CN117618586A - 功能化纳米硒水溶胶及其治疗神经退行性疾病的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明具体涉及到Cs4‑SeNPs在制备抗神经退行性疾病例如帕金森病产品方面的应用。

Description

功能化纳米硒水溶胶及其治疗神经退行性疾病的应用
技术领域
本发明涉及功能化纳米硒水溶胶的制备和在治疗神经退行性疾病方面的新应用。
背景技术
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是多发于中老年人群的缓慢进展的，仅次于阿尔兹海默症的全球第二大神经退行性疾病。近年来，随着我国人口老龄化的增长，PD患者人数和发病率随之增加。目前国内有PD患者近300万，约占全球患病人数的1/3，远远超过世界平均水平。由于PD患者的社会功能和生活质量受到严重危害，给社会和家庭带来沉重的医疗负担。目前PD病因仍不明确，是多种因素共同作用的结果。PD药物治疗主要在于提高脑内多巴胺(DA)的含量以及降低乙酰胆碱的活力，多数患者的症状可因而得到缓解，但不能阻止病变的自然进展。因此，针对PD的新的防治手段研发一直是科学界研究热点。
硒是人体必需的一种微量元素，生物学功能广泛。硒在自然环境以无机硒和有机硒的形式存在。硒缺乏会导致脑内硒依赖性抗氧化酶表达量以及活性降低，增加脑内氧化应激，促进脑神经退行性病变。研究还发现，老年人血硒水平与其运动协调性和运动速度呈正相关，提示硒对PD可能的预防作用。动物实验也证明了无机硒干预可预防PD大鼠DA能神经元的丢失以及神经递质DA及其代谢产物的减少，从而改善PD大鼠的运动障碍。但由于硒的有效剂量与有毒剂量之间的范围极其狭窄，容易造成硒中毒，严重限制了硒在PD防治中的应用。近年，纳米硒因其较常见的无机硒和有机硒的生物兼容性高、毒性低与生物活性显著而成为新的研究热点。然而，没经过特殊调控的纳米硒极易聚集，其生物活性更会因纳米尺度的变化而大大降低。因此，纳米硒制备方法需要不断进行创新。
冬虫夏草是一种珍贵的中药药用真菌，由于野生冬虫夏草非常稀少且价格昂贵，中国科学院于第4次成功分离培养的虫草菌丝体(Cs4)，在过去的20年中受到了商界和科学家的推崇，促进了它大量的商业生产和科学研究。药理学和临床研究表明，多糖是Cs4的主要生物活性成分之一，具有广泛的健康促进和治疗作用，如免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、改善低血糖、高脂血症以及肝、肾和骨保护作用。
本发明人已经利用虫草菌丝体Cs4水溶性多糖蛋白成功将纳米硒功能化，制备出Cs4多糖蛋白功能化纳米硒(Cs4-SeNPs)，不但提高了硒的生物利用度和生物活性，而且降低了硒的细胞毒性并验证了其显著的体内外促进骨骼生长活性。Cs4-SeNPs用于儿童青少年期促进骨发育以及中年期防治骨质疏松症、骨流失、骨折等疾病状态拥有巨大的潜力。发明人的研究成果申请了专利“一种纳米硒水溶胶及其制备方法与应用”并已被授权(专利号：ZL 201911215358.5)。
本领域仍然需要治疗神经退行性疾病的新制剂。
发明内容
我们利用虫草菌丝体Cs4水溶性多糖蛋白成功将纳米硒功能化，制备出Cs4多糖蛋白功能化纳米硒(Cs4-SeNPs)，不但提高了硒的生物利用度和生物活性，而且降低了硒的细胞毒性。
我们在小鼠中对制备的Cs4-SeNPs进行的毒理测试结果发现，Cs4-SeNPs比常见的无机硒(亚硒酸钠)毒性降低了7-8倍；比常见的有机硒(硒代蛋氨酸)毒性降低了4-5倍。在此基础上，我们将Cs4-SeNPs应用于帕金森病(PD)的动物模型，研究其可能的治疗功效。我们研究首次发现，相比较相同硒含量的硒代蛋氨酸(Selenomethionine，Se-Met；硒酵母中主要的有机硒形式)，只有Cs4-SeNPs能够通过改善PD小鼠行为学和增加黑质多巴胺(DA)合成酶，酪氨酸羟化酶(TH)表达，从而显著地预防PD小鼠模型中DA能神经元的丢失。此外，我们通过PD大鼠模型进一步验证Cs4-SeNPs对PD的作用，发现Cs4-SeNPs也明显地改善PD大鼠行为学和增加黑质TH表达，减少PD大鼠的DA能神经元丢失。Cs4-SeNPs拥有应用于防治PD的巨大开发前景。
