CN114886872A - 一种载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒及其应用 - Google Patents
一种载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒及其应用。其制备方法包括:将三聚磷酸钠水溶液加入鳕鱼皮胶原肽和三甲基壳聚糖的混合水溶液中得载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒。该载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒可以有效提高鳕鱼皮胶原肽的生物利用度,可以制备成口服制剂口服给药,而且可以有效预防或减轻机体脑内氧化应激所导致的损害。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒及其应用。
背景技术
随着社会人口老龄化日趋严重,老年性疾病已成为影响人类健康的突出性问题,例如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿氏舞蹈症等。阿尔茨海默病(Alzheim-erdisease,AD)是老年痴呆的主要亚型,是指神经系统退行性变导致的记忆力和其他认知功能受损,严重程度足以干扰日常生活的神经变性病,其流行趋势受到广泛关注。AD患者初期会出现进行性记忆力衰退、认知功能障碍、运动功能丧失和人格改变等症状,后期将失去说话、行动及吞咽功能等自理能力,生活质量严重降低,最终导致死亡,给病人本身及家属都带来了极大的精神压力和经济负担。同时,AD日益增加的发病率,造成了严重的公共健康问题。AD发病原因复杂,由多种因素长期共同作用引起,关于其发病机制,根据其临床表现、病理学特征及相关的发病因素等提出了诸多学说,包括胆碱能损伤学说、β-淀粉样蛋白学说、tau蛋白学说、氧化应激学说、钙稳态学说、雌激素降低学说等。越来越多的证据表明,氧化应激与自由基在AD疾病发生发展中发挥重要的作用。AD患者脑内氧化应激所导致的损害明显先于β-淀粉样蛋白沉积及神经纤维缠结的发生,其被认为是一系列病理过程级联反应的启动信号,从而加速了AD的病理进展。因此,基于此机制治疗AD可能成为阿尔茨海默病治疗的重要途径,具有重要意义。
鳕鱼皮胶原肽(CSCPs)是一种不同于陆生动物和淡水鱼、浅海鱼胶原蛋白肽的具有高度生物安全性的小分子活性肽(分子量一般100-5000Da)。现代诸多药理研究资料均表明,对鳕鱼皮胶原肽进行选择性水解可制得具有极强的抗氧化活性的肽段,其可通过清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基等抑制氧化应激,是一种抗氧化药物的潜在优质原料。多肽类药物由于具有良好的选择性和生物活性,往往疗效显著、不良反应小、安全性高,很少引起严重的免疫反应(少数异源性蛋白除外),已成为治疗多种疾病的一线药物。
但由于多肽类药物属于水溶性物质,较大的亲水性使其很难被细胞摄取,经过肠胃、肝脏等首过效应,会遇到多种生物障碍,口服生物利用度极低,且易受温度、酸碱度及一些物理因素(如超声波、剧烈振荡)等的影响而失活。另外,由于血脑屏障(BBB)的存在,约有98%的小分子药物无法通过外周给药的方式直接递送入脑,阻碍了用于脑部疾病诊断和治疗。目前临床上多肽类药物以注射剂型为主,但注射给药的顺应性较差。
发明内容
针对以上问题,本发明目的之一在于提供了一种载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒,提高了鳕鱼皮胶原肽的生物利用度,可以制备成口服制剂口服给药,而且可以有效预防或减轻机体脑内氧化应激所导致的损害。
为了达到上述目的,可以采用以下技术方案:
本发明一方面提供了一种载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒,其制备方法包括:将三聚磷酸钠水溶液加入鳕鱼皮胶原肽和三甲基壳聚糖的混合水溶液中得载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒。
