CN1931370B - 一种糖肽缀合物微球或微囊及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种糖肽缀合物微球或微囊及其制备方法。糖肽缀合物微球或微囊由多糖构成糖肽缀合物的糖基部分，由聚肽构成糖肽缀合物的肽链部分，多糖和聚肽以共价键的形式连接。该方法采用界面聚合反应，首先制备水溶性壳聚糖，然后利用壳聚糖上氨基的亲核性引发多种氨基酸羧酸内酐单体开环聚合，形成以壳聚糖为主链，侧链接枝聚肽链段的多糖和聚肽以共价键相连的糖肽缀合物结构。利用水溶性壳聚糖本身具有的两亲性，在接枝共聚反应过程中可一步生成微球或微囊，并且无需添加乳化剂。本发明方法工艺简单、材料易得、聚合速率快、反应条件温和。制得的微球或微囊可用于药物缓释领域。

Description

一种糖肽缀合物微球或微囊及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种糖肽缀合物微球或微囊及其通过界面聚合的制备方法。

背景技术

微球或微囊作为一种新型控/缓释给药体系，具有能保护药物免遭破坏、控制药物释放速度、延长药物作用时间、减少药物不良反应及降低用药量等优点，在药物释放领域受到极大关注。在临床治疗上微球属于被动靶向制剂，它能被器官组织的网状内皮系统(RES)所内吞或被细胞融合，集中于靶区逐步扩散释出药物或被溶酶体中的酶降解而释出药物。目前，微球的控缓释行为研究已进行得相当广泛。其中，对抗生素、避孕药和麻醉药等药物的控/缓释放研究较为普遍，技术也相对成熟。另外，微球用作蛋白、多肽及疫苗等大分子药物载体也越来越受到重视。

制备药物缓释用微球的材料必须具备无毒、生物相容性好和可生物降解等性质。近年来在药物释放材料研究中，生物降解高分子材料因其具备无毒、无免疫活性及不在体内积累滞留等优点而逐渐受到重视。

目前使用最多的是以聚α-羟基酸，如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)及其共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚原酸酯等为代表的不饱和聚酯类，凭借其良好的生物相容性以及降解产物无毒等优点，被FDA批准广泛用作药物控制载体(Uhrich，K.E.et al，Polymeric Systems forControlled Drug Release.Chem.Rev.(Review)；1999；99(11)：3181-3198)。例如，US6,551,522中制备了一种以PCL为基材的多孔药物缓释材料，并制成两端封闭的中空管，在中空管的内外表面间含有通道，使药剂填入从可以中空管通道中进出，从而达到控制释放。US7,041,320公开了一种高载药量的可注射性微球材料，由PLA、PCL及其共聚物组成。

另一种被广泛使用的天然高分子类脂质是一类分子结构中具有两亲基团(亲水基与亲油基)的化合物，能形成被称为脂质体的类脂双分子层微球，其中，磷脂与胆固醇是脂质体主要制备材料。由类脂质形成的脂质体双层分子层与生物膜极其相似，生物相容性优良，易被组织吸收。不同的细胞因子包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素(IL)-1-α，IL-2，IL-6，IFN-γ及肿瘤坏死因子(TNF)等均被制成脂质体制剂，以改变其体内的分布特性，使药物更易进入细胞发挥作用，提高受体敏感性及细胞毒活性(田瑞琴等，细胞因子类药物制剂研究进展，中国生化药物杂志，2005：26(5)：315-317)。Yuyama等(Yuyama et al，Potential usage ofthermosensitive liposomes for site-specific delivery of cytokines.Cancer Letters，2000，155(1)：71-77)用热敏性脂质体包裹的TNF在37℃血浆中是稳定的，但是在42℃时能被迅速释放，因此，具有很好的靶向性。Kedar等(Kedar E，et al.Delivery of cytokines by liposomes.III Liposome-encapsulated GM-CSFand TNF-alpha show improved pharmacokinetics and biological activity andreduced toxicity in mice.J.Immunother，1997，20(3)：180-193)将rhGM-CSF包囊于0.3～2.2μm的脂质体中，包囊后显示了较高的稳定性和活性，半衰期及药时曲线下面积是未包囊前的10-20倍，在4℃放置4个月生物活性降低不显著，且能显著提高粒细胞的数量。另外近年来日益受到瞩目的是阳性脂质体。它是由一种中性磷脂和一种或多种阳性成分组成的。其中，中性磷脂起到稳定双层膜和降低阳性成分毒性的作用，同时提供阳性脂质的细胞渗透功能，如胆固醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺以及二油酰磷脂酰乙醇胺等。阳性成分是具有不同化学结构的两性分子，多为双链季胺盐表面活性剂，为整个脂质体提供正电荷。正是由于这种性质，它可作为负电荷物质的传递载体，特别适用于蛋白质、多肽、寡核苷酸类物质、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)等(扈木荃等，荧光素钠阳离子脂质体的制备及向金黄色葡萄球菌转运的效率.华西药学杂志2003，23：199-202)。如可以用其介导基因转染，使阳性脂质体与DNA形成复合物，介导与细胞的作用，并将DNA释放到细胞中，实现基因转染，所以在基因治疗方面有独特应用。

