CN110623918B - 羧甲基壳聚糖/海藻酸钠纳米水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

羧甲基壳聚糖/海藻酸钠纳米水凝胶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种羧甲基壳聚糖/海藻酸钠纳米水凝胶，由羧甲基壳聚糖和海藻酸钠通过离子交联形成网络互穿结构体，且该网络互穿结构体的网络空间能够进行物质包载。本发明还公开了该纳米水凝胶的制备方法，将羧甲基壳聚糖和海藻酸钠混合后超声处理得到混合溶液；将混合溶液滴入乙酸乙酯中，机械搅拌，真空旋转蒸发，除去有机相得到水相溶液；将氯化钙溶液按比例加入到水相溶液中，室温下交联反应；将交联后的水相溶液透析，冷冻干燥，即得到终产物羧甲基壳聚糖/海藻酸钠纳米水凝胶。本发明基于羧甲基壳聚糖和海藻酸钠构建的纳米水凝胶展现出了良好的蛋白包载能力，具有良好的生物相容性和pH敏感性，在口服给药方面具有广阔的应用前景。

Description

羧甲基壳聚糖/海藻酸钠纳米水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种羧甲基壳聚糖/海藻酸钠纳米水凝胶。
背景技术
I型糖尿病通常被认为与产生胰岛素的胰腺β细胞的破坏有关，对外源性胰岛素的即时需求也是I型糖尿病的标志，其需要终身治疗。胰岛素至今仍然是I型糖尿病治疗中的主要药物，由于其作为蛋白药物的性质，侵入性非经肠治疗(即注射治疗)仍然是广泛使用的给药方式。其效果受制于病人的惧针症、疼痛、皮肤鼓胀、过敏反应、常见的感染，以及长期胰岛素疗法下的生活压力。并且，许多病人尽管采取了更加简单有效的血糖监测措施，仍然遭受低血糖发作的困扰。以上不良反应发生几率不等，且其发生率与病人本身的健康状态、用药剂量、使用的胰岛素种类等密切相关，难以得到彻底的解决。口服给药且经由胃肠吸收是最为可行和方便的给药方法，可提升糖尿病人的适应性。除极大的吸收面积外，口服胰岛素还可经历与自身分泌胰岛素类似的代谢过程，更好地实现血糖稳定。
口服胰岛素经肠道吸收后经门脉循环转运到肝脏，在此处抑制肝糖原生成。与其他给药途径不同，肠道是天然的营养物质消化与吸收场所，所以具有最大的吸收面积并可因此提升药效。但肽类药物由于消化系统中pH变化及酶的存在，可能导致胰岛素结构的不稳定，进而造成失活。为克服肠道吸收中的困难，多种天然与合成高分子化合物被用于制作药物载体，其形式包括水凝胶、珠、微球、纳米粒等。天然高分子材料如琼脂、琼脂糖、海藻酸及壳聚糖，合成高分子如聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸、聚磷脂酸均被用作蛋白药物载体。应用于递送胰岛素的聚合物药物运载系统需要具有以下特点：
(1)pH敏感性，以保护胃液pH下的药物并在肠液pH下释放。
(2)释放应具有“位点特异性”，即接近吸收表面以避免肠蛋白酶分解。
(3)优选选择并可逆打开紧密连接。
(4)应具有控释效果，以维持血液中的生理胰岛素浓度。
(5)药物递送载体应具有生物相容性。
羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan，CMC)是一种水溶性壳聚糖衍生物，为淡黄色至白色粉末，溶于水。海藻酸是一类从褐藻中提取的天然多糖，为淡黄色粉末，不溶于水。而当其分子结构单元中的6号位羧基与金属离子结合时可形成海藻酸盐。常见的海藻酸盐有海藻酸钠(sodium alginate，SA)、海藻酸钾和海藻酸钙等。羧甲基壳聚糖与海藻酸钠均具有良好的水溶性，生物安全性与可降解性。