在第一个方面，本发明提供了包含虫草菌丝体Cs4多糖蛋白功能化纳米硒水溶胶的复合物在制备治疗有需要的受试者中神经退行性病变的制剂中的用途。
在一个实施方案中，神经退行性病变为帕金森病。
在一个实施方案中，硒来自二氧化硒或亚硒酸盐。
在一个实施方案中，亚硒酸盐为亚硒酸钠。
在一个实施方案中，虫草菌丝体Cs4多糖蛋白通过水提虫草菌丝体Cs4得到。
在一个实施方案中，虫草菌丝体Cs4多糖蛋白功能化纳米硒水溶胶的制备方法包括以下步骤：
(a)通过水提虫草菌丝体Cs4得到虫草菌丝体Cs4多糖蛋白溶液；
(b)向步骤(a)得到的虫草菌丝体Cs4多糖蛋白溶液中加入二氧化硒溶液或亚硒酸盐溶液，混合均匀，得到混合溶液A；
(c)向混合溶液A滴加还原性维生素C溶液，混匀，得到混合溶液B；
(d)待混合溶液B反应完全，经过透析得到虫草菌丝体Cs4多糖蛋白功能化纳米硒水溶胶。
在前述实施方案中，于混合溶液B中，虫草菌丝体Cs4多糖蛋白的浓度为60～6000mg·L-1，还原性维生素C的浓度为1.0～100mmol·L-1，二氧化硒或亚硒酸盐的浓度为0.2～20mmol·L-1。
在前述实施方案中，于混合溶液B中，虫草菌丝体Cs4多糖蛋白的浓度为300～1200mg·L-1，维生素C的浓度为10.0～100mmol·L-1，二氧化硒或亚硒酸盐的浓度为2.0～20mmol·L-1。
在前述实施方案中，于混合溶液B中，还原性维生素C与二氧化硒或亚硒酸盐的摩尔比为5∶1。
在第二个方面，本发明提供了一种用于治疗神经退行性疾病的制剂，其包括虫草菌丝体Cs4多糖蛋白功能化纳米硒水溶胶。
在一个实施方案中，所述制剂为口服药剂。
附图说明
图1.虫草多糖功能化纳米硒(Cs4-SeNPs)制备示意图。
图2.新型Cs4-SeNPs表征。([A和B：Nanosight NS3000颗粒跟踪分析仪；C：JEOL-2010型高解像投射电子显微镜(TEM)；及D1-3：JEOL-2010型超高解像投射电子显微镜+Horiba EX-250型光能源扩散分析仪(HR-TEM-EDX)。
图3.不同组别小鼠在爬杆实验中的爬杆时间(A)和转棒实验中的在棒时间(B)。Se-Met和Cs4-SeNPs剂量均以硒含量(1mg Se/kg/d)计算并灌胃。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001vs.模型组。
图4.不同组别小鼠黑质的酪氨酸羟化酶(TH)的基因(A)和蛋白(B)表达。Se-Met和Cs4-SeNPs剂量均以硒含量(1mg Se/kg/d)计算并灌胃。*p＜0.05，**p＜0.01vs.模型组。
图5.不同组别小鼠纹状体的神经递质水平，包括多巴胺(Dopamine，DA)(A)，3，4-二羟基苯乙酸(3，4-Dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC(B)和高香草酸(Homovanillicacid，HVA)(C)。Se-Met和Cs4-SeNPs剂量均以硒含量(1mg Se/kg/d)计算并灌胃。*p＜0.05，***p＜0.001vs.模型组。
图6.不同组别小鼠黑质的凋亡关键蛋白基因表达，Bax，Bcl-2以及Bax/Bcl-2比值：细胞感染因子TNFα和IL-6基因表达。Se-Met和Cs4-SeNPs剂量均以硒含量(1mg Se/kg/d)计算并灌胃。*p＜0.05，**p＜0.01vs.模型组。
