CN110585136A - 一种负载蛋白多肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒及其制备方法 - Google Patents

一种负载蛋白多肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种负载蛋白多肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒及其制备方法，三甲基壳聚糖与水溶性生物素通过N‑酰胺化反应，得到生物素修饰的三甲基壳聚糖；将生物素修饰三甲基壳聚糖溶解于乙酸溶液中，先后加入蛋白多肽溶液和离子交联剂溶液，搅拌，过滤，即得负载蛋白多肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒。本发明的纳米粒由生物素修饰的三甲基壳聚糖、离子交联剂和蛋白多肽通过聚电解质作用形成；该纳米粒制备方法简便，粒径均一，稳定性好；该纳米粒可主动靶向小肠上皮细胞生物素受体，并利用三甲基壳聚糖促进蛋白多肽在肠道的黏附和吸收，从而提高蛋白多肽的口服生物利用度，具有较好的应用前景。

Description

一种负载蛋白多肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒及其制 备方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别涉及了一种负载蛋白多肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒及其制备方法。
背景技术
随着医药技术的快速发展，具有药理活性的蛋白多肽类生物大分子不断涌现，并在激素调节、抗病毒及抗肿瘤等治疗领域发挥着重要作用。目前临床上应用的蛋白多肽大多以注射给药为主。但长期频繁的注射给药所造成的肌体损伤及精神、经济压力往往令患者难以承受。因此对该类药物非注射给药途径的研究意义重大，其中口服给药因其简便、患者顺应性好、可接受程度高，而尤为引人关注。然而，蛋白多肽类药物口服给药存在诸多问题，比如：1)口服后，蛋白多肽遭受胃酸、消化酶的影响而降解失活；2)因分子量大，且易与小肠上皮黏液发生静电排斥，不易突破黏液层进入吸收上皮；3)缺乏脂溶性，渗透性差，难以通过小肠上皮细胞吸收进入体循环等。
纳米药物传输系统的发展，为蛋白多肽的口服递送提供了可行性。各种高分子化合物，尤其是生物可降解、具有生物黏附性的天然有机高分子化合物成为口服纳米给药系统极具潜力的基质材料之一。壳聚糖是由甲壳素经脱乙酰化处理得到的一系列具有不同脱乙酰度和分子量的高分子。壳聚糖表面带有正电荷，可以通过静电相互作用黏附在带负电荷的小肠黏液层中，从而延长纳米粒在小肠的滞留时间。同时，壳聚糖能够通过与细胞膜的相互作用，导致紧密结合的膜蛋白发生结构重构，从而打开消化道上皮细胞间的紧密连接，增加药物通过细胞旁路途经转运，进一步促进药物的吸收。壳聚糖在消化道还具有一定的酶抑制作用，能够保护蛋白多肽在消化道不被破坏。壳聚糖经化学改性可得到一系列性质更加优良的衍生物，如三甲基壳聚糖、羧甲基壳聚糖等。其中，三甲基壳聚糖(TMC)是壳聚糖的甲基化衍生物。与壳聚糖相比，三甲基壳聚糖除了保留壳聚糖优良的生物黏附性和吸收促进作用之外，其溶解度更大，在生理条件下正电性更强，更有利于和带负电的小肠上皮黏膜结合。
在纳米载药系统表面修饰某些功能基团，如可被消化道黏膜上皮细胞识别或转运的配体、底物分子等，将有助于进一步增强纳米粒透过消化道黏膜屏障的能力。在肠道内，上皮细胞膜上存在多种受体和转运蛋白，如维生素受体、转铁蛋白受体，以及氨基酸、糖类和胆盐的转运蛋白等。生物素受体是一种非特异性受体，广泛分布于整个小肠以及部分结肠。生物素是一种人体必需的水溶性B族维生素，它的肠道摄取是依赖生物素受体介导的主动转运过程。生物素的胃肠道吸收速度极快，以其作为口服纳米载体的修饰剂无疑具有极大的潜力。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种负载蛋白多肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒及其制备方法，可以有效解决背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种负载蛋白多肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒，粒径为50-800nm，其包括药物、载体及交联剂，所述药物与载体的质量比为0.05-0.2:1，交联剂与生物素修饰的三甲基壳聚糖的比例为0.1-0.5:1，所述载体为生物素修饰的三甲基壳聚糖。所述的交联剂为三聚磷酸钠、海藻酸钠及羟丙甲基纤维素邻苯二甲酸酯中的任意一种或组合。所述的蛋白多肽为艾塞那肽、胰岛素、利拉鲁肽、洛塞那肽、降钙素。