当前，已有研究证明羧甲基壳聚糖水凝胶能够应用于药物控释，实验结果表明羧甲基壳聚糖的脱乙酰度、交联剂用量对水凝胶溶胀率的影响较大.pH＝3.0时,水凝胶收缩,而pH＝1.0,5.0,7.4,9.0时,水凝胶溶胀,且在碱性条件下水凝胶的溶胀率远大于酸性条件下的溶胀率.包埋在此水凝胶中的水杨酸释放随载药介质的pH值和水凝胶半径大小的变化而显著不同,pH＝1.0条件下载药的水凝胶的释药率大于pH＝7.4,12.0条件下的释药率,且水凝胶的半径越大,释药速度和释药率也越大。
纳米水凝胶是指稳定胶态粒子的粒径为纳米尺度的水凝胶，纳米水凝胶同时具备了纳米微粒和水凝胶的性质。纳米水凝胶颗粒中相对大的内部体积及亲水性使得它们适用于封装一些小物质比如DNA、蛋白质等。封装后，纳米水凝胶颗粒的网状结构可以保护他们或者按照某种设定的方式释放它们，这对胰岛素等药物口服递送给予了启发。
但是，羧甲基壳聚糖-海藻酸钠是天然高分子物质，难以形成纳米级凝胶，且当前未有其纳米级水凝胶的研究。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种羧甲基壳聚糖/海藻酸钠纳米水凝胶，目的之二是提供该水凝胶的制备方法和应用。
为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案为：
一种羧甲基壳聚糖/海藻酸钠纳米水凝胶，由羧甲基壳聚糖和海藻酸钠通过离子交联形成网络互穿结构体，且该网络互穿结构体的网络空间能够进行物质包载。
进一步的，以羧甲基壳聚糖和海藻酸钠通过钙离子交联并进行超声处理得到的网络互穿结构为主体，并能够将蛋白质包载其中。
进一步的，所述纳米水凝胶形状接近球形，表面光滑，大小均一，平均粒径为在100-200nm之间，具有典型纳米结构。
进一步的，上述纳米水凝胶表面Zeta电位为-20～-26.6mV。
进一步地，上述纳米水凝胶具有pH敏感性，其粒径与Zeta电位会因环境pH值改变而发生明显变化，在酸性环境下发生团聚，在中性及弱碱性环境下发生溶胀。
所述纳米水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将羧甲基壳聚糖和海藻酸钠混合后超声处理得到混合溶液；
(2)将混合溶液滴入乙酸乙酯中，机械搅拌，真空旋转蒸发，除去有机相得到水相溶液；
(3)将氯化钙溶液按比例加入到水相溶液中，室温下交联反应；
(4)将交联后的水相溶液透析，冷冻干燥，即得到终产物羧甲基壳聚糖/海藻酸钠纳米水凝胶。
进一步的，所述步骤(1)中羧甲基壳聚糖和海藻酸钠混合之前也进行分别超声，超声条件为2.5s、暂停2.5s、循环60min、功率630w。
进一步的，所述步骤(1)中羧甲基壳聚糖和海藻酸钠混合后进行超声，超声条件为：超声2.5s、暂停2.5s、循环30min、功率630w。
进一步的，所述纳米水凝胶包载蛋白的方法：将蛋白溶液与羧甲基壳聚糖混合后超声处理，再向其中加入海藻酸钠溶液得到含有蛋白的混合溶液，超声处理，将含有蛋白的混合溶液按照上述纳米水凝胶的制备方法，即最终得到载蛋白的羧甲基壳聚糖/海藻酸钠纳米水凝胶。
进一步的，所述蛋白溶液与羧甲基壳聚糖混合后超声处理的条件为：超声2.5s，暂停2.5s，功率630w，循环10min。
进一步的，所述海藻酸钠溶液得到含有蛋白的混合溶液进行超声处理的条件为：超声2.5s，暂停2.5s，功率630w，循环20min。
进一步的，所述蛋白溶液为：牛血清白蛋白溶液或胰岛素溶液。
本发明的优点和技术效果：
1、本发明将羧甲基壳聚糖与海藻酸钠交联，制备出了纳米级的网络互穿结构，在此之前尚未报道，这种羧甲基壳聚糖/海藻酸钠纳米水凝胶的在水溶液中的平均粒径为254.9nm，PDI＝0.268，表面Zeta电位为-26.6mV，粒径大小较为均一，分散性良好，且纳米粒之间存在较强的静电作用，有利于保持微观结构的稳定，且该羧甲基壳聚糖/海藻酸钠纳米水凝胶具有pH敏感性。