图7.不同组别小鼠黑质的硒蛋白基因表达。Se-Met和Cs4-SeNPs剂量均以硒含量(1mg Se/kg/d)计算并灌胃。*p＜0.05vs.模型组。
图8.不同组别小鼠的阿扑吗啡诱导旋转行为测试结果。###p＜0.001，模型组vs.正常组；*p＜0.05，Cs4-SeNPs组vs.模型组。
图9.不同组别大鼠损毁侧黑质的酪氨酸羟化酶(TH)的基因(A)和蛋白(B)表达。#p＜0.05，模型组vs.正常组；*p＜0.05，Cs4-SeNPs组vs.模型组。
图10.不同组别小鼠在转棒实验中的在棒时间。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001vs.模型组。
图11.不同组别小鼠黑质的酪氨酸羟化酶(TH)的蛋白表达。*p＜0.05vs.模型组。
具体实施方式
本发明的有益效果：
(1)本发明提供Cs4-SeNPs的新用途，用于制备抗帕金森病药物或特医食品或保健食品。
(2)虫草菌丝体Cs4多糖蛋白富含亲水性的羟基(-OH)和氨基(-NH)基团，提高了纳米硒的水溶性，增强了硒的生物利用度以及硒进入脑组织的量，从而增强疗效但同时减少毒副作用的整体治疗效果。
(3)本发明以虫草菌丝体Cs4多糖蛋白为纳米硒功能化分子，在调控剂作用下提高其生物利用度和生物活性，获得一种稳定性好、抗帕金森病活性显著的新型纳米硒。
(4)本发明使用的虫草菌丝体Cs4多糖蛋白在化学结构上具有特殊性，多糖部分具有多羟基结构，因而对纳米硒具有很强的物理吸附作用，避免纳米硒进一步聚集沉淀，有效的对纳米硒表面进行修饰，发挥很好的粒径调控和稳定化作用。
在第一个方面，本发明提供了包含虫草菌丝体Cs4多糖蛋白功能化纳米硒水溶胶的复合物在制备治疗有需要的受试者中神经退行性病变的制剂中的用途。本文中神经退行性疾病的意思是，以神经功能和结构的渐进性丧失和神经元死亡为特征的神经疾病。神经退行性病症的非限制性实例包括帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、亨延顿氏病(HD)、脑卒中、脑肿瘤、心肌缺血、老年性黄斑变性(AMD)、视网膜色素变性(RP)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS，例如，家族性ALS和散发性ALS)，和多发性硬化症(MS)。
在一个优选的实施方案中，神经退行性病变为帕金森病。
在一个实施方案中，Cs4多糖蛋白功能化纳米硒水溶胶的复合物的制备方法如附图1所示。
在一个实施方案中，硒来自二氧化硒或亚硒酸盐。亚硒酸盐包括亚硒酸钠、亚硒酸钾、亚硒酸钡、亚硒酸锌等。在一个优选的实施方案中，亚硒酸盐为亚硒酸钠。
在一个实施方案中，虫草菌丝体Cs4多糖蛋白通过水提虫草菌丝体Cs4得到。具体而言，虫草菌丝体Cs4多糖蛋白功能化纳米硒水溶胶的制备方法包括以下步骤：
(a)通过水提虫草菌丝体Cs4得到虫草菌丝体Cs4多糖蛋白溶液；
(b)向步骤(a)得到的虫草菌丝体Cs4多糖蛋白溶液中加入二氧化硒溶液或亚硒酸盐溶液，混合均匀，得到混合溶液A；
(c)向混合溶液A滴加还原性维生素C溶液，混匀，得到混合溶液B；
(d)待混合溶液B反应完全，经过透析得到虫草菌丝体Cs4多糖蛋白功能化纳米硒水溶胶。
在前述实施方案中，于混合溶液B中，虫草菌丝体Cs4多糖蛋白的浓度为60～6000mg·L-1，还原性维生素C的浓度为1.0～100mmol·L-1，二氧化硒或亚硒酸盐的浓度为0.2～20mmol·L-1。
在前述实施方案中，于混合溶液B中，虫草菌丝体Cs4多糖蛋白的浓度为300～1200mg·L-1，维生素C的浓度为10.0～100mmol·L-1，二氧化硒或亚硒酸盐的浓度为2.0～20mmol·L-1。