然而这些材料还并非理想，对于聚酯类合成高分子来说，细胞亲和性差、缺乏细胞识别信号、与细胞间缺乏生物性相互作用等是它们共同的缺陷。聚酯在体内降解主要是酯键的随机、非酶性水解。由于PLA及PLGA疏水性较强，与亲水性药物，尤其是蛋白类药物亲和性较差，且在降解过程中微球内部局部酸性环境不利于药物稳定(Sood，A.et al.Peroral Route：An Opportunity for Protein and Peptide Drug Delivery，Chem.Rev.；(Review)；2001；101(11)；3275-3304，Ha，C.S.et al.Surface Chemistry of BiodegradablePolymers for Drug Delivery Systems，Chem.Rev.；(Review)；2005；105(11)；4205-4232)。脂质体作为一种对人体无毒、无免疫原性的定向药物载体，能控制药物释放，提高药效，降低毒副作用。但在实际应用中，脂质体需要克服储存期限短、过度融合造成药物泄漏、组织专一性和靶向性差、易被吞噬细胞的网状内皮细胞系统迅速清除等困难。因此，开发性能优良的微球体系对于药剂学的发展具有重要意义。

根据微球和微囊形成的原理，常见微球(囊)的制备方法大致可分为利用反应形成微球或囊壁的化学方法、利用相分离形成微球或囊壁的物理化学方法和利用机械或其它物理作用，如喷雾干燥、空气悬浮、静电结合等形成微球或囊壁的物理方法等。上述制备微球或微囊的过程中一般都需加入表面活性剂或乳化剂。例如CN02137781.2采用油包油技术，以水溶性抗癌药物和聚乳酸及其共聚物的有机溶剂为内油相，液体石蜡或植物油为其外油相，制备了含有阿霉素、氟尿嘧啶、柔红霉素等抗肿瘤药物的微球。CN1607033A针对蛋白质、多肽、抗癌剂、激素等亲水性药物和油溶性药物，将亲水性药物溶于壳聚糖和醋酸水溶液中，将该水相用压力通过微孔膜压入油相中，得到尺寸均一的乳滴，然后采用一定的固定方法使乳滴固化，得到尺寸均一、分散稳定的壳聚糖微球或微囊药物载体；将油溶性药物溶于油性溶剂中，亲水性药物溶于壳聚糖醋酸水溶液中，先用均相乳化器制备O/W初乳，将该初乳用压力通过微孔膜压入油相中，得到尺寸均一的复乳滴，然后采用一定的固化方法使乳滴固化，得到尺寸均一、分散稳定的壳聚糖微球或微囊药物载体。

近年来，在制备微胶囊方面，又发展了许多新的制备方法，如模板组装、表面接枝聚合、分散聚合等。其中，基于弱相互作用的层-层自组装技术制备的微胶囊具有结构和性能可控、易赋予各种独特功能的特点。这些弱相互作用包括静电力、氢键、疏水力等。然而通过这种方法制备的聚合物微胶囊的稳定性常常不足，不能抵御较为苛刻的外部条件，如有机溶剂的溶解、酸碱盐的侵蚀、高温的分解等而被破坏。利用高分子聚合技术，使小分子单体在模板表面聚合成薄膜是近十几年发展起来的一种新技术。CN1772366A公开了一种制备中空微胶囊的方法，以二氧化硅微粒为模板，在其表面接枝双键，然后在另外一种分子模板聚乙烯基吡咯烷酮存在下，将丙烯酸聚合，生产含氢键的复合物，这种复合物或丙烯酸单体被捕捉或聚合到接双键的二氧化硅粒子表面，从而形成核-壳结构的微粒。最后把模板除去，得到中空微囊。CN1772365A则是基于共价键相互作用层-层组装方法，采用将两种可反应的聚合物在氨基化的二氧化硅颗粒表面进行反应，获得具有多层结构的聚合物超薄膜；然后采用氢氟酸去除无机粒子，得到囊壁为共价交联多层膜结构的中空微胶囊。但通过模板法制备微囊步骤较复杂。

发明内容

本发明的目的是提供一种糖肽缀合物微球或微囊及其制备方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明的构思是这样的：

从仿生的角度，模拟天然组织中细胞外基质对生长因子等生物活性物质的控释过程是一种设计药物缓释体系的新思路。细胞外基质(ExtracellularMatrix，ECM)是构成组织的3种主要结构单元之一，天然ECM在组织和器官中起骨架作用，同时也是生长因子的贮存器，将生长因子控制释放至相邻细胞和组织。细胞外基质中，糖不仅以多糖或寡糖的游离形式直接参与生命过程，更重要的是以糖缀合物(Glycoconjugates)，即糖链与蛋白等生物大分子以共价键相连的形式参与许多重要的生命过程。

以具有良好生物相容性并且与细胞外基质中糖胺多糖结构相似的天然高分子多糖壳聚糖为糖肽缀合物的糖基部分，以化学合成的聚肽作为糖肽缀合物中的肽链，壳聚糖和聚肽通过共价键相连，可形成仿细胞外基质结构的糖肽缀合物材料。