2、根据羧甲基壳聚糖：海藻酸钠：牛血清白蛋白＝1:1:8的质量比制备的羧甲基壳聚糖/海藻酸钠载牛血清白蛋白纳米水凝胶的包封率为87.6％，载药量79.6％，粒径为393.1nm，Zeta电位为8.76mV。根据羧甲基壳聚糖：海藻酸钠：牛血清白蛋白＝1:1:4的质量比制备的羧甲基壳聚糖/海藻酸钠载胰岛素纳米水凝胶的包封率为85.7％，载药量为63.2％，其粒径为218.5nm，Zeta电位为-55.2mV。说明了羧甲基壳聚糖/海藻酸钠纳米水凝胶对两种不同的蛋白均具有一定的包载能力，且载药量高。
3、羧甲基壳聚糖/海藻酸钠载胰岛素纳米水凝胶可在胃酸环境下保护胰岛素不受降解，能够对胰岛素进行可控释放，pH＝1.2处理2h时释放至23.8％，pH＝6.8处理5h时释放至36.7％(7h时)，pH＝7.4处理12时释放至56.6％。使用羧甲基壳聚糖/海藻酸钠载胰岛素纳米水凝胶对Wistar糖尿病大鼠进行，口服羧甲基壳聚糖/海藻酸钠载胰岛素纳米水凝胶与注射胰岛素相对比的生物利用度为6.57％；并且表现出明显的缓释功能，能在较长时间内将患病大鼠的血糖维持在较低的水平，且具有良好的生物安全性。
本发明基于羧甲基壳聚糖和海藻酸钠构建的纳米水凝胶展现出了良好的蛋白包载能力，具有良好的生物相容性和pH敏感性，在口服给药方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为OCMC/SA纳米水凝胶的SEM图。
图2为MTT法24h测定结果。
图3为MTT法48h测定结果。
图4为不同浓度OCMC/SA纳米水凝胶浸提液培养L929细胞照片。其中a-d分别表示原浓度浸提液、1/2浓度浸提液、1/4浓度浸提液、空白培养基；1-3分别表示0h、24h、48h。
图5为OCMC/SA载BSA纳米水凝胶在不同BSA用量下对BSA的包封率与载药量。
图6为OCMC/SA载BSA纳米水凝胶的SEM图。
图7为不同pH值下OCMC/SA载BSA纳米水凝胶的体外药物释放曲线。
图8为OCMC/SA载胰岛素纳米水凝胶在不同胰岛素用量下对胰岛素的包封率与载药量。
图9为OCMC/SA载胰岛素纳米水凝胶的SEM图。
图10为模拟消化道pH值下OCMC/SA载胰岛素纳米水凝胶对胰岛素的体外释放曲线图。
其中0-2h在pH＝1.2的环境下释放，2-7h为pH＝6.8，7-12h为pH＝7.4。
图11为各组大鼠血糖-时间曲线。
具体实施方式
以下通过具体实施例并结合附图对本发明进一步解释和说明。
实施例1：
配制浓度为2.5mg/mL的羧甲基壳聚糖(OCMC)与海藻酸钠(SA)溶液，两者分别在超声2.5s、暂停2.5s、循环60min、功率630w的条件下超声，之后按体积比1：1混合，混合液在超声2.5s、暂停2.5s、循环30min、功率630w的条件下超声。
将混合液滴入乙酸乙酯中，使水相：有机相＝1：9(v：v)，机械搅拌2小时，转速为600rpm。之后产物转移到圆底烧瓶中，35℃抽真空旋转蒸发，除去有机溶剂得到水相。按照钙离子与海藻酸钠物质的量比为1:1的比例加入浓度为1mg/mL的氯化钙溶液，磁力搅拌，室温下交联2h。产物在去离子水中透析2天，之后进行冷冻干燥，制得OCMC/SA纳米水凝胶。
取小部分溶于水，浓度2mg/mL，用超声辅助纳米水凝胶在水中的分散。制得的溶液滴一滴在盖玻片上自然干燥，用于SEM检测。其余用作粒径与Zeta电位检测。分别使用pH分别为1.2(稀盐酸)、6.8、7.4(0.1mol/L PBS)的溶液处理OCMC/SA纳米水凝胶溶液2h，之后进行粒径测定，观察OCMC/SA纳米水凝胶颗粒粒径变化。
OCMC/SA的SEM照片如图1所示。由图可见，干态下OCMC/SA纳米水凝胶的粒径大约在100-200nm之间，其表面形貌光滑，形状接近球形，大小较为均一。
