EA030339B1 - Композиция водорастворимых селеногликопротеинов и способ ее получения - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к композициям растворимого селена и способам их получения, выделения и очистки. В частности, в изобретении представлена композиция для обеспечения биологически доступного селена, которая включает pH 4- и/или pH 6-зависимую фракцию водорастворимых селеногликопротеинов, причем указанная композиция получена способом, включающим обеспечение обогащенных селеном дрожжей; воздействие на обогащенные селеном дрожжи кислотных условий с pH от 1,5 до 5,5 с последующим центрифугированием, с образованием i) осадка, включающего не растворимый в кислой среде материал, и ii) жидкой фазы, включающей экстракт обогащенных селеном дрожжей, растворимый в кислотных условиях с pH 5,5 или ниже; осаждение селеногликопротеинов из жидкой фазы, включающей экстракт обогащенных селеном дрожжей, растворимый в кислотных условиях, путем повышения pH жидкой фазы до pH 6,0; и выделение осажденных селеногликопротеинов pH 4- и/или pH 6-зависимых фракций из жидкой фазы, а также способ получения такой композиции.

Description

Изобретение относится к композициям растворимого селена и способам их получения, выделения и очистки. В частности, в изобретении представлена композиция для обеспечения биологически доступного селена, которая включает рН 4- и/или рН 6-зависимую фракцию водорастворимых селеногликопротеинов, причем указанная композиция получена способом, включающим обеспечение обогащенных селеном дрожжей; воздействие на обогащенные селеном дрожжи кислотных условий с рН от 1,5 до 5,5 с последующим центрифугированием, с образованием ί) осадка, включающего не растворимый в кислой среде материал, и ίί) жидкой фазы, включающей экстракт обогащенных селеном дрожжей, растворимый в кислотных условиях с рН 5,5 или ниже; осаждение селеногликопротеинов из жидкой фазы, включающей экстракт обогащенных селеном дрожжей, растворимый в кислотных условиях, путем повышения рН жидкой фазы до рН 6,0; и выделение осажденных селеногликопротеинов рН 4- и/или рН 6-зависимых фракций из жидкой фазы, а также способ получения такой композиции.

030339

Настоящая заявка является частичным продолжением и испрашивает приоритет заявки на патент Соединенных Штатов Америки серийного номера 13/051646, поданной 18 марта 2011 г., в которой испрашивается приоритет предварительной заявки на патент Соединенных Штатов Америки серийного номера 61/315265, поданной 18 марта 2010 г., каждая из которых включена в настоящий документ путем ссылки в полном объеме.

Область техники

Настоящее изобретение относится к композициям растворимого селена и способам их получения. В частности, в настоящем изобретении представлены способ получения водорастворимых селеногликопротеинов (например, путем экстракции селеногликопротеинов из обогащенных селеном дрожжей), и композиции, включающие водорастворимые селеногликопротеины.

Уровень техники

Селен является следовым элементом, важным для надлежащей физиологической функции организма человека. Селен поглощается из пищи, которая содержит различное количество селена.

Известно, что селен играет решающую роль в подержании физиологического метаболизма, роста, репродуктивного здоровья и иммунитета. Селен входит в состав различных органических молекул, включая, например, аминокислоты, такие как 1-селенометионин, селеноцистеин и селеноцистин. Поэтому селен может быть составляющей частью белков, многие из которых структурно важны для организма. Более того, селен является важным компонентом ряда ферментов, которые влияют на метаболизм, репродукцию, предупреждение рака и иммунную защиту у людей (смотри, например, Каутап, М., Ьаисе!, 356:233-241 (2000)).

В многочисленных исследованиях была сделана попытка выявить потенциальную пользу для здоровья, обусловленную потреблением низких доз селена. Например, было показано, что низкие концентрации неорганической формы селена обладают некоторым потенциальным благотворным действием на здоровье (смотри, например, Риги81ип е! а1., Ιηΐ. ί о£ ОЬекйу апб Ке1а!еб Ме1аЬ. Όίδ, 19, 458-463 (1995)). Однако при повышенных дозах благотворное влияние меняется на противоположное и возникает опасная токсичность.

Исследования последних двух десятилетий позволяют предположить, что селен является эффективным для снижения заболеваемости раком, при введении животным в дозах лишь в 5-10 раз выше пищевой потребности (смотри, например, Е1-Вауоиту, ТНе го1е о£ 8е1еишт ш сапсег ргеуепОоп. РНбабе1рН1а, Ырршсой, 1-15, 1991). Химиопрофилактические исследования с селеном в системах моделей на животных показали, что этот элемент эффективен для большинства, если не всех систем органов, и защищает от канцерогенного действия (смотри, например, Е1-Вауоиту, ТНе го1е о£ 8е1ешит ш сапсег ргеуепйоп, РЫ1абе1рЫа, ИрртсоП. 1-15, 1991). Эпидемиологические исследования и испытания с подкормками также подтверждают его эффективность при снижении заболеваемости раком печени, ободочной кишки, простаты и легких (смотри, например, Уи е! а1., Вю1 Тгасе Е1ет Ке8, 56: 117-124 (1997); С1агк е! а1., I Ат Меб А88ос, 276: 1957-1963 (1996); Уо81и/а\уа е! а1., I Ыа!1 Сапсег 1п8!, 90: 1219-1224, (1998); Вгоок8, е! а1., I Иго1, 166: 2034-2038, (2001)). В других исследованиях было показано отсутствие благотворного влияния снижения селена на раковые заболевания (смотри, например, Оаг1апб е! а1., ί. Ат. Со11 ΝιιΙγ. 12: 40011 (1993); ОНабтап е! а1., Сапсег Эе1ес1 Ргеу, 24: 305-13(2000)).

Были исследованы многочисленные формы селена. Они включают неорганический селен, такой как селенит натрия, а также органические источники, включая селеновые дрожжи. Существует значительная разница между токсичностью неорганического и органического селена, неорганические соединения обычно абсорбируются и используются менее эффективно, а также являются более токсичными, чем органические источники селена.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к растворимым композициям селена и способам их получения. В частности, в настоящем изобретении представлены способы получения водорастворимых селеногликопротеинов (например, путем экстракции селеногликопротеинов из обогащенных селеном дрожжей), композиции, включающие водорастворимые селеногликопротеины.

Соответственно в настоящем изобретении представлен способ получения растворимых селеногликопротеинов, включающий:

a) обеспечение обогащенных селеном дрожжей;

b) воздействие на обогащенные селеном дрожжи кислотных условий с рН от 1,5 до 5,5 с последующим центрифугированием, с образованием:

ί) осадка, включающего не растворимый в кислой среде материал;

ίί) жидкой фазы, включающей экстракт обогащенных селеном дрожжей, растворимый в кислотных условиях с рН 5,5 или ниже;

c) осаждение селеногликопротеинов из жидкой фазы, включающей экстракт обогащенных селеном дрожжей, растворимый в кислотных условиях, путем повышения рН жидкой фазы до рН 6,0;

б) выделение осажденных селеногликопротеинов рН 4- и/или рН 6-зависимых фракций из жидкой фазы.

В некоторых вариантах реализации воздействие кислотных условий на обогащенные селеном

- 1 030339

дрожжи происходит при температуре выше комнатной (например, выше чем около 20-25°С). Настоящее изобретение не ограничивается температурой выше комнатной, при которой обогащенные селеном дрожжи подвергаются действию кислотных условий. Действительно, могут быть использованы различные температуры, включая, но не ограничиваясь этим, около 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 90, 95, 97, 99°С или выше).

В настоящем изобретении представлены также композиции, содержащие растворимые селеногликопротеины, полученные в соответствии с настоящим изобретением. Например, в некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении представлена селенодефицитная композиция, содержащая растворимые селеногликопротеины настоящего изобретения. Композиция для обеспечения биологически доступного селена включает рН 4- и/или рН 6-зависимую фракцию водорастворимых селеногликопротеинов, причем указанная композиция получена способом, включающим:

a) обеспечение обогащенных селеном дрожжей;

b) воздействие на обогащенные селеном дрожжи кислотных условий с рН от 1,5 до 5,5 с последующим центрифугированием, с образованием:

ί) осадка, включающего не растворимый в кислой среде материал;

ϊϊ) жидкой фазы, включающей экстракт обогащенных селеном дрожжей, растворимый в кислотных условиях с рН 5,5 или ниже;

c) осаждение селеногликопротеинов из жидкой фазы, включающей экстракт обогащенных селеном дрожжей, растворимый в кислотных условиях, путем повышения рН жидкой фазы до рН 6,0;

к) выделение осажденных селеногликопротеинов рН 4- и/или рН 6-зависимых фракций из жидкой фазы.

В некоторых вариантах реализации растворимые селеногликопротеины настоящего изобретения добавляют и/или смешивают с указанной селенодефицитной композицией. Настоящее изобретение не ограничивается типом селенодефицитной композиции или материалом, к которому добавляют или с которым смешивают растворимые селеногликопротеины настоящего изобретения, такие композиции или материалы включают, но не ограничиваясь этим, добавки к рациону, лекарства, фармацевтические средства, пищевые продукты, животные корма и другие типы материалов. В некоторых вариантах реализации добавление или смешивание (например, примешивание) селеногликопротеина включает смешивание в композицию селеногликопротеина и одного или нескольких других типов селена. В некоторых вариантах реализации растворимые селеногликопротеины настоящего изобретения добавляют или смешивают с композициями, содержащими селен (например, для увеличения и/или пополнения общего количества селена).

В настоящем изобретении представлена также композиция, содержащая растворимые селеногликопротеины и носитель. В некоторых вариантах реализации селеногликопротеины являются определенной рН-зависимой фракцией селеногликопротеинов. Настоящее изобретение не ограничивается типом используемого носителя. Действительно, могут быть использованы различные носители, включая, но не ограничиваясь этим, дендримеры, полимеросомы, наночастицы, полимеры с медленным высвобождением, нанокапсулы и/или молекулярно фиксированные полимеры. В одном предпочтительном варианте реализации носителем является полимер с медленным высвобождением. В другом предпочтительном варианте реализации носителем является молекулярно фиксированный полимер. В другом предпочтительном варианте реализации носителем является полимеросома, используемая для инкапсуляции селеногликопротеина. Настоящее изобретение не ограничивается типом используемой полимеросомы. Действительно, могут быть использованы любые полимеросомы, известные в данной области. В некоторых вариантах реализации полимеросома включает поли(этиленоксид) (РЕО) блоксополимер. Однако настоящее изобретение не ограничивается этим. Может быть использован любой известный блоксополимер, включая, например, поли(этилэтилен) (РЕЕ), поли(бутадиен) (РВ или ΡΒΌ), поли(стирол) (Р8) и поли(изопрен) (Р1). В некоторых вариантах реализации полимер включает поли(е-капролактон) (РСЬ) диблок-сополимер. В некоторых вариантах реализации полимеросома включает диблок-сополимеры на основе поли(этиленоксид)-блок-поли(е-капролактон) (РЕО-Ь-РСЬ). В некоторых вариантах реализации полимеросома включает блоксополимер, который является триблок-, тетраблок-, пентаблок- или по меньшей мере шестиблочным сополимером. В некоторых вариантах реализации полимеросома получена связыванием поли(молочной кислоты), поли(гликолида), поли(молочно-согликолевой кислоты) и/или поли(З-гидроксибутирата) с РЕО. Настоящее изобретение не ограничивается размером полимеросомы, инкапсулирующей селеногликопротеин. В композициях и способах настоящего изобретения находят применение различные размеры, включая, но не ограничиваясь этим, полимеросомы, инкапсулирующие селеногликопротеины, размер которых составляет около 50-300 нм в диаметре, хотя могут быть использованы более крупные (например, около 350, 400, 500 нм или больше) или мелкие (например, около 40, 30, 20 или меньше) полимеросомы, инкапсулирующие селеногликопротеины.

- 2 030339

Описание графических материалов

На фиг. 1 представлено последовательное приготовление растворимых селеногликопротеинов (8СР) из 8ЕЬ-РРЕХ путем кислотной экстракции и последующего осаждения одного варианта реализации настоящего изобретения.

На фиг. 2 показан процесс рН-зависимого осаждения селеногликопротеинов одного варианта реализации настоящего изобретения.

На фиг. 3 показана теплокарта, иллюстрирующая влияние различных обработок с добавлением селена, описанных в табл. 3 и 4 примера 3, на уровни генной экспрессии в грудной скелетной мышце кур по сравнению с базовым контрольным образцом.

На фиг. 4 показана диаграмма Венна, изображающая различное влияние фракции 8ОР рН4,0 и 8ЕЬРЬЕХ на профиль генной экспрессии в грудной мышце.

На фиг. 5 представлены иллюстративные гены, которые обычно регулируются селенитом натрия

(88), 8ЕЬ-РЬЕХ (8Р) и фракцией селеногликопротеина (8сР) рН 4,0.

На фиг. 6 изображены иллюстративные гены, которые обычно регулируются 8ЕЬ-РЬЕХ (8Р) и фракцией селеногликопротеина (8СР) рН 4,0, но не селенитом натрия (88).

На фиг. 7 изображены иллюстративные гены, которые уникально регулируются фракцией селеногликопротеина (8ОР) рН 4,0 и не регулируются селенитом натрия (88) или 8ЕЬ-РЬЕХ (8Р).

На фиг. 8 изображен иллюстративный ген, который уникально регулируется фракцией селеногликопротеина (8ОР) рН 4,0 и не регулируется селенитом натрия (88) или 8ЕЬ-РЬЕХ (8Р).

На фиг. 9 изображен иллюстративный ген, который уникально регулируется фракцией селеногликопротеина (8ОР) рН 4,0 и не регулируется селенитом натрия (88) или 8ЕЬ-РЬЕХ (8Р).

На фиг. 10 изображен иллюстративный ген, который уникально регулируется фракцией селеногликопротеина (8ОР) рН 4,0 и не регулируется селенитом натрия (88) или 8ЕЬ-РЬЕХ (8Р).

На фиг. 11 изображена теплокарта, представляющая влияние различных обработок с добавлением селена, описанных в табл. 3 и 4 примера 3, на уровни генной экспрессии в печеночной ткани по сравнению с базовым контрольным образцом.

На фиг. 12 изображено высвобождение 8ОР из нанокапсул при рН 5,1 и 7,4 в течение двух недель.

На фиг. 13 представлены изображения криогенной туннельной электронной микроскопии (криоТЭМ) полимеросом, инкапсулирующих селеногликопротеин, при рН 7,4.

Определения

Для облегчения понимания настоящего изобретения ниже представлено определение ряда терминов и выражений.

При использовании в настоящем документе термины "пептид", "полипептид" и "белок" относятся к первичной последовательности аминокислот, которые связаны ковалентными "пептидными связями". В общем, пептид состоит из нескольких аминокислот, обычно из 2-50 аминокислот, и он короче белка. Термин "полипептид" включает пептиды и белки.

Термин "гликопротеин(ы)" или "гликопептид(ы)" относится к белку или пептиду, который содержит один или более углеводных остатков, ковалентно связанных с полипептидной цепью. Термин "селенопротеин(ы)" или "селенопептид(ы)" относится к белку или пептиду, который содержит один или несколько атомов селена. Как правило, атомы селена включены в белки в составе селеносодержащих аминокислот, включая селеноцистеин и селенометионин.

Термины "селеногликопротеин(ы)", "селеногликопептид(ы)" или "8ОР" относится к гликопротеину или гликопептиду, которые содержат один или более атомов селена. Как правило, "селеногликопротеины" содержат одну или несколько селеносодержащих аминокислот. "Селеногликопротеины" могут содержать ряд углеводов в любом количестве различных форм.

Термины "образец", "проба" используются в своем самом широком смысле и охватывают образцы и пробы, полученные из любого источника. При использовании в настоящем документе термин "образец" используется для обозначения биологических образцов, полученных из животных (включая людей), и охватывает жидкости, твердые вещества и ткани. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения биологические образцы включают спинномозговую жидкость (С8Р), серозную жидкость, мочу и слюну, кровь и продукты крови, такие как плазма, сыворотка и тому подобные. Однако эти примеры не следует толковать как ограничивающие типы образцов, которые находят применение по настоящему изобретению.

При использовании в настоящем документе термины "дрожжи" и "дрожжевые клетки" относится к эукариотическим микроорганизмам, классифицированным в царство Грибы, имеющим клеточную стенку, клеточную мембрану и внутриклеточные компоненты. Дрожжи не образуют специфических таксономических или филогенетических групп. В настоящее время известно около 1500 видов; по оценкам описан лишь 1% из всех видов дрожжей. Термин "дрожжи" зачастую используется как синоним для 8. сегеУ181ае, однако филогенетическое разнообразие дрожжей демонстрируется их размещением в обоих разделах ЛксошусоЩ и ВалбютусоЮ. Термин "дрожжи" охватывает пивные дрожжи, винокуренные дрожжи и пекарские дрожжи. Почкующиеся дрожжи ("истинные дрожжи") классифицируют в отряд 8ассйаготусе1а1е8. Большинство видов дрожжей размножаются вегетативным способом путем почкования,

- 3 030339

хотя некоторые размножаются простым делением надвое. Дрожжи являются одноклеточными, хотя некоторые виды стали многоклеточными за счет образования цепочки связанных почкующихся клеток, известные как ркеийоНурНае, или Га1ьс НурНае. Размер дрожжей может в значительной степени варьироваться в зависимости от вида, и обычно имеют 3-4 мкм в диаметре, хотя некоторые дрожжи могут достигать свыше 40 мкм.

При использовании в настоящем документе термины "обогащенные селеном дрожжи" и "селенизированные дрожжи" относятся к любым дрожжам (например, 8ассЬаготусе8 сегеуыае). которые выращены в среде, содержащей неорганические соли селена. Настоящее изобретение не ограничивается используемой солью селена. Действительно, предполагается, что в настоящем изобретении могут применяться различные соли селена, включая, но не ограничиваясь этим, селенит натрия или селенат натрия. Свободный селенометионин (например, не связанный с клеткой или дрожжами) также может использоваться в качестве источника для обогащенных селеном дрожжей, поскольку дрожжи инкорпорируют эту форму селена. При выращивании, из-за химического сходства между селеном и серой, дрожжи инкорпорируют селен вместо серы, которая обычно содержится в серосодержащих органических соединениях в клетке. Селеносодержащим соединением в таких дрожжевых композициях является селенометионин, который встраивается в полипептиды/белки. Количество общего клеточного селена, присутствующего в форме селенометионина в таких композициях варьируется, но может составлять от 10 до 100%, 20-60%, 50-75% или между 60 и 75%. Остальное количество органического селена в селенизированных дрожжевых композициях преимущественно образуется из промежуточных соединений по пути биосинтеза селенометионина. Сюда входят, но не ограничиваясь этим, селеноцистеин, селеноцитатионин, селеногомоцистеин и селеноаденозилселенометионин. Количество остаточной неорганической соли селена в конечном продукте обычно достаточно низкое (например, <2%).

При использовании в настоящем документе термин "§ЕЕ-РЬЕХ" относится к высушенным, нежизнеспособным обогащенным селеном дрожжам (например, 8ассНоготусе8 сегеуыае с номером доступа 0Ν0Μ 1-3060, Со11ес1юп №10опа1е Эе СиЙигек Эе Мюгоогдашктек (0Ν0Μ), Институт Пастера, Париж, Франция), выращенным ферментацией с подпиткой, которая обеспечивает инкрементные количества тростниково-сахарной патоки и солей селена так, что происходит минимизация пагубного действия солей селена на скорость роста дрожжей, и дает возможность оптимально внедрять неорганический селен в клеточный органический материал. Остаточный неорганический селен удаляют (например, при помощи тщательного промывания), и его количество не превышает 2% от общего содержания селена.

При использовании в настоящем документе термин "органический селен" относится к любому органическому соединению, в котором атом селена напрямую связан с атомом углерода.

При использовании в настоящем документе термин "неорганический селен" обычно относится к любой селеновой соли (например, селенит натрия, селенат натрия), в которой селен находится в степени окисления -2, +4 и +6.

При использовании в настоящем документе термины "реципиент", "субъект" и "пациент" относятся к любому животному, включая, но не ограничиваясь этим, людей и животных (например, приматов, собак, кошек, коров, лошадей, овец, домашних птиц, рыбу, ракообразных), которых изучают, анализируют, испытывают, диагностируют или лечат. При использовании в настоящем документе термины "реципиент", "субъект" и "пациент" используются взаимозаменяемо, если не указано иное.

При использовании в настоящем документе термин "вес/вес." ("вес/вес") относится к количеству данного вещества в композиции в весовом выражении. Например, если корм для животных включает 0,02% (вес./вес.) кормовой добавки, то это обозначает, что масса кормовой добавки составляет 0,02% от общей массы корма для животных (например, 200 г композиции кормовой добавки в 999800 г корма для животных).

При использовании в настоящем документе термин "очищенный" или "очищать" относится к удалению компонентов из образца. Например, клеточные оболочки дрожжей очищают путем удаления компонентов, не относящихся к клеточным оболочкам дрожжей (например, компоненты плазматической мембраны и/или внутриклеточные компоненты дрожжей); их очищают также путем удаления примесей и других агентов, отличных от клеточных оболочек дрожжей. Удаление компонентов, не относящихся к клеточным оболочкам дрожжей, и/или примесей, не относящихся к клеточным оболочкам дрожжей, приводит к увеличению процентного содержания клеточных оболочек дрожжей или их компонентов в образце.

При использовании в настоящем документе термин "эффективное количество" относится к такому количеству композиции (например, включающей селеногликопротеины настоящего изобретения), которого достаточно для достижения благотворного действия или заданных результатов. Эффективное количество может быть введено за одно или несколько введений, применений или доз, и оно не ограничивается конкретной композицией или способом введения.

При использовании в настоящем документе термин "биодоступность" относится к фракции молекулы или компонента, которая доступна для организма или достигает большого круга кровообращения. При внутривенном введении молекулы или компонента, его биодоступность достаточно высока. Однако при введении молекулы или компонента другими способами (такими как пероральный способ), его био- 4 030339

доступность снижается (из-за неполной абсорбции и пресистемного метаболизма). В контексте питательных веществ, биодоступность относится к скорости абсорбции и утилизации питательного вещества. Различные формы одного питательного вещества, например, могут иметь различную биодоступность.