在前述实施方案中，于混合溶液B中，还原性维生素C与二氧化硒或亚硒酸盐的摩尔比为5∶1。
在第二个方面，本发明提供一种用于治疗神经退行性疾病的制剂，其包括虫草菌丝体Cs4多糖蛋白功能化纳米硒水溶胶。
本发明的复合物制备的制剂可使用下述各种过程中任一种来生产，包括但不限于常规混合、溶解、制粒、包衣、乳化、封装和冻干。制剂可采用下述各种形式的任一种，包括但不限于水溶胶、无菌溶液、混悬剂、乳剂、冻干剂、片剂、滴丸剂、微丸剂、胶囊剂、粉剂、糖浆剂、酏剂或适于施用的任何其它剂型。优选的剂型为口服剂型。
本文公开复合物制备的制剂可任选地包括但不限于其它药学上可接受的组分(或药学组分)，包括但不限于缓冲剂、防腐剂、张力调节剂、盐、抗氧化剂、渗透度调节剂、生理物质、药理物质、填充剂、乳化剂、润湿剂、甜味剂或调味剂等。调节pH的各种缓冲液和方法可用于制备本文公开的制剂。这种缓冲液包括但不限于醋酸盐缓冲液，硼酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，中性缓冲盐水以及磷酸盐缓冲盐水。
本发明的虫草菌丝体Cs4多糖蛋白功能化纳米硒水溶胶的制备方法包括以下步骤：
(a)通过水提虫草菌丝体Cs4得到虫草菌丝体Cs4多糖蛋白溶液；
(b)向步骤(a)得到的虫草菌丝体Cs4多糖蛋白溶液中加入二氧化硒溶液或亚硒酸盐溶液，混合均匀，得到混合溶液A；
(c)向混合溶液A中滴加还原性维生素C溶液，混匀，得到混合溶液B；
(d)待混合溶液B反应完全，经过透析得到虫草菌丝体Cs4多糖蛋白功能化纳米硒水溶胶。
上述步骤(a)中，虫草菌丝体Cs4多糖蛋白可采用下述方法制备得到：按照虫草菌丝体Cs4与水的重量比为1∶20的比例，向虫草菌丝体Cs4中加入水，加热至95～100℃，提取2小时后取滤液；按照前面的步骤将滤渣重复提取一次，重复提取的时间为2小时，合并两次提取所得滤液，透析24小时，截留分子量为8,000，得到所述虫草菌丝体Cs4多糖蛋白。
上述步骤(c)中，所述的混合溶液B中，维生素C与所述的二氧化硒或亚硒酸盐的摩尔比为5∶1。
本发明采用的虫草菌丝体Cs4多糖蛋白溶液、二氧化硒溶液或亚硒酸盐溶液以及维生素C溶液均是以水作为溶剂。上述步骤(d)中，混合溶液B是否反应完全可依据产物的颜色进行判断，例如，待产物中出现的红色不再加深即表明反应完全。另外，向混合溶液A中加入维生素C溶液时，可采用将维生素C溶液滴加到混合溶液A中的方式。上述步骤(c)中，维生素C为还原型维生素C。
作为本发明所述的纳米硒水溶胶制备方法，于混合溶液B中，虫草菌丝体Cs4多糖蛋白的浓度为60～6000mg·L-1，二氧化硒或亚硒酸盐的浓度为0.2～20mmol·L-1，维生素C的浓度为1.0～100mmol·L-1。技术人员可根据不同浓度需要的新型纳米硒水溶胶，计算出上述的原料所需采用的浓度体积。
在一个实施方案中，于混合溶液B中，维生素C与所述的二氧化硒或亚硒酸盐的摩尔比为5∶1。
在一个优选的实施方案中，于混合溶液B中，虫草菌丝体Cs4多糖蛋白的浓度为300～1200mg·L-1，维生素C的浓度为10.0～100mmol·L-1，二氧化硒或亚硒酸盐的浓度为2.0～20mmol·L-1。
虫草菌丝体Cs4多糖蛋白在化学结构上具有特殊性，多糖部分具有多羟基结构，因而对纳米硒具有很强的物理吸附作用，避免纳米硒进一步聚集沉淀，有效的对纳米硒表面进行修饰，发挥良好的粒径调控和稳定作用。此外，虫草菌丝体Cs4多糖蛋白富含亲水性的羟基(-OH)和氨基(-NH)基团，提高了纳米硒的水溶性，增强了硒的生物利用度以及硒进入脑组织的量，从而增强疗效但同时减少毒副作用的整体治疗效果。此外，采用本发明方法制得的新型纳米硒，可在液相中以水溶胶的形式长时间保存，分散性和稳定性好，可作注射、喷雾等多种剂型应用。
本发明所述的新型纳米硒水溶胶可在2～10℃下以溶胶形态保存，保存期为30～60天。
实施例