OCMC/SA纳米粒子的粒径与电位检测结果如表1所示。PdI为多分散系数，体现粒径分布的均匀程度，越接近1说明粒径分布差异越大，越接近0说明粒径分布差异越小；zeta电位体现了表面电荷的正负及强弱。OCMC/SA纳米水凝胶在水中分散后，其粒径为254.9nm，PdI为0.268，zeta电位为-26.6mV。经pH＝1.2稀盐酸处理后，其结合大量氢离子，发生溶胀，电位转为7.3mV，且此时PdI增大为1，推测此时OCMC/SA纳米水凝胶的粒径分布相差较大，很可能发生不同程度的团聚，粒径平均值大幅增加到440.9nm。pH＝6.8PBS处理后，其粒径增大到298.0nm，PdI为0.285，zeta电位为-20.3mV；pH＝7.4PBS处理后，其粒径增大到271.3nm，PdI为0.272，zeta电位为-21.0mV。该结果表明在pH＝6.8及7.4的环境下，OCMC/SA均能发生一定程度的溶胀，但未发生团聚。以上结果说明OCMC/SA纳米水凝胶具有pH敏感性，其粒径与zeta电位会因环境pH值的改变而发生明显变化，在酸性环境下发生团聚，在中性及弱碱性环境下发生溶胀。
表1 OCMC/SA纳米水凝胶在不同溶剂中粒径与zeta电位表
Figure BDA0002232216350000051
实施例2
在对L929细胞进行复苏、培养与传代后，吸弃原培养基，加入2-3mL PBS冲洗两次。加入1mL胰酶的PBS溶液(浓度2.5mg/mL，过滤除菌后使用)消化3min(放入培养箱内37度下进行)。消化完成后在显微镜下观察，待细胞变为圆球形则消化完成。加3mL培养基吹打。转移到离心管中进行离心(1000rpm，5min)。弃上清液，加入6mL培养基吹起。吹打均匀后转移到培养瓶中，每个培养瓶加入3mL细胞悬液。
完成两次传代后，细胞离心后弃去上清，重新加入5mL培养基，吹打混匀。取一滴滴入到计数板内，根据结果进行稀释，调整浓度达到1.5-1.8×104个/mL。用完计数板后用酒精棉擦拭，放回原处。96孔板中每孔加入200μL细胞悬液。培养过夜，观察细胞生长情况。细胞从圆球形变为梭形或星形即为贴壁。
取冻干后的OCMC/SA纳米水凝胶灭菌，按0.1g材料加入1mL培养基的比例浸提，放置于培养箱内37℃处理24h。将制得的浸提液过0.22μm滤膜，通过加入培养基稀释，制得原液、1/2浓度浸提液、1/4浓度浸提液各1.2mL。一组加入200μL空白培养基作为对照，其他三组分别加入等量浸提液原液、1/2浓度浸提液、1/4浓度浸提液进行培养。
一板在培养箱中孵育24h，一板孵育48h。24h后，取出拍照，吸弃培养基，每孔新加180μL培养基与20μL MTT溶液，37℃下孵育4h。4h后吸弃各孔内溶液，加入150μL DMSO，在酶标仪上振荡孵育10min后，于490nm波长下进行吸光度测定。48h组同理。以所含浸提液浓度为横轴、吸光度为纵轴，以阳性对照组(细胞+普通DMEM培养基)为100％，注明各组细胞活性。判断OCMC/SA纳米水凝胶的细胞毒性。
用DMEM培养基制备的OCMC/SA纳米水凝胶浸提液，在与培养基进行不同比例混合后，培养L929细胞，细胞培养情况如图2、图3与图4所示。可以看到，24h时，含OCMC/SA纳米水凝胶浸提液的培养基对于L929细胞具有生长促进作用，三组的细胞活性均高于不含浸提液的对照组；48h时使用原浓度浸提液的一组细胞活性相对于其他组偏低，但仍高于90％，而含浸提液浓度为25％与50％的两组细胞活性均大于对照组。这说明OCMC/SA纳米水凝胶无细胞毒性，其细胞毒性评级为0级，且其浸提液在较低浓度下即可促进细胞生长。
实施例3
配制浓度为2.5mg/mL的OCMC与SA溶液；配制浓度为5mg/mL的BSA溶液，取4mL OCMC溶液(含OCMC 10mg)，向其中分别加入4(8,12,16)mL BSA溶液(即OCMC:SA:BSA＝1:1:2(4，6，8)(m:m:m))，超声2.5s，暂停2.5s，功率630w，分散10min。之后向其中滴入4mL SA溶液(含SA10mg)，超声2.5s，暂停2.5s，功率630w，分散20min。