具体地,三甲基壳聚糖(TMC)是壳聚糖(CS)甲基化形成的一种衍生物,具有永久性正电荷,TMC比CS更易溶解并具有更强的生理活性。近年来,TMC是广泛应用的药物载体材料,对于口服药物,其可通过多种机制增强药物吸收(增加药物在细胞旁路的吸收、增加药物在肠道上皮细胞的渗透量等),防止药物体内降解,提高生物利用度,从而可以降低给药剂量,为昂贵药物提供经济优势。纳米载药系统可通过细胞旁路或肠黏膜派伊尔氏结的M细胞吞噬途径吸收,也可直接被肠上皮细胞吸收,其作为给药系统能够实现小分子化学药物、蛋白多肽药物以及基因药物的递释,用于疾病的诊断和治疗。利用纳米效应,可达到长效释药或靶向治疗的目的,纳米技术可被应用于药物向脑部的递送研究中。由于三甲基壳聚糖纳米颗粒的带正电部分与脑毛细血管内皮上带负电的质膜表面区域之间的静电相互作用可触发吸附介导的胞吞作用(AMT),从而通过BBB递送药物表现出脑靶向现象,故基于三甲基壳聚糖的纳米药物递释系统可以用于治疗脑部疾病的药物递送。脑靶向药物递释系统的研究对于多种脑部疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、脑胶质瘤和HIV感染等的诊断和治疗有着重要的意义。
进一步地,三甲基壳聚糖与载鳕鱼皮胶原肽的质量比可以为1:1-2。
进一步地,三甲基壳聚糖可以是以硫酸二甲酯作为甲基化试剂制备而得。
进一步地,三聚磷酸钠水溶液中还包括海藻酸钠。
具体地,有研究表明,以三聚磷酸钠为交联剂制备的三甲基壳聚糖纳米粒在提高某些药物的包封率时,体外释放存在着突释现象,使用三聚磷酸钠联合海藻酸钠作为交联剂对制备的纳米粒子进行修饰,可避免这一现象的发生。
进一步,载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒的粒径可以≤200nm。
具体地,根据文献报道,微粒的粒径小于10um时,则可以被M细胞摄取并通过小肠上皮细胞间隙Peryer氏结区域进入门脉系统;微粒的粒径在小于2OOnm时,既可以通过细胞内吞,也可以通过细胞旁路穿过肠道粘膜而被吸收,因此本发明将载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒的粒径控制在200nm以下。
进一步地,三聚磷酸钠水溶液加入鳕鱼皮胶原肽和三甲基壳聚糖的混合水溶液中的方式为滴加。
进一步地,将载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒加入支架剂后冻干得载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒冻干剂。
具体地,为保证冻干粉末中固形物能保持原体积,不塌陷,不皱缩,再分散性良好,有时需要加入适当的支架剂,对于纳米粒的冻干,一般用糖类或醇类物质作保护剂。
本发明另一方面提供了一种用于预防或治疗阿尔茨海默病药物,其包括上述的载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒和可药用载体。
进一步地,所述可药用载体适用于及口服给药、肺部吸入给药、鼻黏膜给药、微针经皮给药或注射给药剂型中任一种。
具体地,药学上可接受的载体和/或稀释剂指的是可以将上述的载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒制备成各种所需的剂型。例如可以作为口服剂的片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片、膏剂等,作为非口服剂,可以作为注射剂、栓剂、经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂等,本领域的技术人员能够根据给药途径和给药对象等选择适当的剂型。比如为了提高顺应性,优选可以制成口服剂。
本发明另一方面提供了上述的载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒在制备用于预防或治疗阿尔茨海默病制剂中的应用。
本发明另一方面提供了上述的载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒在制备用于预防或减轻机体脑内氧化应激所导致损害的制剂中的应用。
本发明有益效果至少包括:
(1)本发明提供的载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒可以有效提高鳕鱼皮胶原肽的生物利用度,可以制备成口服制剂口服给药,而且可以有效预防或减轻机体脑内氧化应激所导致的损害。