生物素修饰的三甲基壳聚糖聚合物以三甲基壳聚糖为载体，生物素为配体，利用N-酰胺化制备生物素修饰的三甲基壳聚糖。生物素的接枝率≥5％。三甲基壳聚糖由分子量为10kD-30kD的壳聚糖制得，季铵化度为10％-70％。
一种负载蛋白多肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将生物素修饰的三甲基壳聚糖溶解于1％的乙酸溶液中，调节PH为6.0；
步骤二、在磁力搅拌下，将蛋白多肽溶液逐滴加入步骤一配制的生物素修饰的三甲基壳聚糖溶液中，搅拌过夜，然后将交联剂溶液缓慢滴加入药物和生物素修饰的三甲基壳聚糖的混合溶液中，继续搅拌0.5h；
步骤三、将上述混合溶液过0.45μm PVDF滤膜，即得负载蛋白多肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒。
在本发明提供的负载蛋白多肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒的制备方法的一种较佳实施例中，纳米粒粒径50-800nm，包括药物、载体及交联剂，所述药物与载体的质量比为0.05-0.2:1，交联剂与壳聚糖的比例为0.1-0.5:1。
在本发明提供的负载蛋白多肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒的制备方法的一种较佳实施例中，步骤二所述交联剂为三聚磷酸钠、海藻酸钠及羟丙甲基纤维素邻苯二甲酸酯中的任意一种或组合，浓度为0.5-3mg/ml。
在本发明提供的负载蛋白多肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒的制备方法的一种较佳实施例中，步骤二所述蛋白多肽为艾塞那肽、胰岛素、利拉鲁肽、洛塞那肽、降钙素。
本发明中生物素修饰的三甲基壳聚糖聚合物采用以下步骤制得：
步骤一、将三甲基壳聚糖溶解于1％的乙酸溶液中，调节PH至6.5；
步骤二、在磁力搅拌下将水溶性生物素缓慢滴加到步骤一制备的三甲基壳聚糖溶液中，室温搅拌4h-12h。反应结束后，用丙酮沉淀产物，依次用甲醇和丙酮洗涤，抽滤、干燥即得生物素修饰的三甲基壳聚糖。
在本发明提供的生物素修饰三甲基壳聚糖聚合物的制备方法的一种较佳实施例中，在上述步骤一中，所采用的三甲基壳聚糖由分子量为10kD-30kD的壳聚糖制得，季铵化度为10％-70％。
在本发明提供的生物素修饰三甲基壳聚糖聚合物的制备方法的一种较佳实施例中，步骤二所述水溶性生物素为N-羟基磺酸基琥珀生物素。
在本发明提供的生物素修饰三甲基壳聚糖聚合物的制备方法的一种较佳实施例中，步骤二中，水溶性生物素和三甲基壳聚糖摩尔比为0.5-10:1。
在本发明提供的生物素修饰三甲基壳聚糖聚合物的制备方法的一种较佳实施例中，生物素的接枝率≥5％。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明的负载蛋白多肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒，具有靶向肠道表面生物素受体，增强药物跨膜转运和细胞旁路转运能力，可提高蛋白多肽类药物口服生物利用度，促进其口服吸收；
2、本发明的负载蛋白多肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒，制备工艺简便，粒径均一，稳定性好；
3、本发明的生物素修饰三甲基壳聚糖聚合物材料，具有良好的生物相容性、可降解性和无免疫原性，是一种优良的蛋白多肽口服吸收的载体。
附图说明
图1是载艾塞那肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒粒径分布图。
图2是生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒Zeta电位图。
图3是载艾塞那肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒的电镜照片。
图4是生物素修饰三甲基壳聚糖聚合物合成路线图。
图5是生物素修饰三甲基壳聚糖聚合物的核磁共振氢谱图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1
载艾塞那肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒的制备
1)将10mg生物素修饰的三甲基壳聚糖溶解于2ml 1％的乙酸溶液中，调节PH为6.0。
2)将艾塞那肽溶解在去离子水中，配制成浓度为0.5mg/ml的溶液。
3)将TPP溶于去离子水中，配制成浓度为1mg/ml的溶液。