При использовании в настоящем документе термины "пища", "пищевые продукты", "корм для животных" и "кормовые продукты" относятся к материалу (ам), который потребляется животными и вносит вклад в энергетическую и/или пищевую ценность рациона животного. Примеры включают, но не ограничиваясь этим, однородную смесь компонентов рациона (ТМК), фураж(и), гранулы, концентрат(ы), премикс(ы), совместный продукт(ы), барду, мелассу, волокна, грубый корм(а), траву(ы), сено, зерно(а), листья, измельченный корм, растворимое вещество(а) и добавку(и).

При использовании в настоящем документе термины "пищевая добавка", "добавка к рациону", "композиция добавки к рациону" и тому подобные относятся к пищевому продукту, составленному в виде композиции диетической или пищевой добавки для применения в составе рациона человека или животного, например в качестве добавки к корму для животных.

При использовании в настоящем документе термины "введение" и "вводить" относятся к факту введения лекарства, пролекарства или другого агента, или к терапевтической обработке (например, композициями настоящего изобретения) субъекта (например, субъекта или ίη νίνο, ίη νίίτο или ех νίνο клеток, тканей или органов). Примерами способов введения в организм человека могут быть введение через глаза (офтальмическое), через рот (пероральное), через кожу (локальное или трансдермальное), через нос (назальное), через легкие (ингаляция), через слизистую оболочку рта (буккальное), ушное, ректальное, вагинальное, инъекции (например, внутривенно, подкожно, внутрь опухоли, внутрибрюшинно и так далее) и тому подобные.

При использовании в настоящем документе термины "совместное введение" и "совместно вводить" относятся к введению субъекту по меньшей мере двух агентов (например, композиции, включающей селеногликопротеины настоящего изобретения и один или несколько других агентов, например антибиотика, терапевтического (например, лекарственного или фармацевтического) или другого биологически активного соединения) или терапий. В некоторых вариантах реализации совместное введение двух или более агентов или терапий является параллельным. В других вариантах реализации первый агент/терапия вводится до второго агента/терапии. Специалистам в данной области понятно, что композиции и/или способы введения различных используемых агентов или терапий могут варьироваться. Соответствующая доза для совместного введения может быть легко определена специалистом в данной области. В некоторых вариантах реализации, если агенты или терапии вводят совместно, то соответствующие агенты или терапии вводят в более низких дозах, чем необходимо для их введения по отдельности. Таким образом, совместное введение особенно желательно в тех вариантах реализации, в которых совместное введение этих агентов или терапий снижает необходимую дозу потенциально вредного (например, токсичного) агента(ов), и/или если совместное введение двух или более агентов приводит к сенсибилизации субъекта к благотворному действию одного из этих агентов при совместном введении другого агента.

При использовании в настоящем документе термин "лечение" или грамматические эквиваленты включают улучшение и/или реверсирование симптомов заболевания (например, нейродегенеративного заболевания). Соединения, которые вызывают улучшение любого параметра, связанного с заболеванием, при использовании в скрининговых способах настоящего изобретения, могут посредством этого быть идентифицированы как терапевтические соединения. Термин "лечение" относится к терапевтическому лечению и профилактическим или превентивным мерам. Например, пользу от лечения композициями и способами настоящего изобретения могут получить те, кто уже страдает заболеванием и/или расстройством (например, нейродегенеративным заболеванием, диабетом или недостатком или потерей когнитивной функции), а также те, у которых необходимо предотвратить заболевание и/или расстройство (например, используя профилактическое лечение настоящего изобретения).

При использовании в настоящем документе термин "с риском заболевания" относится к субъекту (например, человеку), который предрасположен к заболеванию конкретной болезнью. Эта предрасположенность может быть генетической (например, определенная генетическая склонность к заболеванию указанной болезнью, такая как наследственные расстройства) или из-за других факторов (например, возраст, вес, условия окружающей среды, воздействие вредных соединений, присутствующих в окружающей среде, и так далее). Так, настоящее изобретение не ограничивается каким-либо определенным риском, а также не ограничивается каким-либо определенным заболеванием.

При использовании в настоящем документе термин "страдающий заболеванием" относится к субъекту (например, человеку), который болеет определенным заболеванием. Настоящее изобретение не ограничивается конкретными признаками или симптомом, а также заболеванием. Так, настоящее изобретение охватывает субъектов, которые находятся в любой стадии заболевания (например, от субклинического проявления до развившегося заболевания), при котором субъект демонстрирует по меньшей мере некоторые из показателей (например, признаки или симптомы), связанные с конкретным заболеванием.

При использовании в настоящем документе термины "заболевание" и "патологическое состояние" используются взаимозаменяемо для описания состояния, признаков и/или симптомов, которые связаны с любым ухудшением нормального состояния живого животного или любого из его органов или тканей,

- 5 030339

которое нарушает или изменяет характеристики нормального функционирования, и может быть реакцией на внешние факторы (такие как радиация, недостаточное питание, промышленные виды опасности или климат), определенные инфекционные агенты (такие как черви, бактерии или вирусы), врожденный порок организма (такой как различные генетические отклонения), или на их комбинацию и другие факторы.

Термин "соединение" относится к любому химическому веществу, фармацевтическому средству, лекарству и тому подобному, которое может быть использовано для лечения или предупреждения заболевания, болезни, слабости или расстройства функционирования организма. Соединения включают уже известные и потенциальные терапевтические соединения. Соединение может быть определено как терапевтическое путем скрининга с использованием скрининговых способов настоящего изобретения. "Известное терапевтическое соединение" относится к терапевтическому соединению, для которого была продемонстрирована (например, путем испытания на животных или предыдущего опыта введения людям) эффективность при таком лечении. Другими словами, известное терапевтическое соединение не ограничивается соединением, эффективным при лечении заболевания (например, рака, нейродегенеративного заболевания и так далее).

При использовании в настоящем документе термин "набор" используется в отношении комбинации реагентов и других материалов. Подразумевается, что набор может включать реагенты, такие как питательные вещества, и лекарства, а также средства для введения. Термин "набор" не ограничивается конкретной комбинацией реагентов и/или других материалов.

При использовании в настоящем документе термин "токсичный" относится к любому пагубному или вредному действию на субъект, клетку или ткань по сравнению с такой же клеткой или тканью до введения токсичного вещества.

При использовании в настоящем документе термин "фармацевтическая композиция" относится к комбинации активного агента (например, композиции, включающей селеногликопротеины) с носителем, инертным или активным, который делает эту композицию особенно применимой для диагностического, профилактического и/или терапевтического применения ίη νίίτο, ίη νίνο или ех νίνο.

Термины "фармацевтически приемлемые" или "фармакологически приемлемые", используемые в настоящем документе, относятся к композициям, которые в основном не вызывают неблагоприятных реакций, например токсических, аллергических или иммунологических реакций, при введении субъекту.

При использовании в настоящем документе термин "локально" относится к нанесению композиций настоящего изобретения на поверхность кожи и клеток и тканей слизистых оболочек (например, слизистые оболочки альвеол, щек, языка, жевательные слизистые оболочки и слизистые оболочки носа, а также другие ткани и клетки, которые выстилают полые органы или полости тела).

При использовании в настоящем документе термин "фармацевтически приемлемый носитель" относится к любым стандартным фармацевтическим носителям, включая, но не ограничиваясь этим, фосфатно-солевой буферный раствор, воду, эмульсии (например, такие как эмульсии масло/вода или вода/масло) и различные типы увлажняющих агентов, любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, лаурилсульфат натрия, изотонические средства и средства замедления абсорбции, средства для улучшения распадаемости таблеток (например, картофельный крахмал или натрия крахмалгликолят) и тому подобные. Композиции могут также включать стабилизаторы и консерванты. Примеры носителей, стабилизаторов и адъювантов описаны, например, в публикации Магйп, РепипдЮп'х РНагтасеи(1са1 Заепсек, 15-е изд, Маск РиЫ. Со, Истон, штат Пенсильвания (1975), которая включена в настоящий документ путем ссылки. В некоторых вариантах реализации пищевые продукты (например, диетический материал и/или лекарство) действуют в качестве носителя (например, в композиции селеногликопротеина настоящего изобретения).

При использовании в настоящем документе термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к любой соли (например, полученной по реакции с кислотой или основанием) соединения настоящего изобретения, которая является физиологически переносимой в организме заданного субъекта (например, млекопитающего субъекта и/или ίη νίνο или ех νίνο, клетках, тканях или органах). "Соли" соединений настоящего изобретения могут быть получены из неорганических или органических кислот и оснований. Примеры кислот включают, но не ограничиваясь этим, хлороводородную, бромоводородную, серную, фумаровую, малеиновую, фосфорную, гликолевую, молочную, салициловую, янтарную, толуол-псульфоновую, винную, уксусную, лимонную, метансульфоновую, этансульфоновую, муравьиную, бензойную, малоновую, нафталин-2-сульфоновую, бензолсульфоновую кислоту и тому подобные. Другие кислоты, такие как щавелевая, хотя сами и не являются фармацевтически приемлемыми, могут быть использованы при получении солей, применимых в качестве промежуточных соединений при получении соединений настоящего изобретения и их фармацевтически приемлемых солей присоединения кислот. Примеры оснований включают, но не ограничиваясь этим, гидроксиды щелочных металлов (например, натрия), гидроксиды щелочно-земельных металлов (например, магния), аммиак и соединения формулы Νν\ν,|'. где V является С_1-4 алкилом, и тому подобные. Примеры солей включают, но не ограничиваясь этим: ацетат, адипат, альгинат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфат, бутират, цитрат, камфорат, камфорсульфонат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, фумарат,

- 6 030339

флукогептаноат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, хлорид, бромид, йодид, 2гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, оксалат, пальмоат, пектинат, фенилпропионат, пикрат, пивалат, пропионат, сукцинат, тартрат, тиоцианат, тозилат, ундеканоат и тому подобные. Другие примеры солей включают анионы соединений настоящего изобретения, соединенные с соответствующим катионом, таким как Να'. ΝΗ₄+ и Ν\ν.·ι' (где V является С_1-4 алкильной группой), и тому подобные. Для терапевтического применения соли соединений настоящего изобретения рассматриваются как фармацевтически приемлемые. Однако соли кислот и оснований, которые не являются фармацевтически приемлемыми, также могут находить применение, например, при получении или очистке фармацевтически приемлемого соединения. Для терапевтического применения соли соединений настоящего изобретения рассматриваются как фармацевтически приемлемые. Однако соли кислот и оснований, которые не являются фармацевтически приемлемыми, также могут находить применение, например, при получении или очистке фармацевтически приемлемого соединения.

При использовании в настоящем документе термин "высушивание" относится к распылительному высушиванию, высушиванию замораживанием, высушиванию на воздухе, вакуумному высушиванию и любому другому виду процесса, в котором снижается или исключается содержание жидкости в субстанции.

При использовании в настоящем документе термин "распылительное высушивание" относится к общепринятому способу высушивания вещества, содержащего жидкость, с использованием горячего газа для испарения жидкости с целью снижения или исключения содержания жидкости в веществе. Другими словами, материал является высушенным распылением или тонким измельчением в потоке нагретого сухого воздуха.

При использовании в настоящем документе термин "высушивание замораживанием" и термин "лиофилизация", а также термин "криовысушивание" относятся к удалению растворителя из вещества в замороженном состоянии путем сублимации. Это осуществляют замораживанием материала, подлежащего высушиванию, до температуры ниже его эвтектической точки с последующим обеспечением скрытой теплоты сублимации. Точный контроль вакуума и подводимого тепла позволяет выполнять высушивание из замороженного состояния без расплавления продукта. При практическом осуществлении этот процесс ускоряют и точно контролируют в условиях пониженного давления.

При использовании в настоящем документе термин "сухой легкосыпучий порошок" относится к легкосыпучему сухому порошку, например порошку, который может быть высыпан из контейнера, мешка, емкости и так далее, без блокировки крупных комков.

При использовании в настоящем документе термин "измельчение" относится к снижению размера частиц при помощи ударов, разрезания или истирания.

При использовании в настоящем документе термин "промывание" относится к удалению или вымыванию (например, с использованием любого раствора (например, дистиллированной воды, буера или растворителя) или смеси) примесей или нежелательных растворенных компонентов препарата (например, клеточные оболочки дрожжей могут быть промыты для удаления из образца компонентов, не относящихся к клеточным оболочкам дрожжей).

При использовании в настоящем документе термин "полимеросома" относится к пузырькам, состоящим из синтетических полимеров, в одном растворе (например, которые могут быть использованы для инкапсуляции материала). Полимеросомы могут быть получены с использованием амфифильных синтетических блок-сополимеров с образованием мембраны пузырьков, и могут иметь радиус от 50 нм до 5 мкм или более. Большинство полимеросом содержит в своем ядре водный раствор, и они являются применимыми для инкапсуляции и защиты чувствительных молекул, таких как лекарства, ферменты, другие белки и пептиды, а также фрагменты ДНК и РНК. Мембрана полимеросомы обеспечивает физический барьер, который изолирует инкапсулированный материал от внешних веществ, таких как вещества, находящиеся в биологических системах. Примеры полимеросом, которые находят применение в вариантах реализации настоящего изобретения, а также их синтез, можно найти, например, в патентах США №№ 7867512, 7682603 и 6835394, каждый из которых включен в настоящий документ путем ссылки в полном объеме.

При использовании в настоящем документе термин "отходы" относится к нежелательным или бесполезным материалам.

При использовании в настоящем документе термин "сточная вода" представляет любую воду, качество которой необратимо ухудшилось под действием антропогенного влияния.

- 7 030339

Подробное описание изобретения

I. Введение.

Селен является следовым элементом, участвующим в регуляторных аспектах противоокислительного защитного механизма во всех живых тканях за счет взаимодействия с глутатионом организма (СЗН) и его основным Зе-содержащими противоокислительными ферментами, глутатион-пероксидазой (СРХ) и тиоредоксин-редуктазой (смотри, например, Соейппд е! а1., ί. Атт. Зс1. 59, 725-732 (1984); Сег1о££ е! а1., 1. Атт. Зс1. 70, 3934-3940 (1992); включены в настоящий документ путем ссылки в полном объеме). Глутатион и СРХ способны защищать целостность ненасыщенных связей фосфолипидов мембраны, гася атаки свободных радикалов, которые могут инициировать и распространять окисление липидов (смотри, например, Мей1ег апй Апйегкоп, Аппи. Реу. Вюсйет. 52, 711-760 (1983); Эе1еуе апй 1<.ар1о\\1ю, Рйагт. Тйег. 52, 287-305 (1991); Ра1тег апй Раийоп, Ыи1г. Реу. 55, 353-361 (1997); включены в настоящий документ путем ссылки в полном объеме).

В нескольких эпидемиологических исследованиях было также показано, что селен связан со снижением риска рака (смотри, например, За1опеп е! а1., Ат. 1. Ер1йетю1. 120: 342-349 (1984); Ай1ей е! а1., Ьапсе! 2: 130-134 (1983); Уй£ато е! а1., Сапсег 60: 145-148 (1987); включены в настоящий документ путем ссылки в полном объеме). Было показано, что различные селеновые соединения природного и синтетического происхождения ингибируют развитие опухоли в исследованиях на животных, в широком диапазоне доз (смотри, например, 1р,. 1. ΝιιΙγ. 128: 1845-1854 (1998); включен в настоящий документ путем ссылки в полном объеме). Хотя в большинстве исследований на животных были использованы фармакологические дозы селена (>2 мг/кг) при химиопрофилактике рака (смотри, например, 1р,. 1. ΝιιΙγ. 128: 1845-1854 (1998)), было также показано, что дефицит селена усиливает канцерогенез молочной железы (смотри, например, 1р апй Эашек Сапсег Ке8. 45: 61-65 (1985); включен в настоящий документ путем ссылки в полном объеме) и УФВ-индуцированного рака кожи (смотри, например, Репсе е! а1., 102: 759761 (1994); включен в настоящий документ путем ссылки в полном объеме).

Белки клеточной оболочки дрожжей связаны с полисахаридами клеточной оболочки химическими связями, и для высвобождения белка из клеточной оболочки дрожжей в раствор эти связи необходимо разрушить. Стандартной практикой экстракции белка из клеточных оболочек дрожжей является разрушение этих связей при помощи щелочного гидролиза (рН 11,5, 80°С) с последующим центрифугированием для выделения белков из глюкановых полисахаридов, которые не растворимы в воде.

При разработке вариантов реализации настоящего изобретения были выполнены эксперименты в попытках экстрагировать селеногликопротеины с использованием стандартной практики щелочного гидролиза. Эти попытки экстрагировать селеногликопротеины из клеточных оболочек дрожжей с использованием стандартной практики щелочного гидролиза оказались неудачными. Позже стало понятно, что неудача при экстракции селеногликопротеинов из клеточных оболочек дрожжей с использованием стандартной практики щелочного гидролиза обусловлена разложением селеногликопротеинов. Позже были предприняты попытки экстрагировать селеногликопротеины с использованием модифицированного способа щелочного гидролиза (рН 11,5, 60°С). Эти попытки экстракции селеногликопротеинов из клеточных оболочек дрожжей также оказались неудачными. Как правило, щелочные способы экстракции белков из дрожжей не работают при экстракции селеногликопротеинов из дрожжей. Поэтому при разработке вариантов реализации настоящего изобретения были предприняты дополнительные попытки экстрагировать селеногликопротеины с использованием кислотной экстракции (рН 5, 80°С). Как описано в настоящем документе, способ кислотной экстракции оказался успешным; селеногликопротеины не были разрушены, и экстракция была возможной.

Таким образом, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлены новые способы получения селеногликопротеинов (ЗСР), композиций селеногликопротеинов (ЗСР) (например, полученных с использованием способов кислотной экстракции (например, рН-зависимых фракций селеногликопротеина)), композиций, включающий инкапсулированные селеногликопротеины (ЗСР), а также способы их применения (например, для обеспечения преимущества щ νί\Ό (например, изменения профилей генной экспрессии) у пациента (например, человека, животного и так далее)). В частности, эксперименты, которые были выполнены при разработке вариантов реализации настоящего изобретения, показали, что композиции (например, включающие ЗСР (например, выделенные по способу настоящего изобретения) и способы настоящего изобретения могут быть использованы для обеспечения биологически доступного селена для пациента (например, увеличения посредством этого содержания селена в ткани и/или мышцах пациента (например, приводя посредством этого к стабилизации и/или улучшению здоровья субъекта))). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлены способы получения ЗСР, композиций, включающих инкапсулированные (например, инкапсулированные в полимеросому) ЗСР, а также способы их применения для изменения клеточной функции (например, обеспечивая посредством этого благотворного действия на систему субъекта (например, включая, но не ограничиваясь этим, мышечно-скелетную систему, неврологическую систему, нервную систему, эндокринную систему, метаболическую систему и/или иммунную систему). В настоящем изобретении представлены также способы применения ЗСР отдельно или в комбинации с одним или несколькими другими активными агентами для лечения или предупреждения заболевания (например, роста рака и/или метастаза). В

- 8 030339

настоящем изобретении представлены также способы применения δΟΡ для улучшения здоровья животных (например, сельскохозяйственных животных). В некоторых вариантах реализации композиции настоящего изобретения используют для дополнения, улучшения и/или усиления целебной и/или питательной ценности пищевых продуктов (например, мяса, молочных продуктов, яиц и так далее). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлены композиции, включающие δΟΡ, и способы их применения в качестве терапевтических средств, пищевых добавок и/или для профилактического лечения (например, для общего здоровья, для укрепления иммунной системы, для нейродегенеративных заболеваний, для улучшения когнитивной функции, для лечения или профилактики рака, роста опухоли и/или метастаза и так далее), а также способы их получения, производства, очистки, выделения, экстракции и/или определения. В настоящем изобретении представлены также δΟΡ и способы применения δΟΡ для кормления животных и/или дополнения кормов для животных.

В настоящем изобретении представлены также растворимые композиции селена (например, δΟΡ) и способы их применения, получения и очистки. Например, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлены растворимые δΟΡ (смотри, например, примеры 1-2, в которых описано получение (например, выделение и определение) рН-зависимых фракций δΟΡ) и композиции, а также способы их введения (смотри, например, примеры 3-4). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлен селен (например, органический селен (например, рН-зависимая фракция δΟΡ δΕΡΡΕΕΧ или других обогащенных селеном дрожжей) в растворимой форме, который вводят субъекту различными способами (например, пероральным, локальным, внутривенным и так далее). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлена растворимая композиция селена (например, органического селена) с низким содержанием волокон. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлены композиции и способы для систем доставки растворимого органического селена (например, селеногликопротеины, инкапсулированные в полимеросому, нанокапсулы, полимеры и так далее).

Дрожжи (например, δαεεΙιαίΌΐηνεοδ сегеу1к1ае), выращенные в среде, содержащей селен (например, неорганический селен (например, селенит натрия Ща^еО₃))) метаболизируют селен (например, неорганический селен) и встраивают селен вместо серы в цистеин и метионин, в результате чего образуются белки, содержащие селеноаминокислоты (8еСук и δеΜеΐ) (Лет1гс1 е! а1., 1. Адпс. Роой СНет. 47, 24962500 (1999), Петита & Ρоте!!о. 1. Адгс. Роой СНет. 47, 2491-2495 (1999), Оиегйапе & Мек!ег. 1. Адпс. Роой СНет. 56, 11792-11799, (2008), каждый из которых включен в настоящий документ путем ссылки в полном объеме). Компания АЬЬТЕСН, 1пс. (Николасвилл, штат Кентукки, США) производит высушенные распылением обогащенные селеном дрожжи, продаваемые под названием δΕΡ-ΡΡΕΧ, в качестве кормовой и пищевой добавки, содержащей "органический селен" (смотри, например, КогНо1а е! а1., Кек. 18, 65-68, (1986), включен в настоящий документ путем ссылки в полном объеме). Минимальная концентрация селена в δΕΡ-ΡΡΕΧ составляет 1500 м.д, и белки являются единственным его носителем (смотри, например, διππί. №!йпдЬаш ипуегкйу Ριόκκ 2002, 234-236 (2002), Ке11у & Ρо\γе^. 1. Пану δθ. 78, 237-242 (1995), МсδЬееЬу е! а1., Апа1ук! 130, 35-37 (2005), включены в настоящий документ путем ссылки в полном объеме). В дрожжах существует две группы белков: белки, присутствующие внутри клеток дрожжей, и белки, связанные с маннаном клеточной оболочки дрожжей (смотри, например, δейтак, публикация заявки на патент США №: υδ 2006/0263415, включена в настоящий документ путем ссылки в полном объеме). Около 17,0 вес.% коммерческого δΕΡ-ΡΡΕΧ растворимо в воде, и этот материал содержит менее 6,5 общего селена, присутствующего в δΕΡ-ΡΡΕΧ. Исследования, выполненные при откорме цыплят, в которых в качестве источников селена использовали δΕΡ-ΡΡΕΧ и селенит натрия, показали, что δΕΡ-ΡΡΕΧ гораздо лучше переносит селен в грудную мышцу цыплят. Для перорального введения δΕΡΡΡΕΧ были открыты многочисленные биоактивные средства (смотри, например, Каутап. ТНе Ьапсе! 356, 233-241 (2000), МсКеп/1е Тгепйк ίη 1тшипо1оду 19, 342-345 (1998), Тар1его. Вютейюше & ΡЬа^тасоίЬе^ару 57, 134-144 (2003), СотЬк & Сгеу ΡЬа^тасо1. ТНег. 79, 179-192 (1998), С1агк е! а1., 1. Ат. Мей. Аккос. 276, 1957-1963 (1996), включены в настоящий документ путем ссылки в полном объеме).