(2)本发明提供的载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒利用离子胶凝法制备,操作简便,无需使用有机溶剂,过程温和,能有效地保护鳕鱼皮胶原肽的活性。
附图说明
图1为TMC的红外光谱图。
图2为TMC的核磁氢谱。
图3为纳米粒胶体宏观图(从左到右依次为TMC-TPP/SL NPs、TMC-TPP-CSCPs NPs、TMC-TPP/SL-CSCPs NPs和去离子水)。
图4为CSCPs的吸收曲线。
图5为CSCPs的标准曲线。
图6为TMC-TPP-CSCPs NPs和TMC-TPP/SL-CSCPs NPs的累积释放率。
图7为TMC-TPP/SL-CSCPs NPs的电镜图。
图8为TMC-TPP/SL-CSCPs NPs的粒度分布图。
图9为不同季氨程度TMC制成纳米粒的zeta电位。
图10为冻干制剂宏观图。
图11为冻干制剂电镜图。
图12为冻干制剂粒度分布图。
图13为小鼠宏观状态图。
图15为小鼠获得性训练路径图。
图16为小鼠空间探索路径图。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明,但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整,仍属于本发明的保护范围。
本文中使用的术语仅用于描述特定实施例,并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义,否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的,应当理解,诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语,并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的,根据情况,“/”可以被解释为“和”或“或”。
为了更好地理解本发明,下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容,但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。
实施例1三甲基壳聚糖(TMC)的合成及表征
三甲基壳聚糖合成
(1)以碘甲烷作为甲基化试剂制备(一步法)
称取2.0g壳聚糖、4.8g碘化钠于烧杯中,向其加入80mlN-甲基吡咯烷酮、11ml15%氢氧化钠溶液、11.5ml的碘甲烷,60℃水浴下,避光反应90min,得棕黄色反应液,将该反应液使用一定量乙醇析出沉淀,沉淀倒入10%40ml氯化钠溶液中以Cl-交换I-,离心分离,再使用乙醇及乙醚洗涤沉淀各两次,干燥得白色粉末,将其在去离子水中透析3d,冷冻干燥得TMC1。
(2)以碘甲烷作为甲基化试剂制备(两步法)
称取2.0g壳聚糖、4.8g碘化钠于烧杯中,向其加入80mlN-甲基吡咯烷酮、11ml氢氧化钠溶液及11.5ml的碘甲烷,60℃水浴下避光反应60min,得棕黄色反应液,将该反应液使用一定量乙醇析出沉淀,并使用乙醇及乙醚洗涤沉淀各两次;将沉淀转移至烧杯中,再加入80mlN-甲基吡咯烷酮,60℃水浴下磁力搅拌,挥发乙醚;再加入4.8g碘化钠,11mL氢氧化钠溶液及7mL的碘甲烷,60℃水浴下反应40min,得棕红色反应液;反应产物倒入10%40ml氯化钠溶液中以Cl-交换I-,再使用一定量乙醇析出沉淀;离心分离,再使用乙醇及乙醚洗涤沉淀各两次,干燥得白色粉末,将其在去离子水中透析3d,冷冻干燥得TMC2。
(3)以硫酸二甲酯作为甲基化试剂制备
称取0.85g壳聚糖置于烧杯中,称取0.88gNaCl溶于15ml去离子水中,将烧杯置于40℃水浴锅中,打开搅拌器,匀速搅拌10min,使得壳聚糖均匀分散在溶液里;用移液管量取硫酸二甲酯16ml加入烧杯中,称取1.2gNaOH溶于10ml去离子水中,将其缓慢滴加到烧杯中,磁力搅拌5h,得到黄色粘稠反应液,反应结束,将反应液进行旋转浓缩蒸发掉多余的溶剂,再将浓缩液转入透析袋,投入去离子水中透析3天,每12h换1次去离子水;透析完后,用旋转蒸发仪蒸发掉多余的溶剂(蒸发至原体积的1/3),再于无水乙醇中静置24h得沉淀;将沉淀进行过滤,然后用乙醇及乙醚各洗涤2次;将产物冷冻干燥得TMC3。