将混合液滴入乙酸乙酯中，水相：有机相体积比为1：9，机械搅拌600rpm下反应2小时；反应体系真空干燥除去有机溶剂，将剩余的水相分装在50mL离心管中，室温下36400g离心30min。取上清液测定其体积，并在280nm处测定吸光度，对照BSA标准曲线确定BSA浓度。
按如下公式计算载BSA纳米水凝胶的包封率与载药量：
EE＝(W1-W2)/W1×100％
LC＝(W1-W2)/W0×100％
其中，EE为包封率，LC为载药量，W1为BSA的总量，W2为游离BSA的量，W0为载药pH敏感性纳米水凝胶的量
以质量比为横轴、包封率与载药量为纵轴绘图，从图中选出最适宜的质量比。
按选定的最佳质量比制备OCMC/SA载BSA纳米水凝胶。抽真空旋转蒸发除去乙酸乙酯后，水相中按物质的量比1：1滴加浓度为1mg/mL的氯化钙溶液，室温下交联反应2h，去离子水中透析2天，冷冻干燥。
不同质量比下OCMC/SA对BSA的包封率与载药量变化如表2和图5所示。在OCMC:SA:BSA质量比为1:1:8时，包封率为87.6％，载药量最高达到79.6％，因此按照此质量比制备OCMC/SA载BSA纳米水凝胶供后续实验使用。
表2 OCMC/SA载BSA纳米水凝胶在不同BSA用量下对BSA的包封率与载药量
Figure BDA0002232216350000061
OCMC/SA载BSA纳米水凝胶的SEM如图6所示。由图可见，包载BSA后OCMC/SA纳米水凝胶的粒径明显增大到300-400nm，表面光滑，近似球形。
OCMC/SA载BSA纳米水凝胶的粒径与zeta电位检测结果如表3所示。水中粒径为393.1nm，PdI为0.238，zeta电位8.76mV。粒径分布均匀。
pH＝1.2、6.8、7.4的溶液处理后，OCMC/SA载BSA纳米水凝胶的粒径与zeta电位发生变化。pH＝1.2时，粒径为429.9nm，PdI为0.342，推测此时OCMC/SA载BSA纳米水凝胶发生轻度溶胀；zeta电位增大至16.6mV。
pH＝6.8时，粒径为501.3nm，PdI增大到0.371，说明部分载药水凝胶已经发生了溶胀和药物释放。zeta电位减至-17.7mV，此电位与未包药的纳米水凝胶相近但略偏高，说明载BSA纳米水凝胶中包载的药物已经释放。
pH＝7.4时，载BSA纳米水凝胶发生明显的溶胀，载药纳米水凝胶的粒径增加到559.2nm，此时PdI为0.262。zeta电位为-16.3mV，与未载药的纳米水凝胶接近但偏高，说明也有一部分载药纳米水凝胶发生了溶胀并进行了药物释放。
综上所述，OCMC/SA载BSA纳米水凝胶具有pH敏感性，在酸性环境中仅发生少量溶胀，在中性及弱碱性环境中发生大幅溶胀。
表3 OCMC/SA载BSA纳米水凝胶在不同溶剂中粒径与zeta电位表
Figure BDA0002232216350000071
实施例4
选取载最适质量比制得的OCMC/SA载BSA纳米水凝胶，称取冻干后的纳米水凝胶各2mg置于离心管中，分别加入2mL pH为1.2(稀盐酸)、6.8与7.4(0.1mol/L PBS)的溶液。室温下混匀，在0-8h，每隔1h置于36400g下离心10min，取上清液用分光光度计在280nm波长处测定吸光度，测定后补充离心管液体到2mL。之后在12h、24h、36h、48h各测定一次。对照BSA标准工作曲线，计算上清液中的BSA浓度，以时间为横轴、上清液中药物量为纵轴，作图。