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлено выделение и физическое и химическое определение растворимых селеногликопротеинов (δΟΡ) из дрожжей (например, δ;·ι^1ι;·ιΐΌтусек сегеу1К1ае), выращенных в среде, содержащей селен (например, неорганический селен (например, селенит натрия)), а также их активное участие в доставке "органического селена" в ткани (например, человека, животного, кур и так далее), путем кормления субъекта пищей (например, кормом), дополненной или иным образом содержащей ΟδΡ настоящего изобретения (смотри, например, примеры 1-4). В настоящем изобретении представлена направленная на ткани, внутривенная, пероральная и/или трансдермальная доставка активных, растворимых селеновых компонентов (например, рН-зависимых фракций δΟΡ обогащенных селеном дрожжей (например, δΕΡ-ΡΡΕΧ)). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлены системы доставки "органического селена" в форме медленного высвобождения (например, нанокапсулы, полимерные сферы и полимеросомы с инкапсулированными δΟΡ) (смотри, например, примеры 5-9). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлена композиция, включающая полимеросому с инкапсулированными δΟΡ. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлена усиленная доставка и улучшенное биораспределение δΟΡ

- 9 030339

путем инкапсулирования 8ОР внутри полимеросом на основе поли(этиленоксид)-блок-поли(екапролактон) (РЕО-Ь-РСЬ).

Описано выделение различных компонентов дрожжевых клеток путем экстракции клеточных оболочек из внутриклеточных компонентов дрожжевых клеток (смотри, например, О1сго с1 а1., ί. Скет. Теск. В1о1ескио1. 66, 67-71 (1996), включен в настоящий документ путем ссылки в полном объеме). Эти методики выделения не использовались для экстракции высушенных распылением селеносодержащих дрожжей. Стандартные, щелочные условия (рН 9,0-14,0), используемые в данной области техники при экстрации гликопротеинов из дрожжей (смотри, например, КоЬегде е1 а1., 1. Адпс. Роой Скет. 51, 4191-4197 (2003), включены в настоящий документ путем ссылки в полном объеме), оказались неудачными, поскольку заместители 8еН или 8еМе удалялись из аминокислот селеноцистина или селенометионина. Другими словами, заданные заместители разлагались, и в результате при попытке экстракции в щелочных условиях, использованных для экстракции дрожжей, содержащих селеногликопротеины, терялся селен, присутствовавший в исходных 8ОР (смотри, например, табл. 12 примера 8).

Соответственно в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлены композиции селеногликопротеинов (например, включающие рН-зависимую фракцию селеногликопротеинов, описанную в настоящем документе) и способы их применения. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлены способы получения, очистки, выделения, экстракции, выделения, осаждения и/или определения селеногликопротеинов (например, из обогащенных селеном дрожжей). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлены композиции и способы доставки растворимых композиций селена (например, 8ОР (например, рН-зависимых фракций 8ОР)) субъекту, включая композиции пищевых добавок (например, включающие 8ОР (например, фармацевтические средства, нутрицевтики, добавки, пищевые продукты и так далее)). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлены композиции и способы улучшенной доставки (например, прямой доставки, доставки с временным высвобождением и так далее) селена (например, 8ОР (например, полимеросом, нанокапсул, наночастиц, полимеров и так далее). Композиции и способы настоящего изобретения находят применение в различных областях, включая, но не ограничиваясь этим, диетическое (например, смешивание с кормом или для кормления животных иным способом), профилактическое, терапевтическое, а также исследовательское применения. Соответственно в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлены композиции кормов для животных (например, включающие 8ОР (например, растворимые 8ОР (например, растворимый органический селен))), способы производства композиций и способы обеспечения питания (например, включающего 8ОР (например, растворимый 8ОР (например, растворимый органический селен))) животным, включающие обеспечение животных такими композициями.

II. Экстракция, выделение, очистка и применение.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения растворимый селен получают в форме селеногликопротеинов (8ОР). В некоторых вариантах реализации 8ОР экстрагируют из общего источника селенопротеинов (например, обогащенных селеном дрожжей (например, 8ЕЬ-РЕЕХ)). В некоторых вариантах реализации экстракция и/или очистка 8ОР включает одну или несколько рН-зависимых этапов экстракции/осаждения (например, как описано в примерах 1 и 2). В некоторых вариантах реализации экстракция и/или очистка 8ОР включает одну или несколько рН-зависимых стадий фракционирования. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлена кислотная экстракция обогащенных селеном дрожжей (например, 8ЕЬ-РЕЕХ) для солюбилизации 8ОР (например, без денатурации и/или разрушения 8ОР). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения показано, что рНзависимое осаждение 8ОР из кислотного экстракта (например, как описано в примерах 1-2) дает увеличенное содержание селеногликопротеинов, пониженное содержание неусвояемых волокон и высокую концентрацию селена (например, концентрацию селена, Которая выше, чем присутствует в 8ЕЬ-РЕЕХ). Таким образом, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлены 8ОР, экстрагированные из обогащенных селеном дрожжей, в которых содержание селена в 8ОР выше, чем содержание селена в материале, из которого экстрагировали 8ОР (например, в вес./вес.%, м.д. и так далее). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлен селен в форме рН-зависимой фракции 8ОР (например, фракции рН 4,0 или рН 6,0) обогащенных селеном дрожжей (например, 8ЕЬ-РЕЕХ), которая демонстрирует такую же или очень похожую степень биодоступности при введении пациенту по сравнению с биодоступностью селена из исходного источника обогащенных селеном дрожжей (например, 8ЕЬ-РЕЕХ) (смотри, например, пример 3, табл. 5).

В некоторых вариантах реализации 8ОР экстрагируют из общего источника селенопротеинов (например, клеток обогащенных селеном дрожжей (например, 8ЕЬ-РЕЕХ)). В некоторых вариантах реализации часть селенопротеинов в источнике селенопротеина включает 8ОР (например, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10, 20, 50% или более 8ОР). В некоторых вариантах реализации источник селенопротеина включает клетки (например, дрожжевые клетки), которые были выращены в присутствии 8е-содержащей среды (например, 8е-обогащенной среды). В некоторых вариантах реализации 8е-содержащие клетки (например, дрожжевые клетки) подвергают экстракции, выделению и/или очистке селенопротеинов, в результате чего получают источник селенопротеина или обогащенную селенопротеином композицию (например,

- 10 030339

δΟΡ-обогащенную композицию). В некоторых вариантах реализации образец, включающий селенопротеины и δΟΡ, богат на δΟΡ.

В некоторых вариантах реализации источник селенопротеина или обогащенная селеном композиция (например, источник обогащенных селеном дрожжей (например, δΕΕ-ΡΕΕΧ)) подвергают одной или нескольким стадиям для получения выделенных, очищенных, разделенных и/или экстрагированных δΟΡ. В некоторых вариантах реализации источник селенопротеина смешан (например, в жидком носителе (например, воде, буфере, соли и так далее)) с образованием белковой суспензии, смеси, лизата и/или раствора. В некоторых вариантах реализации источник селенопротеина (например, источник обогащенных селеном дрожжей (например, δΕΕ-ΡΕΕΧ)) смешивают при высокой температуре (например, выше точки замерзания, выше комнатной температуры, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90°С или выше). В некоторых вариантах реализации источник селенопротеина (например, источник обогащенных селеном дрожжей (например, δΕΕ-ΡΕΕΧ)) смешивают при низких рН (например, в кислотных условиях (например, рН около 0,5, около 1,0, около 1,5, около 2,0, около 3,0, около 4,0, около 4,5, около 5,0, около 5,5, около 6,0 или около 6,5). В некоторых вариантах реализации источник селенопротеина (например, источник обогащенных селеном дрожжей (например, δΕΕ-ΡΕΕΧ)) смешивают осторожно, смешивают быстро, смешивают тщательно, смешивают энергично и так далее. В некоторых вариантах реализации источник селенопротеина (например, источник обогащенных селеном дрожжей (например, δΕΕ-ΡΕΕΧ)) смешивают при низком рН (например, в кислотных условиях (например, рН около 0,5, около 1,0, около 1,5, около 2,0, около 3,0, около 4,0, около 4,5, около 5,0, около 5,5, около 6,0 или около 6,5) и высокой температуре (например, выше точки замерзания, выше комнатной температуры, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90°С или выше)). В некоторых вариантах реализации рН смеси поддерживают добавлением кислоты или основания.

В некоторых вариантах реализации селенопротеинсодержащую смесь центрифугируют для выделения жидкой/растворимой и твердой/нерастворимой фаз. В некоторых вариантах реализации скорость центрифуги выбирают так, чтобы она была достаточной для разделения указанных фаз. В некоторых вариантах реализации жидкая фаза включает растворимые δΟΡ. В некоторых вариантах реализации рН жидкой фазы доводят (например, повышают) для осаждения части δΟΡ. В некоторых вариантах реализации выполняют повышение рН жидкой фазы, от слабого до умеренного (например, рН повышают примерно на 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0) для осаждения δΟΡ, которые были растворимыми при исходном рН, но не при повышенном рН. В некоторых вариантах реализации рН жидкой фазы повышают существенно (например, рН повышают примерно на 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0) для осаждения большой части δΟΡ, которые были растворимы при исходном рН. В некоторых вариантах реализации селеногликопротеины осаждают и выделяют из жидкой фазы при различных рН условиях для получения нескольких рН-зависимых фракций растворимых селеногликопротеинов. Например, в некоторых вариантах реализации одну жидкую фазу, включающую экстракт обогащенных селеном дрожжей, растворимый при кислотных условиях, используют для получения первой фракции растворимых селеногликопротеинов, осажденных при первом рН (например, рН 1,85), второй фракции растворимых селеногликопротеинов, осажденных при втором рН (например, рН 3,0), третьей фракции растворимых селеногликопротеинов, осажденной при третьем рН (например, рН 4,0) и четвертой фракции растворимых селеногликопротеинов, осажденной при четвертом рН (например, рН 6,0). В некоторых вариантах реализации осаждение селеногликопротеинов из жидкой фазы за счет повышения рН жидкой фазы включает несколько последовательных рНзависимых реакций осаждения жидкой фазы.

В некоторых вариантах реализации осажденные δΟΡ выделяют из жидкой фракции с отрегулированным рН путем центрифугирования (например, при достаточной скорости для получения отдельно жидкой и твердой фаз). В некоторых вариантах реализации δΟΡ, которые были выделены из жидкой фазы, высушивают замораживанием для получения твердой фракции δΟΡ. В некоторых вариантах реализации процесс повышения рН жидкой фазы и центрифугирования для выделения фракции δΟΡ повторяют для получения фракций δΟΡ с различной растворимостью (например, растворимые ниже рН 1,5, растворимые ниже рН 2, растворимые ниже рН 3, растворимые ниже рН 4, растворимые ниже рН 5, растворимые ниже рН 6 и так далее). В некоторых вариантах реализации выполняют одну стадию регулировки рН и центрифугирования для получения одной фракции, содержащей δΟΡ заданной растворимости (например, растворимой ниже рН 1,5, растворимой ниже рН 2, растворимой ниже рН 3, растворимой ниже рН 4, растворимой ниже рН 5, растворимой ниже рН 6 и так далее). В некоторых вариантах реализации жидкая фаза, которая остается после удаления последней фракции δΟΡ, находит применение в качестве компонента питательной среды для клеток, используемых для дальнейшей выработки селенопротеинов или δΟΡ. В некоторых вариантах реализации композиция, включающая растворимые селеногликопротеины, содержит только одну, рН-зависимую фракцию селеногликопротеинов (например, растворимые селеногликопротеины из жидкой фазы, включающей экстракт обогащенных селеном дрожжей, растворимый при кислотных условиях, осажденный при рН 4,0). В некоторых вариантах реализации композиции, включающая растворимые селеногликопротеины, содержат две или более рН-зависимые фракции селеногликопротеинов (например, растворимых селеногликопротеинов из жидкой фазы, включающей экстракт обогащенных селеном дрожжей, растворимый при кислотных условиях, осажденный при двух или более различных значениях рН).

- 11 030339

В предпочтительных вариантах процесс экстракции δΟΡ из источника селенопротеина (например, обогащенных селеном дрожжей (например, δΕΕ-РЬЕХ)) и ρΗ-зависимого фракционирования смеси δΟΡ (смотри, например, фиг. 2 и 3) включает две стадии (смотри, например, примеры 1-2, фиг. 1 и 2). На первой стадии суспензию обогащенных селеном дрожжей в 0,3н. НС1 (ρΗ 1,5) перемешивают и нагревают при 80°С в течение 8 ч. рН смеси поддерживают при рН 1,5 добавлением концентрированной НС1 в течение первого часа экстракции. Через 8 ч смесь центрифугируют, а жидкую фазу отделяют. рН раствор доводят до 1,85 добавлением 2,0н. ЫаОН, и δΟΡ, которые имеют ограниченную растворимость при этом рН, осаждают из раствора и отделяют от жидкости (рН 1,85) вторым центрифугированием, а затем высушивают замораживанием для получения твердой фракции δΟΡ с рН 1,85. В некоторых вариантах реализации жидкие вещества (рН 1,85) смешивают с твердыми веществами (рН 1,5) из первого центрифугирования, что приводит к изменению рН смеси до рН 1,6. Большая часть δΟΡ, растворимых при рН 1,6, переходит в жидкую фазу, без увеличения объема сточного потока, образованного на этой стадии процесса. Большая часть побочного продукта из этой стадии процесса представляет собой твердые вещества из второго центрифугирования. Поток твердых отходов состоит примерно из 56,5 вес.% обогащенных селеном дрожжей, взятых для экстрации, и содержит ценный материал клеточных оболочек селеносодержащих дрожжей, содержащий: 38,91% белка и 2477 м.д. селена. В некоторых вариантах реализации эти твердые вещества утилизируют (например, отдельно или в комбинации с другим материалом (например, обогащенными селеном дрожжами)) в качестве экологичной питательной добавки в кормах для животных. На второй стадии (смотри, например, фиг. 3) жидкую фазу (рН 1,6) из второго центрифугирования (смотри фиг. 2) переносят в смеситель и доводят рН до 3,0 добавлением 2,0н. ЫаОН, и δΟΡ, которые имеют ограниченную растворимость при этом рН, осаждают из раствора и выделяют из жидкости (рН 3,0) третьим центрифугированием и, наконец, высушивают замораживанием для получения твердой фракции δΟΡ с рН 3,0 (смотри, например, примеры 1, 2 и фиг. 2 и 3). Жидкую фазу (рН 3,0) из третьего центрифугирования переносят в смеситель и доводят рН до 4,0 добавлением 2,0н. ЫаОН, и δΟΡ, которые имеют ограниченную растворимость при этом рН, осаждают из раствора и выделяют из жидкости (рН 4,0) четвертым центрифугированием и, наконец, высушивают замораживанием для получения твердой фракции δΟΡ с рН 4,0. Жидкую фазу (рН 4,0) из четвертого центрифугирования переносят в смеситель и доводят рН до 6,0 добавлением 2, н. ЫаОН, и δΟΡ, которые имеют ограниченную растворимость при этом рН, осаждают из раствора и выделяют из жидкости (рН 6,0) пятым центрифугированием, а затем высушивают замораживанием для получения твердой фракции δΟΡ с рН 6,0. Единственный сточный поток, образованный на второй стадии процесса, представляет собой поток сточной воды, содержащий 13,4 вес.% твердых веществ (по сравнению с весом обогащенных селеном дрожжей, использованных в экстракции), из которых белковая фракция составляет около 13,3 вес.%, хлорид натрия 3,6 вес.%, а монои олигосахариды глюкозы и маннозы составляют около 80 вес.%. Этот поток "сточной воды" с рН 6,0 и концентрацией селена 242 м.д. может быть возвращен в цикл или повторно использован иным образом для получения новой партии селеносодержащих дрожжей (например, может быть использован в питательной среде).

В некоторых вариантах реализации δΟΡ, осажденный при рН 4,0, демонстрирует более высокую доставку селена (например, в мышечную ткань) по сравнению с обогащенными селеном дрожжами (например, δΕΕ-ΡΕΕΧ), и гораздо более высокую доставку по сравнению с неорганическими формами селена (например, селенитом натрия) (смотри, например, пример 3). Кроме того, рН-зависимые фракции селеногликопротеинов (например, рН 6,0) отличаются по составу от обогащенных селеном дрожжей (например, δΕΕ-ΡΕΕΧ) и обеспечивают возможность доставки аналогичных количеств селена при расходе гораздо меньшего количества исходного материала (например, обогащенных селеном дрожжей).

В некоторых вариантах реализации процедура экстракции δΟΡ включает 4 или менее стадий регулировки рН и центрифугирования описанной выше процедуры (например, 1 стадия регулировки рН и центрифугирования, 2 стадии регулировки рН и центрифугирования, 3 стадии регулировки рН и центрифугирования, 4 стадии регулировки рН и центрифугирования).

III. Корм для животных.

"Корм для животных" относится к любой пище, используемой для кормления одомашненных животных (например, крупнорогатого скота, коз, овец, лошадей, домашних птиц, буйволов, альпаков, лам, ослов, мулов, кроликов, кур, гусей, индеек или свиней). Корм для животных зачастую включает сено, солому, силос, прессованные и гранулированные корма, масла и смешанные корма, а также пророщенные зерна и бобовые. В 2006 г. во всем мире в отрасли животноводства было расходовало 635 млн т кормов, а скорость ежегодного прироста составляет около 2%. Использование сельскохозяйственных угодий для выращивания кормов, а не пищевых продуктов для человека может быть спорным; некоторые виды кормов, такие как кукуруза (маис) могут служить в качестве пищи для людей, тогда как другие, такие как трава - не могут. Для обеспечения животных источником энергии, в кормах для животных присутствуют также пищевые добавки (например, селен), которые используются организмом.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлены пищевые композиции (например, композиции растворимого селена (например, δΟΡ), которые позволяют создавать композиции животных кормов, включающие селен (например, повышенные концентрации селена по сравнению со

- 12 030339

стандартными кормовыми композициями (например, растворимого селена)), который снижает общие затраты, повышает превращение пищи и сохраняет и/или улучшает качество продуктов животноводства (например, мяса, яиц, молочных продуктов и тому подобных), полученных из сельскохозяйственных животных, получающих их, по сравнению с обычными животными кормами.

Например, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлена композиция пищевой добавки, включающая §ОР, которая может быть смешана и/или включена в корм для животных и может вводиться (например, скармливаться) животному для обеспечения такого же или улучшенного эффекта на показатели роста животного (например, по сравнению с животными кормами с другими формами дополняющего селена (например, обогащенных селеном дрожжей (например, δΕΡ-РЬЕХ)). В некоторых вариантах реализации композиция пищевой добавки настоящего изобретения увеличивает количество циркулирующего селена (например, находящегося в крови и/или сыворотке) в организме субъекта (например, человека или животного), принимающего указанную композицию. В некоторых вариантах реализации биодоступной является более высокая доля введенного селена в растворимых композициях селена настоящего изобретения (например, δΟΡ), чем в других селеновых композициях (например, селените натрия или обогащенных селеном дрожжах (например, δΕΕ-РЬЕХ)). То есть в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлены композиции, включающие селеногликопротеины, которые содержат более высокую долю и/или часть селена, которая является доступной (например, биодоступной) для субъекта по сравнению с другими формами селена (например, обогащенными селеном дрожжами), что обозначает, что необходимы меньшие количества композиции, включающей селеногликопротеин настоящего изобретения (например, для получения таких же количеств биодоступности). В некоторых вариантах реализации композиция пищевой добавки настоящего изобретения (например, включающая δΟΡ настоящего изобретения) повышает количество селена (например, находящегося в мышцах или другой ткани) в организме пациента (например, человека или животного, принимающего указанную композицию. В некоторых вариантах реализации введение δΟΡ и/или растворимого селена приводит к увеличенной биодоступности селена в сыворотке, жировой ткани, мышечной ткани и так далее.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлен способ повышения эффективности, с которой животное использует питательные вещества в корме для животного, включающий обеспечение животного питанием, включающим композицию пищевой добавки настоящего изобретения, причем указанная дополняющая композиция усиливает способность животного перерабатывать и использовать питательные вещества, присутствующие в корме. В некоторых вариантах реализации композиция пищевой добавки настоящего изобретения увеличивает количество циркулирующих антиоксидантов (например, селена, находящегося в крови и/или сыворотке) в организме субъекта, принимающего указанную композицию. В некоторых вариантах реализации композиция пищевой добавки настоящего изобретения увеличивает количество антиоксидантов (например, селена, находящегося в жировой ткани, мышцах и так далее) в организме субъекта, принимающего указанную композицию.

IV. Фармацевтические средства, нутрицевтики и добавки.

Пищевые уровни селена установлены Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (ΡΌΛ) (смотри Свод Федеральных правил, 21, 101.9(с)(8)(щ), январь 1994 г.). Люди и животные могут безопасно метаболизировать ограниченные количества неорганических и органических форм селена и могут превращать неметилированный селен в моно- или ди-, или триметилированные производные, из которых монометилированные производные являются наиболее токсичными (смотри, например, ВеФтак Κ.δ., ек а1., МеФса1 НурокНекек, 41 (2): 150-159 (август 1993 г.)). ΡΌΆ адаптировало ориентировочные нормы дневного потребления (ΚΗΙ) на уровне 70 микрограмм селена для кормящих женщин и ΚΗΙ 55 микрограмм для не кормящих взрослых. Доза селена в 600 мкг в день описана как безопасная (смотри, например, Ретк О.М. Ь1оуД, е( а1., Арр. С1ш. ВюсНепт 26:83-88 (1989). Примерно при этой дозе нормальная активность фермента глутатион-редуктазы безопасно превращает селеноглутатион в селенид водорода в печени и эритроцитах, который полностью выводится из организма. Следовательно, при таких низких дозах организм способен безопасно метаболизировать и выводить селен, присутствующий в форме свободного металла. Однако, как и для многих следовых элементов (например, селена), при более высоких уровнях или концентрациях дозы благотворный эффект аннулируется и возникает опасная токсичность (смотри, например, Ритпапи, С. е( а1., 1пкегпа1'1 1. о£ ОЬекНу апб Ре1а1еб МекаЬ. ϋΐδ, 19(7):458-463 (1995)).