三甲基壳聚糖表征
(1)三甲基壳聚糖红外(IR)测定
将以上不同制备方法制备的TMC1、TMC2和TMC3分别与KBr干粉压片,用傅里叶变换红外光谱仪测定样品的红外光谱(扫描波数范围为4000-400cm-1,分辨率4cm-1)。
结果如图1示,壳聚糖谱图中由N-H弯曲振动引发的1595cm-1处的吸收峰,在TMC的谱图上消失。另外,TMC谱图中1473-1490cm-1处出现了新吸收峰,其归属于-N(CH3)3的不对称伸缩振动吸收峰,这就表明反应过程中壳聚糖分子的亲核中心氨基上所连的两个氢原子被甲基取代。
(2)核磁共振氢谱分析(1HNMR)
将以上不同制备方法制备的TMC1、TMC2和TMC3分别溶于D2O中配成10g/L溶液,用300MHz核磁共振仪进行分析,检测温度为353K,核磁共振光谱参数为:脉冲强度为90°,脉冲宽度为8.2pm;LB=0.3Hz。结果如图2所示。
(3)TMC季氨化程度分析
TMC季氨化程度的计算公式:DQ(%)=[(∫TM/∫H)Xl/9]X100%;DQ(%):表示季氨化程度,∫TM:表示在3.3-3.6ppm左右季氨基团中H峰的积分,∫H:表示从4.7至5.7ppm1H峰的积分。
将以上不同制备方法制备的TMC1、TMC2和TMC3分别计算季氨化程度,季氨化程度分别为8.36%和54.19%和56.92%。
TMC季铵化程度的不同决定了所带正电荷的多少,季氨化程度越高,其所带的正电荷越多,与蛋白质、多肽药物之间的相互作用越强,因此其对纳米粒的载药和释药具有重要的影响。同时,TMC的季氨化程度对于药物的渗透有重要作用。有研究表明,季氨化程度高的TMC在PH7.4时为一种有效的吸收促进剂,而季氨化程度较低的TMC在此条件下作为吸收促进剂是无效的,故季氨化程度为8.36%的TMC不适合用于本发明。加之碘甲烷毒性大、挥发性强且价格昂贵,DMS法合成TMC更加经济,故选取季氨化程度为56.92%的TMC(即TMC3)进行进一步的纳米粒的制备。
实施例2纳米粒的制备及表征
纳米粒的制备
(1)空白纳米粒的制备
室温下,称取10mg TMC溶于5ml去离子水中,于水浴锅中搅拌;称取1.2mg三聚磷酸钠(TPP)溶于2ml去离子水中,另称取0.6mg海藻酸钠(SL)加入其中;将所得溶液以1ml/min的速度滴加到TMC溶液中,磁力搅拌10min后,即可得到空白纳米粒胶体(TMC-TPP/SL NPs)。
(2)TMC-TPP-CSCPs NPs制备
室温下,称取10mg TMC,21mg CSCPs溶于5ml去离子水中,于水浴锅中搅拌;称取1.2mg三聚磷酸钠(TPP)溶于2ml去离子水中,以1ml/min的速度滴加到TMC溶液中,磁力搅拌10min后,即可得到载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒(TMC-TPP-CSCPs NPs)。
(3)TMC-TPP/SL-CSCPs NPs制备
称取10mgTMC,21mgCSCPs溶于5ml去离子水中,置于25℃水浴锅下搅拌;称取1.2mgTPP溶于2ml去离子水中,另称取0.6mg海藻酸钠(SL)加入其中,将所得溶液以1ml/min的速度滴加到CSCPs和TMC混合溶液中,磁力搅拌10min后,即可得到经海藻酸钠修饰的载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒(TMC-TPP/SL-CSCPs NPs)。
纳米粒胶体的表征
(1)颜色观察
上述制备的TMC-TPP/SL NPs、TMC-TPP-CSCPs NPs和TMC-TPP/SL-CSCPs NPs如图3所示,肉眼观察均呈现白色乳光,在激光笔的照射下均出现丁达尔效应,初步说明纳米粒胶体制备成功。
(2)包封率和载药量
通过紫外分光光度法测定其包封率和载药量;将制备好的胶体在10000*g,4℃的条件下离心15分钟,分离上清液(待测液),以去离子水作为空白对照,测定上清液中游离肽的含量,离心后得到的沉淀,真空冷冻干燥后称重,包封率及载药量用以下公式计算:
包封率=(投药量-游离肽量)/投药量;
载药量=(投药量-游离肽量)/纳米粒干重。
吸收曲线的绘制:以去离子水为参比液,将浓度为0.3mg/ml的鳕鱼皮胶原肽溶液,进行波长扫描测量,得到吸收曲线。结果如图4所示,从吸收曲线可得0.3mg/mL标准鳕鱼皮胶原肽溶液的最大吸收波长为212nm,此波长下的吸光度为2.029。
