble)) que disminuye los costes globales, aumentara la conversion del pienso y mantiene y/o mejora la calidad de los productos animales (por ejemplo, carne, huevos, productos lacteos, etc.) obtenidos a partir del ganado que recibe los mismos en comparacion con los piensos convencionales.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, una composicion de suplemento dietetico comprende las SGPs que se pueden combinar con y/o incorporar en un alimentacion para animal y se pueden administrar a (por ejemplo, dar en forma de alimento a) un animal para proporcionar efectos equivalentes o superiores en el rendimiento del crecimiento en el animal (por ejemplo, en comparacion con dietas de alimentacion para animales con otras formas de suplemento de selenio (por ejemplo, levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX)). En algunas realizaciones, una composicion de suplemento dietetico de la invencion aumenta la cantidad de selenio circulante (por ejemplo, situada en la sangre y/o suero) en un sujeto (por ejemplo, ser humano o animal) que recibe la composicion. En algunas realizaciones, en las composiciones de selenio soluble de la invencion (por ejemplo, SGPs) esta biodisponible una mayor proporcion de selenio administrado que en otras formulaciones de selenio (por ejemplo, selenito sodico o levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX)). Es decir, en algunas realizaciones, las composiciones comprenden selenoglicoprotemas que contienen una proporcion mas elevada y/o proporcion de selenio que se pone a disposicion (por ejemplo, biodisponible) para un sujeto en comparacion con otras formas de selenio (por ejemplo, levadura enriquecida con selenio) lo que significa que son necesarias cantidades menores de una composicion que comprende la selenoglicoprotema de la invencion (por ejemplo, para obtener cantidades similares de biodisponibilidad). En algunas realizaciones, una composicion de suplemento dietetico (por ejemplo, que comprende las SGPs de la invencion) aumenta la cantidad de selenio (por ejemplo, situado en el musculo u otro tejido) en un sujeto (por ejemplo, ser humano o animal) que recibe la composicion. En algunas realizaciones, la administracion de las SGPs y/o selenio soluble da como resultado un aumento de la biodisponibilidad de selenio para suero, tejido adiposo, tejido muscular.

En algunas realizaciones, un metodo para aumentar la eficacia con la que un animal usa los nutrientes en una dieta para alimentar al animal comprende la provision al animal una dieta que comprende una composicion de suplemento dietetico, donde la composicion de suplemento aumenta la capacidad del animal para profesar y usar Los nutrientes presentes en su dieta. En algunas realizaciones, una composicion de suplemento dietetico aumenta la cantidad de antioxidantes circulantes (por ejemplo, selenio localizado en la sangre y/o suero) en un sujeto que recibe la composicion. En algunas realizaciones, una composicion de suplemento dietetico aumenta la cantidad de antioxidantes (por ejemplo, selenio localizado en tejido adiposo, musculo, etc.) en un sujeto que recibe la composicion.

IV. Agentes farmaceuticos, nutriceuticos y suplementos

La FDA ha establecido los niveles de selenio nutricionales (Vease 21 C.F.R. 101.9 (c)(8) (iv), enero de 1994). Los seres humanos y los animales pueden antagonizar de forma segura a cantidades limitadas de formas tanto inorganicas como organicas de selenio y pueden convertir el selenio no metilado en derivados mono- o di- o trimetilados, de los cuales los mas toxicos son los derivados monometilados. (Vease, por ejemplo, Bedwal, R. S., et al., Medical Hypotheses, 41 (2): 150-159 (agosto de 1993)). La FDA ha adoptado las Ingestas Diarias de Referencia (RDI) de 70 microgramos de selenio para mujeres en periodo de lactancia y RDI de 55 microgramos para adultos que no estan en periodo de lactancia. Se ha informado que la dosificacion de selenio de 600 microgramos al dfa es segura. (Vease, por ejemplo, Ferris G. M. Lloyd, et al., App. Clin. Biochem., 26: 83-88 (1989). A aproximadamente esta dosificacion, la actividad normal de la enzima glutation reductasa convierte de forma segura a la selenoglutation en seleniuro de hidrogeno en el tugado y eritrocitos y por ultimo se secreta. Por lo tanto, a tales dosificaciones mas bajas, el cuerpo es capaz de estabilizar y secretar de forma segura es el ano que esta presente en una forma metalica libre. Sin embargo, al igual que con muchos elementos traza (por ejemplo, selenio), a niveles de dosificacion o concentraciones mas elevados los efectos beneficiosos se invierten y se manifiesta una toxicidad peligrosa. (Vease, por ejemplo, Furnsinn, C. et al., Internat'l J. of Obesity and Related Metab. Dis., 19 (7): 458-463 (1995)).

La administracion de selenio en la forma natural implica una solucion de compromiso cientffica y medica porque, cuando se administra en concentraciones relativamente bajas, el selenio proporciona efectos de salud beneficiosos, sin embargo, a concentraciones mas elevadas, de selenio presenta una toxicidad espectacular de modo que los beneficios potenciales de salud se pierden y la toxica se convierte en la preocupacion principal.

Como se ha descrito anteriormente, ciertas formas de selenio (por ejemplo, SGPs, selenio soluble en agua) proporcionan efectos beneficiosos a un sujeto. La evidencia ha demostrado que las formas organicas de selenio (por ejemplo, selenometionina y levadura enriquecida con selenio) pueden ser menos toxicas y mejor absorbidas que las formas inorganicas (Vease, por ejemplo, Mahan, Proceedings of the 15th Annual Symposium Nottingham University Press, Nottingham, Reino Unido, pp. 523-535 (1999). Sin embargo, en algunas realizaciones, se usan multiples formas de selenio en combinacion con otras (por ejemplo, para proporcionar efectos beneficiosos para la salud de un sujeto). Las fuentes naturales de selenio incluyen, pero no se limitan a, levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, selenizada).

En ciertas realizaciones preferentes, las SGPs (por ejemplo, obtenidas a partir de levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX), como se describe en los Ejemplos 1-2) son la forma de selenio elegida para las formulaciones y composiciones de la invencion. En algunas realizaciones, las composiciones que comprenden selenio soluble en agua y/o SGPs proporcionan una forma de selenio mas biologicamente disponible en comparacion con otras formas de selenio. Sin embargo, tambien se pueden usar otras formas de selenio, incluyendo derivados o modificaciones de selenio soluble en agua y/o SGPs, SEL-PLEX, u otras formas de levadura enriquecida con selenio, selenometionina, selenocistema, un compuesto de selenito, un compuesto de seleniato, o derivados, sales, o modificaciones de los mismos. Por lo tanto, en algunas realizaciones preferentes, cada una de estas formas de selenio se puede usar como un componente de una formulacion. Como alternativa, cada una de las formas de selenio que se han descrito anteriormente puede estar relacionada (por ejemplo, qmmica o ffsicamente) con un farmaco o agente terapeutico para formar un derivado de farmaco de selenio. De hecho, una composicion o formulacion puede comprender multiples formas de selenio (por ejemplo, SGPs y SEL-PLEX, o Sod-sel y selenio soluble en agua).

Otras formas de selenio que encuentran en uso en diversas realizaciones de la presente invencion se describen en los documentos de Patente de Estados Unidos N.os 6.911.550, 6.197.295, 5.221.545, 6 y 6,576,233, y en las solicitudes de Patente de Estados Unidos N.os 20010043925, 20050069594, 20050089530, y 20080107755.

Por consiguiente, las composiciones farmaceuticas, nutriceuticas y/o de suplemento (por ejemplo, producto alimentario y/o composicion o tratamiento dietetico) que comprenden una o mas formas de selenio (por ejemplo, SGPs, selenio soluble (por ejemplo, selenio soluble en agua), etc.), solas o en combinacion con al menos otro agente, tal como un compuesto estabilizante, otro u otros agentes terapeuticos, nutriente(s) y/o minerales; y se puede administrar en cualquier vetuculo esteril biocompatible, incluyendo solucion salina, solucion salina tamponada, dextrosa, agua que se pueda proporcionar.

Los metodos encuentran uso en el tratamiento (por ejemplo, por via profilactica o terapeutica) de enfermedades (por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas, cancer, etc.) o en la alteracion de estados fisiologicos. El selenio (por ejemplo, selenio soluble (por ejemplo, selenio soluble en agua, SGPs))) se puede administrar a un sujeto (por ejemplo, un paciente) por via intravenosa en un vetuculo farmaceuticamente aceptable tal como solucion salina fisiologica. Para la administracion intracelular de compuestos se pueden usar metodos convencionales (por ejemplo, administracion a traves de liposomas). Los metodos de ese tipo son bien conocidos por las personas con experiencia habitual en la materia. Las formulaciones son utiles para administracion parenteral, tal como intravenosa, subcutanea, intramuscular e intraperitoneal. En algunas realizaciones, las composiciones (por ejemplo, SGPs y/o formulaciones farmaceuticas que comprenden las mismas) se administran por via oral.

Como se sabe bien en las tecnicas medicas, las dosificaciones para un sujeto cualquiera pueden depender de muchos factores, incluyendo la talla del paciente, el area de la superficie corporal, la edad, el compuesto particular que se va a administrar, el sexo, el tiempo y la via de administracion, la salud general y la interaccion con otros farmacos que se estan administrando de forma simultanea.

Por consiguiente, en algunas realizaciones las composiciones y/o formulaciones que comprenden selenio (por ejemplo, selenio soluble (por ejemplo, selenio soluble en agua), SGPs,) se administran a un sujeto solo, o en combinacion con otras formas de selenio, farmacos, moleculas pequenas, o en composiciones farmaceuticas en las que se mezcla con excipiente(s) u otros vetuculos farmaceuticamente aceptables. En algunas realizaciones, el vetuculo farmaceuticamente aceptable es farmaceuticamente inerte. En otras realizaciones, las composiciones que comprenden selenio (por ejemplo, selenio soluble (por ejemplo, selenio soluble en agua), SGPs) se administran solas a sujetos individuales que padecen una enfermedad o afeccion. En otras realizaciones, las composiciones que comprenden selenio (por ejemplo, selenio soluble (por ejemplo, selenio soluble en agua), SGPs,) se administran solas a sujetos individuales para la promocion de la salud general o la salud de un sistema corporal. Las composiciones que comprenden selenio (por ejemplo, selenio soluble (por ejemplo, selenio soluble en agua), SGPs) solas o en combinacion con una u otras formas mas de selenio se pueden anadir a una bebida o alimento nutricional (por ejemplo, ENSURE, POWERBAR), una multivitamina, productos nutricionales, productos alimentarios, etc., para el consumo diario.

Dependiendo de la diana que se busca alterar con el tratamiento (por ejemplo, la expresion genetica asociada con el envejecimiento, y/o la regulacion de la expresion genetica asociada con el cancer y/o el crecimiento o metastasis tumoral), estas composiciones farmaceuticas, suplementos, y/o nutraceuticas se formulan y administran por via sistemica o por via local. Las tecnicas para formulacion y administracion se pueden encontrar en la ultima edicion de "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Publishing Co, Easton Pa.). Las vfas adecuadas pueden incluir, por ejemplo, la administracion oral o transmucosal; asf como la administracion parenteral, incluyendo la administracion intramuscular, subcutanea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, o intranasal.

Para inyeccion, las composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio soluble (por ejemplo, selenio soluble en agua), SGPs, etc.) se formulan en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiologicamente compatibles tales como solucion de Hanks, solucion de Ringer, o solucion salina fisiologicamente tamponada. Para la administracion tisular o celular, en la formulacion se usan agentes penetrantes apropiados para la barrera particular que se va a permear. Los agentes penetrantes de ese tipo generalmente se conocen en la tecnica.

En otras realizaciones, las composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio soluble (por ejemplo, selenio soluble en agua), SGPs, etc.) se formulan usando vehfculos farmaceuticamente aceptables bien conocidos en la tecnica en dosificaciones adecuadas para la administracion oral. Los vetuculos de ese tipo permiten que las composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio soluble (por ejemplo, selenio soluble en agua), SGPs,) se formulen como comprimidos, pfldoras, capsulas, lfquidos, geles, jarabes, lodos, suspensiones para ingestion oral o nasal por parte de un paciente que se va a tratar.

Las composiciones farmaceuticas incluyen composiciones donde los principios activos (por ejemplo, composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio soluble (por ejemplo, selenio soluble en agua), SGPs) estan contenidos en una cantidad eficaz para conseguir el proposito deseado. Por ejemplo, una cantidad del agente farmaceutico puede ser la cantidad que altera la expresion de un gen espedfico (por ejemplo, KTLG, GRB2, DNAJ3, TGFB1, MAPK8, C1R, UBE4A, S^m PX, USP22, y/o PTP4A1). La determinacion de las cantidades eficaces esta bien dentro de la capacidad de las personas con experiencia en la materia.