Введение селена в природной форме затрагивает научный и медицинский компромисс, поскольку при введении относительно низких концентраций селен обеспечивает благотворное действие на здоровье, однако при высоких концентрациях селен демонстрирует чрезвычайную токсичность, так что потенциальная польза для здоровья теряется, и основным вопросом становится токсичность.

Как описано выше, в настоящем изобретении представлены некоторые формы селена (например, δΟΡ, водорастворимый селен), которые обеспечивают благотворное действие на субъекта. Данные показали, что органические формы селена (например, селенометионин и обогащенные селеном дрожжи) могут быть менее токсичными и лучше абсорбируются, чем неорганические формы (смотри, например, МаНап, Ртосеебшдк о£ (Не 15(Н Аппиа1 δутрок^ит ЫоккшдНат ИпщеткНу Ргекк, Ноттингем, Великобрита- 13 030339

ния, с. 523-535 (1999). Несмотря на это в некоторых вариантах реализации используются многие формы селена в комбинации друг с другом (например, для обеспечения благотворного влияния на здоровье субъекта). Природные источники селена включают, но не ограничиваясь этим, обогащенные селеном (например, селенизированные) дрожжи. Используемый штамм дрожжей не является ограничивающим.

В некоторых предпочтительных вариантах настоящего изобретения §ОР (например, полученные из обогащенных селеном дрожжей (например, 8ЕЬ-РЬЕХ), как описано в примерах 1-2) являются предпочтительной формой селена для препаратов и композиций настоящего изобретения. В некоторых вариантах реализации композиции, включающие водорастворимый селен и/или δΟΡ, обеспечивают более биологически доступную форму селена по сравнению с другими формами селена. Однако другие формы селена также могут находить применение в настоящем изобретении, включая производные или модификации водорастворимого селена и/или δΟΡ, δΕΕ-РЬЕХ или других форм обогащенных селеном дрожжей, селенометионина, селеноцистеина, селенитных соединений, селенатных соединений или их производных, солей или модификаций. Так, в некоторых предпочтительных вариантах каждая из этих форм селена может быть использована в качестве компонента композиции. Альтернативно, каждая из описанных выше форм селена может быть связана (например, химически или физически) с лекарством или терапевтическим средством с образованием селеносодержащего производного лекарства. Кроме того, композиции и препараты не ограничиваются одной формой селена. Действительно, композиция или препарат может включать несколько форм селена (например, δΟΡ и δΕΕ-РЬЕХ или селенит натрия и водорастворимый селен).

Другие формы селена, которые находят применение в различных вариантах реализации настоящего изобретения, описаны в патентах США №№ 6911550, 6197295, 5221545, 6 и 6576233, и заявках на патент США №№ 20010043925, 20050069594, 20050089530 и 20080107755, которые включены в настоящий документ путем ссылки в полном объеме.

Соответственно в настоящем изобретении представлены композиции фармацевтических средств, нутрицевтиков и/или добавок (например, пищевые и/или диетические композиции или лекарственные средства), которые включают одну или несколько форм селена (например, δΟΡ, растворимый селен (например, водорастворимый селен) и так далее), самостоятельно или в комбинации по меньшей мере с одним другим средством, таким как стабилизатор, другое терапевтическое средство(а), питательное вещество(а) и/или минералы; и могут быть введены в любом стерильном, биосовместимом носителе, включая, но не ограничиваясь этим, солевой раствор, буферный солевой раствор, декстрозу, воду и так далее.

Способы настоящего изобретения находят применение при лечении (например, профилактически или терапевтически) заболеваний (например, нейродегенеративных заболеваний, рака и так далее) или измененных физиологических состояний. Селен (например, растворимый селен (например, водорастворимый селен), δΟΡ))) может быть введен субъекту (например, пациенту) внутривенно в фармацевтически приемлемом носителе, таком как физиологический солевой раствор. Могут быть использованы стандартные способы внутриклеточной доставки (например, доставка через липосомы). Такие способы хорошо известны специалистам в данной области. Композиции настоящего изобретения применимы для парентерального введения, такого как внутривенное, подкожное, внутримышечное и внутрибрюшинное. В некоторых вариантах реализации композиции (например, δΟΡ и/или фармацевтические композиции, содержащие их) вводят перорально.

Как хорошо известно в области медицины, дозы для любого субъекта могут зависеть от многих факторов, включая размер пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное соединение, подлежащее введению, пол, время и способ введения, общее состояние здоровья и взаимодействие с другими лекарствами, которые вводят параллельно.

Соответственно в некоторых вариантах реализации композиции и/или препараты, содержащие селен (например, растворимый селен (например, водорастворимый селен), δΟΡ и так далее) вводят субъекту самостоятельно или в комбинации с другими формами селена, лекарствами, низкомолекулярными соединениями, или в фармацевтических композициях, где он смешан с формообразующим средством(ами) или другими фармацевтически приемлемыми носителями. В некоторых вариантах реализации фармацевтически приемлемым носителем является фармацевтически инертный носитель. В других вариантах реализации композиции, включающие селен (например, растворимый селен (например, водорастворимый селен), δΟΡ и так далее) отдельно самостоятельно конкретным субъектам, страдающим от заболевания или состояния. В других вариантах реализации настоящего изобретения композиции, включающие селен (например, растворимый селен (например, водорастворимый селен), δΟΡ и так далее) вводят самостоятельно конкретным субъектам для улучшения общего состояния здоровья или здоровья какой-либо системы организма. Композиции, включающие селен (например, растворимый селен (например, водорастворимый селен), δΟΡ и так далее) самостоятельно или в комбинации с одной или несколькими другими формами селена могут быть добавлены в питье или пищу (например, ЕИЬиРЕ, РОУЕРВАР и тому подобные), поливитаминные, питательные продукты, пищу и так далее для ежедневного потребления.

В зависимости от цели, которую необходимо изменить при лечении (например, генная экспрессия, связанная со старением, и/или регуляция генной экспрессии, связанной с раком и/или ростом опухоли

- 14 030339

или метастазом), эти композиции фармацевтических средство, добавок и/или нутрицевтиков составляют и вводят системно или локально. Методики составления и введения композиции можно найти в последнем издании "РсттдЮп'х Ркагтасеикса1 Зшеисек" (Маск РиЫЫипд Со, ЕаЧоп Ра.). Соответствующие способы могут включать, например, пероральное или трансмукозальное введение; а также парентеральную доставку, включая внутримышечное, подкожное, интрамедуллярное, интратекальное, внутрижелудочковое, внутривенное, внутрибрюшинное или интраназальное введение.

Для инъекций композиции, содержащие селен (например, растворимый селен (например, водорастворимый селен), §ОР и так далее), готовят в виде водных растворов, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнкса, раствор Рингера или физиологический буферный солевой раствор. Для тканевого или клеточного введения в композиции используют пенетранты, соответствующие конкретному барьеру, через который происходит проникновение. Такие пенетранты общеизвестны в данной области техники.

В других вариантах реализации композиции, содержащие селен (например, растворимый селен (например, водорастворимый селен), §ОР и так далее), готовят с использованием фармацевтически приемлемых носителей, хорошо известных в данной области, в дозах, применимых для перорального введения. Такие носители обеспечивают возможность составлять композиции, содержащие селен (например, растворимый селен (например, водорастворимый селен), §ОР и так далее) в виде таблеток, пилюль, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и тому подобного, для перорального или назального поглощения пациентом, подлежащим лечению.

Фармацевтические композиции, пригодные дли использования в настоящем изобретении, включают композиции, в которых активные ингредиенты (например, композиции, содержащие селен (например, растворимый селен (например, водорастворимый селен), §ОР и так далее) содержатся в эффективном количестве для достижения заданной цели. Например, эффективное количество фармацевтического средства может быть таким, чтобы изменять экспрессию определенного гена (например, КТЬО, ОКВ2, ΩΝΑΤ3. ТОРВ1, МАРК8, С1К, ИВЕ4А, §МРХ, И8Р22 и/или РТР4А1). Определение эффективных количеств находится в рамках возможностей специалиста в данной области.

В настоящем изобретении представлены также рН-зависимые 8ОР и композиции, включающие их, для применения для профилактического и/или терапевтического лечения рака (например, для предупреждения или замедления прогрессирования рака/опухоли и/или метастаза). Например, в предпочтительном варианте рН-зависимую фракцию 8ОР обогащенных селеном дрожжей (например, §ЕЬ-РЬЕХ) вводят субъекту для регуляции экспрессии (например, заданным образом) гена, связанного с ростом рака и/или метастаза). Как описано в настоящем документе, было установлено, что некоторые растворимые фракции §ОР обладают биологическими свойствами (например, способностью регулировать генную экспрессию), которыми не обладает исходный материал, из которого была получена растворимая фракция §ОР (например, обогащенные селеном дрожжи (например, §ЕЬ-РЬЕХ)) (смотри, например, пример 4 и фиг. 7-11). В предпочтительном варианте реализации рН-зависимая фракция §ОР обогащенных селеном дрожжей (например, §ЕЬ-РЬЕХ) является рН 4,0 зависимой фракцией, хотя другие фракции (например, рН 3,0, рН 6,0 и так далее) также находят применение в композициях и способах настоящего изобретения.

Помимо активных ингредиентов эти содержащие селен (например, растворимый селен (например, водорастворимый селен), §ОР и так далее) фармацевтические композиции могут содержать соответствующие фармацевтически приемлемые носители, включающие формообразующие средства и вспомогательные вещества, которые облегчают переработку активных соединений в препараты, которые могут быть использованы фармацевтически. Препараты, составленные в композиции для перорального введения, могут быть в форме таблеток, драже, капсул или растворов.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут выпускаться по известным способам (например, традиционными процессами смешивания, растворения, гранулирования, получения драже, растирания в порошок, эмульгирования, инкапсуляции, включения в какой-либо носитель или лиофилизации).

Фармацевтически композиции для парентерального введения включают водные растворы активных соединений в водорастворимой форме. Кроме того, суспензии активных соединений могут быть получены как соответствующие маслянистые суспензии для инъекции. Соответствующие липофильные растворители или жидкие носители включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или сложные эфиры синтетических жирных кислот, такие как этилолеат, или триглицериды, или липосомы. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, сорбит или декстран. Необязательно, суспензия может также содержать соответствующие стабилизаторы или агенты, которые увеличивают растворимость соединений для обеспечения возможности получения высококонцентрированных растворов.

Фармацевтические препараты для перорального применеия могут быть получены смешиванием активных соединений с твердым формообразующим средством, необязательным измельчением полученной смеси, и переработки этой смеси в гранулы, после добавления, при необходимости, соответствующих вспомогательных веществ, для получения таблеток или ядер драже. Соответствующими формообразую- 15 030339

щими средствами являются углеводные или белковые наполнители, такие как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; крахмал из кукурузы, пшеницы, риса, картофеля и так далее; целлюлоза, такая как метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза или натрия карбоксиметилцеллюлоза; и смолы, включая гуммиарабик и трагакант; а также белки, такие как желатин и коллаген. При необходимости могут быть добавлены средства для улучшения распадаемости таблеток или солюбилизаторы, такие как поперечно сшитый поливинилпирролидон, агар, альгиновая кислота или их соли, такие как альгинат натрия.

Ядра драже снабжают соответствующими покрытиями, такими как концентрированные растворы сахара, которые могут также содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, карбопол гель, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, растворы глазури и соответствующие органические растворители или смеси растворителей. К покрытиям таблеток или драже могут быть добавлены красители или пигменты для идентификации продукта или для определения количества активного соединения (то есть дозы).

Фармацевтические препараты, которые могут быть использованы перорально, включают твердые и мягкие капсулы из желатина, герметичные капсулы из желатина и покрытия, такого как глицерин или сорбит. Твердые капсулы могут содержать активные ингредиенты, смешанные с наполнителем или связующими веществами, такими как лактоза или крахмалы, смазывающими веществами, такими как тальк или стеарат магния, и, необязательно, стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или суспендированы в соответствующих жидкостях, таких как жирные кислоты, жидкий парафин или жидкий полиэтиленгликоль со стабилизаторами или без них.

Композиции, включающие соединение настоящего изобретения, смешанное с фармацевтически приемлемым носителем, могут быть приготовлены, помещены в соответствующий контейнер и маркированы для лечения указанного состояния. Для композиций или препаратов, включающих селен, состояния, указанные на этикетке, могут включать лечение состояния, связанного с профилактическим или терапевтическим лечением заболевания или состояния (например, рака, нейродегенеративного заболевания и/или когнитивной функции).

Фармацевтическая композиция может быть представлена в виде соли и может быть образована со многими кислотами, включая, но не ограничиваясь этим, хлороводородную, серную, уксусную, молочную, винную, яблочную, янтарную и так далее. Соли имеют склонность быть более растворимыми в водных или других протонных растворителях, чем соответствующие формы свободного основания. В других случаях предпочтительный препарат может быть лиофилизированным порошком в 1-50 мМ гистидине, 0,1-2% сахарозе, 2-7% манните в диапазоне рН от 4,5 до 5,5, который смешивают с буфером перед применением.

Для любого соединения, используемого в способах настоящего изобретения, терапевтически эффективная доза может быть первоначально определена из анализов в клеточных культурах. Затем предпочтительно доза может быть подобрана в моделях на животных (в частности, в мышиных моделях) для достижения заданного диапазона циркулирующей концентрации.

Терапевтически эффективная доза относится к такому количеству, которое улучшает или предотвращает симптомы стадии заболевания или состояния (например, путем изменения генной экспрессии). Токсичность и терапевтическая эффективность таких соединений может быть определена стандартными фармацевтическими процедурами в клеточных культурах или экспериментальных животных, например, для определения ЬБ₅₀ (дозы, летальной для 50% популяции) и ЕБ₅₀ (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Соотношение доз между токсическим и терапевтическим эффектом является терапевтическим индексом, и он может быть выражен как отношение ЕБ5₀/ЕБ₅₀. Соединения, которые демонстрируют высокие терапевтические индексы, являются предпочтительными. Данные, полученные из этих анализов в клеточных культурах и дополнительных исследованиях на животных, могут быть использованы для подбора диапазона доз для применения у людей. Доза таких соединений предпочтительно лежит в диапазоне циркулирующих концентраций, который включает ЕБ₅₀ с небольшой токсичностью или без нее. Доза варьируется в пределах этого диапазона в зависимости используемой лекарственной формы, восприимчивости пациента и способа введения.

Точная доза может быть выбрана субъектом или лечащим врачом с учетом пациента, подлежащего лечению. Дозы и введение регулируются для обеспечения достаточных уровней активных частиц или для поддержания заданного эффекта (например, изменения генной экспрессии у субъекта). Дополнительные факторы, которые могут быть приняты во внимание, включают степень болезненного состояния; возраст, вес и пол пациента; питание, время и частоту введения, комбинацию(и) лекарств, восприимчивость и переносимость/реакцию на терапию. Фармацевтические композиции продолжительного действия следует вводить каждые 3-4 дня, один раз в неделю или один раз в две недели, или один раз в месяц, в зависимости от периода полувыведения и скорости выведения из организма конкретной композиции.

В некоторых вариантах реализации селен (например, растворимый селен, водорастворимый селен, 8СР и так далее) вводят в дневной дозе от 25 до 600 мкг в день (например, растворимый селен, водорастворимый селен и/или 8СР вводят субъекту таким образом, чтобы обеспечивать пациенту от 25 до 600 мкг селена каждый день). В предпочтительных вариантах реализации селен вводят в дневной дозе от 50

- 16 030339

до 200 мкг в день. В других предпочтительных вариантах реализации селен вводят в дневной дозе от 100 до 200 мкг в день. Могут быть использованы дозы за пределами 25 м 600 мкг. В некоторых вариантах реализации однократную дозу селена (например, растворимого селена, водорастворимого селена, 8СР и так далее) вводят один раз в день. В других вариантах реализации каждый день может быть введено 2, 3, 4 или более доз (например, один раз утром и один раз вечером, или один раз каждые 4-6 ч). Например, в некоторых вариантах реализации селен (например, растворимый селен, водорастворимый селен, 8СР) водят субъекту тремя отдельными, более чем тремя отдельными, двумя отдельными или менее, чем двумя отдельными дозами. В некоторых предпочтительных вариантах реализации дневную дозу вводят в капсуле с временным высвобождением. В некоторых предпочтительных вариантах реализации дневная доза составляет 25-75 мкг селена (например, растворимого селена, водорастворимого селена, 8СР и так далее). В других предпочтительных вариантах реализации дневная доза составляет 200 мкг селена (например, органического селена, селеносодержащих дрожжей, 8ЕЕ-РЬЕХ, растворимого селена, водорастворимого селена, 8ОР и так далее).

Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть введены многими способами в зависимости от того, необходимо ли локальное или системное лечение, а также от области, подлежащей лечению. Введение может быть локальным (включая офтальмическое и введение в слизистые оболочки, включая вагинальную и ректальную доставку), легочным (например, путем ингаляции или инсуфляции порошков или аэрозолей, включая введение при помощи распылителя; интратекальным, интраназальным, эпидермальным и трансдермальным), пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию; или внутричерепным, например, интратекальным или внутрижелудочковым введением. Композиции и препараты, включающие селен, предположительно являются особенно применимыми для перорального введения.

Селеносодержащие (например, 8ОР-содержащие) композиции фармацевтических средств, нутрицевтиков и/или добавок для локального введения могут включать трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Могут быть необходимы или желательны стандартные фармацевтические носители, водные, порошковые или масляные основы, загустители и тому подобные.

Композиции и препараты для перорального введения включают порошки или гранулы, суспензии или растворы в воде или неводной среде, капсулы, саше или таблетки. Могут быть желательны загустители, ароматизаторы, разбавители, эмульгаторы, диспергаторы или связующие вещества.

Композиции и препараты для парентерального, интратекального или внутрижелудочкового введения могут включать стерильные водные растворы, которые могут содержать также буферы, разбавители или другие соответствующие добавки, такие как, но не ограничиваясь этим, усилители проницаемости, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители или формообразующие средства.

Так, в накоторых вариантах реализации композиции фармацевтических средств, нутрицевтиков и/или добавок настоящего изобретения включают, но не ограничиваясь этим, растворы, эмульсии и липосома-содержащие композиции. Эти композиции могут быть получены из различных компонентов, которые включают, но не ограничиваясь этим, заготовленные жидкости, самоэмульгирующиеся твердые вещества и самоэмульгирующиеся полутвердые вещества.

Композиции фармацевтических средств, нутрицевтиков и/или добавок настоящего изобретения, которые могут быть для удобства представлены в единичной лекарственной форме, могут быть получены в соответствии со стандартными методиками, хорошо известными в фармацевтической промышленности. Такие методики включают стадию смешивания активных ингредиентов с фармацевтическим носителем(ями) или формообразующим средством(ами). Как правило, такие композиции готовят равномерным и тщательным смешиванием активных ингредиентов с жидкими носителями или тонко измельченными твердыми носителями, или с ними обоими, а затем, при необходимости, формованием продукта.

В некоторых вариантах реализации содержащие селен (например, растворимый селен, водорастворимый селен, 8ОР) композиции настоящего изобретения могут быть приготовлены в виде любой из многочисленных возможных лекарственных форм, таких как, но не ограничиваясь этим, таблетки, капсулы, жидкие сиропы, мягкие гели, суппозитории и клизмы. Композиции настоящего изобретения могут быть приготовлены также в виде наночастиц (например, нанокапсулы), пузырьков, липосом, полимеров (например, молекулярно фиксированные полимеры (М1Р), биоразлагаемых полимеров с медленным высобождением, поликатионных полимеров с временным высвобождением и так далее. Композиции настоящего изобретения могут быть представлены в виде суспензий в водных, неводных или смешанных средах. Водные суспензии могут дополнительно содержать вещества, увеличивающие вязкость суспензии, включая, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбит и/или декстран. Суспензия может также содержать стабилизаторы. В одном варианте реализации настоящего изобретения композиции фармацевтических средств/или добавок могут быть приготовлены и использоваться в виде пен. Пены включают такие композиции как, но не ограничиваясь этим, эмульсии, микроэмульсии, кремы, желе и липосомы. Хотя эти композиции в основном близки по природе, они отличаются по составу и консистенции конечного продукта.

- 17 030339

Содержащие селен (например, растворимый селен, водорастворимый селен, §ОР и так далее) композиции настоящего изобретения могут дополнительно содержать вспомогательные компоненты, обычно содержащиеся в фармацевтических композициях. Так, например, композиции могут содержать дополнительные, совместимые, биологически активные материалы, такие как, например, противозудные средства, вяжущие средства, местные анестетики или противовоспалительные средства, или могут содержать дополнительные материалы, применимые при физическом смешивании различных лекарственных форм композиций настоящего изобретения, такие как красители, ароматизаторы, консерванты, антиоксиданты, замутнители, загустители и стабилизаторы. Однако при добавлении такие материалы не должны чрезмерно препятствовать биологической активности компонентов или композиций настоящего изобретения. Композиции могут быть стерилизованы и, при необходимости, смешаны со вспомогательными агентами, например, смазывающими добавками, консервантами, стабилизаторами, увлажняющими средствами, эмульгаторами, солями для изменения осмотического давления, буферами, красителями, вкусовыми добавками и/или ароматическими веществами и тому подобными, которые не проявляют неблагоприятного взаимодействия с нуклеиновой кислотой(ами) композиции.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлены композиции фармацевтических средств, нутрицевтиков и/или добавок, содержащие (а) одну или несколько форм селена (например, 8ОР (например, ρΗ-зависимую фракцию 8ОР), растворимый селен, водорастворимый селен, §ЕЬ-РЬЕХ) и (Ь) один или несколько других агентов (например, питательное вещество, минерал, терапевтическое средство и так далее).