标准曲线的绘制:取六只试管,编号后用去离子水配制0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mg/ml鳕鱼皮胶原肽溶液,在212nm下测定各管中溶液的吸光度值,得标准曲线。结果如图5所示,标准曲线方程为y=1.8237x+0.0189,R2=0.9942。
待测样品的测定:分别取2ml的上述制备的TMC-TPP/SL-CSCPs NPs和TMC-TPP-CSCPs NPs待测液,用去离子水稀释至10ml,按上述方法测定212nm处的吸光度值,平行测定三次。TMC-TPP/SL-CSCPs NPs和TMC-TPP-CSCPs NPs的吸光度分别为0.738和0.727,代入标准曲线方程可得TMC-TPP/SL-CSCPs NPs和TMC-TPP-CSCPs NPs的游离态含量。根据上述的包封率及载药量的公式计算,上述制备的TMC-TPP/SL-CSCPs NPs和TMC-TPP-CSCPs NPs的包封率分别为86.86%和87.06%,载药量分别为72.39%和81.62%,均具有较高的包封率和载药量。
(3)体外释放测定
分别将上述制备好的TMC-TPP/SL-CSCPs NPs和TMC-TPP-CSCPs NPs转移至透析袋中,置于PH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中,37℃水浴下搅拌,每隔15min取2ml外液测试,并补充相同量的释放递质,以保证释放介质的总体积保持不变,测定值取三次平均值,根据以下公式计算药物累积释放率:
Q:药物累计释放率;Ve:PBS的置换体积;V0:释放介质总体积;Ci:第i次置换取样时释放液的浓度;mdrug:纳米粒子所载药物总质量;n:置换PBS的次数。
体外释放结果如图6示,未经SL修饰的纳米粒(TMC-TPP-CSCPs NPs)在2h内的累计释放率为52.73%,6h内达81.57%;而经SL修饰的纳米粒(TMC-TPP/SL-CSCPs NPs)在2h内的累计释放率仅为25.52%,6h内达58.37%,24h后达79.71%,说明作为缓控释制剂,TMC-TPP/SL-CSCPs NPs更优,可以持续缓慢释放鳕鱼皮胶原肽,延长药物作用时间。
(3)形态观察
将上述制备的TMC-TPP/SL-CSCPs NPs用红外烤干后置于载物台上,喷金制样,然后将样品置于日立S-4800扫描电镜中,在加速电压5kV下观察粒子的形态并拍照。结果如图7示,本发明制备的纳米粒子呈近球形,但是出现了大量的粘连、团聚的现象,可见本发明制备的纳米粒不适合以液体状储存。
(4)zeta电位、粒径及分布测定
将上述制得的TMC-TPP/SL-CSCPs NPs(TMC,56.92%)样品,超声5min后,移取一定量的胶体加到纳米粒度及Zeta电位分析仪(DLS)中检测,记录电位及粒径。将制得TMC-TPP/SL NPs(TMC,8.36%/54.19%/56.92%)样品,超声5min后,移取一定量的胶体加到纳米粒度及Zeta电位分析仪(DLS)中检测,记录电位。
粒径结果如图8所示,上述制备的纳米粒粒径在100nm左右,但是由于制备的胶体的不稳定性,粒径分布非常不均。
Zeta电位的重要意义在于它的数值与胶态分散的稳定性相关。Zeta电位是对颗粒之间相互排斥或吸引力的强度的度量。分子或分散粒子越小,Zeta电位的绝对值(正或负)越高,体系越稳定,即溶解或分散可以抵抗聚集。反之,Zeta电位(正或负)越低,越倾向于凝结或凝聚,即吸引力超过了排斥力,分散被破坏而发生凝结或凝聚。电位测试结果如图9示,由TMC(8.36%)制备的纳米粒电位为负,由TMC(54.19%、56.92%)制备的纳米粒电位均为正值,负载鳕鱼皮胶原肽后电位有一定程度的下降。一般认为zeta电位值在|30mV|以下胶体不稳定,在|30mV|以上稳定性相对较好,故由zeta电位数值可知,载肽后胶体的稳定性较差,不利于储存使用,故方便后续使用,将其制成冻干制剂进行保存。
实施例3纳米粒冻干剂的制备及表征
纳米粒冻干剂的制备
在冻干样品时向已制备的胶体中加入5%蔗糖作为支架剂,振摇使溶,按常规方法置-40℃超低温冷柜中预冻3h后,在真空冷冻干燥机中冻干,得到所需冻干品。并将TMC-TPP/SL-CSCPs NPs冻干剂置于冰箱(4℃,-20℃),分别于1、2、3月后取出,考察外观及再分散性。