Las SGP dependientes del pH y las composiciones que las comprenden se pueden usar en la prevencion y/o el tratamiento terapeutico del cancer (por ejemplo, para prevenir o retardar la progresion y/o metastasis del cancer/tumor). Por ejemplo, en una realizacion preferente, una fraccion de SGP dependiente del pH de una levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) se administra a un sujeto para regular la expresion (por ejemplo, de una manera deseada) de un gen asociado con el crecimiento y/o metastasis del cancer). Como se describe en el presente documento, se ha identificado que ciertas fracciones solubles de SGP tienen propiedades biologicas (por ejemplo, la capacidad de regular la expresion genica) de la cual se obtuvo que el material precursor de la fraccion de SGP, soluble (por ejemplo, levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX)) no tiene (Vease, por ejemplo, el Ejemplo 4 y las Figuras 7-11). En una realizacion preferente, la fraccion de SGP dependiente del pH de una levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) es una fraccion dependiente del pH 4,0, aunque otras fracciones (por ejemplo, pH 3,0, pH 6,0, etc.) tambien encuentran no son las composiciones y metodos de la invencion.

Ademas de los principios activos, estas composiciones farmaceuticas que contienen selenio (por ejemplo, selenio soluble (por ejemplo, selenio soluble en agua), SGPs, etc.) pueden contener veldculos farmaceuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y agentes auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se pueden usar farmaceuticamente. Las preparaciones formuladas para administracion oral pueden estar en forma de comprimidos, grageas, capsulas, o soluciones.

Las composiciones farmaceuticas se pueden fabricar de una manera que sea conocida por sf misma (por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezcla, disolucion, granulacion, fabricacion de grageas, levigacion, emulsificacion, encapsulacion, atrapamiento o liofilizacion).

Las formulaciones farmaceuticas para administracion parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Ademas, las suspensiones de los compuestos activos se pueden preparar como suspensiones oleosas apropiadas para inyeccion. Los disolventes o veldculos lipofilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sesamo, esteres de acidos grasos sinteticos, tales como oleato de etilo o trigliceridos, o liposomas. Las suspensiones para inyeccion acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspension, tales como carboximetil celulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspension tambien puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparacion de soluciones altamente concentradas.

Las preparaciones farmaceuticas para uso oral se pueden obtener mediante combinacion de los compuestos activos con un excipiente solido, moliendo opcionalmente una mezcla resultante y procesando la mezcla de granulos, despues de anadir los agentes auxiliares adecuados, si se desea, nucleos de comprimidos o grageas. Los excipientes adecuados son los rellenos de carbohidratos o protemas, tales como azucares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; almidon de mafz, trigo, arroz, patata; celulosa tal como metil celulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, o carboximetilcelulosa de sodio; y gomas que incluyen arabigas y tragacanto; y protemas tales como gelatina y colageno. Si se desea, se pueden agregar agentes disgregantes o solubilizantes, tales como polivinilo pirrolidona reticulada, goma de agar, acido algmico o una sal del mismo tal como alginato sodico.

Se proporcionan nucleos de gragea con revestimientos adecuados tales como soluciones de azucar concentradas, que tambien pueden contener goma arabiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, y/o dioxido de titanio, soluciones de laca y disolventes o mezclas de disolventes organicos adecuados. A los comprimidos o revestimientos de grageas se les pueden anadir colorantes o pigmentos para la identificacion del producto o para caracterizar la cantidad de compuesto activo, (es decir, dosificacion).

Las preparaciones farmaceuticas que se pueden usar incluyen capsulas de ajuste a presion hechas de gelatina, asf como capsulas blandas selladas hechas de gelatina y un revestimiento tal como glicerol o sorbitol. Las capsulas de ajuste a presion pueden contener los principios activos mezclados con un relleno o aglutinantes tales como lactosa o almidones, lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, agentes estabilizantes. En las capsulas blandas, los compuestos activos se pueden disolver o suspender en lfquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina lfquida o polietilenglicol lfquido con o sin estabilizantes.

Las composiciones que comprenden un compuesto de la invencion formulado en un vehmulo farmaceuticamente aceptable se pueden preparar, se pueden colocar en un recipiente apropiado y se pueden etiquetar para el tratamiento de una afeccion indicada. Para composiciones o formulaciones que contengan selenio, las afecciones indicadas en la etiqueta pueden incluir el tratamiento de afecciones relacionadas con el tratamiento profilactico o terapeutico de una enfermedad o afeccion (por ejemplo, cancer, enfermedad neurodegenerativa y/o funcion cognitiva).

La composicion farmaceutica se puede proporcionar como una sal y se puede formar con muchos acidos, que incluyen, pero no se limitan a, clortndrico, sulfurico, acetico, lactico, tartarico, malico, succmico, etc. Las sales tienden a ser mas solubles en disolventes acuosos u otros disolventes protonicos que son las correspondientes formas de base libre. En otros casos, la preparacion preferente puede ser un polvo liofilizado en histidina 1 mM-50 mM, sacarosa al 0,1 %-2 %, manitol al 2 %-7 % a un intervalo de pH de 4,5 a 5,5 que se combina con tampon antes de su uso.

Para cualquier compuesto, la dosis terapeuticamente eficaz se puede calcular inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. A continuacion, preferentemente, la dosificacion se puede formular en modelos animales (en particular modelos murinos) para conseguir un intervalo de concentracion circulante deseable.

Una dosis terapeuticamente eficaz se refiere a la cantidad que mejora o previene smtomas de una patologfa o afeccion (por ejemplo, mediante la alteracion de la expresion genica). La toxicidad y la eficacia terapeutica de tales compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmaceuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL⁵⁰ (la dosis letal para un 50 % de la poblacion) y la DE⁵⁰ (la dosis terapeuticamente eficaz para un 50 % de la poblacion). La proporcion de dosis entre los efectos toxicos y terapeuticos es el mdice terapeutico, y se puede expresar como la proporcion DL⁵⁰/DE⁵⁰. Son preferentes los compuestos que presentan grandes indices terapeuticos. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos de cultivo celular y estudios en animales adicionales se pueden usar para formular un intervalo de dosificacion para uso humano. La dosificacion de los compuestos de ese tipo se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones en circulacion que incluyen la DE⁵⁰ con poca o ninguna toxicidad. La dosificacion vana dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificacion usada, sensibilidad del paciente, y la via de administracion. La dosificacion exacta puede ser elegida por un sujeto o por un medico en vista del paciente a tratar. La dosificacion y la administracion se ajustan para proporcionar niveles suficientes del resto activo o para mantener el efecto deseado (por ejemplo, alteracion de la expresion genetica en un sujeto). los factores adicionales que se pueden tener en cuenta incluyen la gravedad de la patologfa; edad, peso y genero del paciente; dieta, tiempo y frecuencia de administracion, combinacion o combinaciones de farmacos, sensibilidad a la reaccion y tolerancia/respuesta a la terapia. Las composiciones farmaceuticas de accion prolongada se pueden administrar cada 3 a 4 dfas, cada semana, o una vez cada dos semanas o una vez al mes, en funcion de la semivida y la tasa de eliminacion de la formulacion particular.

En algunas realizaciones, el selenio (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGPs,) se administra a una dosis diaria de entre 25 y 600 |jg al dfa (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, y/o SGP se administra a un sujeto de un modo tal como para proporcionar entre 25 y 600 jg de selenio al sujeto cada dfa). En realizaciones preferentes, el selenio se administra a una dosis diaria de entre 50 y 200 jg al dfa. En otras realizaciones preferentes, el selenio se administra a una dosis diaria de entre 100 y 200 jg al dfa. Se pueden usar dosis fuera del intervalo de 25 y 600 jg. En algunas realizaciones, una dosis unica de selenio (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGPs) se administra una vez al dfa. En otras realizaciones, cada dfa se pueden administrar 2, 3, 4, o mas dosis (por ejemplo, na vez por la manana y una vez por la noche, o una vez cada 4 a 6 horas). Por ejemplo, en algunas realizaciones, el selenio (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGPs, etc.) se administra a un sujeto en tres dosis separadas, mas de tres dosis separadas, dos dosis separadas, o menos de dos dosis separadas. En algunas realizaciones preferentes, la dosis diaria se administra en una capsula de liberacion prolongada. En algunas realizaciones preferentes, la dosis diaria es entre 25-75 jg de selenio (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGPs). En otras realizaciones preferentes, la dosis diaria es de 200 jg de selenio (por ejemplo, selenio organico, levadura selenizada, SEL-PLEX, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGPs).

Las composiciones farmaceuticas se pueden administrar de varias maneras dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistemico y de la zona que se va a tratar. La administracion puede ser topica (incluyendo botanica y a las membranas mucosas, incluyendo la administracion vaginal y rectal), pulmonar (por ejemplo, por inhalacion o insuflacion de polvos o aerosoles, incluyendo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidermica y transdermica), oral o parenteral. La administracion parenteral incluye inyeccion o infusion intravenosa, intraarterial, subcutanea, intraperitoneal o intramuscular; o administracion intracraneal, por ejemplo, intratecal o intraventricular. Se cree que las composiciones y formulaciones que comprenden selenio son particularmente utiles para administracion oral. Las composiciones y formulaciones (por ejemplo, que contienen SGP) farmaceuticas, nutriceuticas, y/o de suplementos que contienen selenio para administracion topica pueden incluir parches transdermicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, lfquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vetnculos farmaceuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, agentes espesantes.

Las composiciones y formulaciones para administracion oral incluyen polvos o granulos, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, capsulas, sobrecitos o comprimidos. Pueden ser deseables agentes espesantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, adyuvantes de dispersion o aglutinantes.

Las composiciones y formulaciones para administracion parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas esteriles que tambien pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados, tales como mejoradores de la penetracion, compuestos veldculo y otros veldculos o excipientes farmaceuticamente aceptables.

Por lo tanto, en algunas realizaciones, las composiciones farmaceuticas, nutriceuticas, y/o de suplemento incluyen, soluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones se pueden generar a partir de una diversidad de componentes que incluyen lfquidos formados previamente, solidos autoemulsionantes y semisolidos autoemulsionantes.

Las formulaciones farmaceuticas, nutriceuticas, y/o de suplemento, que se pueden presentar convenientemente en forma de dosificacion unitaria, se pueden preparar de acuerdo con tecnicas convencionales bien conocidas en la industria farmaceutica. Las tecnicas de ese tipo incluyen la etapa de poner en asociacion los principios activos con el vehnculo(s) o excipiente(s) farmaceutico(s). En general, las formulaciones se preparan poniendo en asociacion de manera uniforme e mtima los principios activos con vehfculos lfquidos o vehfculos solidos finamente divididos o ambos, y a continuacion, si fuera necesario, se le da forma al producto.

En algunas realizaciones, las composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP) se pueden formular en cualquiera de las muchas formas de dosificacion posibles, tales como comprimidos, capsulas, jarabes lfquidos, geles blandos, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente invencion tambien se pueden formular como nanopartfculas de liberacion prolongada (por ejemplo, nanocapsulas), vesfculas, liposomas, polfmeros (por ejemplo, polfmeros con impresion molecular (MIP), polfmeros de liberacion lenta biodegradables, polfmeros policationicos. Las composiciones de la presente invencion tambien se pueden formular como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos, y las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspension, que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspension tambien puede contener agentes estabilizantes. En una realizacion, las composiciones farmaceuticas y/o de suplementos se pueden formular y usar como espumas. Las espumas incluyen formulaciones tales como emulsiones, microemulsiones, cremas, gelatinas y liposomas. Aunque basicamente estas formulaciones son de naturaleza similar, estas formulaciones vanan en los componentes y la consistencia del producto final.

Las composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP) pueden contener adicionalmente otros componentes adyuvantes que se encuentran convencionalmente en las composiciones farmaceuticas. Por lo tanto, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales farmaceuticamente activos adicionales, compatibles, tales como, por ejemplo, antiprunticos, astringentes, anestesicos locales o agentes antiinflamatorios, o pueden contener materiales adicionales utiles para formular ffsicamente diversas formas de dosificacion de las composiciones de la presente invencion, tales como colorantes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, agentes de opacidad, agentes espesantes y estabilizantes. Sin embargo, los materiales de ese tipo, cuando se anaden, no deben interferir de forma indebida con las actividades biologicas de los componentes de las composiciones de la presente invencion. Las formulaciones se pueden esterilizar y, si se desea, mezclar con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizantes, humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presion osmotica, tampones, colorantes, aromas y/o sustancias aromaticas que no interactuan de forma perjudicial con el acido o acidos nucleicos de la formulacion.