4)在磁力搅拌下，将0.5ml步骤2)制备的艾塞那肽溶液滴加入步骤1)所述生物素修饰的三甲基壳聚糖溶液中，搅拌过夜，然后将3ml步骤3)制备的TPP溶液缓慢滴加入艾塞那肽和生物素修饰的三甲基壳聚糖的混合溶液中，继续搅拌0.5h。
5)将上述混合溶液过0.45μm PVDF滤膜，即得载艾塞那肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒。
本实施案例中制备的载艾塞那肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒的平均粒径为131.6nm，多分散性指数PI为0.14，Zeta电位为+15.3mV。图1为载艾塞那肽的生物素修饰的三甲基壳聚糖纳米粒的粒径分布图。图2为载艾塞那肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒的Zeta电位图。在透射电子显微镜下观察纳米粒表面形态，如图3所示，所得载药纳米粒子大小均匀、形态圆整、成型性好。高效液相色谱法测得该载艾塞那肽的纳米粒制剂的包封率和载药量分别为51.34％和1.22％。
实施例2
载艾塞那肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒的制备
1)将20mg生物素修饰的三甲基壳聚糖溶解于2ml 1％的乙酸溶液中，调节PH为6.0。
2)将艾塞那肽溶解于去离子水中，配制成浓度为1mg/ml的溶液。
3)将TPP溶于去离子水中，配制成浓度为2mg/ml的溶液。
4)在磁力搅拌下，将0.5ml步骤2)制备的艾塞那肽溶液滴加入步骤1)所述生物素修饰的三甲基壳聚糖溶液中，搅拌过夜，然后将3ml步骤3)制备的TPP溶液缓慢滴加入艾塞那肽和生物素修饰的三甲基壳聚糖的混合溶液中，继续搅拌0.5h。
5)将上述混合溶液过0.45μm PVDF滤膜，即得载艾塞那肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒。
本实施案例中制备的载艾塞那肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒的平均粒径为145.2nm，多分散性指数PI为0.26，Zeta电位为+10.3mV。高效液相色谱法测得该载艾塞那肽纳米粒制剂的包封率和载药量分别为56.78％和1.40％。
实施例3
载胰岛素的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒的制备
1)将10mg生物素修饰的三甲基壳聚糖溶解于2ml 1％的乙酸溶液中，调节PH为6.0。
2)将胰岛素溶解于去离子水中，配制成浓度1mg/ml的溶液。
3)将TPP溶于去离子水中，配制成浓度为1mg/ml的溶液。
4)在磁力搅拌下，将0.5ml步骤2)制备的胰岛素溶液滴加入步骤1)所述生物素修饰的三甲基壳聚糖溶液中，搅拌过夜，然后将3ml步骤3)制备的TPP溶液缓慢滴加入胰岛素和生物素修饰的三甲基壳聚糖的混合溶液中，继续搅拌0.5h。
5)将上述混合溶液过0.45μm PVDF滤膜，即得载胰岛素的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒。
本实施案例中制备的载胰岛素的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒的平均粒径为150.8nm，多分散性指数PI为0.16，Zeta电位为+12.1mV。高效液相色谱法测得该载胰岛素纳米粒制剂的包封率和载药量分别为62.10％和1.53％。
实施例4
生物素修饰的三甲基壳聚糖聚合物的合成
1)将250mg三甲基壳聚糖溶解于10m l％的乙酸溶液中，用5％的NaOH溶液调PH至6.5。
2)将100mg N-羟基磺酸基琥珀生物素溶解于10ml去离子水中配制N-羟基磺酸基琥珀生物素溶液。
3)将步骤2)配制的N-羟基磺酸基琥珀生物素溶液在磁力搅拌下缓慢滴加到步骤1)制备的三甲基壳聚糖溶液中，室温搅拌5h。反应结束后，用丙酮沉淀产物，依次用甲醇和丙酮洗涤，抽滤、干燥即得生物素修饰的三甲基壳聚糖。
请参阅图5，为上述步骤所制备的生物素修饰的三甲基壳聚糖聚合物的1H-NMR谱。化学位移3.18归属于三甲基壳聚糖上的N+(CH3)3；化学位移2.0归属于三甲基壳聚糖乙酰氨基上的CH3；化学位移3.6-3.8归属于三甲基壳聚糖糖环C3～C6上的氢；化学位移4.8归属于三甲基壳聚糖糖环C1上的氢；化学位移1.4归属于生物素上C11上的氢；化学位移1.5-1.7归属于生物素上C10和C9上的氢；化学位移2.3归属于生物素上C12上的氢；化学位移4.6归属于生物素上C4上的氢。可见，三甲基壳聚糖分子上成功接枝了生物素。