OCMC/SA载BSA纳米水凝胶在不同pH值下对BSA的体外释放曲线如图7所示，BSA的累计释放量如表4所示。在三个不同pH值下，最开始纳米水凝胶都经历了对药物的快速释放，但随后速度逐渐减慢。可以看出，pH＝1.2组有少量突释，很快在3h时进入平台期，此时释放量约为36％；pH＝6.8组药物释放速度较慢，其药物释放量居中，约50％，在48h左右进入平台期；而pH＝7.4组药物释放最快，药物释放量最多，达到68％，在24h左右进入平台期。OCMC/SA载BSA纳米水凝胶的体外药物释放结果说明其具有pH敏感性。
实验结果表明，在包载模型蛋白药物BSA的情况下，纳米水凝胶表现出pH敏感性，并且在不同pH值下实现了对药物的可控释放。
表4 BSA累积体外药物释放量(％)
Figure BDA0002232216350000081
实施例5
配制浓度为2.5mg/mL的OCMC与SA溶液；用pH＝1.2的稀盐酸配制浓度为1mg/mL的胰岛素溶液，取2mL OCMC溶液(含OCMC 5mg)，向其中分别加入5(10,15,20,25)mL胰岛素溶液(即OCMC：SA：胰岛素＝1:1:1(2,3,4,5)(m:m:m))，超声2.5s，暂停2.5s，功率630w，分散5min。之后向其中滴入2mL SA溶液(含SA5mg)，超声2.5s，暂停2.5s，功率630w，分散20min。
将混合液滴入乙酸乙酯中，水相：有机相体积比为1：9，600rpm机械搅拌，反应2小时；反应体系35℃真空旋转蒸发除去有机溶剂，将剩余的水相分装在50mL离心管中，室温下36400g离心30min。取上清液测定其体积，并在280nm处测定吸光度，对照胰岛素标准曲线确定浓度。
包封率与载药量计算公式见实施例3。以质量比为横轴、包封率与载药量为纵轴绘图，从图中选出最适宜的质量比。
按选定的最佳质量比制备OCMC/SA载胰岛素纳米水凝胶。抽真空旋转蒸发除去乙酸乙酯后，水相中按物质的量比1：1滴加浓度为1mg/mL的氯化钙溶液，室温下交联反应2h，去离子水中透析2天，冷冻干燥。
随OCMC:SA:Ins质量比变化，包封率与载药量变化如表5与图8所示。根据实验结果，质量比为1:1:4时OCMC/SA载胰岛素纳米水凝胶的载药量最高，因此按照此质量比制备OCMC/SA载胰岛素纳米水凝胶供后续实验使用。
表5 OCMC/SA载胰岛素纳米水凝胶在不同胰岛素用量下对胰岛素的包封率与载药量
Figure BDA0002232216350000082
Figure BDA0002232216350000091
(3)OCMC/SA载胰岛素纳米水凝胶的表面形貌
OCMC/SA载胰岛素纳米水凝胶的SEM检测结果如图9所示。载胰岛素纳米水凝胶干态下粒径为100-200nm，表面光滑，形状为球型或近似球型。
(4)OCMC/SA载胰岛素纳米水凝胶的粒径与zeta电位
OCMC/SA载胰岛素纳米水凝胶的粒径与zeta电位检测结果如表6所示。OCMC/SA载胰岛素纳米水凝胶的粒径为218.5nm，PdI为0.373，粒径分布较为均匀；其zeta电位为-55.2mV。
和未包药的情况相比，OCMC/SA纳米水凝胶在包药以后粒径缩小，可能是由于其表面电位大幅增大且仍为负值，因此分散在水中后纳米水凝胶颗粒间的团聚程度减小，因此测得以上结果。
在pH＝1.2的强酸环境下，OCMC/SA载胰岛素纳米水凝胶的粒径几乎没有变化，而其表面电位发生反转。此时由于内部带有强烈负电性的胰岛素存在，其表现与未包药的OCMC/SA纳米水凝胶不同。
在pH＝6.8与pH＝7.4的环境下，OCMC/SA载纳米水凝胶的粒径稍有增大，但变化很小；其zeta电位与未包药的情况相似。
表6 OCMC/SA纳米水凝胶在不同溶剂中粒径与zeta电位表
Figure BDA0002232216350000092
实施例6