En algunas realizaciones, se pueden proporcionar composiciones farmaceuticas, nutriceuticas, y/o de suplemento que contienen (a) una o mas formas de selenio (por ejemplo, SGP (por ejemplo, fraccion de SGP dependiente del pH), selenio soluble, selenio soluble en agua, SEL-PLEX) y (b) uno u otros agentes mas (por ejemplo, nutrientes, minerales, terapeuticos, etc.).

Los metodos pueden implicar la administracion conjunta de compuestos que comprenden selenio (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, etc.) descritos en el presente documento con uno o mas agentes activos adicionales (por ejemplo, un agente terapeutico (por ejemplo, agente terapeutico para el cancer, agente terapeutico para el Alzheimer), antioxidante, etc.). De hecho, un aspecto adicional es proporcionar metodos para mejorar las terapias y/o composiciones farmaceuticas, nutriceuticas, y/o de suplemento mediante la administracion conjunta de una composicion que comprende selenio (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP (por ejemplo, fraccion de SGP dependiente del pH)) de la presente invencion con una composicion farmaceutica, nutriceutica y/o de suplemento preventiva o terapeutica. En los procedimientos de administracion conjunta, los agentes se pueden administrar de forma simultanea o de forma secuencial. En una realizacion, los compuestos que se describen en el presente documento se administran antes que el otro u otros agentes activos. Las formulaciones y modos de administracion pueden ser cualquiera de los que se han descrito anteriormente. Ademas, los dos o mas agentes coadministrados se pueden administrar cada uno usando diferentes modos o diferentes formulaciones. En algunas realizaciones, una composicion de la invencion se administrar en forma conjunta con un tratamiento para el cancer.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, una composicion que contiene una o mas formas de selenio (por ejemplo, SGP (por ejemplo, fraccion de SGP dependiente del pH), selenio soluble, selenio soluble en agua, SEL PLEX) se administra por via sistemica o por via local para inhibir la proliferacion de celulas tumorales y la angiogenesis, y/o para inducir la muerte de celulas tumorales en pacientes con cancer. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una composicion que comprende una fraccion de SGP dependiente del pH (pH 4,0) de una levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, SEL-PLEX) se administra a un sujeto en condiciones tales que la expresion de uno o mas genes asociados con cancer/crecimiento tumoral y/o metastasis esta regulada (por ejemplo, regulada de forma positiva o de forma negativa) de una manera beneficiosa en el sujeto (Vease, por ejemplo, el Ejemplo 4). Las composiciones se pueden administrar por via intravenosa, por via intratecal, por via intraperitoneal asf como por via oral. Ademas, se pueden administrar solas o en combinacion con farmacos antiproliferativos.

Un ejemplo es cuando una composicion que contiene una o mas formas de selenio esta unida con enlace covalente a un vehmulo de orientacion o a un agente farmaceutico activo. La union covalente se puede realizar con uno cualquiera de los muchos compuestos de reticulacion disponibles en el mercado.

Por ejemplo, las composiciones de ese tipo se pueden proporcionar en combinacion con vehmulos, diluyentes, adyuvantes y excipientes lfquidos, geles o solidos, fisiologicamente tolerables.

Estas preparaciones terapeuticas se pueden administrar a mairnferos para uso veterinario, tal como a animales domesticos o criados en granjas, y uso clmico en seres humanos de una manera similar a otros agentes terapeuticos. En general, la dosificacion requerida para la eficacia terapeutica variara de acuerdo con el tipo de uso y modo de administracion, asf como los requisitos particulares de los hospedadores individuales.

Las composiciones de ese tipo se preparan generalmente como soluciones o suspensiones lfquidas, o en formas solidas. Las formulaciones orales para el cancer por lo general incluyen tales aditivos normalmente usados tales como aglutinantes, cargas, vehmulos, conservantes, agentes estabilizantes, emulsionantes, tampones y excipientes como, por ejemplo, calidades farmaceuticas de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, celulosa, carbonato de magnesio. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, pfldoras, capsulas, formulaciones de liberacion sostenida, o polvos, y contienen un 1 %-95 % de principio activo, preferentemente un 2 %-70 %.

Las composiciones tambien se preparan como agentes inyectables, ya sea como soluciones lfquidas o suspensiones; tambien se pueden preparar formas solidas adecuadas para solucion en, o suspension en, lfquido antes de la inyeccion.

Las composiciones a menudo se mezclan con diluyentes o excipientes que son fisiologicamente tolerables y compatibles. Los diluyentes y excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solucion salina, dextrosa, glicerol y combinaciones de los mismos. Ademas, si se desea, las composiciones pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes estabilizantes o agentes de taponamiento de pH.

Una amplia gama de agentes terapeuticos encuentran uso con la presente invencion. Por ejemplo, es adecuado cualquier agente terapeutico que se pueda coadministrar con una composicion que contenga una o mas formas de selenio de la invencion.

Algunas realizaciones proporcionan la administracion, a un sujeto, de una cantidad eficaz de una composicion que contiene una o mas formas de selenio y al menos un agente anticancer (por ejemplo, un agente anticancer convencional, tal como medicamentos quimioterapeuticos, y/o terapia de radiacion).

Los mecanismos de agentes anticancer adecuados para su uso incluyen, agentes que inducen la apoptosis, agentes que inducen/causan dano a acido nucleico, agentes que inhiben la smtesis de acidos nucleicos, agentes que influyen en la formacion de microtubulos y agentes que influyen en la smtesis o estabilidad de la protema.

Las clases de agentes anticancer adecuados para uso en composiciones y metodos incluyen: 1) alcaloides, que incluyen inhibidores de microtubulos (por ejemplo, Vincristina, Vinblastina y Vindesina), estabilizantes de microtubulos (por ejemplo, Paclitaxel (Taxol), y Docetaxel), e inhibidores de la funcion de la cromatina, que incluyen, inhibidores de la topoisomerasa, tales como, epipodofilotoxinas (por ejemplo, Etoposido (VP-16), y Teniposido (VM-26)), y agentes que se dirigen a la topoisomerasa I (por ejemplo, Camptotecina e Isirinotecan (CPT-11)); 2) agentes covalentes de union al ADN (agentes alquilantes), que incluyen mostazas de nitrogeno (por ejemplo, Mecloretamina, Clorambucilo, Ciclofosfamida, Ifosfamida, y Busulfan (Myleran)), nitrosoureas (por ejemplo, Carmustina, Lomustina, y Semustina), y otros agentes alquilantes (por ejemplo, Dacarbazina, Hidroximetilmelamina, Tiotepa, y Mitocicina); 3) agentes de union a ADN no covalentes (antibioticos antitumorales), que incluyen inhibidores de acido nucleico (por ejemplo, Dactinomicina (Actinomicina D)), antraciclinas (por ejemplo, Daunorrubicina (Daunomicina, y Cerubidina), Doxorrubicina (Adriamicina), es Idarrubicina (Idamicina)), antracenodionas (por ejemplo, analogos de antraciclina, tales como, (Mitoxantrona)), bleomicinas (Blenoxane), y plicamicina (Mitramicina); 4) antimetabolitos, que incluyen, antifolatos (por ejemplo, Metotrexato, Folex, y Mexato), antimetabolitos de purina (por ejemplo, 6-Mercaptopurina (6-MP, Purinetol), 6-Tioguanina (6-TG), Azatioprina, Aciclovir, Ganciclovir, Clorodesoxiadenosina, 2-Clorodesoxiadenosina (CdA), y 2'-Desoxicoformicina (Pentostatina)), antagonistas de pirimidina (por ejemplo, fluoropirimidinas (por ejemplo, 5-fluorouracilo (Adrucilo), 5-fluorodesoxiuridina (FdUrd) (Floxuridina))), y arabinosidos de citosina (por ejemplo, Cytosar (ara-C) y Fludarabina); 5) enzimas, incluyen, L-asparaginasa e hidroxiurea; 6) hormonas, que incluyen, glucocorticoides, tales como antiestrogenos (por ejemplo, Tamoxifeno), antiandrogenos no esteroideos (por ejemplo, Flutamida), e inhibidores de la aromatasa (por ejemplo, anastrozol (Arimidex)); 7) compuestos de platino (por ejemplo, Cisplatino y Carboplatino; 8) anticuerpos monoclonales conjugados con farmacos anticancer, toxinas, y/o radionuclidos; 9) modificadores de la respuesta biologica (por ejemplo, interferones (por ejemplo, IFN-a) e interleuquinas (por ejemplo, IL-2)); 10) inmunoterapia adoptiva; 11) factores de crecimiento hematopoyetico; 12) agentes que inducen la diferenciacion de celulas tumorales (por ejemplo, acido all-transretinoico); 13) tecnicas de terapia genetica; 14) tecnicas de terapia antisentido; 15) vacunas tumorales; 16) terapias dirigidas contra las metastasis tumorales (por ejemplo, Batimistat); y 17) otros inhibidores de la angiogenesis.

A un sujeto se le puede administrar una cantidad eficaz de una composicion que contiene una o mas formas de selenio de la invencion y al menos un agente anticancer convencional que induce apoptosis y/o evita la proliferacion de celulas cancerosas. En algunas realizaciones preferentes, el sujeto tiene una enfermedad caracterizada por metastasis. Una cantidad eficaz de una composicion que contiene una o mas formas de selenio y un taxano (por ejemplo, Docetaxel) se le puede administrar a un sujeto que tiene una enfermedad caracterizada por la sobreexpresion de protemas de la familia de protema(s) Bcl-2 (por ejemplo, Bcl-2 y/o B^cI-X^l).

Los taxanos (por ejemplo, Docetaxel) son una clase eficaz de agentes quimioterapeuticos contra el cancer. (Vease por ejemplo, K. D. Miller y G. W. Sledge, Jr. Cancer Investigation, 17: 121-136 (1999)). Se cree que la muerte celular mediada por taxano se realiza a traves de la estabilizacion de microtubulos intercelulares y la posterior induccion de la ruta apoptotica. (Vease por ejemplo, S. Haldar et al., Cancer Research, 57: 229-233 (1997)). En algunas otras realizaciones, el cisplatino y el taxol se contemplan espedficamente para su uso con una composicion que contiene una o mas formas de selenio de la presente invencion. En algunas realizaciones, cualquier producto farmaceutico que se usa habitualmente en un contexto de terapia contra el cancer encuentra uso en la presente invencion. Los agentes anticancer convencionales que son adecuados para la administracion con las composiciones que se divulgan que contienen una o mas formas de selenio incluyen, adriamicina, 5-fluorouracilo, etoposido, camptotecina, metotrexato, actinomicina-D, mitomicina C, o mas preferentemente, cisplatino. En algunas realizaciones, los tratamientos terapeuticos comprenden adicionalmente uno o mas agentes que reticulan directamente los acidos nucleicos (por ejemplo, ADN) para facilitar el dano al ADN lo que conduce a agentes antineoplasicos sinergicos. Por ejemplo, se pueden usar agentes tales como cisplatino y otros agentes alquilantes del ADN. Los agentes que danan el ADN tambien incluyen compuestos que interfieren con la replicacion del ADN, mitosis y segregacion cromosomica. Tales compuestos quimioterapeuticos incluyen adriamicina, tambien conocida como doxorrubicina, etoposido, verapamilo, podofilotoxina. Estos compuestos se usan ampliamente en entornos clmicos para el tratamiento de neoplasias y se administran mediante inyecciones de bolo por via intravenosa en dosis que vanan de 25-75 M/2 a intervalos de 21 dfas para adriamicina, a 35-50 Mg/M2 para etoposido por via intravenosa o duplicar la dosis intravenosa por via oral.

Los agentes que alteran la smtesis y fidelidad de los precursores y subunidades de acidos nucleicos tambien causan dano en el a Dn y encuentran uso como agentes quimioterapeuticos en la presente invencion. Se han desarrollado una serie de precursores de acido nucleico. Son particularmente utiles los agentes que se han sometido amplios ensayos y estan disponibles con facilidad. Como tales, los agentes como 5-fluorouracilo (5-FU) son usados preferentemente por el tejido neoplasico, lo que hace que este agente sea util para orientarse hacia las celulas neoplasicas. Las dosis administradas pueden variar de 3 a 15 mg/kgMa, aunque otras dosis pueden variar considerablemente de acuerdo con diversos factores que incluyen el estadio de la enfermedad, la disposicion de las celulas para la terapia y la cantidad de resistencia a los agentes.