В настоящее изобретение входят также способы, включающие совместное введение соединений, включающих селен (например, растворимый селен, водорастворимый селен, 8ОР), описанных в настоящем документе, с одним или несколькими дополнительными активными агентами (например, терапевтическим средством (например, терапевтическим средством для лечения рака, терапевтическим средством для лечения болезни Альцгеймера), антиоксидантом и так далее). Действительно, в следующем аспекте настоящего изобретения представлены способы усиления терапий и/или композиций фармацевтических средств, нутрицевтиков и/или добавок путем совместного введения композиции, включающей селен (например, растворимый селен, водорастворимый селен, §ОР (например, ρΗ-зависимую фракцию 8ОР) и так далее) настоящего изобретение с профилактической или терапевтической композицией фармацевтического средства, нутрицевтика и/или добавки. При совместном введении агенты могут вводиться параллельно или последовательно. В одном варианте реализации соединения, описанные в настоящем документе, вводят до другого активного агента(ов). Композиции и способы введения могут быть любыми из описанных выше. Кроме того, каждый из двух или более совместно вводимых агентов могут быть введены с использованием различных способов или различных композиций. В некоторых вариантах реализации композиция настоящего изобретения вводится совместно со средством лечения рака.

Соответственно в некоторых вариантах реализации композицию, содержащую одну или несколько форм селена (например, 8ОР (например, ρΗ-зависимую фракцию 8ОР), растворимый селен, водорастворимый селен, §ЕЬ-РЬЕХ) вводят системно или локально для ингибирования пролиферации клеток опухоли и ангиогенеза, и/или инициации гибели клеток опухоли у онкологических пациентов. Например, в некоторых вариантах реализации композицию, включающую ρΗ-зависимую фракцию 8ОР (ρΗ 4,0) обогащенных селеном дрожжей (например, §ЕЬ-РЬЕХ) вводят субъекту в таких условиях, что у субъекта благоприятным образом регулируется экспрессия одного или нескольких генов, связанных с ростом рака/опухоли и/или метастаза (например, повышающе регулируется или понижающее регулируется) (смотри, например, пример 4). Композиции могут быть введены внутривенно, интратекально, внутрибрюшинно, а также перорально. Более того, они могут быть введены самостоятельно или в комбинации с антипролиферативными лекарствами.

При рассмотрении комбинаций, подразумевается, что настоящее изобретение не ограничивается конкретной природой указанной комбинации. Настоящее изобретение охватывает комбинации в виде простых смесей, а также химических гибридов. Примером последнего является композиция, содержащая одну или несколько форм селена, ковалентно связанного с заданным носителем или с активным фармацевтическим средство. Ковалентное связывание может быть выполнено при помощи любого из многих имеющихся в продаже сшивающих соединений.

Настоящее изобретение не ограничивается конкретной природой терапевтического препарата. Например, такие композиции могут быть представлены вместе с физиологически переносимыми жидкими, гелеобразными или твердыми носителями, разбавителями, адъювантами или формообразующими средствами.

Эти терапевтические препараты могут быть введены млекопитающим для ветеринарного применения как для домашних, так и для сельскохозяйственных животных, а также для клинического применения для людей таким же образом, как и другие терапевтические средства. Как правило, доза, необходимая для терапевтической эффективности, варьируется в соответствии с типом использования и способа введения, а также особых требований индивидуальных реципиентов.

Такие композиции обычно готовят в виде жидких растворов или суспензий или в твердых формах. Пероральные композиции для лечения рака обычно включают такие обычно используемые добавки, как

- 18 030339

связующие вещества, наполнители, носители, консерванты, стабилизатор, эмульгаторы, буферы и формообразующие средства, как, например, фармацевтические марки маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, сахарина натрия, целлюлозы, карбоната магния и тому подобные. Эти композиции принимают форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, композиций устойчивого высвобождения или порошков, и обычно содержат 1-95% активного ингредиента, предпочтительно 2-70%.

Композиции также готовят в виде средств для инъекции, в виде жидких растворов или суспензий; также могут быть приготовлены твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией.

Композиции настоящего изобретения зачастую смешивают с разбавителями или формообразующими средствами, которые являются физиологически переносимыми и совместимыми. Соответствующими разбавителями и формообразующими средствами являются, например, вода, солевой раствор, декстроза, глицерин или подобные, а также их комбинации. Кроме того, при необходимости композиции могут содержать небольшие количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие средства или эмульгаторы, стабилизаторы или рН-буферные агенты.

В настоящем изобретении находит применение широкий диапазон терапевтических средств. Например, любое терапевтическое средство, которое может быть совместно введено с композицией, содержащей одну или несколько форм селена настоящего изобретения, является пригодным для применения в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретение представлено введение субъекту эффективного количества композиции, содержащей одну или несколько форм селена, и по меньшей мере одного противоракового средства (например, обычного противоракового средства, такого как химиотерапевтические лекарства и/или лучевая терапия).

Механизм действия противоракового средства, пригодного для применения в настоящем документе, включает, но не ограничиваясь этим, агенты, которые вызывают апоптоз, агенты, которые инициируют/вызывают повреждение нуклеиновых кислот, агенты, которые ингибируют синтез нуклеиновых кислот, агенты, которые нарушают образование микротрубочек, а также агенты, которые нарушают синтез или устойчивость белков.

Классы противораковых средств, пригодных для применения в композициях и способах настоящего изобретения, включают, но не ограничиваясь этим:

1) алкалоиды, включая ингибиторы микротрубочек (например, винкристин, винбластин и виндезин и так далее), стабилизаторы микротрубочек (например, паклитаксел (таксол) и доцетаксел и так далее) и ингибиторы хроматиновой функции, включая ингибиторы топоизомеразы, такие как эпиподофиллотоксины (например, этопозид (УР-16) и тенипозид (УМ-26) и так далее, и агенты, которые нацелены на топоизомеразу I (например, камптотецин и изиринотекан (СРТ-11) и так далее);

2) агенты, ковалентно связывающие ДНК (алкилирующие агенты), включая азотные иприты (например, мехлоретамин, хлорамбуцил, циклофосфамид, ифосфамид и бусульфан (милеран) и так далее), нитрозомочевины (например, кармустин, ломустин и семустин и так далее) и другие алкилирующие агенты (например, дакарбазин, гидроксиметилмеламин, тиотепа и митоцицин и так далее);

3) агенты, не ковалентно связывающие ДНК (противоопухолевые антибиотики), включая ингибиторы нуклеиновых кислот (например, дактиномицин (актиномицин Ό) и так далее), антрациклины (например, даунорубицин (дауномицин и церубидин), доксорубицин (адриамицин) и идарубицин (идамицин) и так далее), антрацендионы (например, антрациклиновые аналоги, такие как (митоксантрон) и так далее), блеомицины (бленоксан) и так далее, а также пликамицин (митрамицин) и так далее;

4) антиметаболиты, включая антифолаты (например, метотрексат, фолекс и мексат и так далее), пуриновые антиметаболиты (например, 6-меркаптопурин (6-МР, пуринетол), 6-тиогуанин (6-ТО), азатиоприн, ацикловир, ганцикловир, хлордезоксиаденозин, 2-хлордезоксиаденозин (СбА) и 2'дезоксикоформицин (пентостатин) и так далее), пиримидиновые антагонисты (например, фторпиримидины (например, 5-фторурацил (адруцил), 5-фтордезоксиуридин (РбИгб) (флоксуридин)) и так далее), а также цитозиновые арабинозиды (например, цитозар (ага-С) и флударабин и так далее);

5) ферменты, включая Ь-аспарагиназу и гидроксимочевину и так далее;

6) гормоны, включая глюкокортикоиды, такие как антиэстрогены (например, тамоксифен и так далее), нестероидные антиандрогены (например, флутамид и так далее) и ингибиторы ароматазы (например, анастрозол (аримидекс) и так далее);

7) платиновые соединения (например, цисплатин и карбоплатин и так далее);

8) моноклональные антитела, конъюгированные с противораковыми лекарствами, токсинами и/или радионуклидами и так далее;

9) модификаторы биологического ответа (например, интерфероны (например, ΙΡΝ-α и так далее) и интерлейкины (например, 1Ь-2 и так далее);

10) адоптивную иммунотерапию;

11) гепатопоэтические факторы роста;

12) агенты, которые вызывают дифференцировку клеток опухоли (например, полностью-трансретиноевая кислота и так далее);

- 19 030339

13) методики генной терапии;

14) методики антисмысловой терапии;

15) опухолевые вакцины;

16) терапии, направленные против опухолевых метастазов (например, батимистат и так далее);

17) другие ингибиторы ангиогенеза.

В предпочтительных вариантах настоящего изобретения представлено введение эффективного количества композиции, содержащей одну или несколько форм селена настоящего изобретения, и по меньшей мере одного стандартного противоракового средства, которое вызывает апоптоз и/или предотвращает пролиферацию раковых клеток у субъекта. В некоторых предпочтительных вариантах реализации субъект страдает заболеванием, характеризующимся метастазом. В других предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения представлено введение эффективного количества композиции, содержащей одну или несколько форм селена, и таксан (например, доцетаксел) субъекту, страдающему заболеванием, характеризующимся сверхэкспрессией белков семейства Вс1-2 (например, Вс1-2 и/или Вс1Хь).

Таксаны (например, доцетаксел) являются эффективным классом противораковых химиотерапевтических средств (смотри, например, К.Б. МШет аий Ο.Υ. 81ейде, 1т. Сапсег 1иуе8Йда1юи, 17:121-136 (1999)). Хотя настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным механизмом, таксанопосредованная гибель клеток предположительно происходит за счет внутриклеточной стабилизации микротрубочек с последующей инициацией апоптического пути (смотри, например, 8. На1йаг е! а1., Саисег ВезеагсН. 57:229-233 (1997)). В некоторых других вариантах реализации специально подразумеваются цисплатин и таксол для применения с композицией, содержащей одну или несколько форм селена настоящего изобретения. В некоторых вариантах реализации любое фармацевтическое средство, обычно используемое в контексте терапии рака, находит применение в настоящем изобретении. Стандартные противораковые средства, которые применимы для введения с описанными композициями, содержащими одну или несколько форм селена, включают, но не ограничиваясь этим, адриамицин, 5-фторурацил, этопозид, камтотецин, метотрексат, актиномицин-Б, митомицин С или более предпочтительно цисплатин. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения терапевтические средства лечения дополнительно включают один или несколько агентов, напрямую сшивающих нуклеиновые кислоты (например, ДНК) для облегчения разрушения ДНК, что приводит к синергетическим антинеопластическим агентам настоящего изобретения. Например, могут быть использованы такие агенты как цисплатин и другие ДНК-алкилирующие агенты. Агенты, которые могут повреждать ДНК, включают также соединения, которые препятствуют репликации ДНК, митозу и хромосомной сегрегации. Такие химиотерапевтические соединения включают, но не ограничиваясь этим, адриамицин, известный также как доксорубицин, этопозид, верапамил, подофиллотоксин и тому подобные. Эти соединения широко используют в клинических условиях для лечения неоплазм, и их вводят болюсными инъекциями внутривенно в дозах, находящихся в диапазоне от 25-75 М² с интервалом 21 день для адриамицина, до 35-50 Мд/М² для этопозида, внутривенно, или двойной внутривенной дозой перорально.

Агенты, которые нарушают синтез и точность воспроизведения предшественников и субъединиц нуклеиновых кислот, также приводят к разрушению ДНК и находят применение в качестве химиотерапевтических средств в настоящем изобретении. Было разработано ножество предшественников нуклеиновых кислот. Особенно применимыми являются средства, которые прошли обширные испытания и являются легкодоступными. Поэтому такие агенты как 5-фторурацил (5-РИ) предпочтительно используются неопластическими тканями, что делает эти агенты особенно применимыми для направленного действия на неопластические клетки. Доставляемые дозы могут варьироваться от 3 до 15 мг/кг/день, хотя другие дозы могут существенно варьироваться в соответствии с различными факторами, включая стадию заболевания, податливость клеток к указанной терапии, степень устойчивости к этим агентам и тому подобные.

В предпочтительных вариантах противораковые средства (например, антиангиогенные факторы, рассмотренные в настоящем документе) используют в настоящем документе как средства, которые поддаются совместному введению с композицией, содержащей одну или несколько форм селена, или иным образом связанные с композицией, содержащей одну или несколько форм селена, так что они могут быть доставлены в организм субъекта, ткань или клетку без потери способности подвергаться противораковому действию. Более подробное описание противораковых терапевтических средств, таких как платиновые комплексы, верапамил, подофиллотоксин, карбоплатин, прокарбазин, мехлоретамин, циклофосфамид, камптотецин, ифосфамид, мелфалан, хлорамбуцил, бисульфан, нитрозомочевина, адриамицин, дактиномицин, даунорубицин, доксорубицин, блеомицин, пликомицин, митомицин, этопозид (ΥΡ16), тамоксифен, таксол, трансплатина, 5-фторурацил, винкристин, винбластин и метотрексат, а также другие аналогичные противораковые средства, специалисты в данной области могут найти, обратившись к любому количеству инструктивных руководств, включая, но не ограничиваясь этим, РкузЮап'з Безк геГегеисе аий !о Ооойтаи аий СПтап'з "Ркагтасеийса1 ВаЪз оГ Ткетареийск" ηίηΐΗ еййюи, Ейз. Нагйтап е! а1., 1996.

- 20 030339

V. Антиоксиданты.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения антиоксиданты вводят совместно с композициями или препаратами настоящего изобретения. Настоящее изобретение не ограничивается конкретным типом используемого антиоксиданта. Действительно, подразумевается, что различные антиоксиданты являются применимыми в настоящем изобретении, включая, но не ограничиваясь этим, алкилированные дифениламины, Ν-алкилированные фенилендиамины, фенил-а-нафтиламин, алкилированный фенил-а-нафтиламин, диметилхинолины, триметилдигидрохинолины и олигомерные композиции, полученные из них, стерически затрудненные фенольные соединения, алкилированные гидрохиноны, гидроксилированные тиодифениловые эфиры, алкилиденбисфенолы, тиопропионаты, дитиокарбаматы металлов, 1,3,4-димеркаптотиадиазол и производные, растворимые в масле соединения меди и тому подобные, №ида1иЪе. КТМ. 438, №ида1иЪе 438Ь, №ида1иЪе 640, №ида1иЪе 635, №ида1иЪе 680, №шда1иЬе АМ8, №ида1иЪе ΑΓΑΝ, №шдагб РΑNΑ, №шда1иЬе ТМр. №шда1иЬе 531, №шда1иЬе 431, №шдагб ВНТ, №шда1иЬе 403 и №шда1иЬе 420, аскорбиновая кислота, токоферолы, включая альфа-токоферол, водорастворимые антиоксиданты, такие как сульфгидрильные соединения и их производные (например, натрия метабисульфит и Ν-ацетил-цистеин), липоевая кислота и дигидролипоевая кислота, ресвератрол, лактоферрин, производные аскорбиновой кислоты (например, аскорбил пальмитат и аскорбил полипептид), бутилированный гидрокситолуол, ретиноиды (например, ретинол и ретинил пальмитат), токотриенолы, убихинон, экстракты, содержащие флавоноиды и изофлавоноиды, и их производные (например, генистеин и диадзеин), экстракты, содержащие ресвератрол и тому подобные, экстракты виноградных косточек, зеленого чая, состовой коры, прополиса, 1гдапох1010, 1035, 1076, 1222 (производства СаЬа 8рес1аЛу СПетюак Со, Ыб.), Аибдеие Р, 3С, РК, 8ипиП/ег ОА-80 (производства 8итбото СНет1са1 1пби8б1е8 Со, Ыб.), бета-каротин, ликопен, витамины С, Е и А и другие вещества.

Хотя понимание механизма не является обязательным для практического осуществления настоящего изобретения, и настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным механизмом действия, в некоторых вариантах реализации введение композиции, содержащей селен (например, растворимый селен, 8ОР) субъекту изменяет профили генной экспрессии (например, ТОРВ1, МАРК8, С1К, иВЕ4А, 8МРХ, И8Р22 и РТР4А1) у субъекта. В некоторых вариантах реализации введение композиции, содержащей селен (например, растворимый селен, 8ОР), субъекту снижает степень повреждения ДНК (например, в ткани головного мозга (например, неокортексе), мышечной ткани, жировой ткани и так далее) субъекта.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлен способ снижения чувствительности клеток к цитотоксичности Н₂О₂, включающий введение в клетки композиции, содержащей селен (например, растворимый селен, водораствормый селен, 8ОР, 8ЕР-РЬЕХ и так далее).

В настоящем изобретении дополнительно представлен способ уменьшения супероксидных радикалов у субъекта (например, у субъекта, страдающего оксидативным стрессом), включающий введение композиции (например, пищевой добавки), включающей селен (например, растворимый селен, водорастворимый селен, 8ОР, 8ЕР-РЬЕХ и так далее) субъекту. Более того, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения показано, что субъекты, получающие определенные композиции, включающие селен (например, растворимый селен, водорастворимый селен, 8ОР, 8ЕР-РЬЕХ и так далее), обладают улучшенной способностью переносить оксидативный стресс. Хотя понимание механизма не является необходимым для практического осуществления настоящего изобретения, и настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным механизмом действия, в некоторых вариантах реализации субъекты, получающие композицию, включающую селен (например, диетическую добавку, включающую селен (например, растворимый селен, водорастворимый селен, 8ОР, 8ЕР-РЬЕХ и так далее)), обладают улучшенной способностью справляться с оксидативным стрессом благодаря способности некоторых форм селена (например, растворимого селена, водорастворимого селена, 8ОР, 8ЕР-РЬЕХ и так далее) изменять (например, снижать) уровень супероксидных радикалов в организме субъекта.

Подразумевается, что композиции и способы настоящего изобретения найдут применение в различных областях, включая, но не ограничиваясь этим, исследования и клиническую диагностику.

VI. Носители.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлена доставка селена (например, селеногликопротеина) при помощи одного или нескольких носителей, включающих, но не ограничиваясь этим, наночастицы (например, нанокапсулы), пузырьки, липосомы, полимеры (например, молекулярно фиксированные полимеры (М1Р), полимеры с медленным высвобождением, поликатионные полимеры и/или полимеросомы. В некоторых вариантах реализации носитель селена обеспечивает введение, таргетинг и/или временное высвобождение селеносодержащих соединений (например, водорастворимого селена, 8ОР) в организме субъекта (например, человека или животного). В некоторых вариантах реализации носители (например, полимер с медленным высвобождением, нанокапсула, М1Р, полимеросомы и так далее) усиливают доставку селеносодержащих соединений (например, органического селена, растворимого селена, водорастворимого селена, 8ОР, 8ЕР-РЬЕХ и так далее) субъекту. В некоторых вариантах реализации носители (например, полимер с медленным высвобождением, нанокапсула, М1Р,

- 21 030339

полимеросомы и так далее) увеличивают биодоступность селеносодержащих соединений (например, органического селена, растворимого селена, водорастворимого селена, δΟΡ, δΕΕ-ΡΕΕΧ и так далее) субъекту.

Настоящее изобретение не ограничивается типом используемого носителя. Действительно, могут быть использованы различные носители, включая, но не ограничиваясь этим, дендримеры, полимеросомы, наночастицы, полимеры медленного высвобождения, нанокапсулы, молекулярно фиксированные полимеры и/или другой тип носителя (например, любой из носителей, описанных в настоящем документе). В одном предпочтительном варианте реализации носителем является полимер с медленным высвобождением. В другом предпочтительном варианте реализации носителем является молекулярно фиксированный полимер. В другом предпочтительном варианте реализации носителем является полимеросома, используемая для инкапсуляции селеногликопротеина. Настоящее изобретение не ограничивается типом используемой полимеросомы. Действительно, могут быть использованы полимеросомы, известные в данной области. В некоторых вариантах реализации полимеросома включает поли(этиленоксид) (ΡΕΟ) блок-сополимер. Однако настоящее изобретение не ограничивается этим. Может быть использован любой известный блок-сополимер, включая, например, поли(этилэтилен) (ΡΕΕ), поли(бутадиен (ΡΒ или ΡΒΌ), поли(стирол) (Ρδ) и поли(изопрен) (ΡΙ). В некоторых вариантах реализации полимер включает поли(е-капролоктон) (ТСЕ) диблок-сополимер. В некоторых вариантах реализации полимеросома включает диблок-сополимеры на основе поли(этиленоксид)-блок-поли(е-капролоктон) (ΡΕΟ-Ь-ГСЬ). В некоторых вариантах реализации полимеросома включает блок-сополимер, который является триблок-, тетраблок-, пентаблок- или по меньшей мере шестиблочный сополимер. В некоторых вариантах реализации полимеросома получена путем связывания поли(молочной кислоты), поли(гликолида), поли(молочнойсогликолевой кислоты) и/или поли(3-гидроксибутирата) с ΡΕΟ. Настоящее изобретение не ограничивается размером полимеросомы, инкапсулирующей селеногликопротеин. В композициях и способах настоящего изобретения находят применение различные размеры, включая, но не ограничиваясь этим, полимеросомы, инкапсулирующие селеногликопротеины, размер которых составляет около 50-300 нм в диаметре, хотя могут быть использованы более крупные (например, около 350, 400, 500 нм или больше) или мелкие (например, около 40, 30, 20 нм или меньше) полимеросомы, инкапсулирующие селеногликопротеины.