取冻干后的OCMC/SA载胰岛素纳米水凝胶，加入pH＝1.2溶液处理2h，之后离心除去溶液，加入pH＝6.8溶液处理5h，再之后加入pH＝7.4溶液。以上过程中每1h在36400g下离心10min，测定上清液体积与其中的胰岛素浓度，并计算每小时时间节点处药物释放量占总量多少。之后在8h、10h、12h各测一次。以时间为横轴、药物释放率为纵轴绘图。
模拟消化道pH值下载胰岛素纳米水凝胶体外释放情况如图10和表7所示。模拟胃肠消化环境下OCMC/SA载胰岛素纳米水凝胶对胰岛素的释放量作图如下：在最初2h，处于pH＝1.2环境下时，OCMC/SA对胰岛素在1h内发生突释，2h时释放量总计23.8％。之后2-7h，处在pH＝6.8环境下，载药纳米水凝胶对胰岛素持续释放，但是释放速度较慢，7h时累计释放36.7％。7h起进入pH＝7.4环境下，释放量继续快速增大，直到12h时累计为56.7％。
对应人体消化道内情况，在0-2h，载药纳米水凝胶位于胃中，此时仅存在少量药物释放，可保护胰岛素不被胃酸分解；2-7h载药纳米粒依次进入十二指肠、空肠，7h后载药纳米水凝胶位于回肠部分，此时为药物释放的主要地点，而胰岛素正是主要从小肠部位吸收并进入循环系统发挥作用。OCMC/SA载胰岛素纳米水凝胶的药物释放特性有利于胰岛素通过口服给药发挥作用。
表7胰岛素累积体外药物释放量(％)
Figure BDA0002232216350000101
实施例7
选用Wistar雄性大鼠，6到8周龄，体重200克左右(150～250g)，清洁级，进行Ⅰ型糖尿病的治疗实验。
(1)饲养方法
饲养于塑料大鼠笼中，每笼5只，给予标准鼠粮、白开水，食水供应充足，每天更换洁净大鼠代谢笼，室内通风良好，光照周期为12h明亮12h黑暗，氨浓度小于20ppm，相对湿度40～70％，室温25度左右，适应性饲养3天。
(2)造模方法
STZ一次性大剂量腹腔注射：使用pH为4.2～4.5的0.1M柠檬酸缓冲液配制10mg/mLSTZ溶液，柠檬酸溶液需提前灭菌，STZ快速称取并用锡箔纸包裹，配制后溶液置于冰屑中低温保存。需造模的大鼠禁食12h，自由饮水，称重。按65mg/kg体重计算，一次性腹腔注射STZ溶液。对照组注射等量柠檬酸缓冲液(即6.5mL/kg)。STZ注射后两组均给予0.5％葡萄糖自由饮水1d。
(3)统计造模成功率
STZ注射72h后，禁食8h，自由饮水，尾静脉取血，血糖试纸吸取米粒大小血滴，使用血糖仪检测血糖水平。血糖水平>16.7mmol/L且出现多饮、多食、多尿症状大鼠为成模标准。
(4)后续实验分组
在造模成功的鼠中随机进行分组，划入三个组中，每组不少于5只。另从健康鼠中随机取5只作为血糖正常的健康对照组。
(5)OCMC/SA载胰岛素纳米水凝胶的体内降糖效果及生物利用度
给药前禁食8h，自由饮水。正常对照组和高血糖组使用生理盐水进行灌胃。胰岛素的使用量根据体重决定。OCMC/SA载胰岛素纳米水凝胶组使用OCMC/SA载胰岛素纳米水凝胶的生理盐溶液进行灌胃，胰岛素剂量为25U/kg；注射组胰岛素剂量为1U/kg。
各组取血时间点：给药后0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、8h、12h时间点通过尾静脉取血，测定血糖。对于四组大鼠(n＝5)，将其空腹血糖计为100％，以时间为横轴、血糖水平相对空腹血糖的百分比为纵轴，绘制血糖-时间曲线。
药理生物利用度计算方法：口服组与注射组的血糖-时间曲线下面积与剂量之比相除。
PA＝(〖AAC〗口服×〖Dose〗注射)/(〖AAC〗注射×〖Dose〗口服)×100％
PA：药理生物利用度
AAC：通过梯形计算法得到的血糖-时间曲线上面积
Dose：胰岛素剂量，单位为U
造模的28只大鼠中有20只经空腹血糖监测血糖水平高于16.7mmol/L，诊断为高血糖，判断为造模成功，成功率为71.4％。造模成功的大鼠表现出多饮、多食、多尿，且精神萎靡、毛色暗淡。