纳米粒冻干制剂的表征
(1)外观评价
上述制备的冻干制剂宏观如图10示,基本可维持原体积,不塌陷、不皱缩,质地细腻,表面光洁,色泽均匀、无花斑,呈疏松状,可整块脱落但不散碎,有一定脆性。
(2)形态观察
将冻干制剂置于载物台上,喷金制样,然后将样品置于日立S-4800扫描电镜中,在加速电压5kV下观察粒子的形态并拍照。
冻干制剂电镜图如图11示,所制备的纳米粒子整体大小、形态均较均匀,呈球形,偶见粘连。
(3)zeta电位、粒径及分布测定
将上述制得的TMC-TPP/SL-CSCPs NPs冻干剂用去离子水复溶后,超声5min,移取一定量的胶体加到纳米粒度及Zeta电位分析仪(DLS)中检测,记录电位及粒径。冻干制剂粒径分布如图12示,粒径在90nm左右,和冻干前无显著差异。
(4)复溶性及稳定性研究
1、2、3月后取TMC-TPP/SL-CSCPs NPs冻干剂,观察外观,未见明显变化,加入去离子水振摇后均能很快分散得均匀的胶体,复溶性良好,再分散性良好。
实施例4动物试验
(1)实验动物
昆明雄性小鼠,6-8周龄,体重35-45克,SPF级,动物饲养条件:(25±2)℃,相对湿度:(55±5)%。
(2)实验动物分组与造模
采用每日颈背部皮下注射D-半乳糖的方法进行造模并每日灌胃相应受试物,具体操作如表1示。
表1实验动物分组与造模
(3)小鼠一般状态观察
每天观察各组小鼠一般状态,如饮水、摄食、活动度、毛色光度变化等方面,在各组间进行比较(每周拍照一次),如图13示。
第1周为适应性饲养,各组小鼠饮食正常、反应敏捷、发色为白色且浓密、精神状态良好;八周造模结束后,N组小鼠饮食正常,行动比较敏捷,毛色鲜亮,有良好的精神状态;M组小鼠出现饮食下降,反应不灵敏,毛色暗淡及扎堆、精神萎靡等症状,说明造模成功;J组小鼠与M组小鼠体征近似,活动缓慢,活动量下降,嗜睡且喜蜷缩,发色逐渐发黄且稀疏,精神状态下降,说明基质对D-Gal致衰小鼠体征等无明显改善作用;T组与M组相比,其体征、精神等有一定程度的改善,但不明显,说明鳕鱼皮胶原肽可在一定程度上对抗D-Gal致小鼠损伤;NPs组小鼠在行动、毛发状态、精神状态等方面均有明显改善,近乎接近正常组小鼠,说明本实验制备的TMC-TPP/SL-CSCPs NPs对改善D-gal致衰小鼠外观、精神等一定的效果。
(4)Morris水迷宫
试验开始前先将小鼠放入水池中(不放平台)自由游泳1分钟,使其熟悉迷宫环境。之后开始为期五天的训练,每天固定时间段训练4次,4次训练分别从四个不同的起始点(不同象限)将小鼠放入水中。训练开始时,将平台置于第二象限,小鼠找到平台后或60秒内找不到平台(由实验者将其拿上平台),在平台上休息15秒,再进行下一次试验。自由录像记录系统记录小鼠找到平台的时间(逃避潜伏期,escapelatency)和游泳路径,小鼠60秒内找不到平台(潜伏期记为60秒),每日以小鼠四次训练潜伏期的平均值做为当日的学习成绩。第6天撤除原平台进行测试,将小鼠从第四象限中心处放入水中,所有小鼠必须为同一入水点,记录小鼠在1min内跨越原平台的次数。
记忆获得能力实验结果
水迷宫实验是一种非常有效的测试啮齿类动物空间学习记忆能力的方法。本实施例中各组小鼠在训练期间逃避潜伏期均呈递减趋势(D1-D5),提示小鼠空间学习记忆能力随训练次数增加有所增强。但M组小鼠逃避潜伏期在五天内下降速度很慢,说明其脑损伤明显,N组小鼠逃避潜伏期下降速度相对最快,其余各组下降速度介于N组和M组之间,P组和NPs组下降尤为显著。
获得性训练第1天,各组小鼠之间未见显著差异,从第三天开始,M组小鼠逃避潜伏期与N组相比,显著增加(P<0.01),说明D-gal致衰模型建立成功;T组小鼠与M组小鼠相比,逃避潜伏期有所缩短,但未见显著性差异(P>0.05);J组小鼠与M组小鼠相比,未见差异,说明基质对本损伤小鼠模型无干扰作用;P组和NPs组小鼠与M组小鼠、NPs组小鼠与T组相比逃避潜伏期显著下降,第3-4天具有显著性差异(P<0.05),第5天具有极显著差异(P<0.01),具有统计学意义。结果说明使用纳米粒作为载体材料比单独使用多肽对于D-gal致小鼠脑损伤更具治疗效果,如图14示。另外,由图15可以看出,M组和J组小鼠运动路线无规律性,而N组、P组、NPs组小鼠寻找平台的目的性明确,说明本实验制备的TMC-TPP/SL-CSCPs NPs能提高衰老模型小鼠的空间学习能力。