En realizaciones preferentes, los agentes anticancer (por ejemplo, los factores anti-angiogenicos que se discuten en el presente documento) son aquellos susceptibles de administracion conjunta con una composicion que contiene una o mas formas de selenio o que estan asociados de otro modo con la composicion que contiene una o mas formas de selenio de manera que se pueden administrar a un sujeto, tejido o celula sin perdida de fidelidad del efecto anticancer. Para obtener una descripcion mas detallada de los agentes terapeuticos contra el cancer tales como un complejo de platino, verapamilo, podofilotoxina, carboplatino, procarbazina, mecloretamina, ciclofosfamida, camptotecina, ifosfamida, melfalan, clorambucilo, bisulfano, nitrosurea, adriamicina, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, bleomicina, plicomicina, mitomicina, etoposido etopoxido (VP16), tamoxifeno, taxol, transplatino, 5-fluorouracilo, vincristina, vinblastina y metotrexato y otros agentes anticancer similares, las personas con experiencia en la materia se refieren a cualquier numero de manuales instructivos, incluyendo la referencia del Physician's Desk y a "Pharmaceutical Basis of Therapeutics" de Goodman y Gilman, novena edicion, Eds. Hardman et al., 1996.

V. Antioxidantes

Los antioxidantes se pueden coadministrar con composiciones o formulaciones de la presente invencion. De hecho, se contempla que una diversidad de antioxidantes son utiles en la presente invencion, incluyendo difenilaminas alquiladas, fenilendiaminas N-alquiladas, fenil-.alfa.-naftilamina, fenil-.alfa.-naftilamina alquilada, dimetil quinolinas, trimetildihidroquinolinas y composiciones oligomericas obtenidas a partir de los mismos, agentes fenolicos impedidos, hidroquinonas alquiladas, tiodifenil eteres hidroxilados, alquilidenbisfenoles, tiopropionatos, ditiocarbamatos metalicos, 1,3,4-dimercaptotiadiazol y derivados, compuestos de cobre solubles en aceite Naugalube.RTM. 438, Naugalube 438L, Naugalube 640, Naugalube 635, Naugalube 680, Naugalube AMS, Naugalube APAN, Naugard PANA, Naugalube TMQ, Naugalube 531, Naugalube 431, Naugard BHT, Naugalube 403, y Naugalube 420, acido ascorbico, tocoferoles incluyendo alfa-tocoferol, antioxidantes solubles en agua tales como compuestos de sulfhidrilo y sus derivados (por ejemplo, metabisulfito sodico y N-acetil-cistema), acido lipoico y acido dihidrolipoico, resveratrol, lactoferrina, derivados del acido ascorbico (por ejemplo, palmitato de ascorbilo y polipeptido de ascorbilo), hidroxitolueno butilado, retinoides (por ejemplo, retinol y palmitato de retinilo), tocotrienoles, ubiquinona, extractos que contienen flavonoides e isoflavonoides y sus derivados (por ejemplo, genistema y diadzema), extractos que contienen resveratrol, semilla de uva, te verde , corteza de pino, propoleo, Irganox1010, 1035, 1076, 1222 (fabricado por Ciba Specialty Chemicals Co., Ltd.), Antigene P, 3C, fR, Sumilizer GA-80 (fabricado por Sumitomo Chemical Industries Co., Ltd.), beta-caroteno, licopeno, vitaminas C, E y A, y otras sustancias.

En algunas realizaciones, la administracion de una composicion que contiene selenio (por ejemplo, selenio soluble, SGP) a un sujeto cambia los perfiles de expresion genetica (por ejemplo, TGFB1, mAp K8, c 1r , UBE4A, SMPX, USP22, y PTp4A1) en el sujeto. En algunas realizaciones, la administracion de una composicion que contiene selenio (por ejemplo, selenio soluble, SGP) a un sujeto reduce el nivel de dano en el ADN (por ejemplo, en tejido cerebral (por ejemplo, neocortex), tejido muscular, tejido adiposo, etc.) de un sujeto.

En algunas realizaciones, se puede proporcionar un metodo para reducir la sensibilidad de las celulas a la citotoxicidad por H²O² que comprende la administracion de una composicion que contiene selenio (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX) a las celulas.

Ademas se puede proporcionar un metodo para reducir los radicales superoxido en un sujeto (por ejemplo, en un sujeto que esta experimentando estres oxidativo) para comprender la administracion de una composicion (por ejemplo, un suplemento nutricional) que contiene selenio (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX, etc.) al sujeto. Ademas, en algunas realizaciones, los sujetos que reciben determinadas composiciones que comprenden selenio (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX, etc.) presentan un aumento de la capacidad para enfrentarse al estres oxidativo. En algunas realizaciones, los sujetos que reciben una composicion que comprende selenio (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, s EL-PLEX, etc.)) presentan un aumento de la capacidad para enfrentarse al exceso oxida activo debido a la capacidad de las formas seleccionadas de selenio (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX, etc.) para alterar (por ejemplo, reducir) en nivel de radicales superoxido en el sujeto radicales.

VI. Vehculos

En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona la administracion de selenio (por ejemplo, selenoglicoprotema) a traves de uno o mas vehmulos que incluyen nanopartmulas (por ejemplo, nanocapsulas), vesmulas, liposomas, polfmeros (por ejemplo, polfmeros con impresion molecular (MIP), polfmeros de liberacion lenta, polfmeros policationicos, y/o polimersomas. En algunas realizaciones, un vetnculo de selenio proporciona administracion, orientacion, y/o liberacion temporalizada de compuestos que contienen selenio (por ejemplo, selenio soluble en agua, SGP) en sujeto (por ejemplo, ser humano o animal). En algunas realizaciones, los vehmulos (por ejemplo, polfmero de liberacion lenta, nanocapsula, MIP, polimersomas) mejoran la administracion de los compuestos que contienen selenio (por ejemplo, selenio organico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX) a un sujeto. En algunas realizaciones, los vehmulos (por ejemplo, polfmero de liberacion lenta, nanocapsula, MIP, polimersomas) aumentan la biodisponibilidad de compuestos que contienen selenio (por ejemplo, selenio organico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX) a un sujeto.

Se puede usar una diversidad de vehmulos que incluyen dendnmeros, polimersomas, nanopartmulas, polfmeros de liberacion lenta, nanocapsulas, polfmeros con impresion molecular y/u otro tipo de vetnculo (por ejemplo, uno cualquiera de los vehnculos que se describen en el presente documento). En una realizacion preferente, el vetnculo es un polfmero de liberacion lenta. En otra realizacion preferente, el vetnculo es un polfmero con impresion molecular. Ademas en otra realizacion preferente, el vetnculo es un polimersoma usado para encapsular selenoglicoprotema. Se puede usar cualquier polimersoma conocido en la tecnica. En algunas realizaciones, el polimersoma comprende copolfmero de bloque de poli(oxido de etileno) (PEO). Sin embargo, la invencion no se limita de ese modo. se puede usar cualquier copolfmero de bloque, que incluye, por ejemplo poli(etiletileno) (PEE), poli(butadieno) (PB o PBD), poli(estireno) (PS), y poli(isopreno) (PI). En algunas realizaciones, El polfmero comprende copolfmero de dibloque de poli(e-caprolactona) (PCL). En algunas realizaciones, el polimersoma comprende copolfmeros de dibloque a base de poli(oxido de etileno)-bloque-poli(e-caprolactona) (PEO-b-PCL). En algunas realizaciones, el polimersoma comprende un copolfmero de bloque que es un copolfmero de tribloque, tetrabloque, pentabloque, o al menos de seis bloques. En algunas realizaciones, el polimersoma se obtiene a partir del acoplamiento de poli(acido lactico), poli(glicolido), poli(acido lactico-coglicolico) y/o poli(3-hidroxibutirato) con PEO. Una diversidad de tamano se encuentra en uso en las composiciones y metodos de la invencion incluyendo selenoglicoprotemas encapsuladas con polimersoma que tienen un diametro de 50-300 nm aunque se pueden usar selenoglicoprotemas encapsuladas con polimersoma con un diametro mayor (por ejemplo, 350 nm, 400 nm, 500 nm o mayor) y menor (por ejemplo, 40 nm, 30 nm, 20 nm, o menor).

En algunas realizaciones, la presente invencion comprende nanocapsulas y esferas de MIP de liberacion controlada de SGP para proporcionar un suministro continuo y seguro de selenio organico (por ejemplo, poKmeros con impresion molecular (MIPs), poKmeros de liberacion lenta) en comparacion con otras formas de selenio (por ejemplo, levadura enriquecida con selenio, SEL-PLEX, o capsulas o pfldoras de dosis individuales de selenio inorganico). En algunas realizaciones, se usan solubles en agua, soluble, y/o SGPs para encapsulacion y administracion eficaces de selenio a traves de los metodos de administracion avanzados en el presente documento (por ejemplo, nanopartfculas (por ejemplo, nanocapsulas), vesfculas, poKmeros (por ejemplo, polfmeros con impresion molecular (MIPs), polfmeros de liberacion lenta), y/o polimersomas). En alguna realizacion, los metodos de administracion avanzada en el presente documento mejoran la biodisponibilidad del selenio encapsulado (por ejemplo, SGPs o selenio soluble). En algunas realizaciones, los metodos de administracion avanzada en el presente documento proporcionan liberacion lenta (por ejemplo, 12 horas, 24 horas, 2 dfas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 10 semanas) de selenio en una solucion, un sujeto, suero.

En algunas realizaciones, la invencion proporciona polfmeros de liberacion lenta como un vetuculo para composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio organico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP) de la presente invencion. Como vetuculos se pueden usar polfmeros de liberacion lenta, tales como poli(acido lactico-co-acido glicolico) (PLGA), o polfmeros policationicos, tales como, polietilenimina (PEI). En algunas realizaciones, los polfmeros de liberacion lenta proporcionan una administracion controlada de composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio organico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX). En algunas realizaciones, la administracion controlada se produce cuando un polfmero (por ejemplo, PEI), ya sea natural o sintetico, se combina con criterio con una composicion que contiene selenio (por ejemplo, selenio organico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX) y opcionalmente otros agentes activos o inactivos de un modo tal que la composicion que contiene selenio (por ejemplo, selenio organico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX) se libera desde el material de una manera disenada previamente. La liberacion de la composicion que contiene selenio (por ejemplo, selenio organico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX) puede ser constante durante un periodo de tiempo largo, puede ser dclica durante un periodo de tiempo largo, o la puede desencadenar el entorno otros sucesos externos. En algunas realizaciones, el control de la administracion proporciona una terapia mas eficaz. En algunas realizaciones, el control de la administracion elimina el potencial tanto de sub- como de sobredosificacion. Otras ventajas del uso de sistemas de administracion controlada pueden incluir el mantenimiento de los niveles de selenio dentro de un intervalo deseado, la necesidad de administraciones menores, y aumento del cumplimiento por parte del paciente.

En algunas realizaciones, la invencion proporciona polimersomas como vetuculos para composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio organico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX) de la presente invencion. En algunas realizaciones, los polimersomas se preparan usando copolfmeros de bloques sinteticos anfifflicos para formar la membrana de la vesfcula, y tienen radios que vanan de 50 nm a 10 pm o mas (Vease, por ejemplo, Discher et al., Journal of Physical Chemistry B (2002), 106 (11), 2848-2854). En algunas realizaciones, los polimersomas contienen una solucion acuosa en su nucleo y son utiles para encapsular y proteger moleculas, tales como composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio organico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX) y opcionalmente uno o mas farmacos, enzimas, otras protemas y peptidos, y fragmentos de ADN y ARN. En algunas realizaciones, la membrana del polimersoma proporciona una barrera ffsica que afsla el material encapsulado de materiales externos, tales como los que se encuentran en sistemas biologicos. En algunas realizaciones, los polimersomas permiten una liberacion temporalizada de los contenidos dentro de su nucleo (por ejemplo, composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio organico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX)). En algunas realizaciones, el uso de polfmeros sinteticos para construir polimersomas permite que los disenadores manipulen las castristas de la membrana y por lo tanto el control de la permeabilidad, tasas de liberacion, estabilidad y otras propiedades.

En una realizacion, las composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP) s de la presente invencion se pueden encapsular dentro de polimersomas a base de poli(oxido de etileno)-bloque-poli(s-caprolactona) (PEO-b-PCL). Aunque para la practica de la invencion no es necesaria una comprension de un mecanismo, y la invencion no se limita a ningun mecanismo de accion en particular, en algunas realizaciones, el PEO proporciona la estabilidad qmmica y mecanica in vitro mejorada por el vetuculo resultante, aumento de la in vivo biodisponibilidad y prolongacion de las semividas en circulacion sangumea. El PCL, un biomaterial implantable bien conocido, forma la membrana del polimersoma, y facilita la degradacion in vivo completa y segura del producto resultante por hidrolisis de sus enlaces ester.