В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение включает нанокапсулы с контролируемым высвобождением δΟΡ и ΜΙΡ сферы для обеспечения равномерной и безопасной доставки органического селена (например, молекулярно фиксированные полимеры (ΜΙΡ), полимеры с медленным высвобождением и так далее) по сравнению с другими формами селена (например, капсулами или пилюлями разовых доз обогащенных селеном дрожжами, δΕΕ-ΡΕΕΧ или неорганического селена). В некоторых вариантах реализации используют водорастворимые, растворимые и/или δΟΡ для эффективной инкапсуляции и доставки селена путем улучшенных способов доставки, описанных в настоящем документе (например, наночастицы (например, нанокапсулы), пузырьки, полимеры (например, молекулярно фиксированные полимеры (ΜΙΡ), полимеры с медленным высвобождением и так далее) и/или полимеросомы). В другом варианте реализации улучшенные способы доставки, описанные в настоящем документе, усиливают биодоступность инкапсулированного селена (например, δΟΡ или растворимого селена). В некоторых вариантах реализации улучшенные способы доставки, описанные в настоящем документе, обеспечивают медленное высвобождение (например, 12, 24 ч, 2 дня, 1, 2, 3, 10 недель и так далее) селена в раствор, организм субъекта, сыворотку и так далее.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлены полимеры с медленным высвобождением в качестве носителя для селеносодержащих композиций (например, органического селена, растворимого селена, водорастворимого селена, δΟΡ и так далее) настоящего изобретения. Полимеры с медленным высвобождением, такие как поли(молочная кислота-согликолевая кислота) (ΡΕΟΆ) или поликатионные полимеры, такие как полиэтиленимин (ΡΕΙ) могут быть использованы в качестве носителей. В некоторых вариантах реализации полимеры с медленным высвобождением обеспечивают контролируемую доставку селеносодержащих композиций (например, органического селена, растворимого селена, водорастворимого селена, δΟΡ, δΕΕ-ΡΕΕΧ и так далее). В некоторых вариантах реализации контролируемая доставка происходит при рациональном смешивании полимера (например, ΡΕΙ), природного или синтетического, с селеносодержащей композицией (например, органического селена, растворимого селена, водорастворимого селена, δΟΡ, δΕΕ-ΡΕΕΧ и так далее) и необязательно других активных или неактивных средств таким образом, что селеносодержащая композиция (например, органического селена, растворимого селена, водорастворимого селена, δΟΡ, δΕΕ-ΡΕΕΧ и так далее) высвобождается из этого материала заданным образом. Высвобождение селеносодержащей композиции (например, органического селена, растворимого селена, водорастворимого селена, δΟΡ, δΕΕ-ΡΕΕΧ и так далее) может быть постоянным в течение долгого периода времени, оно может быть циклическим в течение долгого периода времени, или оно может запускаться окружающими условиями или другими внешними событиями. В некоторых вариантах реализации контролируемая доставка обеспечивает более эффективную терапию. В некоторых вариантах реализации контролируемая доставка исключает потенциальную

- 22 030339

возможность более низкой дозы или передозировки. Другие преимущества использования систем контролируемой доставки могут включать поддержание уровней селена в заданном диапазоне, необходимость более редкого введения и улучшенное соблюдение больным режима и схемы лечения.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлены полимеросомы в качестве носителей для селеносодержащих композиций (например, органического селена, растворимого селена, водорастворимого селена, §СР, §ЕЬ-РЬЕХ и так далее) настоящего изобретения. В некоторых вариантах реализации полимеросомы получают с использованием амфифильных синтетических блок-сополимеров с образованием мембраны пузырьков, которые имеют радиус в диапазоне от около 50 на до около 10 мкм или более (смотри, например, Э^сНег с( а1., 1оигиа1 о£ РЬу51са1 СЬеш151гу В (2002), 706(11), 2848-2854,), включен в настоящий документ путем ссылки в полном объеме). В некоторых вариантах реализации полимеросомы в своем ядре содержат водный раствор и они являются пригодными для инкапсуляции и защиты молекул, таких как селеносодержащие композиции (например, органического селена, растворимого селена, водорастворимого селена, 8СР, 8ЕЬ-РЬЕХ и так далее) и необязательно одного или нескольких лекарств, ферментов, других белков и пептидов, а также фрагментов ДНК и РНК. В некоторых вариантах реализации мембрана полимеросомы обеспечивает физический барьер, которые отделяет инкапсулированный материал от внешних материалов, таких как те, которые находятся в биологических системах. В некоторых вариантах реализации полимеросомы обеспечивают высвобождение содержимого из их ядер в зависимости от времени (например, селеносодержащих композиций (например, органического селена, растворимого селена, водорастворимого селена, 8СР, 8ЕЬ-РЬЕХ и так далее)). В некоторых вариантах реализации применение синтетических полимеров для создания полимеросом обеспечивает разработчикам возможность манипулировать характеристиками мембраны и посредством этого контролировать проницаемость, скорость высвобождения, устойчивость и другие свойства.

В одном варианте реализации содержащие селен (например, растворимый селен, водорастворимый селен, §СР) композиции настоящего изобретения могут быть инкапсулированы внутри полимеросом на основе поли(этиленоксид)-блок-поли(е-капролоктона (РЕО-Ь-РСЬ). Хотя понимание механизма не является обязательным для практического осуществления настоящего изобретения, и настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным механизмом действия, в некоторых вариантах реализации РЕО обеспечивает улучшенную химическую и механическую устойчивость полученного носителя ίη νίΐΓΟ, увеличенную биодоступность ίη νίνο и пролонгированные периоды полувыведения из кровотока. РСЬ, хорошо известный имплантируемый биоматериал, образует мембрану полимеросомы и облегчает полное и безопасное разложение ίη νίνο образующегося продукта путем гидролиза его сложноэфирных связей.

В другом варианте реализации селеносодержащие композиции (например, селеногликопротеины) настоящего изобретения могут быть инкапсулированы в полимеросомы, синтезированные из смесей или чистых производных других биоразлагаемых блок-полимеров, полученных путем связывания поли(молочной кислоты), поли(гликолида), поли(молочной-согликолевой кислоты) или поли(3гидроксибутирата) с РЕО.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлены нанокапсулы (Соиугеиг е( а1., С’гП Реу ТЬег Эгид Сатег §ук1. 2002;19(2):99-134, включен в настоящий документ путем ссылки в полном объеме) в качестве носителей для селеносодержащих композиций (например, органического селена, растворимого селена, водорастворимого селена, 8СР, 8ЕЬ-РЬЕХ и так далее) настоящего изобретения (смотри, например, патент США № 7498045, включен в настоящий документ путем ссылки в полном объеме). В некоторых вариантах реализации нанокапсулы обеспечивают контролируемое высвобождение селеносодержащих композиций (например, органического селена, растворимого селена, водорастворимого селена, 8СР, §ЕЬ-РЬЕХ и так далее) при биоразложении нанокапсулы. В некоторых вариантах реализации нанокапсулы имеют периоды биологического полуразложения от около 2 до около 100 ч (например, около 2, 4, 6, 12, 24, 48, 96 ч и так далее). В некоторых вариантах реализации биоразлагаемые нанокапсулы настоящего изобретения могут быть приспособлены для контролируемого высвобождения селеносодержащих композиций (например, органического селена, растворимого селена, водорастворимого селена, 8СР, §ЕЬ-РЬЕХ и так далее) и необязательно различных других инкапсулированных терапевтических средств, включая макромолекулы, в ίη νίνο кровообращение субъекта при введении в организм субъекта. Композиции нанокапсул настоящего изобретения дополнительно приспособлены для инкапсуляции терапевтически эффективных концентраций селеносодержащих композиций (например, органического селена, растворимого селена, водорастворимого селена, 8СР и так далее) и их доставки в ίη νίνο кровообращение реципиента. В некоторых вариантах реализации нанокапсула, которая инкапсулирует селеносодержащие композиции (например, органического селена, растворимого селена, водорастворимого селена, 8СР, §ЕЬ-РЬЕХ и так далее), является мембраной, включающей, например, сополимер полимера полимолочной кислоты и полиэтиленгликоля. В некоторых вариантах реализации нанокапсулы образованы межфазной полимеризацией мономера или межфазным наноосаждением предварительно образованного полимера.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения представлены молекулярно фиксированные полимеры в качестве носителей для селеносодержащих композиций (например, органического

- 23 030339

селена, растворимого селена, водорастворимого селена, 8ОР, 8ЕЬ-РЬЕХ и так далее) настоящего изобретения (МокЬасй. Тгепйк ίη ВюсНеписгй Баепсеь том 7, с. 92-96, 1994, №и1ГГ. Тгепйк ίη В1о1есЬпо1оду, том 11, с. 85-87, 1993, Лпйег88оп, е! а1., Мо1еси1аг 1п1егасйоп8 ίη Вюкерагайопк (Ν^ Т.Т. ей.), с. 383-394), патент США № 5959050, включены в настоящий документ путем ссылки в полном объеме.

Экспериментальная часть

Следующие примеры представлены для демонстрации и дополнительной иллюстрации некоторых предпочтительных вариантов реализации и аспектов настоящего изобретения, и их не следует толковать как ограничение рамок настоящего изобретения.

Пример 1.

A. Последовательное получение растворимых селеногликопротеинов из §ЕЬ-РЬЕХ кислотной экстракцией с последующим осаждением.

4-л трехгорлый реактор (экстрактор № 1, смотри фиг. 1), оснащенный механической мешалкой, термометром и электрическим одеялом, наполнили 3 л деионизированной Н₂О и 50 мл 0,3н. НС1. Реактор нагрели примерно до 50°С и частями добавили 600 г §ЕЬ-РЬЕХ при концентрации 1600 м.д, при перемешивании. Примерно через час температура достигла 80°С, а рН смеси составил 2,23. рН понизили до 1,5 добавлением 13,5 мл 0,3н. НС1. Реакционный сосуд поддерживали при нагревании и перемешивании в течение 7 ч. рН смеси проверяли примерно один раз в час, чтобы убедиться, что уровень рН остается при 1,5. После реакции кислотную смесь (рН 1,5) распределили в четыре 1 л банки для центрифугирования (центрифуга № 1, смотри фиг. 1) при относительной силе центрифугирования (КСР) 4000 на 20 мин при 8°С. Собрали надосадочную жидкость (рН 1,5) и осадка твердого вещества. Надосадочную жидкость добавили в 3 л 3-горлый реактор (смеситель № 1, смотри фиг. 1) на ледяной бане (4°С) и присоединили капельную воронку, содержащую 2н. №ОН, механическую мешалку и рН электрод. К раствору по каплям добавляли 2н. №ГОН при перемешивании до достижения рН смеси 1,85. При добавлении №ЮН образовался белый осадок. Перемешивание продолжали в течение 30 мин, и снова центрифугировали смесь (центрифуга № 2, смотри фиг. 1), получив надосадочную жидкость и осадок селеногликопротеина. Осадок селеногликопротеина собрали и высушили замораживанием (лиофильная сушилка № 1, смотри фиг.

1) , получив 1,635 г белого осадка. Надосадочную жидкость с рН 1,85 и осадок, образованный при рН 1,5, добавили в реакционный сосуд (смеситель № 2, смотри фиг. 1) и поместили на ледяную баню (4°С). Смесь перемешивали в течение 30 мин, а затем центрифугировали (центрифуга № 3, смотри фиг. 1 и фиг.

2) , получив влажные твердые вещества остатка и надосадочную жидкость с рН 1,6, которую позже использовали для получения §ОР при помощи последующего рН-зависимого осаждения (например, фракций §ОР с рН 3,0, рН 4,0 и рН 6,0, как описано ниже).

B. рН-зависимое осаждение селеногликопротеинов.

Надосадочную жидкость с рН 1,6 поместили в реактор (смеситель № 3, смотри фиг. 2) и добавляли к раствору 2н. №ГОН при перемешивании до достижения рН смеси 3,0. Перемешивание продолжали еще 30 мин и центрифугировали смесь (центрифуга № 4, смотри фиг. 2), получив надосадочную жидкость и осадок селеногликопротеина. Осадок селеногликопротеина при рН 3,0 (§ОР с рН 3,0) собрали и высушили замораживанием (лиофильная сушилка № 2, смотри фиг. 2), получив светло-серый осадок. Надосадочную жидкость с рН 3,0 поместили в реактор (смеситель № 4, смотри фиг. 2) и добавляли к раствору 2н. №ГОН до увеличения рН раствора до 4,0. Перемешивание продолжали еще 30 мин и центрифугировали смесь (центрифуга № 5, смотри фиг. 2), получив надосадочную жидкость и осадок селеногликопротеина. Осадок селеногликопротеина с рН 4,0 (§ОР с рН 4,0) собрали и высушили замораживанием (лиофильная сушилка № 3, смотри фиг. 2), получив светло-серый осадок. Надосадочную жидкость с рН 4,0 поместили в реактор (смеситель № 5, смотри фиг. 2) и добавляли к раствору 2н. №ГОН до увеличения рН раствора до 6,0. Перемешивание продолжали еще 30 мин и центрифугировали смесь (центрифуга № 6, смотри фиг. 2), получив надосадочную жидкость и осадок селеногликопротеина. Осадок селеногликопротеина с рН 6,0 (§ОР с рН 6,0) собрали и высушили замораживанием (лиофильная сушилка № 4, смотри фиг. 2), получив севтло-серый осадок. Образовавшиеся впоследствии осадки собрали центрифугированием. Поток сточной воды с рН 6,0 из последнего центрифугирования содержал некоторое количество селенопептидов, олигосахаридов маннозы и глюкозы (например, которые могут быть использованы при получении питательной среды для дрожжей или другого питательного вещества). В этом процессе не образуются токсичные отходы, и он является экологически безопасным.

Пример 2. Выделение и определение растворимого 8ОР.

Осадок, содержащий твердые остатки при рН 1,5, образованный кислотной экстракцией §ЕЬ-РЬЕХ, промыли надосадочной жидкостью с рН 1,85 из второй экстракции (смотри пример 1) для снижения объема воды, использованной в процессе, и для растворения большей части §ОР, задержанных в осадке. Твердый остаток после третьего центрифугирования с рН 1,6 содержит значительное количество селена и может быть смешан со свежей партией селеновых дрожжей перед распылительной сушкой, полностью используя материал, взятый для экстракции.

Общее содержание селена, процентную концентрацию белка и вес каждой фракции §ОР усреднили после трех последовательных экстракций из §ЕЬ-РЬЕХ (смотри табл. 1). Экстрагированные фракции 8ОР состояли из 2,0-2,5 вес.% §ЕЬ-РЬЕХ и 4,3-5,75% общего селена, который присутствовал в §ЕЬ- 24 030339

РЬЕХ до экстракции. Была отмечена положительная корреляция между рН фракций БОР и весом белка, а обратное является верным для общей концентрации селена (смотри табл. 1). Средний вес белка для фракций БОР находился в диапазоне от около 65 до 90 вес.%, а концентрация селена для того же набора фракций находилась в диапазоне от около 2900 до 4900 м.д. Фракции БОР содержали от 4 до 37 вес.% углеводной составляющей.

Гель-электрофорез фракции БОР с рН 1,5, полученной кислотной экстракцией БЕТ-РЬЕХ, выявил, что полосы, соответствующие высокомолекулярным белкам или белкам с большим содержанием углеводов, отсутствуют. Такое же распределение по размеру с преобладанием низкомолекулярных фракций было обнаружен с использованием капиллярного электрофореза, и низкомолекулярные белки размером от 5,1 до 12,2 кДа составили более 90% смесей.

Эксклюзионная хроматография трех фракций БОР с рН 3,0. 4,0 и 6,0 на геле ΒΙΘ-ΚΆΌ Р10 (время удерживания до 6 ч) и геле ΒΙΘ-ΚΆΌ Р30 (время удерживания менее 1 ч) дала ранний пик со временем удерживания 5-10 мин и широкий, более поздний пик, со временем удерживания 35-60 мин. Ранний пик содержал гораздо больше белка: от 64,74 до 75,24%, и существенно более высокую концентрацию селена: от 2972 до 4252 м.д. Содержание белка в позднем пике было гораздо ниже: от 31,66 до 54,95%, и концентрация селена была существенно ниже: от 1193 до 1858 м.д. Этот тип хроматографии может давать БОР с высоким содержанием Бе из неочищенных фракций, и он показал низкую гомогенность углеводной составляющей в этих смесях.

Эксклюзионная хроматография на смоле БИРЕКОЕХ РерШе 10/300 ОЬ (ЛМЕКБНЛМ Вюзшепсез; диапазон фракционирования 7,0-100 кДа) с использованием 0,1 М Ас€ЖН₁ (рН 7,5) различных пептидов из триптического расщепления БЕЬ-РЬЕХ показала такой же набор пиков для образцов БОР (10-100 кДа и >100 кДа) и совершенно другую модель элюирования для образца БЕЬ-РЬЕХ. Лишь "ранние" пики со временем элюирования менее 20 мин содержали селен. Селеносодержащие элюенты собрали, лиофилизировали и анализировали при помощи методик БЕС 1СР МБ, МАР-ΟΙ ТОР МБ и нано ЕБ1 МБ/МБ. Результаты были комплементарными и позволили обнаружить, идентифицировать и секвенировать селеносодержащие пептиды. Идентификацию обнаруженных белков осуществили при помощи базы данных БхуГЛАсЯ (смотри табл. 2).

Таблица 2

Идентифицированные селенопептиды и селенопротеины из триптического расщепления экстракта БЕТ-РЬЕХ

5ЕС Анализированная фракция	Масса обнаруженного	Установленная последовательность пептида	Белок	Молярная масса белка (кДа)
пептида [М + Н]+, ТК	( 5е)
2	653,39 701,42	Ο5ϋΤΜΚ5ν5ΡΙΚ5ΕΟ ГО ΝΟ: 1 050Т5еМР5У5Р1Р ЗЕО ГО ΝΟ: 2	У1г 190 ννρ	42
3	637,39 685,41	5СМ5КК ЗЕО ГО ΝΟ: 3 ЗСЗеМЗКК ЗЕО ГО ΝΟ: 4	Фосфатидилинозитол 4 киназа альфа	89
2	587,33 635,35	ЕУЮГОРЗЗАМ1_31АЕК ЗЕО ГО ΝΟ: 5 ЕУ1СГОР53А5еМ1_51АЕК ЗЕО ГО ΝΟ: 6	ΥήΓ209ννρ	34
3	637,39	АЗеМ1УР ЗЕО ГО ΝΟ: 7	Рибонуклеаза III	77
1 и2	402,10	ЭУЗеМСААК ЗЕО ГО ΝΟ: 8	Н5Р 12	12
1 и2	489,55	51УР1_5еМ0В ЗЕО ГО ΝΟ: 9	Н5Р 10	10
1 и2	504,03	ЗеМСНЮОЗеТКЗЕО ГО ΝΟ: 10	5ΙΡ 18	18

Наиболее неожиданной природой этого способа было то, что белковый состав различных фракций, полученных хроматографическим разделением (например, ионообменной хроматографией, эксклюзионной хроматографией) различных фракций БОР из рН-зависимого осаждения, был одинаковым или очень похожим, по данным использованных электрофоретических методов (гель-электрофореза и капиллярного электрофореза). Как описано в настоящем документе, экстракция селеногликопротеинов из обогащен- 25 030339

ных селеном дрожжей была успешной при низком рН (например, 1,5). Хотя понимание механизма не является необходимым для практического осуществления настоящего изобретения, и настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным механизмом действия, в некоторых вариантах реализации, в кислотных условиях, используемых для экстракции 8ОР, белковые ядра существенно не гидролизуются и по большей части сохраняются в их исходной форме. В некоторых вариантах реализации рНзависимые фракции селеногликопротеина ЗЕЬ-РЬЕХ (например, 8ОР с рН 3,0, 8ОР с рН 4,0, 8ОР с рН 6,0) получают и вводят (например, самостоятельно или в комбинации с другим агентом) субъекту (например, для доставки органического селена субъекту (например, пероральным путем)).

Пример 3. Сравнение биодоступности.

Цыплят вскармливали в течение восемнадцати дней семью различными диетическими составами (смотри табл. 3 и 4) для сравнения биодоступности селена из рН-зависимого осаждения 8ОР из кислотного экстракта ЗЕЬ-РЬЕХ путем измерения содержания селена в грудной мышце цыплят.

Таблица 3

Состав и пищевая характеристика основного рациона

Компонент	%
Кукуруза	57,80
Соевая мука (48%)	35,00
Кукурузное масло	3,20
Известняк	1,30
Дикальция фосфат	1,80
Соль	0,45
Витаминно-минеральная смесь (без Зе)	0,25
ОЬ-Метионин	0,20
Итого	100
Питательное вещество
Калорийность МЕ, ккал/кг	300
Общий белок, %	21,5
Са, %	1,00
Доступный Р, %	0,45
Лизин, %	1,21
Метионин, %	0,54
Метионин + цистеин, %	0,89
Ыа, %	0,20

Диетические составы

Таблица 4

Способ обработки	Компоненты
1	Кукурузно-соевый базовый рацион без
(контроль)	добавления Зе
2(33)	Базовый + 0,3 м.д. Зе в виде селенита натрия
3 (5Р)	Базовый + 0,3 м.д. Зе в виде 8ΕΙ_-ΡΙ_ΕΧ
4 (рН 1,85)	Базовый + 0,3 м.д. Зе в виде фракции, осажденной при рН 1,85
5 (рН 3,0)	Базовый + 0,3 м.д. Зе в виде фракции, осажденной при рН 3,0
6 (рН 4,0)	Базовый + 0,3 м.д. Зе в виде фракции, осажденной при рН 4,0
7 (рН 6,0)	Базовый + 0,3 м.д. Зе в виде фракции, осажденной при рН 6,0

Как показано в табл. 5, цыплята, получавшие питание с добавлением фракций 8ОР с рН 4,0 или 6,0, накопили почти такие же количества селена, отложившегося в ткани грудной мышцы, по сравнению с цыплятами, получавшими питание с добавлением ЗЕЬ-РЬЕХ (8Р). По сравнению с контрольным образцом содержание 8е в ткани цыплят, получавших питание с 8Р, и цыплят, получавших питание с фракциями 8ОР с рН 4,0 или рН 6,0, было более чем в два раза выше по сравнению с цыплятами, получавшими питание с добавлением селенита натрия. Таким образом, в настоящем изобретении в некоторых вариантах реализации показано, что 8Р, а также дочерние 8ОР фракции 8Р (например, с рН 4,0 или рН 6,0) являются биодоступными при введении субъекту (например, в некоторых вариантах реализации, 8Р, 8ОР с рН 4,0 или 8ОР с рН 6,0 являются более (например, в 2 раза или более) биодоступными, чем неоргани- 26 030339

ческий селен (например, селенит натрия) при введении субъекту (например, как подтверждается данными доставки селена в ткань субъекта)).

Таблица 5

Влияние диетических источников δϋ

* Значения с различными буквами показывают, что результаты являются статистически значимыми (Ρ<0,05).

Пример 4.

А. Влияние различных источников диетического селена на профиль генной экспрессии в грудной мышце бройлеров.

Ткань грудной мышцы цыплят, упомянутую в примере 3, использовали также для оценки сходства и различий в профилях генной экспрессии, вызванных следующими способами диетической обработки: обработка 1 - базовая (контроль); обработка 2 - контрольная +0,3 м.д. селенита натрия (δδ); обработка 3 контрольная +0,3 м.д. δΕΕ-ΡΕΕΧ; обработка 6 - 0,3 м.д. фракции δΟΡ, экстрагированной из δΕΕ-ΡΕΕΧ (δΡ) при рН 4,0. Анализировали фракцию δΟΡ с рН 4,0, поскольку она показала практически идентичные значения отложения селена в грудной ткани по сравнению со значениями, полученными с δΡ (смотри табл. 5). Поэтому при разработке вариантов реализации настоящего изобретения выполнили эксперименты для определения того факта, происходят ли в животных, получающих фракцию δΟΡ с рН 4,0, такие же ΐπ νίνο эффекты (например, изменения генной экспрессии), которые наблюдаются у животных, получающих с питанием δΡ, или существуют существенные, измеримые различия.