生物素的接枝率可通过生物素分子中C12上的氢和三甲基壳聚糖C1上的H积分比较得出。通过计算，本实施例制备的生物素修饰的三甲基壳聚糖聚合物，生物素的取代度为33.5％。
实施例5
生物素修饰的三甲基壳聚糖聚合物的合成
1)将250mg三甲基壳聚糖壳聚糖溶解在10m l％的乙酸溶液中，用5％的NaOH溶液调PH至6.5。
2)将200mg N-羟基磺酸基琥珀生物素溶解于10ml去离子水中配制N-羟基磺酸基琥珀生物素溶液。
3)将步骤2)制备的N-羟基磺酸基琥珀生物素溶液在磁力搅拌下缓慢滴加到步骤1)制备的三甲基壳聚糖溶液中，室温搅拌5h。反应结束后，用丙酮沉淀产物，依次用甲醇和丙酮洗涤，抽滤、干燥即得生物素修饰的三甲基壳聚糖。
本实施例制备的生物素修饰的三甲基壳聚糖聚合物，生物素的取代度为47.7％。
实施例6
生物素修饰三甲基壳聚糖聚合物的合成
1)将250mg三甲基壳聚糖壳聚糖溶解在10m l％的乙酸溶液中，用5％的NaOH溶液调PH至6.5。
2)将50mg N-羟基磺酸基琥珀生物素溶解于10ml去离子水中配制N-羟基磺酸基琥珀生物素溶液。
3)将步骤2)配制的N-羟基磺酸基琥珀生物素溶液在磁力搅拌下缓慢滴加到步骤1)制备的三甲基壳聚糖溶液中，室温搅拌5h。反应结束后，用丙酮沉淀产物，依次用甲醇和丙酮洗涤，抽滤、干燥即得生物素修饰的三甲基壳聚糖。
本实施例制备的生物素修饰的三甲基壳聚糖聚合物，生物素的取代度为16.9％。
具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.一种负载蛋白多肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒，粒径为50-800nm，其特征在于：其包括药物、载体及交联剂，所述药物与载体的质量比为0.05-0.2:1，交联剂与生物素修饰的三甲基壳聚糖的比例为0.1-0.5:1，所述载体为生物素修饰的三甲基壳聚糖。
2.根据权利要求1所述的一种负载蛋白多肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒，其特征在于：交联剂为三聚磷酸钠、海藻酸钠及羟丙甲基纤维素邻苯二甲酸酯中的任意一种或组合。
3.根据权利要求1所述的一种负载蛋白多肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒，其特征在于：蛋白多肽为艾塞那肽、胰岛素、利拉鲁肽、洛塞那肽、降钙素。
4.根据权利要求1所述的一种负载蛋白多肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒，其特征在于：生物素修饰的三甲基壳聚糖聚合物以三甲基壳聚糖为载体，生物素为配体，利用N-酰胺化制备生物素修饰的三甲基壳聚糖。
5.根据权利要求5所述的一种负载蛋白多肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒，其特征在于：生物素的接枝率≥5％。
6.根据权利要求5或6所述的一种负载蛋白多肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒，其特征在于：三甲基壳聚糖由分子量为10kD-30kD的壳聚糖制得，季铵化度为10％-70％。
7.一种权利要求1-7任一项所述的负载蛋白多肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：步骤一、将生物素修饰的三甲基壳聚糖溶解于1％的乙酸溶液中，调节PH为6.0；步骤二、在磁力搅拌下，将蛋白多肽溶液逐滴加入步骤一制备的生物素修饰三甲基壳聚糖溶液中，搅拌过夜，然后将交联剂溶液缓慢滴加入药物和生物素修饰的三甲基壳聚糖的混合溶液中，继续搅拌0.5h；步骤三、将上述混合溶液过0.45μmPVDF滤膜，即得负载蛋白多肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒。
8.根据权利要求8所述的一种负载蛋白多肽的生物素修饰三甲基壳聚糖纳米粒的制备方法，其还包括以下步骤：步骤一、将三甲基壳聚糖溶解于1％的乙酸溶液中，调节PH至6.5；步骤二、将水溶性生物素在磁力搅拌下缓慢滴加到步骤一配制的三甲基壳聚糖溶液中，室温搅拌4h-12h。反应结束后，用丙酮沉淀产物，依次用甲醇和丙酮洗涤，抽滤、干燥即得生物素修饰的三甲基壳聚糖。
9.根据权利要求8所述生物素修饰的三甲基壳聚糖的制备方法，其特征在于，步骤二所述水溶性生物素为N-羟基磺酸基琥珀生物素。
10.根据权利要求8所述生物素修饰的三甲基壳聚糖的制备方法，其特征在于：步骤二中，水溶性生物素和三甲基壳聚糖摩尔比为0.5-10:1。
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