En otra realizacion, las composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenoglicoprotemas) de la presente invencion se pueden encapsular en polimersomas sintetizados a partir de mezclas o derivados puros de otros polfmeros de bloque biodegradables obtenidos a partir del acoplamiento de poli(acido lactico), poli(glicolido), poli(acido lactico-coglicolico) o poli(3-hidroxibutirato) con PEO.

En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona nanocapsulas (Couvreur et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 2002; 19 (2): 99-134) como vetuculos para composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio organico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX) de la presente invencion (Vease, por ejemplo, documento de Patente de Estados Unidos N.° 7.498.045). En algunas realizaciones, las nanocapsulas proporcionan la liberacion controlada de composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio organico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX) despues de biodegradacion de la nanocapsula. En algunas realizaciones, las nanocapsulas tienen semividas de biodegradacion de 2 a 100 horas (por ejemplo, 2 horas... 4 horas... 6 horas...

12 horas. 24 horas... 48 horas... 96 horas). En algunas realizaciones, las nanocapsulas biodegradables de la invencion son adecuadas para la liberacion controlada de composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio organico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX) y opcionalmente una diversidad de otros agentes terapeuticos encapsulados, que incluyen macromoleculas, en circulacion in vivo de un sujeto despues de administracion al mismo. Las composiciones de nanocapsula de la presente invencion son ademas adecuadas para encapsular concentraciones terapeuticamente eficaces de composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio organico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP) y proporcionan la misma circulacion in vivo de un receptor. En algunas realizaciones, una nanocapsula que encapsula composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio organico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX) es una membrana que comprende, por ejemplo, un copolfmero de polfmero de acido polilactico y polietilenglicol. En algunas realizaciones, las nanocapsulas se forman por la polimerizacion interfacial de un monomero o la nanodeposicion interfacial de un polfmero formado previamente.

En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona polfmeros con impresion molecular como vehmulos para composiciones que contienen selenio (por ejemplo, selenio organico, selenio soluble, selenio soluble en agua, SGP, SEL-PLEX) de la presente invencion (Mosbach. Trends in Biochemical Sciences, Vol. 7, pp. 92-96, 1994., Wulff. Trends in Biotechnology, Vol. 11, pp. 85-87, 1993., Andersson, et al., Molecular Interactions in Bioseparations (Ngo. T. T. ed.), pp. 383-394,)., documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.959.050.

PARTE EXPERIMENTAL

Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de demostrar e ilustrar adicionalmente ciertas realizaciones y aspectos preferentes de la presente invencion.

EJEMPLO 1

A. Preparacion secuencial de selenoglicoprotemas solubles de SEL-PLEX mediante extraccion acida y precipitaciones posteriores

Un reactor de tres bocas de 4 l (extractor N.° 1, Vease la Figura 1) equipado con un aparato de agitacion mecanica, un termometro, y una manta electrica se cargo con 3 l de H²O desionizada y 50 ml de HCl 0,3 N. El reactor se calento por encima de 50 °C y se anadieron 600 g de SEL-PLEX a 1600 ppm en porciones a la vez que se agitaba. Despues de aproximadamente una hora, la temperatura alcanzo 80 °C y el pH de la mezcla era 2,23. El pH se redujo a 1,5 mediante la adicion de 13,5 ml de HCl 0,3 N. El recipiente de reaccion se mantuvo con calentamiento y agitacion durante 7 h. El pH de la mezcla se comprobo aproximadamente cada hora para asegurar el nivel de pH remanente a 1,5. La mezcla de reaccion posterior acida (pH 1,5) se distribuyo en cuatro tarros para centrifugadora de 1 l y se centrifugo (centrifugadora N.° 1, Vease la Figura 1) a 4000 RCF durante 20 min a 8 °C. El sobrenadante (pH 1,5) y los microgranulos solidos se recogieron. El sobrenadante se anadio a un reactor de 3 bocas de 3 l (mezcladora N.°1, Vease la Figura 1) en un bano con hielo (4 °C), y equipado con un embudo de goteo que contema NaOH 2 N, un aparato de agitacion mecanica y un electrodo de pH. Se anadio NaOH 2 N gota a gota a la solucion a la vez que se agitaba hasta que el pH de la mezcla alcanzo 1,85. Durante la adicion de NaOH, se formo un precipitado de color blanco. La agitacion continuo durante 30 min y la mezcla se centrifugo de nuevo (centrifugadora N.° 2, Vease la Figura 1) formando un sobrenadante y un microgranulo de selenoglicoprotema. El microgranulo de selenoglicoprotema se recogio y se liofilizo (aparato de liofilizacion N.°1, Vease la Figura 1) proporcionando 1,635 g de precipitado de color blanco. El sobrenadante a pH 1,85 y el microgranulo formado con pH 1,5 se anadieron a un recipiente de reaccion (mezcladora N.° 2, Vease la Figura 1) y se coloco en un bano de hieloagua (4 °C). La mezcla se agito durante 30 minutos y a continuacion se centrifugo (centrifugadora N.° 3, Vease la Figura 1 y la Figura 2), formando solidos residuales humedos y un sobrenadante ha pH 1,6, usado posteriormente para generar los SGPs mediante posterior precipitacion dependiente del pH (por ejemplo, fracciones de SGP a pH 3,0, pH 4,0 y pH 6,0 como se describe a continuacion).

B. Precipitacion de selenoglicoprotemas dependiente del pH

El sobrenadante de pH 1,6 se puso en un reactor (mezcladora N.° 3, Vease la Figura 2) y se anadio NaOH 2 N a la solucion a la vez que se agitaba hasta que el pH de la mezcla alcanzo 3,0. La agitacion continuo durante 30 minutos mas y la mezcla se centrifugo (centrifugadora N.° 4, Vease la Figura 2) formando un sobrenadante y un microgranulo de selenoglicoprotema. El microgranulo de selenoglicoprotema a pH 3,0 (SGP a pH 3,0) se recogio y se liofilizo (aparato de liofilizacion N.°2, Vease la Figura 2) proporcionando una fraccion precipitada de color gris claro. El sobrenadante de pH 3,0 se puso en un reactor (mezcladora N.° 4, Vease la Figura 2) y se anadio NaOH 2 N a la solucion hasta que el pH de la solucion aumento a 4,0. La agitacion continuo durante 30 minutos mas y la mezcla se centrifugo (centrifugadora N.° 5, Vease la Figura 2) formando un sobrenadante y un microgranulo de selenoglicoprotema. El microgranulo de selenoglicoprotema a pH 4,0 (SGP a pH 4,0) se recogio y se liofilizo (aparato de liofilizacion N.° 3, Vease la Figura 2) proporcionando la fraccion precipitada de color gris claro. El sobrenadante de pH 4,0 se puso en un reactor (mezcladora N.° 5, Vease la Figura 2) y se anadio NaOH 2 N a la solucion hasta que el pH de la solucion aumento a 6,0. La agitacion continuo durante 30 minutes mas y la mezcla se centrifugo (centrifugadora N.° 6, Vease la Figura 2) formando un sobrenadante y un microgranulo de selenoglicoprotema. El microgranulo de selenoglicoprotema a pH 6,0 (SGP a pH 6,0) se recogio y se liofilizo (aparato de liofilizacion N.°4, Vease la Figura 2) proporcionando la fraccion precipitada de color gris claro. Las fracciones precipitadas posteriores que se habfan formado se recogieron por centrifugacion. En la corriente de agua residual de pH 6,0 de la ultima centrifugacion contema algunos seleno-peptidos, oligosacaridos manosa y glucosa (por ejemplo, que se pueden usar en la preparacion de medios de crecimiento de levadura u otro material nutriente). El proceso no produjo residuos toxicos y es ecologico.

EJEMPLO 2

Separacion y caracterizacion de SGP soluble

El microgranulo que contiene residuos solidos a pH 1,5 formado por la extraccion acida de SEL-PLEX se lavo con el sobrenadante ha pH 1,85 de la segunda extraccion (VEASE el Ejemplo 1) para reducirel volumen de agua Usado en el proceso, y para disolver la mayor parte de las SGP's atrapadas dentro del microgranulo. Los residuos solidos que siguieron la tercera centrifugacion a pH 1,6 contienen una cantidad significativa de selenio y se pueden mezclar con un lote recien preparado de levadura de selenio antes de su secado mediante pulverizacion, usando completamente el material que se tomo para la extraccion.

Se hizo un promedio del selenio total, porcentaje de concentracion de protema, y el peso de cada una de las fracciones de SGP despues de tres extracciones posteriores a partir de SEL-PLEX (Vease la Tabla 1). Las fracciones de SGP extrafdas constitrnan de un 2,0 a un 2,5 % en peso de SEL-PLEX y de un 4,3 a un 5,75 % de selenio total que estaba presente en el SEL-PLEX extrafdo previamente.

Habfa una correlacion positiva entre el pH de las fracciones de SGP y el peso de la protema, siendo lo inverso cierto a la concentracion de selenio total (Vease la Tabla 1).

El promedio del peso de la protema para las fracciones de SGP vario de aproximadamente un 65 a un 90 % en peso, y la concentracion de selenio para el mismo conjunto de fracciones vario en el intervalo de aproximadamente 2900 ppm a 4900 ppm. Las fracciones de SGP conteman de un 4 a un 37 % en peso de componente de carbohidrato.

T l 1. El r m i l r l r x r i n ri r EL-PLEX

La electroforesis en gel de la fraccion de SGP a pH 1,5 formada por la extraccion acida de SEL-PLEX revelo que las bandas que correspondfan a protemas de alto peso molecular o protemas que portaban un componente de carbohidrato grande estaban ausentes. La distribucion de tamano similar, con dominio de fracciones de bajo peso molecular, se detecto usando electroforesis de capilaridad y las protemas de bajo peso molecular de 5,1 kDa a 12,2 kDa comprendfan mas de un 90 % de las mezclas.

La cromatograffa de exclusion por tamano de tres fracciones de SGP a pH 3,0, 4,0, y 6,0 en gel BIO-RAD P10 (tiempos de retencion hasta 6 horas) y en gel BIO-RAD P30 (tiempo de retencion de menos de una hora), dio como resultado un pico inicial con el tiempo de retencion de 5-10 minutos y un pico posterior, ancho, con el tiempo de retencion de 35-60 minutos. El pico inicial contema significativamente mas protema: de un 64,74 a un 75,24 %, y una concentracion de selenio significativamente mas elevada: de 2972 a 4252 ppm. El contenido de protema en el pico posterior fue mucho mas baja: de un 31,66 a un 54,95 % y la concentracion de selenio era significativamente menor: de 1193 a 1858 ppm. Este tipo de cromatograffa puede proporcionar SGP's con un contenido elevado de Se a partir de fracciones en bruto, y puede mostrar una baja homogeneidad del componente de carbohidrato en estas mezclas.

La cromatograffa de exclusion por tamano sobre resina SUPERDEX Peptide 10/300 GL (AMERSHAM Biosciences; intervalo de fraccionamiento 7,0-100 kDa) usando AcONH⁴0,1 M (pH 7,5) de diversos peptidos de digestion tnptica de SEL-PLEX, ha producido conjuntos de pico similares para muestras de SGP (10-100 kDa y > 100 kDa) y un patron de elucion completamente diferente para la muestra de SEL-PLEX. Solo los picos "iniciales", con el tiempo de elucion inferior a 20 min, conteman selenio. Los eluyentes que contienen selenio se recogieron, se liofilizaron y se analizaron usando las tecnicas SEC ICP MS, Ma LDI To F MS y nano ESI MS/MS. Los resultados eran complementarios y permitieron la deteccion, identificacion y secuenciacion de peptidos que contienen selenio. La identificacion de protemas detectadas se obtuvo mediante busqueda en la base de datos SwissProt (Vease la Tabla 2).

T l 2. l n - i l n r in i nifi rir i i n ri i xr EL-PLEX.