Животные и отбор образцов тканей.

В возрасте 18 дней случайным образом выбрали пять цыплят из каждой группы обработки (описанных выше и в табл. 3 и 4) и умертвили под аргоновой асфикцией с последующим смещением шейных позвонков. Образцы ткани грудной мышцы (1 г) быстро удалили и моментально заморозили в жидком азоте. Образцы хранили при -80°С до анализа.

Микроматричный анализ.

Общую РНК выделили из замороженной ткани, используя реагент ТК1/О1. (ΙΝνίΤΡΌΟΕΝ, Карлсбад, штат Калифорния) по инструкциям производителя, и очистили с использованием набора ΚΝΕΑδΥ (ΡΙΑΟΕΝ, Валенсия, штат Калифорния). Общую РНК количественно определили по поглощению при 260 нм, а целостность подтвердили электрофорезом в агарозном геле и окрашиванием бромидом этидия полос 28δ и18δ.

Микроматричный анализ профиля выполнили с использованием геномного массива цыплят ΟϋпесЫр производства ΑΕΕΥΜΕΤΚΙΧ (Санта-Клара, штат Калифорния) по инструкциям, предлагаемым производителем.

Данные обработали, и каждый набор проб пометили как Ρ (присутствие), Μ (пограничное значение) или А (отсутствие) на основании соотношения силы сигнала и шума с использованием алгоритма суммы экспрессии ΑΕΕΥΜΕΤΚΙΧ ΜΑδ5.0.

Анализ биоинформатики.

Οеηеδρ^^η§ ΟΧ 10.0 (8Шсоп Οепеί^сδ, Редвуд, штат Калифорния) использовали для оценки и нормализации микроматричных данных и для выполнения статистических анализов и анализов профиля генной экспрессии.

Для минимизации возможности обманчивых открытий, наборы проб с низкой интенсивностью сигнала (помеченные как "отсутствие" по алгоритму ΜΑδ5.0) исключили из дальнейшего анализа. Отфильтрованные профили генной экспрессии затем подвергли однофакторному дисперсионному анализу для идентификации наборов проб, которые были по-разному экспрессированы в разных группах, а затем

- 27 030339

по полученным результатам выполнили испытание для определения генов, которые были существенно изменены при обработке селеном по сравнению с контрольным образцом. Измененными считали только гены, которые отличались от контрольного образца (Р<0,05) и имели соответствующую кратность изменения интенсивности сигнала (РС)>1,2.

Для визуального представления влияния диетических способов обработки на профили генной экспрессии в ткани грудной мышцы, 693 гена, идентифицированных как гены, которые экспрессируются поразному (дисперсионный анализ, Р<0,05) подвергли неконтролируемой иерархической кластеризации на основании массивов и генов. Как подробно описано выше, фракция ЗСР с рН 4,0 была напрямую получена из ЗР, а группы диетической обработки, получившие ЗР или фракцию ЗСР с рН 4,0, продемонстрировали приблизительно одинаковые уровни отложения селена (биодоступности) в ткани грудной мышцы цыплят (смотри табл. 5, выше). Следовательно, предполагается, что обе группы обработки селеном (ЗР и фракцией ЗСР с рН 4,0) будут демонстрировать одинаковые или очень схожие изменения генной экспрессии. Однако, и совершенно неожиданно, наблюдали чисто диетическое влияние на профили генной экспрессии между двумя группами обработки (смотри фиг. 3). В частности, наблюдали существенные различия между профилями генной экспрессии в группе обработки ЗР по сравнению с группой обработки фракцией ЗСР с рН 4,0, причем большинство анализированных генов по-разному реагировали на две группы обработки. Это большое отличие в профилях генной экспрессии, обусловленное обработкой ЗР по сравнению с обработкой фракцией ЗСР с рН 4,0 было полностью неожиданным и таким образом обусловило недостаток понимания биологии следовых элементов.

Например, 693 дифференцированно регулируемых гена (Р<0,05, дисперсионный анализ) подвергли неконтролируемой иерархической кластеризации на основании массивов и генов. На теплокарте, изображенной на фиг. 3, цветом показаны нормализованные профили генной экспрессии, которые отражают изменение экспрессии по сравнению со средним значением каждого гена; белый, черный или серый цвета представляют уменьшение, увеличение или отсутствие изменений в уровне интенсивности экспрессии соответственно. Дендрограмма в верхней части теплокарты отображает степень схожести профилей экспрессии между обработками, тогда как дендрограмма в левой части представляет различия в профилях экспрессии отдельных генов, среди всех обработок. Длина дендрограмм, изображенных на фиг. 3, соответствует степени несходства между листками кластера (короткая дендрограмма показывает более высокий уровень сходства).

Различное влияние фракции ЗСР с рН 4,0 и ЗР на профили генной экспрессии в грудной мышце было дополнительно анализировано сравнением количества генов, изменившихся существенно (Р<0,05, РС>1,2) под действием фракции ЗСР с рН 4,0 (рН 4), ЗР и селенита натрия (ЗЗ), как показано на диаграмме Венна, изображенной на фиг. 4. Было 198, 173 и 283 гена, существенно измененных под действием ЗР, рН 4 и ЗЗ соответственно. Был лишь 21 ген, который регулировался одинаково во всех трех группах обработки Зе, и 46 генов, которые регулировались одинаково под действием ЗР и фракции ЗСР с рН 4,0. Было 152 и 127 генов, изменившихся уникальным образом под действием ЗР или фракции ЗСР с рН 4,0 соответственно.

Например, некоторые гены, идентифицированные как гены, которые дифференциально или одинаково регулируются в ткани грудной мышцы цыплят в результате различных обработок селеном, изображены на фиг. 5-7.

Трансформирующий фактор роста, β-индуцированный (ТСРВ1, 68 кДа), предположительно участвует во взаимодействия клетки-матрицы, клеточной адгезии, миграции и дифференцировки. Мутации этого гена связаны с некоторыми формами дистрофии роговицы. Митоген-активируемая протеинкиназа 8 (МАРК8, известная также как ΡΝΚ1) является членом семейства киназ МАР. Киназы МАР действуют как точки интеграции для многих биохимических сигналов, и они участвуют в широком ряде клеточных процессов, таких как пролиферация, дифференцировка, регуляция транскрипции и развитие. МАРК8 также играет важную роль в реакции на клеточный оксидативный стресс, иммунной реакции, а также метаболизме углеводов и белков по инсулиновым путям передачи сигналов. Известно, что сверхактивация МАРК8 может вызывать резистентность к инсулину за счет фосфорилирования субстрата инсулинового рецептора 1 (1КЗ1).

На фиг. 5 представлены примеры генов (например, ТСРВ1 и МАРК8), которые одинаково регулируются под действием ЗЗ, ЗР и фракции ЗСР с рН 4,0. На фиг. 6 представлены примеры генов (например, комплементного компонента 1К (С1К) и фактора убиквинации Е4А (ИВЕ4А)), которые одинаково регулируются под действием ЗР и фракции ЗСР с рН 4,0, но не ЗЗ. Комплементный компонент 1К (С1К) является белком, участвующим в комплементном каскаде врожденной иммунной системы и удалении патогенов. Модификация белков убиквитином является важным клеточным механизмом для таргетинга аномальных или недолговечных белков для разложения. ИВЕ4А кодирует убиквитин-лигазу И-Ъох-типа, описанную как фактор убиквитинации Е4. ИВЕ4А предположительно играет роли в различных биохимических процессах, отличных от обиквитинации, включая рост и/или дифференцировку.

На фиг. 7 представлены примеры генов (например, малый мышечный белок, связанный с Xхромосомой (ЗМРХ), и убиквитин-специфичная пептидаза (ИЗР22), которые уникально регулируются

- 28 030339

под действием фракции §ОР с ρΗ 4,0. Малый мышечный белок, связанный с Х-хромосомой (§МРХ) является небольшим белком, который специфически экспрессируется в полосатых мышцах и играет важную роль в сокращении мышц. Убиквитин-специфическая пептидаза 22 (И8Р22) является геном, участвующим в убиквитин-зависимых белковых катаболических процессах. Было показано, что И8Р22 является положительным регулятором роста опухоли. Повышенная экспрессия И8Р22 связана с прогрессированием рака. Возможность снижать или отключать экспрессию И8Р22 может обеспечить ингибирование роста опухоли и/или прогрессирования рака. Например, снижение экспрессии И8Р22 может понижающе регулировать экспрессию Мйт2 и циклина Е, приводя к повышенной регуляции экспрессии ρ53 и ρ21, что приводит к блокировке клеточного цикла и ингибированию пролиферации клеток опухоли мочевого пузыря человека.

Дополнительные испытания уникального профиля генной экспрессии, вызванного фракцией с ρΗ 4,0 в мышечной ткани, дали дополнительные доказательства потенциального терапевтического применения химических форм селена в этой фракции (например, для предупреждения или замедления прогрессирования опухоли и/или метастаза).

Например, ген ΚΠΈΟ (лиганд с-ΚΙΤ) кодирует лиганд тирозин-киназного рецептора, который является плейотропным фактором, который действует в матке на развитие половых клеток и нервных клеток, а также гематопоэз; процессы, Которые предположительно отражают роль в клеточной миграции. Недавно были открыты вариации гена ΚΙΤΈΟ, которые предположительно связаны с повышенным риском рака яичек (КапсЮку с1 а1., 2009). Более того, была описана сверхэкспрессия когнатного рецептора ΚΙΤΈΟ, онкогенного генного продукта ΚΙΤ, в хромофобных клетках карциномы почек, а экспрессия ΚΙΤΈΟ и ΚΙΤ, как известно, участвует в трансформации фибробластов ΝΙΗ3Τ3 и онкогенезе мелкоклеточного рака легких (Уата/аО с1 а1., 2003).

Неожиданно наблюдали, что мышечная ткань из субъектов, которым вводили фракцию с ρΗ 4,0, существенно понижает регуляцию гена ΚΙΤΕΟ, но его уровень экспрессии не был изменен под действием других селеновых обработок, включая §Р, исходного материала для фракции с ρΗ 4,0 (смотри, например, фиг. 8).

Метастазы являются основной причиной гибели большинства онкологических людей и являются многостадийным процессом, в котором клетки из первичной опухоли мигрируют через внеклеточный матрикс, поступают в кровоток через вновь образованные кровеносные сосуды (ангиогенез опухоли) и распространяются к удаленным участкам (экстравазат), где снова начинается пролиферация.

Белок, связанный с рецептором фактора роста 2 (ОгЬ2), является основной молекулой во внутриклеточной сигнальной трансдукции. Он является критическим для развития клеточного цикла и подвижности, основанной на актине, и, впоследствии, более сложных процессов, таких как эпителиальный морфогенез, ангиогенез и васкулогенез. Эти важные функции делают ОгЬ2 терапевтической мишенью для стратегий, разработанных для предупреждения распространения солидных опухолей за счет локальной инвазии и метастаза. Фактически, в настоящее время многие попытки направлены на поиск путей блокады или противодействия ОгЬ2, поскольку предполагается, что это может представлять собой эффективную анти-метастатическую стратегию (ОшЬеШпо, Вигке апй Войаго, 2008).

Как показано на фиг. 9, регуляция ОгЬ2 существенно понижается у ρΗ 4,0-обработанных животных по сравнению с контрольным образцом и другими обработками селена, включая селенит натрия и исходный селеновый материал для ρΗ 4,0; §е1-Р1ех.

Потенциальная противоопухолевая активность фракции с ρΗ 4,0 не ограничивается понижающей регуляцией важных генов, связанных с раком. Например, наблюдали, что снижение экспрессии ΌΝΆ1Ά3 в клетках рака молочной железы усиливает их миграцию за счет обеспечения возможности увеличения интерлейкина-8 (Κίιη е1 а1., 2005). Эти и другие результаты позволяют предположить, что увеличение уровней Τίά1 (ΌΝΆ1Ά3) в раковых клетках понижающе регулирует их подвижность и способность к метастазу.

В экспериментах ΌΝΆ1Ά3 устойчиво повышающе регулируется в мышечной ткани в ответ на селен с ρΗ 4,0 (фиг. 10), но остается невосприимчивым по сравнению с контрольными условиями в мышечной ткани, полученной из животных, получавших другие источники селена.

В. Влияние различных селеновых обработок на профили печеночной генной экспрессии бройлеров.

В попытках описать неожиданно разное влияние на генную экспрессию 8Р и фракции §ОР с ρΗ 4,0 и для определения того факта, распространяется ли регуляция экспрессии на другие ткани, были выполнены исследования генной экспрессии, как описано выше в примере 4(а). Вместо ткани грудной мышцы у тех же цыплят, упомянутых в примере 3, собрали и анализировали печеночную ткань. Помимо групп обработки с добавлением δδ, δР и фракции δΟР с ρΗ 4,0, описали также профили печеночной генной экспрессии цыплят из дополнительных групп обработки (фракции δΟР с ρΗ 1,85 (ρΗ 1,85), фракции δΟР с ρΗ 3,0 (ρΗ 3) и фракции δΟР с ρΗ 6,0 (ρΗ 6), и сравнили их с контрольной группой обработки.

Следуя той же методике эксперимента, описанной в примере 4(А), анализ профилей печеночной генной экспрессии у субъектов каждой группы обработки показал 1520 генов, которые были существенно изменены под действием различных диетических обработок (Р<0,01, дисперсионный анализ). Анализ неконтролируемой иерархической кластеризации этих генов изображен на фиг. 11, и дает дополнитель- 29 030339

ное подтверждение, что обработка различными источниками селена вызывает большую степень изменения способности регулировать генную экспрессию. На теплограмме фиг. 11 цветами показаны нормализованные профили генной экспрессии, которые отражают изменения экспрессии по сравнению со средним значением каждого гена; белый, черный или серый цвета представляют снижение, увеличение или отсутствие изменений уровня интенсивности экспрессии соответственно. Дендрограмма в верхней части теплограммы отражает степень сходства в профилях экспрессии между обработками, тогда как дендрограмма в левой части представляет различия в профилях экспрессии отдельных генов для всех обработок. Длина дендрограмм, изображенных на чертеже, соответствует степени различия между листками кластера (короткая дендрограмма показывает более высокий уровень сходства).

Различия между ЗР и фракцией 8ОР с рН 4,0, а также между фракцией §ОР с рН 3,0 и фракцией 8ОР с рН 6,0 оказались существенными, причем лишь несколько генов одинаково регулируются при обработке каждым из источников селена. В общем, влияние обработки фракцией 8СР с рН 1,85 на генную экспрессию находится между группами обработки 8Р и другими 8СР (смотри фиг. 11). Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения показано, что обработка (например, питанием, содержащим, и/или введением) 8ЕЬ-РЬЕХ по сравнению с обработкой (например, питанием, содержащим, и/или введением) фракций 8СР, экстрагированных из 8ЕЬ-РЬЕХ, приводит к различным биологическим активностям, даже несмотря на то, что различные источники селена демонстрируют одинаковое влияние с точки зрения биодоступности селена.

Пример 5. Инкапсуляция селеногликопротеинов в полимеросомы.

Смесь 1:1 8СР, осажденных при рН 4,0 и 6,0 (смотри, например, примеры 1 и 2), инкапсулировали в полимеросомы. Концентрация селена в смеси составила 3054 м.д, а концентрация белка составила 79,96 вес.%.

Для создания полимеросом, инкапсулирующих селеногликопротеин, смесь растворили в водных буферах с рН 5,1, 6,2 и 7,4, и перемешивали суспензию в течение ночи на платформе встряхивателя. Не растворившийся 8СР удалили центрифугированием. Для получения полимеросом диблок-сополимер на основе РЕО(2к)-Ь-РСЬ(12к) растворили в органическом растворителе (например, метиленхлориде, тетрагидрофуране или диметилоксиде) для получения 1 мМ полимера РЕО-Ь-РСЬ в органическом растворе. Затем раствор осадили на шероховатой полоске из ТЕРЬОИ (около 1"х1"х1/16" толщиной) и поместили на дно стеклянной пробирки, шероховатой стороной вверх. Растворитель выпарили под вакуумом при комнатной температуре в течение 24-48 ч, получив высушенную пленку сополимеров весом 1-10 мг.

Затем эти пленки гидратировали при помощи 2-3 мл водного раствора, содержащего смесь 1:1 селеногликопротеинов с рН 4,0 и рН 6,0, а затем обработали ультразвуком в ванне соникатора при 20-100 Гц в течение 1-2 ч. После завершения обработки ультразвуком пробирки сразу вращали на вортексе в течение 1-2 мин для образования полимеросом, инкапсулирующих селеногликопротеины в водном ядре полимерных пузырьков на основе РЕО-Ь-РСЬ. Затем полимеросомы быстро экструдировали через поликарбонатную мембрану с заданным размером пор, используя экструдер Ь1РО8ОРЛ8Т, для получения заданного среднего диаметра полимеросом, в данном случае, в диапазоне 50-300 нм. Экструдированные полимеросомы затем впрыснули в диализную кассету для обмена раствора против изо-осмотического буфера с рН 7,4 в течение 24 ч, так чтобы удалить все не инкапсулированные селеногликопротеины.

Приготовили образец полимеросомы, инкапсулирующей селеногликопротеин при рН 7,4 с начальной концентрацией селеногликопротеина 10 мг/мл, и диализировали против изо-осмотического фосфатно-солевого буферного раствора. Этот образец визуализировали при помощи крио-ТЕМ при увеличении 21000х и 52000х для получения визуальной идентификации успешной инкапсуляции селеногликопротеина внутри полимеросом (смотри фиг. 13). Крио-ТЕМ позволяет визуализировать частицы при криогенных температурах в их естественных гидратированных состояниях, предотвращая посредством этого любые нежелательные конформационные изменения. Как правило, в визуализированном образце наблюдали одинаковые сферические полимеросомы размером около 100 нм или немного мельче. В некоторых случаях помимо полимеросом наблюдали примерно сферические агрегаты аморфного материала. Эти агрегаты могут состоять из селеногликопротеина, высвободившегося из ядра полимеросомы, и который затем осадился за счет различий рН внутри и снаружи полимеросомы во время визуализации образцов.

Селеногликопротеины, инкапсулированные в полимеросомы при рН 5,1, 6,2 и 7,4, были дополнительно определены измерением концентрации селена (смотри табл. 6). Один мл каждого образца селеногликопротеина, инкапсулированного в полимеросомы, высушили замораживанием, с образованием осадка белого порошка, который затем взвесили и проверили под увеличением 200Х. Все количество селеногликопротеинов, инкапсулированных в полимеросомы, растворили с использованием концентрированных кислот: перхлорной, азотной и хлороводородной кислот, при температуре от 100 до 175°С. Растворы разбавили до 50 мл, используя деионизированную (ΌΙ) воду, и анализировали при помощи прибора и методики МШЬЕИЩМ ЕХСЛЫВИК.

- 30 030339

Таблица 6

Результаты инкапсуляции

Композиции	рн инкапсуляции	Нанокапсулы (мг)	Концентрация 5е (м.д.)
	Отрицательный контроль (без селена)	8,0	0,02
1	5,1	4,6	46,5
2	6,2	3,3	39,6
3	7,4	8,4	32,2

Пример 6. Высвобождение селеногликопротеинов из нанокапсул.

Высвобождение селеногликопротеинов (8ОР) из композиций нанокапсул № 1 и 3 из табл. 6, выше, полученных с 10 мг/мл суспензии 8ОР, которые диализировали против буферов с рН 7,4 и 5,1 соответственно контролировали в течение 14 дней при 37°С. Для контролирования высвобождения селеногликопротеинов из нанокапсул, инкапсулирующих селеногликопротеин, диализированные суспензии концентрировали мембранным центрифугированием (использовали центрифужные пробирки с отсечением молекулярной массы 300 кД). Аликвоты концентрированных суспензий перенесли в изо-осмолярные буферные растворы (рН 5,1 или 7,4) и поддерживали при 37°С с N = 2 образца для каждой временной точки. Для оценки % высвобождения селеногликопротеина, образцы центрифугировали для отделения интактных нанокапсул в каждой точке времени. Чтобы убедиться, что нанокапсулы были эффективно выделены из образца селеногликопротеина, на отдельных пузырьках (ретентат) и свободном растворе (фильтрат) выполнили измерения динамического рассеяния света для измерения размеров частиц. УФабсорбцию свободного раствора измерили при 280 нм, а % высвобождения селеногликопротеинов рассчитали как

- А

Чсонечное исходное

),

^(Аобразца ^{- А}исходное )/(А к

где А_{исходное} является поглощением в 0 день, а А_{конечное} является поглощением в конце исследования, когда образцы солюбилизировали, чтобы вызвать полное высвобождение (смотри фиг. 12). В течение 14дневного периода около 70% 8ОР с рН 5,1 высвободилось из нанокапсул в устойчивом состоянии; тогда как около 50% высвободилось при рН 7,4. Исходная скорость высвобождения 8ОР при более низком рН, предположительно, обусловлена кислотно-катализируемым гидролизом мембраны нанокапсулы, с последующей устойчивой диффузией селеногликопротеинов через мембрану нанокапсул. Эти профили высвобождения заметно схожи с профилями доксорубицина, противоракового средства, инкапсулированного внутри полимеросом на основе РЕО-Ъ-РСЬ (смотри, например, ОИогодИсЫап е! а1., Масгото1еси1е§, 2006, 39 (5), 1673-1675). Эти данные подтверждают, что инкапсуляция селеногликопротеинов даже при относительно высокой загрузочной концентрации не оказывает отрицательного влияния на профиль высвобождения.

Пример 7. Получение полимеров, медленно высвобождающих селеногликопротеины (8ОР).

Синтез полимера А.

Смесь 1:1 8ОР, осажденных при рН 4,0 и 6,0 (смотри пример 5) использовали при получении полимеров, медленно высвобождающих 8ОР. 150 мг 8ОР растворили в 2 мл метакриловой кислоты и 1 мл деионизированной воды. Для ускорения растворения использовали небольшое нагревание. Образец 0,5 мл раствора поместили в 5-мл пробирку, содержащую 10 мг ΑΙΒΝ, перемешивали на вортексе в течение 1 мин, а воздух из пробирки удалили под вакуумом и заменили азотом. Содержимое пробирки полимеризовали, поместив пробирку в лабораторную печь, нагретую до 70°С, на 2 ч. Пробирку разбили, а полимер нарезали тонкими сегментами и высушили под высоким вакуумом.