空间探索实验结果
小鼠空间探索结果如表2和图16,与N相比,M组的小鼠在目标象限停留时间显著减少(P<0.01),穿越原平台次数显著下降(P<0.01),表明持续注射D-gal会损伤小鼠记忆能力。P组、T组和NPs组小鼠与M组小鼠相比,在目标象限停留时间和穿越平台次数不同程度的增加,其中P组、NPs组小鼠与M组小鼠相比,有显著性差异,且NPs组小鼠与T组小鼠相比,在目标象限停留时间和穿越平台次数显著增加(P<0.01),这可表明TMC-TPP/SL-CSCPs NPs能提高衰老模型小鼠的空间记忆能力。
组别 | 目标象限穿越次数(次) | 目标象限停留时间(s) |
N | 5.17±2.04 | 17.22±2.91 |
M | 1.5±2.07<sup>##</sup> | 8.95±4.22<sup>##</sup> |
P | 4.17±1.17<sup>**</sup> | 14.71±5.02* |
T | 3.5±0.84<sup>*</sup> | 10.73±1.3 |
J | 1.67±1.37 | 9.2±4.44 |
NPs | 4.83±1.72<sup>**</sup> | 15.22±3.57<sup>**,§</sup> |
注:#,vs.N;*,vs.M;§,vs.T;##/**,P<0.01;*/§,P<0.05。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围。
Claims (10)
1.一种载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒,其特征在于,其制备方法包括:将三聚磷酸钠水溶液加入鳕鱼皮胶原肽和三甲基壳聚糖的混合水溶液中得载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒。
2.根据权利要求1所述的载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒,其特征在于,三甲基壳聚糖与鳕鱼皮胶原肽的质量比为1:1-2。
3.根据权利要求1所述的载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒,其特征在于,三甲基壳聚糖是以硫酸二甲酯作为甲基化试剂制备而得。
4.根据权利要求1所述的载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒,其特征在于,三聚磷酸钠水溶液中还包括海藻酸钠。
5.根据权利要求1至4中任一所述的载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒,其特征在于,三聚磷酸钠水溶液加入鳕鱼皮胶原肽和三甲基壳聚糖的混合水溶液中的方式为滴加。
6.根据权利要求1至4中任一所述的载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒,其特征在于,将载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒加入支架剂后冻干得载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒冻干剂。
7.用于预防或治疗阿尔茨海默病药物,其特征在于,包括权利要求1至6中任一所述的载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒和可药用载体。
8.根据权利要求7所述的用于预防或治疗阿尔茨海默病药物,其特征在于,所述可药用载体适用于口服给药、肺部吸入给药、鼻黏膜给药、微针经皮给药或注射给药剂型中任一种。
9.权利要求1至6中任一所述的载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒在制备用于预防或治疗阿尔茨海默病制剂中的应用。
10.权利要求1至6中任一所述的载鳕鱼皮胶原肽三甲基壳聚糖纳米粒在制备用于预防或减轻机体脑内氧化应激所导致损害的制剂中的应用。
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