本实施例中所用的材料和试剂均商业可得，且所用到的方法是本领域熟知的。
1)虫草多糖功能化纳米硒(Cs4-SeNPs)的制备和表征
Cs4-SeNPs制备过程如图1所示。也可参考专利号201911215358.5。制备成功的Cs4-SeNPs平均粒径为73.2±3.49nm(图2A)，在4℃储存6周后仍高度稳定，颗粒尺寸没有明显变化(图2B)。根据TEM成像的结果(图2C)，硒作为分散良好的球形颗粒存在于水中，平均直径约为30nm。在HR-TEM图像中测得的条纹间距约为(图2D1)，Cs4-SeNPs的相应选定区域电子衍射(SAED)模式显示出一系列由白点构成的同心环(图2D2)。来自另一种用于确定元素组成的显微镜技术HR-TEM-EDX(图2D3)的结果表明，Cs4-SeNPs包含非常高的Se水平(83.9％)，表明使用Cs4多糖成功制备了纳米硒。
2)虫草多糖功能化纳米硒(Cs4-SeNPs)对帕金森病(PD)小鼠模型的保护作用
我们研究了虫草多糖稳定制备的纳米硒(Cs4-SeNPs)用于帕金森病小鼠急性模型，并与相同硒含量的亚硒酸钠(SeNa，无机硒形式)和硒代蛋氨酸(Se-Met，常见的有机硒形式)并行比较，观察不同形式的硒对PD可能的神经保护作用。
实验选用40只C57BL/6J雄性小鼠，随机分为5组，每组8只；分别为空白正常组(Normal)，PD小鼠模型组(Model)，SeNa处理PD小鼠组(SeNa)，Se-Met处理PD小鼠组(Se-Met)，虫草多糖纳米硒处理PD小鼠组(Cs4-SeNPs)。PD小鼠模型选用神经毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)造模制成急性PD小鼠模型。MPTP的用量为20mg/kg，一天内每2小时一次腹腔注射，共4次，只注射一天。SeNa、Se-Met、Cs4-SeNPs剂量均以硒含量(1mg Se/kg/d)计算和同体积对照水在MPTP注射前12天开始灌胃给各组小鼠，持续共14天；第13天，小鼠注射MPTP造模，造模成功后，第14天进行小鼠行为学测试。第15天，小鼠在麻醉状态被处死，收取脑组织检测黑质(Substantia nigra，SN)中多巴胺合成酶酪氨酸羟化酶(TH)蛋白基因和蛋白表达；以及凋亡关键蛋白、感染因子和硒蛋白的基因表达。
结果发现，SeNa处理组PD小鼠几乎全部死亡，其数据未能计算于最终结果中，也说明无机硒的毒性太大。而相同硒含量的Se-Met与Cs4-SeNPs处理PD小鼠14天后，只发现Cs4-SeNPs对PD小鼠具有统计学意义的显著的保护作用，而Se-Met的保护作用不明显。Cs4-SeNPs可明显改善PD小鼠的运动障碍，增加PD小鼠黑质区多巴胺(DA)能神经元标志物酪氨酸羟化酶(TH)的表达；同时提高PD小鼠纹状体神经递质DA及其代谢物水平。机理探索发现，Cs4-SeNPs拥有比Se-Met更强的升高脑组织中硒蛋白表达的能力，同时具有更强的抗神经感染和抗神经细胞凋亡的作用。具体各实验及其结果如下所示：
I行为学实验
行为学实验包括经典的爬杆实验和转棒实验。
爬杆实验：将一根0.5m长，直径为1cm的金属杆固定在一个洁净的小鼠笼中，杆上缠绕一层无粘着力的纱布。在正式实验前小鼠将接受为期两天的适应性爬杆训练。在正式实验当天，将小鼠以头朝下状放置于杆的顶部，让其自由爬行至杆的底部，记录小鼠到达杆底部的时间。每只小鼠进行三次测试，每次时间记录是以实验者将小鼠放置在杆上后开始，当小鼠到达杆底部时间记录结束，结果取平均值。
转棒实验：转棒测试用于评价小鼠的运动协调能力。造模前，所有小鼠进行转棒实验的学习。造模后，将小鼠置于转棒仪上，转棒速度设为15rpm，测试时间为300s，测定小鼠在棒时间作为测定运动机能的体现。测定3次，取平均值。