Синтез полимера В.

Смесь 0,064 мл метакриловой кислоты, 0,091 мл 2-гидроксиэтилметакрилата, 1,427 мл диметакрилата этиленгликоля и 10 мг ΑΙΒΝ поместили в 5-мл пробирку и перемешивали с магнитной мешалкой, затем 75 мг 8ОР растворили в смеси 1,5 мл уксусной кислоты и 0,75 мл деионизированной воды. Воздух в пробирке заменили на азот, пробирку закрыли и поместили на масляную баню при 70°С на 4 ч. Пробирку разбили, а монолит полимера измельчили в порошок в фарфоровой ступке. Летучие вещества удалили из полимера под вакуумом.

Высвобождение 8ОР в зависимости от времени.

Одну и ту же методику медленного высвобождения 8ОР использовали для каждого из полимеров (А и В). 333,7±0,1 мг полимера поместили в 15-мл центрифужную пробирку, содержащую 5 мл цитратного буфера (рН 5,0), и осторожно встряхивали пробирку в течение 4 ч. Затем пробирки центрифугировали и собрали надосадочную жидкость, а осадок полимера промыли двумя 8-мл объемами деионизированной воды и высушили замораживанием. Из высушенного замораживанием образца взяли ~21 мг для анализа 8е. Экстракции 8ОР повторили еще два раза. Записали вес образцов. Во время этих образцов

- 31 030339

произошло снижение веса всех образцов (смотри табл. 8 и 9).

Таблица 8

Миллиграммы полимера для высвобождения
Полимер	Исходный	После 1 промывания	После 2 промывания	После 3 промывания
А	333,6	271,4	235,6	207,8
В	333,6	301,6	281,1	254

Таблица 9

Миллиграммы полимера, взятые для анализа 5е
Полимер	Исходный	После 1 промывания	После 2 промывания	После 3 промывания
А	21,1	20,5	20,9	20,6
В	20,6	20,5	20,6	20,8

Для оценки концентрации высвобожденного 8ОР измерили УФ-поглощение надосадочных жидкостей при 280 нм и сравнили с калибровочной кривой 8ОР, полученной в том же буфере (смотри табл. 10). _Таблица 10

Полимер А
	Поглощение	мл в 2 мл разбавлении	мг 50 Р/мл в исходном растворе	мг 5ОР, высвобожденного в течение интервала
1 промывание	0,298	0,1	0,781	3,907
2 промывание	0,349	0,5	0,183	0,913
3 промывание	0,.353	Без разбавления	0,046	0,231
Полимер В
	Поглощение	мл в 2 мл разбавлении	мг 50 Р/мл в исходном растворе	мг 5ОР, высвобожденного в течение интервала
1 промывание	0,35	0,25	0,366	1,831
2 промывание	0,572	Без разбавления	0,074	0,372
3 промывание	0,251	Без разбавления	0,033	0,165

Выполнили атомную абсорбционную спектроскопию (с использованием метода и инструмента ЕХСАЫВиК) для измерения концентрации остаточного 8е в полимере с медленным высвобождением (смотри табл. 11).

Таблица 11

Образец	Концентрация 5е в Полимере А (м.д.)	Концентрация 5е в Полимере В (м.д.)
Исходный образец	318,6	127,1
После 1 промывания	268,8	116,1
После 2 промывания	222,3	108,7
После 3 промывания	215,3	92,3

В соответствии с измерениями концентрации 8е в остаточном осадке 36,08% 8ОР высвободилось из полимера А после трехкратного 4-часового промывания (в целом 12 ч). При такой же обработке из полимера В высвободилось 30,11% 8ОР.

Пример 8. Щелочная экстракция внутриклеточных белков дрожжей.

200,0 г 8ЕЬ-РЬЕХ смешали с 1-л 0,1 М гидроксидом натрия при рН 11,5 и нагревали при 60°С в течение 8 ч. Затем смесь центрифугировали при 14000х д/10 мин/10°С, получив надосадочную жидкость и осадок. Осадок дважды промыли 400 мл деионизированной воды и высушили замораживанием, получив вес 54,5 г (смотри табл. 12). Надосадочную жидкость с рН 11,5 и промывочные растворы, которые были использованы, смешали вместе. рН понизили до 6,6 путем нейтрализации с использованием концентрированной хлороводородной кислоты. При нейтрализации образовались небольшие следы осадка и про- 32 030339

зрачная надосадочная жидкость. Осадок отделили центрифугированием, а надосадочную жидкость концентрировали при помощи устройств ультрафильтрации ΑΜ1ΌΟΝ 10 кДа. Концентрат промыли двумя порциями по 100 мл деионизированной воды и высушили замораживанием, получив 64,0 г коричневого твердого вещества. Оставшиеся фильтраты смешали (общей объем 2 л) и анализировали на концентрацию селена. Отделенный осадок анализировали на селен и азот/белок (смотри табл. 12).

Таблица 12

Щелочная экстракция

	Вес (г)	5е (м.д.)	Белок (вес.%)	Общий Зе (мг)	Зе (% ; общего	I от
ЗЕ1_-Р1_ЕХ	200,0	1600	37,0	320,0	100,0
Осадок после экстракции с рН 11,5	54,5	760	2,9	41,4	12,9
Концентрат с рН 6,6 Мол.вес>10 кДа	64,0	1918	52,9	122,8	38,3
Фильтрат, 2 л, Мол.вес<10 кДа	Н.А. (не анализировали	1909	Н.А.	155,8	48,7

Анализ фильтрата показал 40,7% снижение массы и 48,7% снижение селена, который не был выделен ультрафильтрацией через 10 кДа мембрану. β-Нуклеофильное/концевое элиминирование Ме8е-1 и Н8е-1 и окисленных форм этих функциональных групп из селеносодержащих пептидов привело к разложению исходной химической структуры 8ОР и потере массы и селена в фильтрат. Процесс производства, обычно используемый в данной области, дает увеличенный объем и повышенные концентрации селена в фильтрате, что приводит к образованию сточного потока, который может обладать вредным или пагубным действием (например, вредным для окружающей среды). В отличие от него, способы настоящего изобретения обеспечивают кислотную экстракцию и рН-зависимое фракционирование 8ОР из обогащенных селеном дрожжей (например, в крупномасштабном промышленном процессе). В условиях изменения температуры было обнаружено, что традиционный/стандартной метод с использованием щелочного гидролиза не работает при экстракции селеногликопротеинов из дрожжевых клеток. Как описано в настоящем документе, было открыто, что экстракция 8ОР из дрожжевых клеток с использованием кислотной экстракции является успешной.

- 33 030339

Ссылки

Следующие ссылки включены в настоящий документ путем ссылки в полном объеме, как если бы они были изложены в настоящем документе в полном объеме.

1. ΟθΓπίΓοί А., Ротейо III А. 1_. ‘ЕпЬапсес! ОгдагпсаИу Βοιιηά 5е1еп1ит Уеаз! Ргос1ис1юп Ву Рес1-Ва1сЬ РегтегФайоп’ ΰ. Адпс. Ροοό Спет. 47, 2496-2500 (1999).

2. Оет1гс1 А., Ротейо III А. 1_. ‘Ргос1ис1юп οί ОгдагпсаИу Βοιιηά Ве1еп1ит Уеаз! Ьу Сопйпиоиз РегтегФайоп’ ΰ. Адпс. Ροοό Спет. 47, 2491-2495 (1999).

3. ОиегЬапе 1_., Мез1ег Ζ. ‘РгоЬисйоп апс1 СЬагас1епгаИоп οί Еи11у 5е1епоте1Июп1пе1_аЬе11ес1 ЗассЬаготусез сегеУ181ае’ и.Адпс.Роос! Спет. 56,11792-11799, (2008).

4. КогЬо1а.М.; \/а1пю, А.; Ес1ае1тап, К. ‘Ве1еп1ит уеазГ Апп. СПп. Рез. 18, 65-68, (1986).

5. Вига1 Р.Р. Ыа1ига1 Αηΐοοχίάθηΐε ίη Ανίθη Νιιΐπΐιοη апс1 Рергос1исйоп’ ЫоИ1пдпат ипАегзИу Ргезз 2002, 234-236 (2002).

6. КеПу, Μ. Р.; Ромег Р. Р. ‘ Ргасйопайоп апс1 ίόβηΐίίίοθΐίοη οί ΐήβ тарг зе1еп1ит сотроипс1з ίη зе1еп1гес1 уеазГ ΰ. Оа1гу δοί. 78, 237-242 (1995).

7. МсбЬееЬу, δ.; КеПу, ΰ.; Тезз1ег, 1_.; Мез1ег, Ζ. ‘ИепйЛсайоп οί 6е1епоте1Ыоп1пе ίη зе1еп1гес1 уеаз! изюд Ьл/о-сНтепПопа1 Ιίηιιίά сЬготакэдгарЬу-тазз зрескотеку Ьазес! ргсИеотю апа1уз1з’ Апа1уз1 130, 35-37 (2005).

8. беЬтак ΰ. ΰ. ‘РгоЬисйоп οί Ье1а-С1исапз апс1 Маппапз’ ΙΙδ Ρθΐβηΐ ΑρρΙ. РиЬПсайоп РиЬ. Νο.: и δ 2006/0263415 А1.

9. Раутап, М.Р. ’ТЬе 1тро|1апсе οί зе1еп1ит ίο Ьитап ЬеаКЬ’ ТЬе 1_апсе1 356, 233-241 (2000).

10. ΜοΚβηζίβ, Р.С.; РакеЬу, Τ.δ.; Вескек, Ο.ΰ. ‘δβίβηίιιητ ап еззепйа! е1етеп! 1ог 1ттипе ίιιηοΐίοη’ Тгепс1з ίη 1ттипо1оду 19, 342-345 (1998).

11. Тар1его, Н.; Томпзепс!, ϋ.Μ.; Тем, ΚΌ. ‘ТЬе апйох1с1ап1 го1е οί зе1еп1ит апс1 зе1епосотроипс1з’ ВютесПс1пе&РЬагтасок1егару’ 57, 134-144 (2003).

12. СотЬз, С.Р.; Сгеу, \Л/.Р. ‘СЬеторгеуепйуе Адеп1з: бе1еп1ит’ РЬагтасо!. ТЬег. 79,

179-192(1998).

13. С1агк, 1_.С.; СотЬз Дг., С.Р.; ТигпЬиП, В.\Л/. е1 аП. ‘Екес1з οί бе1еп1ит бирр1етеп!айоп ίοτ Сапсег Ргеуепйоп ίη Райеп1з мИЬ Сагапота οί бкт’ ΰ. Ат. Мес1. Аззос. 276,

1957-1963(1996).

14. СИего, М.А.; Х/азаИо, М.С.; \/егс1ес1а, О.; Ретапбег, V.; Ве1апсоиг1, ϋ. ‘А Ргосезз 1ог 1Ье Сотр1е1е Ргасйопайоп οί Вакег’з УеазГ ΰ. СЬет. ТесЬ. ΒίοΐβοήηοΙ. 66, 67-71 (1996).

15. РоЬегде, М.Т.; ВогдегсНпд, Α.ΰ.; Пп1еу, ΰ.νν. ‘δρβοίθΐίοη οί бе1еп1ит Сотроипс1з кот ШдЬ бе1еп1ит ВгоссоП 1з Акес1ес1 Ьу 1Ье Ехкаскпд δοϊιιΐίοη’ ЛАдпс. Ροοό СЬет. 51,

4191-4197 (2003).

16. РитзИп е1 а!., Ιηί. ΰ οί ОЬезИу апс! Ре1а1ес1 Ме1аЬ. 0Ϊ3., 19, 458-463 (1995).

- 34 030339

17. ΕΙ-Вауоиту, ТМе го!е οί зе1еп1ит ίη сапсег ргеуепйоп, РМ|1ас1е1рп1а, Ι_ίρρίηοοΙΙ, 1-15, 1991.

18. Уие1а1. ΒίοΙ Тгасе Е1ет Вез, 56: 117-124(1997).

19. УозЫгам/а е! ак, ΰ 1Ча11 Сапсег 1пз1, 90: 1219-1224, (1998).

20. Вгоокз, е1 ак, ΰ Ыго1, 166: 2034-2038, (2001).

21. СаИапс! θΐ ак, ΰ. Ат. СоП ΝιιΐΓ., 12: 400-11 (1993); ОМасПпап е1 ак, Сапсег ϋβΐβοΐ Ргеу, 24: 305-13(2000).

22. Магйп, Веттдкэп'з Рпагтасеийса! Заепсез, 15ΐή Εά., Маек РиЫ. Со., Еаз1оп, Ра. (1975).

23. Соепппд е! ак, ΰ. Атт. Зек 59, 725-732 (1984); СеИоЯ е! ак, ϋ. Атт. 5οί. 70, 39343940(1992).

24. Ме151ег апб Апбегзоп, Аппи. Ββν. Вюспет. 52, 711-760 (1983).

25. ϋβίβνβ апб ΚθρΙοννίίζ, РИагт. ТИег. 52, 287-305 (1991).

26. Ра1тегапс1 Раи1зоп, 1Чи1г. Веу. 55, 353-361 (1997).

27. 5а1опеп е! ак, Ат. 1 ΕρίάβηηίοΙ. 120: 342-349 (1984).

28. \МПей βί ак, Ьапсе! 2: 130-134(1983).

29. νίΓΐθίτιο е1 ак, Сапсег 60: 145-148 (1987).

30. Ιρ„ 1 ΝιιΐΓ. 128: 1845-1854 (1998).

31. Ιρ апб 0ате1, Сапсег Вез. 45: 61-65 (1985).

32. Репсе βΐ ак, 102: 759-761 (1994).

33. Вескл/а1, В. 5., е1 ак, МесПса! НуроИпезез, 41 (2):150-159 (Аидиз11993).

34. Регпз С. М. Ыоус1, е1 ак, Арр. СПп. Вюспет.,26:83-88 (1989).

35. Ригпзтп, С. е! ак, 1п1егпаГ1 ΰ. οί ОЬезКу апб Ве1а1ес1 Ме1аЬ. ϋί3., 19(7):458-463 (1995).

36. Мапап, РгосеесНпдз οί 1Ие 15ΐή Аппиа! 5утроз1ит ЫойтдИат Ытуегзйу Ргезз, ЫоЙ1пдпат, и К, рр. 523-535 (1999).

37. ϋί3θήβΓ е1 ак Йоигпа! οί Рпузюа1 СИегтзйу В (2002), 106(11), 2848-2854.

38. Соиугеиг е! ак СгК Веу ТИег Огид Сагпег 5уз1. 2002; 19(2):99-134.

39. МозЬасИ. Тгепс1з ίη БюсИетюа! 5с1епсез, νοί. 7, рр. 92-96, 1994.

40. \Λ/ι_ιΙίί. Тгепс1з ίη Вю1есИпо1оду, νοί. 11, рр. 85-87, 1993.

41. Апбегззоп, е! ак, Мо1еси1аг 1п1егасйопз ίη Вюзерагайопз (1Чдо. Τ. Т. еск), рр. 383394.

- 35 030339

<110>

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ОЛТЕК, ИНК. КВЯТКОВСКИ, СТЕФАН ПАУЭР, РОНАН МЭТНИ, КЛЕЙТОН ГОРОХЧИАН, ПЭЙМАН П. ОСТЕРТАГ, ЭРИК М.

<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ВЫДЕЛЕНИЯ, ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ВВЕДЕНИЯ РАСТВОРИМЫХ СЕЛЕНОГЛИКОПРОТЕИНОВ

<130>	АЬЬТЕ-31278/ИО-1/ОКЕ
<140> <141>	РСТ/иЗ 11/52022 2011-09-16
<150> <151>	иЗ 13/051,646 2011-03-18
<150> <151>	иЗ 61/315,265 2010-03-18
<160>	10
<170>	РаВепВ1п уегзЧоп 3.5
<210> <211> <212> <213>	1 12 РКТ ЗассЬоготусез сегеуЧзЧае
<400>	1

О1у Зег Азр ТЬг МеВ Агд Зег Уа1 Зег Рго 11е Агд

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	2 12 РКТ ЗассЬоготусез сегеуЧзЧае

<220> <221> <222> <223>	М1ЗС_ГЕАТиКЕ (5)..(5) ТЬе гезЧЬие аВ ВЫз розЧВЧоп Чз ИпкеЬ Во зе1еп1ит.
<400>	2

О1у Зег Азр ТЬг МеВ Агд Зег Уа1 Зег Рго 11е Агд

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	3 6 РКТ ЗассЬоготусез сегеуЧзЧае
<400>	3

Зег О1у МеВ Зег Ьуз Ьуз

- 36 030339

<210> 4

<211> 6

<212> РКТ

<213> ЗассЬоготусез сегеутзтае

<220>

<221> М1ЗС_ЕЕАТиКЕ

<222> (3)..(3)

<223> Тйе гезШие аб бЫз ρο3ΐ6ίοη ίδ ИпкеТ. бо зе1еп1ит

<400> 4

Зег О1у Меб Зег Ьуз Ьуз

1 5

<210> 5

<211> 17

<212> РКТ

<213> ЗассЬоготусез сегеу1з1ае

<400> 5

О1и Уа1 11е О1у 11е Азр Рго Зег Зег А1а Меб Ьеи Зег 11е А1а О1и 1 5 10 15

Ьуз

<210> 6

<211> 17

<212> РКТ

<213> ЗассЬоготусез сегеутзтае

<220>

<221> М1ЗС_ЕЕАТиКЕ

<222> (11)..(11)

<223> ТЬе гезШие аб бЫз роз1б1оп 1з Ипкед. бо зе1еп1ит

<400> 6

О1и Уа1 11е О1у 11е Азр Рго Зег Зег А1а Меб Ьеи Зег 11е А1а О1и 1 5 10 15

Ьуз

<210> 7

<211> 5

<212> РКТ

<213> ЗассЬоготусез сегеутзтае

<220>

- 37 030339

<221> М1ЗС_ЬЕАТиКЕ <222> (2)..(2)

<223> <400> А1а Мек 1	ТЬе гезНие ак 7 : 11е Уа1 Агд 5	кЫз	розтктоп тз	ИпкеЬ	ко	зе1ептит
<210>	8
<211>	7
<212>	РКТ
<213>	ЗассЬоготусез	сегем!з1ае
<220>
<221>	М1ЗС_ЬЕАТиКЕ
<222>	(3)..(3)
<223>	ТЬе гезНие ак	кЫз	розтктоп тз	ИпкеЬ	ко	зе1ептит
<400>	8

Азр Туг Мек О1у А1а А1а Ьуз 1 5

<210> 9

<211> 8

<212> РКТ

<213> ЗассЬоготусез се^еνίзίае

<220>

<221> М1ЗС_ЬЕАТиКЕ

<222> (6)..(6)

<223> ТЬе гезЫие ак кЫз ρο3ΐϋίοη ίδ ИпкеЬ ко зе1еп1ит.

<400> 9

Зег 11е Уа1 Рго Ьеи Мек Азр Агд

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> РКТ

<213> ЗассЬоготусез се^еνίзίае

<220>

<221> М1ЗС_ЬЕАТиКЕ

<222> (1)..(1)

<223> ТЬе гезНие ак кЫз роз1к1оп 1з ИпкеЬ ко зе1епкит

<400> 10

Мек О1у Н1з Азр О1п Зег О1у ТЬг Ьуз

1 5

- 38

030339

Claims (9)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Композиция для обеспечения биологически доступного селена, которая включает рН 4- и/или рН 6-зависимую фракцию водорастворимых селеногликопротеинов, причем указанная композиция получена способом, включающим:

   a) обеспечение обогащенных селеном дрожжей;

   b) воздействие на обогащенные селеном дрожжи кислотных условий с рН от 1,5 до 5,5 с последующим центрифугированием, с образованием:

   1) осадка, включающего не растворимый в кислой среде материал; и

   ίί) жидкой фазы, включающей экстракт обогащенных селеном дрожжей, растворимый в кислотных условиях с рН 5,5 или ниже;

   c) осаждение селеногликопротеинов из жидкой фазы, включающей экстракт обогащенных селеном дрожжей, растворимый в кислотных условиях, путем повышения рН жидкой фазы до рН 6,0;

   ά) выделение осажденных селеногликопротеинов рН 4- и/или рН 6-зависимых фракций из жидкой фазы.
2. 2. Композиция для доставки селена, включающая композицию водорастворимых селеногликопротеинов согласно п.1 и носитель.
3. 3. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что носитель выбран из группы, состоящей из полимеросомы, полимера с медленным высвобождением, нанокапсулы и молекулярно фиксированного полимера.
4. 4. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что носитель представляет собой полимеросому, используемую для инкапсуляции селеногликопротеина.
5. 5. Композиция по п.4, отличающаяся тем, что средний диаметр полимеросомы, инкапсулирующей селеногликопротеин, составляет 50-300 нм.
6. 6. Способ получения водорастворимых селеногликопротеинов согласно п.1, включающий:

   a) обеспечение обогащенных селеном дрожжей;

   b) воздействие на обогащенные селеном дрожжи кислотных условий с рН от 1,5 до 5,5 с последующим центрифугированием, с образованием:

   1) осадка, включающего не растворимый в кислой среде материал; и

   ίί) жидкой фазы, включающей экстракт обогащенных селеном дрожжей, растворимый в кислотных условиях с рН 5,5 или ниже;

   c) осаждение селеногликопротеинов из жидкой фазы, включающей экстракт обогащенных селеном дрожжей, растворимый в кислотных условиях, путем повышения рН жидкой фазы до рН 6,0;

   ά) выделение осажденных селеногликопротеинов рН 4- и/или рН 6-зависимых фракций из жидкой фазы.
7. 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что на обогащенные селеном дрожжи воздействуют кислотными условиями при температуре выше, чем комнатная температура.
8. 8. Способ по п.6, отличающийся тем, что выделение осажденных селеногликопротеинов из жидкой фазы включает центрифугирование с образованием осадка осажденных селеногликопротеинов с последующим удалением жидкой фазы из осажденных селеногликопротеинов.
9. 9. Способ по п.6, отличающийся тем, что обогащенные селеном дрожжи являются высушенными, нежизнеспособными обогащенными селеном дрожжами, содержащими 2% или менее неорганического селена.

   - 39 030339