La naturaleza mas sorprendente de este metodo fue que la composicion de protema de diversas fracciones obtenidas mediante separaciones cromatograficas (por ejemplo, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de exclusion por tamano) diferentes fracciones de SGP a partir de precipitacion dependiente del pH, era la misma o muy similar, de acuerdo con metodos electroforeticos (electroforesis en gel y electroforesis por capilaridad) que se han aplicado. Como se describe en el presente documento, la extraccion de selenoglico-protemas de levadura enriquecida con selenio fue satisfactoria a un pH bajo (por ejemplo, 1,5). Aunque para la practica de la invencion no es necesaria la comprension de un mecanismo y la invencion no se limita a ningun mecanismo de accion en particular, en algunas realizaciones, en las condiciones acidas usadas para extraccion de SGP, los nucleos de la protema no se hidrolizan de forma significativa y sobreviven en su mayor parte en su forma original. En algunas realizaciones, las fracciones de selenoglicoprotema dependientes del pH de SEL-PLEX (por ejemplo, SGP a pH 3,0, SGP a pH 4,0, SGP a pH 6,0) se generan y administran (por ejemplo, sf mismas o en combinacion con otro agente) a un sujeto (por ejemplo, para administrar selenio organico a un sujeto (por ejemplo, a traves de una via oral)). EJEMPLO3

Comparacion de biodisponibilidad

Los pollos se alimentaron durante dieciocho dfas con siete tratamientos dieteticos diferentes (Veanse las Tablas 3 y 4) para comparar la biodisponibilidad del selenio a partir de la precipitacion de SGP's dependiente del pH a partir de extracto acido de SEL-PLEX por medicion del contenido de selenio crudo de pechuga de pollo:

Tabla 3. Especificacion de composicion y nutrientes de dieta basal

Tabla 4. Tratamientos dieteticos

Como se muestra en la Tabla 5, las dietas de alimentacion para polios suplementadas con fraccion de SGP a pH 4,0 o pH 6,0 acumulaban casi la misma cantidad de deposicion de selenio en tejido de musculo de pechuga de pollo en comparacion con pollos alimentados con la dieta suplementada con SEL-PLEX (SP). En comparacion con el control, el nivel de Se en el tejido en pollos alimentados con la dieta de SP y los alimentados con la fraccion de dietas suplementadas con SGP a pH 4,0 o pH 6,0 era dos veces tan elevada como la de los pollos que recibieron piensos suplementado con selenito sodico. Por lo tanto, la invencion proporciona, en algunas realizaciones, que SP, asf como fracciones de SGP hermanas de SP (por ejemplo, pH 4,0 y pH 6,0) estan biodisponibles cuando se administran a un sujeto (por ejemplo, en algunas realizaciones, SP, SGP a pH 4,0 o SGP a pH 6,0 son mas (por ejemplo, 2 veces o mas) biodisponibles que el selenio inorganico (por ejemplo, selenito sodico) cuando se administra a un sujeto (por ejemplo, tal como se pone en evidencia mediante la administracion de selenio al tejido del sujeto)).

Tabla 5. Efectos de fuentes dieteticas de Se en la concentracion de Se en el musculo

EJEMPLO4

A. Efectos de diferentes fuentes dieteticas de selenio en el perfil de expresion genetica en el musculo de pechuga de pollos para consumo

El tejido de musculo de pechuga de pollos a que se hace referencia en el Ejemplo 3 se uso para evaluar similitudes y diferencias en los perfiles de expresion genetica provocados por los siguientes tratamientos dieteticos: Tratamiento 1 - basal (Control); Tratamiento 2 - Control 0,3 ppm de selenito sodico (SS); Tratamiento 3 - Control 0,3 ppm de SEL-PLEX; Tratamiento 6 - 0,3 ppm de fraccion de SGP extrafda a partir de S^e L-PLEX (SP) a pH 4,0. La fraccion de SGP a pH 4,0 se analizo por que dio como resultado niveles casi identicos de deposicion de selenio en tejido de pechuga de pollo en comparacion con el obtenido con SP (Vease la Tabla 5). Como tal, los experimentos se realizaron durante el desarrollo de realizaciones de la invencion con el fin de determinar si los animales que recibfan la fraccion de SGP a pH 4,0 experimentaban efectos similares in vivo (por ejemplo, cambios en la expresion genetica) observados en animales alimentados con SP, o si existian diferencias mensurables, significativas.

Animales y Toma de Muestras de Tejido:

A los 18 dfas de edad, cinco pollos de cada grupo de tratamiento (que se han descrito anteriormente y en las Tablas 3 y 4) se seleccionaron de forma aleatoria y sacrificaron mediante asfixia con argon, seguido de dislocacion cervical. Las muestras de tejido de pechuga de pollo (1 gramo) se retiraron rapidamente y se congelaron de forma instantanea en nitrogeno lfquido. Las muestras se almacenaron a -80 °C hasta que se analizaron.

Analisis de Micromatriz:

El ARN total se aislo a partir de tejido congelado usando el reactivo TRIZOL (INVITROGEN, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se purifico usando un kit RNEASY (QIAGEN, Valencia, CA). El ARN total se cuantifico mediante absorbancia a 260 nm y la integridad se confirmo mediante electroforesis en gel de agarosa y tincion con bromuro de etidio de las bandas 28S y 18S.

La formacion de perfiles de micromatriz se realizo usando la Matriz de Genoma de Pollo Genechip de AFFYMETRIX (Santa Clara, CA) siguiendo los protocolos sugeridos por el fabricante.

Los datos se procesaron y cada conjunto de sondas se etiqueto, P (presente), M (marginal) o A (ausente) basandose en la proporcion de fuerza de senal con respecto a ruido usando el algoritmo de resumen de expresion MAS5.0 de AFFYMETRIX.

Analisis bioinformatico:

Para calificar y normalizar los datos de la micromatriz y para realizar analisis de patron estadfstico y de expresion genetica se uso GeneSpring GX 10.0 (Silicon Genetics, Redwood, CA).

Para minimizar la posibilidad de hallazgos erroneos, los conjuntos de sondas con intensidad de senal baja (etiquetados como 'Ausente' por el algoritmo MAS5.0) se excluyeron del analisis adicional. Los perfiles de expresion genetica filtrados a continuacion se sometieron a ANOVA de una direccion para identificar los conjuntos de sondas que se expresaban de forma diferencial entre grupos y fue seguido por un ensayo post hoc para determinar los genes que cambiaban de forma significativa con los tratamientos con selenio cuando se comparaban con el Control. Se considero que solamente iban a cambiar los genes que se diferenciaban de los del Control (P < 0,05) y que teman un factor de cambio de intensidad de senal correspondiente (FC) > 1,2.

Con el fin de representar visualmente los efectos de tratamientos dieteticos en los perfiles de expresion genetica en tejido de musculo de pechuga de pollo, 693 genes que se identificaron como expresados diferencial mente (ANOVA, P < 0,05) se sometieron a agrupamiento jerarquico sin supervisar basandose tanto en matrices como en genes. Como se ha descrito con detalle anteriormente, la fraccion de SGP de pH 4,0 se obtuvo directamente a partir de SP, y los grupos de tratamiento dietetico que recibieron SP o la fraccion de SGP de pH 4,0 presentaban niveles casi identicos de deposicion de selenio (biodisponibilidad) en tejido de musculo de pechuga de pollo (Vease la Tabla 5, mencionada anteriormente). Por lo tanto, se esperaba que ambos grupos de tratamiento con selenio (SP y fraccion de SGP a pH 4,0) pudieran presentar cambios en la expresion genetica identicos o altamente similares. Sin embargo, y de forma bastante sorprendente, un efecto dietetico evidente en los perfiles de expresion genetica se observaron entre los dos grupos de tratamiento (Vease la Figura 3). De forma espedfica, sosegaron diferencias espectaculares entre los perfiles de expresion genetica del grupo de tratamiento de SP en comparacion con el grupo de tratamiento con la fraccion de ^s G^p a pH 4,0, donde la mayona de los genes analizados respondieron de diferentes formas a los dos grupos de tratamiento. Esta gran variacion en los perfiles de expresion genetica ocasionados por el tratamiento con SP con respecto al tratamiento con la fraccion de SGP a pH 4,0 era totalmente inesperada y proporciona conocimientos no disponibles hasta ahora con respecto a la biologfa de los elementos traza.

Por ejemplo, 693 genes regulados de manera diferencial (P < 0,05, ANOVA) se sometieron a agrupamientos jerarquicos y supervisar basandose tanto en matrices como en genes. En el mapa de calor que se muestra en la Figura 3, perfiles de expresion genetica normalizada se muestran en colores que reflejan los cambios de la expresion en comparacion con el valor medio de cada gen; los colores blanco, negro o gris representan disminucion, aumento o ningun cambio en el nivel de la intensidad de la expresion, respectivamente. El dendrograma en la parte superior del mapa de calor refleja el alcance de la similitud en los perfiles de expresion entre tratamientos, mientras que el dendrograma en el lado izquierdo representa las diferencias en los patrones de expresion de genes individuales, a traves de todos los tratamientos. Las longitudes de los dendrogramas que se muestran en la Figura 3 corresponden al nivel de diferencias entre hojas de grupo (un dendrograma corto indica un nivel de similitud elevado).

Los diferentes efectos de fraccion de SGP a pH 4,0 y SP en los perfiles de expresion genetica en musculo de pechuga de pollo se analizaron adicionalmente mediante comparacion del numero de genes que cambiaron de forma significativa (P < 0,05, FC > 1,2) con la fraccion de SGP a pH 4,0 (pH 4), SP y selenito sodico (SS), tal como se representa el diagrama de Venn que se muestra en la Figura 4. Habfa 198, 173, y 283 genes que cambiaron de forma significativa con SP, pH 4 y ^s S, respectivamente. Solamente habfa 21 genes regulados comunmente con los tres grupos de tratamiento con Se, y 46 regulados tanto con SP como con la fraccion de SGP a pH 4,0. Habfa 152 y 127 genes que cambiaban unicamente con SP o con la fraccion de SGP a pH 4,0, respectivamente.

Por ejemplo, varios genes que se hadan identificado como regulador diferencial o comunmente en tejido de musculo de pechuga de pollo como resultado de diversos cargamentos con selenio se muestran en las Figuras 5-7.

Se cree que el factor de crecimiento transformante, beta-inducido (TGFBI 68 kDa) esta implicado en interacciones de celula-matriz, adhesion, migracion y diferenciacion celular. Las mutaciones de este gen se han relacionado con varias formas de distrofias corneales. La protema quinasa 8 activada por mitogeno, (MAPK8, tambien conocida como JNK1) es un miembro de la familia de MAP quinasas. Las MAP quinasas actuan como un punto de integracion para multiples senales bioqmmicas, y estan implicadas en una gran diversidad de procesos celulares tales como proliferacion, diferenciacion, regulacion de la transcripcion y desarrollo. MAPK8 tambien desempena un papel importante en la respuesta al estres oxidativo celular, respuesta inmunitaria, asf como metabolismo de carbohidratos y protemas a traves de rutas de senalizacion de insulina. Se sabe que durante la activacion de MAPK8 se puede inducir resistencia a la insulina a traves de fosforilacion de sustrato 1 receptor de Insulina (IRS1).

La Figura 5 proporciona ejemplos de genes (por ejemplo, TGFBI y MAPK8) que se regulaban comunmente con SS, SP y fraccion de SGP a pH 4,0. La Figura 6 proporciona ejemplos de genes (por ejemplo, componente 1R de complemento (C1R), y factor de ubiquitinacion E4A (UBE4A)) regulado comunmente por SP y fraccion de SGP a pH 4,0, pero no por SS. El componente de complemento 1R (C1R) es una protema implicada en la cascada del complemento del sistema inmunitario innato y retirada de patogenos. La modificacion de protemas con ubiquitina es un mecanismo celular importante para orientacion anomalo o para degradacion de protemas de vida corta. UBE4A codifica una ubiquitina ligasa de tipo U-caja que se describe como un factor de ubiquitinacion E4. Se cree que UBE4A tiene papeles en procesos bioqmmicos diferentes distintos a la ubiquitinacion, incluyendo crecimiento y/o diferenciacion.

La Figura 7 proporciona ejemplos de genes (por ejemplo, protema de musculo pequeno, relacionada con el cromosoma X (SMPX) y peptidasa espedfica de ubiquitina (USP22)) que estaban reguladas de forma unica por la fraccion de SGP a pH 4,0. La protema de musculo pequeno, relacionada con el cromosoma X (SMPX) es una protema pequena que se expresa de forma espedfica en el musculo estriado y desempeno un papel importante en la contraccion muscular. La peptidasa 22 espedfica de ubiquitina (USP22) es un gen implicado en procesos catabolico es de protema dependiente de ubiquitina. Se ha mostrado que USP22 es un regulador positivo del crecimiento tumoral. El aumento de la expresion de USP22 esta relacionado con la progresion del cancer. La capacidad para reducir o producir supresion genetica de la expresion de USP22 puede proporcionar la inhibicion del crecimiento y tumoral y/o progresion del cancer. Por ejemplo, la reduccion de la expresion de USP22 puede regular de forma negativa la expresion de Mdm2 y ciclina E, dando como resultado la expresion regulada de forma positiva de p53 y p21, conduciendo una parada del ciclado celular e inhibicion de la proliferacion de celulas tumorales de vejiga humana.