结果发现，PD小鼠模型表现出PD样运动失调，在爬杆实验中的爬杆时间比正常对照组明显延长；同时在转棒实验中的在棒时间明显下降，此结果说明PD小鼠造模是成功的。在此基础上，如图3所示，相比较有机硒Se-Met，纳米硒Cs4-SeNPs能够显著的降低PD小鼠爬杆时间(图3A)和提高其在棒时间(图3B)，从而说明只有预防性给予Cs4-SeNPs才能减轻PD小鼠的运动症状。
II黑质TH基因和蛋白表达
qPCR检测基因表达：将脑组织(约20mg)与50ml试管中的1mlTrizol混合，在冰水浴中匀浆。匀浆后，将混合物转移到eppendorf管中，并使用标准RNA提取方案开始总RNA提取。使用具有随机六聚体的转录酶(Thermo Fermentas，USA)从2μg总RNA反转录合成互补DNA(cDNA)。Real time PCR在iCycleriQ5系统(Bio-Rad Laboratories)中进行。20μl RT-PCR反应由10μl Maxima SYBR Green qPCR Master mix(Roche)、1μl 10μM正向和反向引物(见下表1；本发明所有的引物序列见表1和表2)、7μl无核酸酶水和1μl模板(每个反应使用10ngcDNA模板)组成。热曲线包括在95℃下进行5分钟的初始变性，然后在95℃下进行40次变性10秒，在59℃下退火30秒，在72℃下延伸30秒。18S核糖体RNA(18S rRNA)基因被用作标准化的内源参考。PCR数据通过公式2-ΔΔCT计算。每个样品一式两份进行。通过上述方法分析目标基因的表达水平，用样品中的18S rRNA表达水平对数据进行标准化。
表1用于RT-PCR实验的小鼠基因引物
蛋白质印迹分析：收集中脑组织并在冰上用冰冷的裂解缓冲液匀浆。离心裂解物并获得总蛋白质。通过凝胶中的SDS-PAGE分离来自脑组织的等量蛋白质。分离后，将蛋白质转移到PVDF膜上。用5％脱脂牛奶封闭膜，然后与相应的小鼠抗TH一抗(1∶1000，Millipore，USA)或小鼠抗β-actin(1∶1000，Santa Cruz，USA)孵育，随后与山羊抗小鼠IgG的二抗(1∶1000，Santa Cruz，USA)孵育。完成孵育后，通过使用ECL系统下的化学发光试剂盒使条带可视化，最后通过Image J软件进行光密度测定。
结果发现，PD小鼠模型表现出显著的黑质TH表达降低，说明MPTP注射导致了DA能神经元的大量丢失，符合PD主要病理特征。PD小鼠灌胃相同硒含量的Se-Met和Cs4-SeNPs14天后，只有Cs4-SeNPs可以显著提高黑质TH的基因和蛋白表达，而Se-Met作用不明显(图4A&4B)。
III纹状体神经递质水平
LC-MS测定神经递质及其代谢物：每个纹状体样品取0.1g放入离心管中，用500μl蒸馏水和去离子水稀释，均质化。然后将600μl乙腈添加到每个匀浆中，并将混合物离心(14000g，4℃)10分钟。每管收集300μl上清液，用氮气吹干，最后溶解在150μl乙腈中。随后将每个纹状体样品的100μl乙腈溶液与10μl硫酸靛酚试剂混合，进行色谱分析。超高性能液相系统(Waters，美国)用于色谱分析，包括二元泵、在线脱气机、自动进样器系统和柱温箱。DA及其代谢物3，4-二羟基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)的标准品是新鲜制备的，并注入色谱柱进行校准。
结果发现，PD小鼠模型纹状体的神经递质多巴胺(DA)及其代谢产物3，4-二羟基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)相比较正常小鼠都显著下降，说明MPTP注射导致了DA能神经元的大量丢失，伴随DA神经递质的大幅下降，符合PD主要病理特征。PD小鼠灌胃相同硒含量的Se-Met和Cs4-SeNPs 14天后，只有Cs4-SeNPs可以显著提高纹状体中DA和其代谢产物的水平，尤其是DOPAC和HVA，但Se-Met作用不明显(图5A-5C)。