各组大鼠的血糖水平如图11和表8所示。由实验结果可见，健康组的血糖水平在100％附近波动，这是由于健康组具有正常的血糖调节机制，血糖水平相对于其他组稳定。而作为对照组，经STZ处理后的大鼠胰岛被破坏，因此无法像健康组一样完成对血糖的调节，故随着禁食时间的增加，其血糖水平不断下降。
注射组与口服组均表现出血糖水平的下降。注射组在最初0.5h发生了血糖的快速剧烈下降，但随后由于胰岛素的消耗，胰岛素得不到补充，因此0.5h后血糖水平逐渐回升；而由于其体内血糖水平调节机制被破坏，因此3h后，血糖水平逐渐下降。
口服组则由于OCMC/SA纳米水凝胶对于胰岛素的可控释放，在最初释放的胰岛素较少，此时血糖水平的下降速度不及注射组；但在注射组药效已过后，口服组的血糖水平总体上仍持续下降，且最终保持了很低的血糖水平。初始的快速释放发生在胃部，而由于大鼠为空腹，胃部排空相较于饱腹要快，因此之后载药纳米水凝胶很快进入到小肠部分，并在此对胰岛素进行持续、可控的释放。
注射组与口服组结果相对比，可见注射组起效更快，而口服组则由于缓释效果，开始时起效较慢，但能在更长的时间范围内释放胰岛素以降低血糖，并可维持较低的血糖水平。
经计算，口服OCMC/SA包载的胰岛素相对于注射胰岛素，其生物利用度为PA＝6.57％。与已报道的口服用PEG缀合胰岛素制剂(约5％)相比，具有更高的生物利用度。
表8各组大鼠血糖-时间表
Figure BDA0002232216350000121

Claims (9)

1.一种羧甲基壳聚糖/海藻酸钠纳米水凝胶，其特征在于，该纳米水凝胶由羧甲基壳聚糖和海藻酸钠通过离子交联形成网络互穿结构体，且该网络互穿结构体的网络空间能够进行物质包载；所述纳米水凝胶的平均粒径为在100-200 nm之间，具有典型纳米结构；所述纳米水凝胶的制备方法包括：
（1）将羧甲基壳聚糖和海藻酸钠混合后超声处理得到混合溶液；
（2）将混合溶液滴入乙酸乙酯中，机械搅拌，真空旋转蒸发，除去有机相得到水相溶液；
（3）将氯化钙溶液按比例加入到水相溶液中，室温下交联反应；
（4）将交联后的水相溶液透析，冷冻干燥，即得到终产物羧甲基壳聚糖/海藻酸钠纳米水凝胶。
2.如权利要求1所述的纳米水凝胶，其特征在于，以羧甲基壳聚糖和海藻酸钠通过钙离子交联并进行超声处理得到的网络互穿结构为主体，并能够将蛋白质包载其中。
3.如权利要求1所述的纳米水凝胶，其特征在于，所述纳米水凝胶形状接近球形，表面光滑，大小均一。
4.如权利要求1所述的纳米水凝胶，其特征在于，所述纳米水凝胶表面Zeta电位为-20~-26.6 mV；所述纳米水凝胶具有pH敏感性。
5.如权利要求1所述的纳米水凝胶，其特征在于，所述步骤（1）中羧甲基壳聚糖和海藻酸钠混合之前也进行分别超声，超声条件为2.5s、暂停2.5s、循环60min、功率630w。
6.如权利要求1所述的纳米水凝胶，其特征在于，所述步骤（1）中羧甲基壳聚糖和海藻酸钠混合后进行超声，超声条件为：超声2.5s、暂停2.5s、循环30min、功率630w。
7.权利要求1所述的纳米水凝胶进行包载蛋白的方法，其特征在于，将蛋白溶液与羧甲基壳聚糖混合后超声处理，再向其中加入海藻酸钠溶液得到含有蛋白的混合溶液，超声处理，将含有蛋白的混合溶液按照上述纳米水凝胶的制备方法，即最终得到载蛋白的羧甲基壳聚糖/海藻酸钠纳米水凝胶。
8.如权利要求7所述的包载蛋白的方法，其特征在于，所述蛋白溶液与羧甲基壳聚糖混合后超声处理的条件为：超声2.5s，暂停2.5s，功率630w，循环10min。
9.如权利要求7所述的包载蛋白的方法，其特征在于，所述海藻酸钠溶液得到含有蛋白的混合溶液进行超声处理的条件为：超声2.5s，暂停2.5s，功率630w，循环20min。
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