Un examen adicional del patron de expresion genetica unico provocado por la fraccion de pH 4,0 en el tejido muscular proporciona evidencias adicionales del uso terapeutico potencial de las formas clmicas de selenio en esta fraccion (por ejemplo, para prevenir o disminuir la progresion y/o metastasis tumoral).

Por ejemplo, el gen KITLG (ligando c-KIT) codifica el ligando del receptor de tirosina-quinasa que es un factor pleiotropico que actua en el utero en el desarrollo de celulas germinales y neuronales y hematopoyesis; se cree que los procesos reflejan un papel en la migracion celular. Recientemente, se han descubierto variaciones en el gen KITLG que se cree que se asocian con un mayor riesgo de cancer testicular (Kanetsky et al., 2009). Ademas, la sobreexpresion del receptor relacionado de KITLG, el producto del gen oncogenico KIT, se ha documentado en el carcinoma de celulas renales cromofobas y se sabe que la expresion de KITLG y KIT esta involucrada en la transformacion de los fibroblastos NIH3T3 y en la tumorigenesis del cancer de pulmon de celulas microcfticas (Yamazaki et al., 2003).

De forma sorprendente, se observo que el tejido muscular del sujeto al que se le administro la fraccion de pH 4,0 regulaba significativamente de forma negativa el gen KITLG, pero su nivel de expresion no se vio afectado por los otros tratamientos con selenio, incluyendo SP, el material precursor para la fraccion de pH 4,0 (Vease, por ejemplo, la Figura 8).

La metastasis es la causa principal de muerte en la mayona de los canceres humanos y es un proceso de multiples etapas en el que las celulas del tumor primario migran a traves de la matriz extracelular, entran en la circulacion a traves de los vasos sangumeos recien formados (angiogenesis tumoral) y se diseminan a sitios distantes (extravasacion), donde la proliferacion comienza de nuevo.

La protema 2 unida al receptor del factor de crecimiento (Grb2) es una molecula fundamental en la transduccion de senales intracelulares. Es fundamental para la progresion del ciclo celular y la motilidad basada en actina y, en consecuencia, para procesos mas complejos tales como morfogenesis epitelial, angiogenesis y vasculogenesis. Estas funciones importantes hacen que Grb2 sea una diana terapeutica para estrategias disenadas para prevenir la propagacion de tumores solidos a traves de la invasion local y la metastasis. De hecho, en la actualidad se esta haciendo un gran esfuerzo para encontrar maneras de bloquear o antagonizar Grb2 porque se considera que esto puede representar una estrategia antimetastasica eficaz (Giubellino, Burke y Bottaro, 2008).

Como se muestra en La Figura 9, Grb2 se regulo significativamente de forma negativa en pH 4,0 - animales tratados con respecto a control y otros tratamientos con selenio, incluido selenito sodico y el material de selenio precursor para pH 4,0; Sel-Plex.

La actividad anticarcinogenica potencial de la fraccion de pH 4,0 no se limita a la regulacion negativa de genes importantes asociados con el cancer. Por ejemplo, se ha observado que la reduccion de la expresion de ADNJA3 en celulas de cancer de mama mejora su migracion al permitir que los niveles de interleuquina-8 aumenten (Kim et al., 2005). Este y otros resultados sugieren fuertemente que el aumento de los niveles de Tid1 (DNAJA3) en celulas cancerosas regula de forma negativa su motilidad y capacidad para producir metastasis.

DNAJA3 se regulo fuertemente de forma positiva en tejido muscular en experimentos como respuesta selenio a pH 4,0 (Figura 10), pero permanecio sin respuesta, con respecto a las condiciones de control, en tejido muscular de animales que recibieron las otras fuentes de selenio.

B. Efectos de diferentes tratamientos con selenio en perfiles de expresion genetica hepatica de polios para consumo

En un esfuerzo para caracterizar aun mas los efectos inesperados de la expresion genica diferencial de SP y fraccion de SGP a pH 4,0 y para determinar si la regulacion de la expresion se extendio a otros tejidos, se realizaron estudios de expresion genetica como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 4 (a). En lugar de tejido muscular de la pechuga de pollo, se recogio tejido hepatico y se analizo de los mismos pollos mencionados en el Ejemplo 3. Ademas de los grupos de tratamiento suplementados con SS, SP y la fraccion de SGP a pH 4,0, los perfiles de expresion genetica hepatica de pollos de tratamiento adicional (fraccion de SGP a pH 1,85 (pH 1,85), fraccion de SGP a pH 3,0 (pH 3), y fraccion de SGP a pH 6,0 (pH 6) tambien se caracterizaron y compararon con el grupo de tratamiento de control.

Siguiendo el mismo protocolo experimental al que se ha hecho referencia en el Ejemplo 4(A), el analisis de los perfiles de expresion genetica hepatica de los sujetos de cada grupo de tratamiento identifico 1520 genes que cambiaron de forma significativa con los diferentes tratamientos dieteticos (P < 0,01, ANOVA). Un analisis de agrupamiento jerarquico no supervisado de estos genes se muestra en la Figura 11 y proporciona evidencia adicional de que el tratamiento con diferentes fuentes de selenio provoca un gran grado de variacion en la capacidad de regular la expresion genetica. El mapa de calor de La Figura 11 muestra los perfiles de expresion genetica normalizada en colores que reflejan los cambios en la expresion en comparacion con el valor medio de cada gen; los colores blanco, negro o gris representan disminucion, aumento o sin cambio en el nivel de intensidad de la expresion, respectivamente. El dendrograma en la parte superior del mapa de calor refleja la extension de la similitud en los perfiles de expresion entre los tratamientos, mientras que el dendrograma en el lado izquierdo representa las diferencias en los patrones de expresion de genes individuales en todos los tratamientos. Las longitudes de los dendrogramas que se muestran en la figura corresponden al nivel de disimilitud entre las hojas agrupadas (un dendrograma corto indica un nivel de similitud mas elevado).

Las diferencias entre SP y fraccion de SGP a pH 4,0, asf como la de fraccion de SGP a pH 3,0 y la fraccion de SGP a pH 6,0, fueron espectaculares, con solo unos pocos genes regulados comunmente por tratamiento oscuras cada una de las fuentes de selenio. En general, los efectos del tratamiento con la fraccion de SGP a pH 1,85 en la expresion genetica se encuentran entre SP y los otros grupos de tratamiento con SGP (Vease la Figura 11). Por lo tanto, en algunas realizaciones, la invencion proporciona ese tratamiento con (por ejemplo, dietas que contienen y/o administracion de) SEL-PLEX con respecto al tratamiento con (por ejemplo, dietas que contienen y/o administracion de) fracciones de SGP extrafdas de SEL- PLEX, que da como resultado diferentes actividades biologicas a pesar de que las diferentes fuentes de selenio muestran efectos similares en terminos de biodisponibilidad de selenio.

EJEMPLO5

Encapsulacion en polimersoma de selenoglicoprotemas

Una mezcla de SGP a 1:1 que precipito a pH 4,0 y 6,0 (Veanse, por ejemplo, los Ejemplos 1 y 2) se encapsulo en polimersomas. La concentracion de selenio de la mezcla fue de 3,054 ppm y contema un 79,96 % en peso de protema.

Para generar polimersomas encapsulados en selenoglicoprotema, la mezcla se disolvio en tampones acuosos de pH 5,1, 6,2 y 7,4, y la suspension se mezclo durante una noche en una plataforma de agitacion. La SGP no disuelta se retiro por centrifugacion. Para preparar polimersomas, el copolfmero de dibloque a base de PEO(2k)-b-PCL(12k) se disolvio en un disolvente organico (por ejemplo, cloruro de metileno, tetrahidrofurano, o dimetilsulfoxido) para producir polfmero PEO-b-PCL 1 mM en solucion organica. A continuacion la solucion se deposito sobre una tira rugosa de TEFLON (con un grosor de 1" x 1" x 1/16" aproximadamente) y se coloco en el fondo de un vial de vidrio, con el lado aspero hacia arriba. El disolvente se evaporo a vacm a temperatura ambiente durante 24-48 horas, dando como resultado una pelmula seca de copolfmeros que pesaban 1-10 mg.

Estas pelmulas se hidrataron a continuacion con 2-3 ml de una solucion acuosa que contema una proporcion de selenoglicoprotemas a 1:1 a pH 4,0 y pH 6,0, y a continuacion se sometieron a sonicacion en un bano de ultrasonidos a 20-100 Hz durante 1-2 h . Despues de completar la sonicacion, los viales se sometieron inmediatamente a agitacion vorticial durante 1-2 minutos para formar polimersomas que encapsulan las selenoglicoprotemas en el nucleo acuoso de las vesmulas de polfmero a base de PEO-b-PCL. A continuacion, los polimersomas se extruyeron rapidamente a traves de una membrana de policarbonato del tamano de poro deseado usando una extrusora LIPOSOFAST para obtener un diametro promedio deseado de los polimersomas, en este caso, en un intervalos de 50-300 nm. Los polimersomas extruidos se inyectaron a continuacion en un casete de dialisis para el intercambio de solucion contra un tampon iso-osmotico de pH 7,4 durante 24 horas, de modo que todas las selenoglicoprotemas no encapsuladas se retiraron.

Una muestra de selenoglicoprotema encapsulada en polimersoma a pH 7,4 se preparo con una concentracion inicial de selenoglicoprotema de 10 mg/ml y se sometio a dialisis contra el tampon PBS iso-osmotico. Se tomaran imagenes de esta muestra con cryo-TEM con aumentos de 21.000x y 52.000x para obtener una identificacion visual de la encapsulacion satisfactoria de selenoglicoprotema dentro de los polimersomas (Vease la Figura 13). Cryo-TEM permite la obtencion de imagenes de muestras de ensayo a temperaturas criogenicas en sus estados nativos de hidratacion, lo que evita cualquier cambio conformacional indeseable. Generalmente, se observaron polimersomas esfericos uniformes de tamanos de aproximadamente 100 nm o ligeramente mas pequenos en la muestra de la que se tomaron las imagenes. En algunos casos, se observaron agregados aproximadamente esfericos de material amorfo ademas de polimersomas. Estos agregados pueden estar compuestos por selenoglicoprotema liberada desde el nucleo del polimersoma y que precipita adicionalmente debido a la diferencia en el pH desde el interior hacia el exterior del polimersoma en el momento en que se toman las imagenes de las muestras.

Las selenoglicoprotemas encapsuladas en polimersoma a pH 5,1, 6,2 y 7,4 se caracterizaron adicionalmente por medicion de la concentracion de selenio (Vease la Tabla 6). Se liofilizo un ml de cada muestra de selenoglicoprotema encapsulada en polimersoma, formando un precipitado de polvo de color blanco que a continuacion se peso e inspecciono con aumentos de 200. las cantidades completas de selenoglicoprotemas encapsuladas en polimersoma se disolvieron usando acidos concentrados: acidos perclorico, mtrico y clorlmdrico, a una temperatura entre 100 °C y 175 °C. Las soluciones se diluyeron hasta 50 ml usando agua desionizada (DI) y se analizaron usando un instrumento y metodologfa MILLENIUM EXCALIBUR.