IV黑质凋亡关键蛋白和感染细胞因子的基因表达
qPCR检测基因的方法如上所述，引物序列见上表1。
初步的机理研究如图6所示，MPTP小鼠黑质凋亡水平增加(Bax以及Bax/Bcl-2比值在PD小鼠黑质中显著增加)；同时黑质感染被激活(表现为细胞感染因子如TNFα和IL-6的明显升高)。而只有Cs4-SeNPs可通过升高Bcl-2表达，显著降低Bax/Bcl-2比值，从而降低黑质凋亡水平；Cs4-SeNPs明显降低PD小鼠中升高的IL-6基因表达水平，可能从而降低黑质的感染水平。
V黑质硒蛋白基因表达
qPCR检测基因的方法如上所述，引物序列见上表1。
更重要的是，我们检测了PD小鼠黑质中含量较丰富的6种硒蛋白，包括谷胱甘肽过氧化物酶1和4(GPX1，GPX4)，15KDa硒蛋白(SEP15)，硒蛋白M(Selp M)，硒蛋白P(Selp P)，硒蛋白W(Selp W)。结果发现Cs4-SeNPs只可显著特异性升高PD小鼠黑质的其中两种硒蛋白的表达，包括Selp W和Selp M。参见图7。然而相同硒含量的Se-Met则不能升高检测的6种硒蛋白中的任何一种。此结果说明，补充不同形式的硒升高脑内硒蛋白的能力有不同，且存在硒蛋白特异性。Cs4-SeNPs的神经保护作用与其升高硒蛋白表达关系密切。
3)虫草多糖功能化纳米硒(Cs4-SeNPs)对帕金森病(PD)大鼠模型的保护作用
为了进一步确定Cs4-SeNPs对PD的防治作用，我们将其用于PD大鼠模型观察其可能的神经保护作用。PD大鼠模型的制备也是参照经典的制备方法，以神经毒素6-羟多巴胺(6-OHDA)在大鼠内侧前脑束(MFB)行单侧两点注射来损毁大鼠的DA能神经元。实验选用24只雄性Wistar大鼠，适应环境后，随机分为三组，包括正常组，模型组和Cs4-SeNPs干预组。实验开始后，相当于小鼠的低剂量Cs4-SeNPs(70μg Se/kg/d)口服灌胃于PD大鼠，每日一次，连续灌胃28天；大鼠在第8天进行6-OHDA定位注射于MFB进行造模；第29天进行行为学测试；第30天，大鼠被处死并收集相应组织样本进行生化指标的检测。结果发现，低剂量的Cs4-SeNPs也可以显著改善PD大鼠的运动障碍以及明显减少PD大鼠DA能神经元的丢失来提供神经保护作用。具体的实验结果如下所示：
I行为学实验
旋转行为测试：在实验结束时，在带有自动“旋转计”的容器中测试大鼠被阿扑吗啡腹腔注射(2.5mg/kg，ip，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)诱导的旋转行为。大鼠向病灶侧方向旋转为正值，大鼠在30分钟内转360°的次数则被表示为不对称净旋转分数，分值越高，表明运动障碍越显著。
结果发现，6-OHDA单侧注射于大鼠的MFB的3周后，PD大鼠表现出阿扑吗啡诱导下的旋转行为，证明造模是成功的。在此基础上，口服低剂量Cs4-SeNPs(70μg Se/kg/d)四周后，可以使得PD大鼠在阿扑吗啡诱导下的旋转行为明显减少，说明Cs4-SeNPs显著改善了PD大鼠的运动障碍。
II黑质TH基因和蛋白表达
qPCR检测基因表达方法如上所述。大鼠目标基因为TH，内参基因为β肌动蛋白，相应的引物序列如下表2所示。
表2：用于实时PCR实验的大鼠基因引物
蛋白质印迹分析方法如上所示。实验中使用的抗TH和抗β-actin的一抗和二抗均与小鼠相同。结果发现，PD大鼠模型表现出显著的损毁侧黑质的TH表达降低，尤其是TH蛋白表达，说明6-OHDA导致了黑质DA能神经元的大量丢失，符合PD主要病理特征。PD大鼠口服低剂量Cs4-SeNPs共四周后，损毁侧黑质的TH基因和蛋白表达都显著增加，更证实了Cs4-SeNPs对抗PD的神经保护作用。