Tabla 6. Resultados de enca sulacion

EJEMPLO6

Liberacion de selenoglicoprotemas a partir de nanocapsulas:

La liberacion de selenoglicoprotema (SGP) de las formulaciones de nanocapsula N.° 1 y 3 de la Tabla 6 que se ha mencionado anteriormente, preparadas con 10 mg/ml de suspension de SGP y dializadas frente a tampones de de pH 7,4 y 5,1 respectivamente, se monitorizo durante un penodo de 14 d^as a 370 °C. Para monitorizar la liberacion de selenoglicoprotemas a partir de la selenoglicoprotema encapsulada en nanocapsula, se usaron suspensiones dializadas concentradas mediante centrifugacion en membrana (tubos de centrifugadora con lfmite de corte de peso molecular de 300 kD). Las suspensiones concentradas se dividieron en almuotas en tampones iso-osmolares (pH de 5,1 o 7,4) y se mantuvieron a 37 °C con N = 2 muestras para cada punto de tiempo. Para evaluar el % de liberacion de selenoglicoprotema de las nanocapsulas, las muestras se centrifugaron para separar las nanocapsulas intactas en cada momento. Para determinar que nanocapsulas se separaban de forma eficaz efectivamente de la muestra de selenoglicoprotema, se realizaron mediciones de dispersion dinamica de luz en vesmulas separadas (fraccion retenida) y solucion libre (fraccion filtrada) para medir los tamanos de partmulas. La absorbancia UV de la solucion libre se midio a 280 nm y el % de liberacion de selenoglicoprotemas se calculo como (AEjemplo - Ainicial) / (Afinal -Ainicial), donde Ainicial es la absorbancia en el dfa 0, y Afinal es la absorbancia al final del estudio cuando las muestras se solubilizaron para producir una liberacion completa (Vease la Figura 12). Durante un periodo de 14 dfas, aproximadamente un 70% de la SGP a pH 5,1 se libero de la nanocapsula en estado estacionario; mientras que aproximadamente un 50 % se libero a pH 7,4. Se cree que la tasa de liberacion inicial de las SGP a un pH mas bajo se debe a la hidrolisis de la membrana de la nanocapsula catalizada por acido, seguida por una difusion constante de selenoglicoprotemas a traves de la membrana de las nanocapsulas. Estos perfiles de liberacion son notablemente similares a los de la doxorrubicina, un agente terapeutico para el cancer, encapsulada dentro de polimersomas a base de PEO-b-PCL (Vease, por ejemplo, Ghoroghchian et al., Macromolecules, 2006, 39 (5), 1673­ 1675). Estos datos confirman que la encapsulacion de selenoglicoprotemas incluso en una concentracion de carga relativamente elevada no afecta al patron de liberacion de una manera negativa.

EJEMPLO7

Preparacion de polimeros de liberacion lenta de SelenoGlicoProtemas (SGP)

Smtesis del polfmero A. Una mezcla de SGPs a 1:1 precipitadas a pH 4,0 y 6,0 (Vease el Ejemplo 5) se uso en la preparacion de polfmeros de liberacion lenta de SGP. 150 mg de SGP se disolvieron en 2 ml de acido metacnlico y 1 ml de agua DI. Se aplico una cierta cantidad de calentamiento para acelerar la disolucion. Una muestra de 0,5 ml de la solucion se puso en un vial de 5 ml que contema 10 mg de AIBN, se sometio a agitacion vorticial durante 1 minuto y el aire del tubo se retiro al vacfo y se reemplazo por nitrogeno. Los contenidos del tubo se polimerizaron colocando el tubo en un horno de laboratorio calentado a 70 °C durante 2 h. El tubo se rompio y el polfmero se corto en secciones finas y se seco a alto vacm.

Smtesis del polfmero B. Una mezcla de: 0,064 ml de acido metacnlico, 0,091 ml de metacrilato de 2-hidroxietilo, 1,427 ml de dimetacrilato de etilenglicol y 10 mg de AIBN se colocaron en un vial de 5 ml y se agito con una barra de agitacion magnetica, seguido de 75 mg de SGP disueltos en una mezcla de 1,5 ml de acido acetico y 0,75 ml de agua DI. El aire en el vial se reemplazo con nitrogeno y el vial se cerro hermeticamente y se coloco en un bano de aceite a 70 °C durante cuatro horas. El vial se rompio y el monolito de polfmero se trituro en polvo en un mortero de porcelana. Las fracciones volatiles se retiraron del polfmero a alto vacm.

Liberacion de SGP con el tiempo. El mismo protocolo de liberacion lenta de SGP se aplico a cada uno de los polfmeros (A y B). Se pusieron 333,7 ±0,1 mg de polfmero en un tubo de centrifugadora de 15 ml que contema 5 ml de tampon citrato (pH 5,0) y el tubo se agito suavemente durante cuatro horas. A continuacion los tubos se centrifugaron y el sobrenadante se recogio mientras que los microgranulos de polfmero se lavaron con dos volumenes de 8 ml de agua DI y se liofilizo. Se extrajeron ~21 mg de la muestra liofilizada para el analisis de Se. Las extracciones de SGP se repitieron dos veces mas. Se registraron los pesos de las muestras. Todas las muestras perdieron peso durante estos tratamientos (Veanse las Tablas 8 y 9).

Tabla 8

Tabla 9

Para calcular la concentracion de la SGP liberada, la absorbancia UV a 280 nm de los sobrenadantes se midio y se compare con la curva de calibracion de SGP preparada en el mismo tampon (Vease la Tabla 10).

Tabla 10.

La espectroscopfa de absorcion atomica (usando metodo e instrumento EXCALIBUR) se aplico para medir la concentracion de Se residual en el polfmero de liberacion lenta (Vease la Tabla 11).

Tabla 11

De acuerdo con las mediciones de concentracion de Se en los microgranulos del residuo, se libero un 36,08% de SGP a partir del Polfmero A, despues de lavados de 4 horas, triples (12 horas en total). Durante el mismo tratamiento, un 30,11 % de SGP se libero del Polfmero B.

EJEMPLO8

Extraccion alcalina de protemas de levadura intracelular

200,0 g de SEL-PLEX se mezclaron con 1 l de hidroxido sodico 0,1 M a pH 11,5 y se calento a 60 °C durante 8 horas. a continuacion la mezcla se centrifugo a 14.000x g/10 min/10°C formando un sobrenadante y un microgranulo. El microgranulo se lavo dos veces con 400 ml de agua DI y se liofilizo, dando como resultado un peso de 54,5 g (Vease la Tabla 12). El sobrenadante a pH 11,5 y los lavados que se usaron se mezclaron en conjunto. El pH se redujo a 6,6 mediante neutralizacion usando acido clorhndrico concentrado. Durante la neutralizacion se formaron pequenas trazas de un precipitado y de un sobrenadante transparente. El precipitado se separo mediante centrifugacion y el sobrenadante se concentro usando dispositivos AMICON de ultrafiltracion de 10 kDa. El concentrado se lavo con dos porciones de 100 ml de agua DI y se liofilizo, proporcionando 64,0 g de un solido de color marron. Las fracciones filtradas restantes se combinaron (volumen total 21) y se analizaron para concentracion de selenio. La fraccion precipitada separada se analizo para Selenio y nitrogeno/protema (VEASE la Tabla 12).

Tabla 12: Extraccion alcalina

El analisis de la fraccion filtrada indico una perdida de masa de un 40,7 % y una perdida de selenio de un 48,7 % que no se recupero mediante ultrafiltracion a traves de membrana de 10 kDa. Las eliminaciones pnucleofilas/termicas de MeSe-1 y HSe-1 y formas oxidadas de estos grupos funcionales a partir de peptidos que conteman selenio, dio como resultado la degradacion de la estructura qmmica original de las SGP's y perdida de masa de selenio en la fraccion filtrada. El proceso de produccion que se lleva a cabo comunmente en la tecnica genera un aumento del volumen y una elevacion de la concentracion de selenio en la fraccion filtrada que da como resultado una corriente residual que puede ser nociva puede tener efectos perjudiciales (por ejemplo, nociva para el medio ambiente). por el contrario, los metodos de la presente invencion proporcionan extraccion acida y fraccionamiento dependiente del pH de las SGPs a partir de levadura enriquecida con selenio (por ejemplo, en un proceso comercial a gran escala). En condiciones de temperatura variable, se encontro que la tecnica tradicional/convencional que usa hidrolisis alcalina no funcionaba en la extraccion de selenoglicoprotemas a partir de celulas de levadura. Como se describe en el presente documento, se descubrio que la extraccion de las SGP's a partir de celulas de levadura usando extraccion acida era satisfactoria.

Referencias

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composicion que comprende selenoglicoprotemas solubles, donde las selenoglicoprotemas solubles contienen dos o mas fracciones de las selenoglicoprotemas dependientes del pH, donde las selenoglicoprotemas solubles se obtienen mediante extraccion acida de las selenoglicoprotemas solubles a partir de levadura enriquecida con selenio y despues de exponer la levadura enriquecida con selenio a condiciones acidas, mediante precipitacion secuencial dependiente del pH a dos o mas valores de pH diferentes de las selenoglicoprotemas solubles, donde las selenoglicoprotemas solubles se generan con un metodo que comprende:

a) proporcionar levadura enriquecida con selenio;

b) exponer la levadura enriquecida con selenio a condiciones acidas seguido de centrifugacion para generar i) un microgranulo que comprende material insoluble acido; y

ii) una fase lfquida que comprende el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble en las condiciones acidas;

c) precipitar selenoglicoprotemas de la fase lfquida que comprende el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble en las condiciones acidas mediante un aumento del pH de la fase lfquida de 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 3.0, 4,0, 5,0 o 6,0; y

d) separar las selenoglicoprotemas precipitadas de la fase lfquida.

2. La composicion de la reivindicacion 1, donde las selenoglicoprotemas solubles son solubles a pH inferior a 1,5, 2, 3. 4, 5 o 6.

3. La composicion de la reivindicacion 2, donde las selenoglicoprotemas solubles son solubles a pH inferior a 4, 5 o 6.

4. La composicion de la reivindicacion 1 que comprende adicionalmente un vehmulo.

5. La composicion de la reivindicacion 4, donde el vehmulo se selecciona entre el grupo que consiste en un polimersoma, un polfmero de liberacion lenta, una nanocapsula, y un polfmero con impresion molecular, preferentemente

donde el vehmulo es un polfmero de liberacion lenta, o

donde el vehmulo es un polimersoma usado para encapsular selenoglicoprotema, preferentemente

donde el polimersoma comprende copolfmero de bloque de poli(oxido de etileno) (PEO), o

donde el polimersoma comprende copolfmero de dibloque de poli(e-caprolactona) (PCL), o

donde el polimersoma comprende copolfmeros de dibloque a base de poli(oxido de etileno)-bloque-poli(£-caprolactona) (PEO-b-PCL), o

donde el polimersoma se obtiene a partir del acoplamiento de poli(acido lactico), poli(glicolido), poli(acido lacticocoglicolico) o poli(3-hidroxibutirato) con PEO.

6. La composicion de la reivindicacion 5, donde el diametro medio de un polimersoma que encapsula selenoglicoprotema es 50-300 nm.

7. Un metodo para preparacion de selenoglicoprotemas solubles que comprende:

a) proporcionar levadura enriquecida con selenio;

b) exponer la levadura enriquecida con selenio a condiciones acidas seguido de centrifugacion para generar i) un microgranulo que comprende material insoluble acido; y

ii) una fase lfquida que comprende el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble en las condiciones acidas;

c) precipitar selenoglicoprotemas de la fase lfquida que comprende el extracto de levadura enriquecida con selenio soluble en las condiciones acidas mediante un aumento del nivel de pH de la fase lfquida de 0,1, 0,2, 0,5, 1.0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0 o 6,0; y

d) separar las selenoglicoprotemas precipitadas de la fase lfquida.

8. El metodo de la reivindicacion 7, donde las condiciones acidas se obtienen usando tampon acido o la adicion de un acido, preferentemente

donde el acido es acido clortndrico.

9. El metodo de la reivindicacion 7, donde la exposicion de la levadura enriquecida con selenio a condiciones acidas comprende la exposicion de la levadura enriquecida con selenio a un nivel de pH de 1,5.

10. El metodo de la reivindicacion 7, donde las levaduras enriquecidas con selenio se exponen a condiciones acidas entre una y veinticuatro horas, preferentemente

donde las levaduras enriquecidas con selenio se exponen a condiciones acidas durante aproximadamente 8 horas.

11. El metodo de la reivindicacion 7, donde la exposicion de la levadura enriquecida con selenio a condiciones acidas se produce a una temperature superior a la temperature ambiente, preferentemente

donde la temperature esta entre 50 °C y 100 °C, mas preferentemente

donde la temperatura es 80 °C.

12. El metodo de la reivindicacion 7, donde las selenoglicoprotemas se hacen precipitar desde la fase lfquida en una diversidad de condiciones de pH para generar multiples fracciones de selenoglicoprotemas solubles dependientes del pH, preferentemente

donde las multiples fracciones de selenoglicoprotemas solubles dependientes del pH se generan a valores de pH de 1,85, 3,0, 4,0 y 6,0.

13. El metodo de la reivindicacion 7, donde la separacion de las selenoglicoprotemas precipitadas de la fase lfquida comprende centrifugacion para formar un microgranulo de las selenoglicoprotemas precipitadas seguido de retirada de la fase lfquida de las selenoglicoprotemas precipitadas.

14. El metodo de la reivindicacion 7, donde las levaduras enriquecidas con selenio son levaduras enriquecidas con selenio no viables, secas que contienen un 2 % o menos de selenio inorganico.

15. El metodo de la reivindicacion 7, donde las selenoglicoprotemas solubles son solubles a pH inferior a 1,5, 2, 3, 4, 5 o 6, preferentemente 4, 5 o 6.