4)不同纳米硒对帕金森病(PD)小鼠模型的保护作用比较
我们利用前期实验中成功建立的PD急性小鼠模型，研究比较了不同制备方法的纳米硒以及虫草多糖本身对PD的作用，包括本专利的虫草多糖纳米硒(Cs4-SeNPs)，虎奶菇多糖纳米硒(PTR-SeNPs)，壳聚糖纳米硒(CS-SeNPs)以及虫草多糖(Cs4 PS)。相同硒含量(1mgSe/kg/d)的Cs4-SeNPs，PTR-SeNPs，CS-SeNPs以及与Cs4-SeNPs中粗多糖量相同的虫草粗多糖(6mg/kg/d)口服灌胃于PD小鼠，每日一次，连续灌胃14天；第15天，MPTP造模；第16天进行行为学测试；第17天，小鼠被处死，收集相应的组织样本进行生化指标检测。结果发现，只有Cs4-SeNPs可以明显改善PD小鼠的行为学障碍以及提高PD小鼠中脑DA合成酶TH的表达。结果说明Cs4-SeNPs针对PD神经保护作用的特异性，是虫草多糖和硒结合后才发挥的作用，并非由于单独虫草多糖或硒的作用。具体如下所示：
I行为学实验
转棒实验方法如上所述。
结果发现，PD小鼠模型表现出PD样运动失调，在转棒实验中的在棒时间明显下降，此结果说明PD小鼠造模是成功的。在此基础上，如图10所示，纳米硒Cs4-SeNPs和CS-SeNPs干预后能最好的提高PD小鼠在棒时间，改善其行为学；且Cs4-SeNPs作用强于CS-SeNPs。而PTR-SeNPs以及虫草多糖(Cs4 PS)都不能改善PD小鼠行为障碍。
II黑质TH基因和蛋白表达
qPCR检测基因表达和蛋白质印迹分析方法如上所述。
结果发现，PD小鼠模型表现出显著的黑质TH蛋白表达降低，说明MPTP注射导致了DA能神经元的大量丢失，符合PD主要病理特征。PD小鼠灌胃相同硒含量的不同纳米硒以及相同粗多糖含量的虫草粗多糖14天后，只有Cs4-SeNPs可以显著提高黑质TH的蛋白表达(图11)。

Claims (11)

1.包含虫草菌丝体Cs4多糖蛋白功能化纳米硒水溶胶的复合物在制备治疗有需要的受试者中神经退行性疾病的制剂中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中神经退行性疾病为帕金森病。
3.根据权利要求1的用途，其中硒来自二氧化硒或亚硒酸盐。
4.根据权利要求3的用途，其中亚硒酸盐为亚硒酸钠。
5.根据权利要求1-4中任一项的用途，其中虫草菌丝体Cs4多糖蛋白通过水提虫草菌丝体Cs4得到。
6.根据权利要求1-4中任一项的用途，其中虫草菌丝体Cs4多糖蛋白功能化纳米硒水溶胶的制备方法包括以下步骤：
(a)通过水提虫草菌丝体Cs4得到虫草菌丝体Cs4多糖蛋白溶液；
(b)向步骤(a)得到的虫草菌丝体Cs4多糖蛋白溶液中加入二氧化硒溶液或亚硒酸盐溶液，混合均匀，得到混合溶液A；
(c)向混合溶液A滴加还原性维生素C溶液，混匀，得到混合溶液B；
(d)待混合溶液B反应完全，经过透析得到虫草菌丝体Cs4多糖蛋白功能化纳米硒水溶胶。
7.根据权利要求6的用途，于混合溶液B中，虫草菌丝体Cs4多糖蛋白的浓度为60～6000mg.L-1，还原性维生素C的浓度为1.0～100mmol·L-1，二氧化硒或亚硒酸盐的浓度为0.2～20mmol·L-1。
8.根据权利要求6的用途，于混合溶液B中，虫草菌丝体Cs4多糖蛋白的浓度为300～1200mg·L-1，维生素C的浓度为10.0～100mmol·L-1，二氧化硒或亚硒酸盐的浓度为2.0～20mmol·L-1。
9.根据权利要求6的用途，于混合溶液B中，还原性维生素C与二氧化硒或亚硒酸盐的摩尔比为5∶1。
10.一种用于治疗神经退行性疾病的制剂，其包括虫草菌丝体Cs4多糖蛋白功能化纳米硒水溶胶。
11.根据权利要求10的制剂，其中制剂为口服药剂。
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