目前在聚肽合成中普遍使用的方法是α-氨基酸-N-羧酸内酐(NCA)的开环聚合法。该方法属于阴离子开环聚合机理，其引发剂可选用多种亲核试剂或碱类。胺是NCA法常用的引发剂，它的亲核性强于碱，可以使多种NCA单体聚合。壳聚糖分子上带有自由氨基，可作为一种大分子引发剂引发氨基酸NCA单体的开环聚合。通过壳聚糖的氨基引发氨基酸羧酸内酐单体的开环聚合，形成主链为壳聚糖，侧联为聚肽，多糖和聚肽以共价键相连的糖肽缀合物结构。

此处，发生接枝共聚反应的两种物质分别溶解于水相和油相(有机溶剂)中，利用非均相反应的特点，可以在合成糖缀合物的同时通过界面聚合方法原位制备糖肽微球材料。此外，壳聚糖经疏水化处理后，分子结构中同时具有疏水基团和亲水基团，具备了表面活性剂的两亲性特点，容易在溶液表面吸附，降低反应体系的表面张力。因此壳聚糖在引发NCA开环聚合的同时，又充当了乳化剂，使制备微球的过程中无需添加乳化剂。

本发明制备糖肽缀合物微球或微囊，采用多糖-聚肽接枝共聚的形式，由天然多糖壳聚糖构成糖肽缀合物的糖基部分，由聚(N_ε-苄氧羰基-L-赖氨酸)、聚(N_ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸)、聚(L-亮氨酸)、聚(L-异亮氨酸)、聚(L-丙氨酸)、聚(γ-苯甲酯-L-天冬氨酸)、聚(γ-苯甲酯-L-谷氨酸)、聚(γ-甲酯-L-谷氨酸)、聚(γ-乙酯-L-谷氨酸)、聚(O，O’-二苄氧羰基-3，4-二羟基-L-苯丙氨酸)中的一种或一种以上的均聚肽或其共聚物构成糖肽缀合物的肽链部分，多糖和聚肽以共价键相连接。所制备的微球或微囊的直径为10-1000μm。

本发明所说的糖肽缀合物微球或微囊，由多糖构成糖肽缀合物的糖基部分，由聚肽构成糖肽缀合物的肽链部分，多糖和聚肽以共价键的形式连接；

所说的多糖为天然多糖壳聚糖，所说的天然多糖壳聚糖为水溶性壳聚糖；

所说的聚肽为均聚肽或共聚肽，所说的均聚肽或共聚肽为通过化学方法合成的氨基酸聚合物；

所说的聚肽选自聚(N_ε-苄氧羰基-L-赖氨酸)、聚(N_ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸)、聚(L-亮氨酸)、聚(L-异亮氨酸)、聚(L-丙氨酸)、聚(γ-苯甲酯-L-天冬氨酸)、聚(γ-苯甲酯-L-谷氨酸)、聚(γ-甲酯-L-谷氨酸)、聚(γ-乙酯-L-谷氨酸)、聚(O，O’-二苄氧羰基-3，4-二羟基-L-苯丙氨酸)中的一种以上；

制备糖肽缀合物微球或微囊的方法，包括以下几个步骤：

1)将乙醇和吡啶依次加入重量浓度为0.5～10％的壳聚糖/醋酸溶液，然后加入乙酸酐，反应1～4小时，将反应液倒入乙醇中，过滤，得到壳聚糖凝胶，干燥，并经水/乙醇提纯得到水溶性壳聚糖，脱乙酰度为40～60％；

乙醇和吡啶的体积比为：乙醇∶吡啶＝2～5∶1；

吡啶在壳聚糖/醋酸溶液中的浓度为1～5mol/L；

乙酸酐的体积用量为壳聚糖/醋酸溶液的1～5％；

2)将α-氨基酸单体加入溶剂四氢呋喃溶液中，在氩气保护下，加入三光气，并升温至50～60℃反应，直至溶液变为澄清，将反应液倒入正己烷中，在0～25℃下静置8～15小时，过滤，得到白色固体结晶：α-氨基酸-N-羧酸内酐单体；

α-氨基酸单体与三光气的摩尔比例为，α-氨基酸单体∶三光气＝1∶0.3～3；

所说的α-氨基酸-N-羧酸内酐单体选自N_ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-羧酸内酐、N_ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-羧酸内酐、L-亮氨酸-羧酸内酐、L-异亮氨酸-羧酸内酐、L-丙氨酸-羧酸内酐、γ-苯甲酯-L-天冬氨酸-羧酸内酐、γ-苯甲酯-L-谷氨酸-羧酸内酐、γ-甲酯-L-谷氨酸-羧酸内酐、γ-乙酯-L-谷氨酸-羧酸内酐或O，O’-二苄氧羰基-3，4-二羟基-L-苯丙氨酸-羧酸内酐；

3)将步骤1)得到的水溶性壳聚糖溶解在水中，配成浓度为0.01g/ml～5g/ml的壳聚糖水溶液；将步骤2)得到的α-氨基酸-N-羧酸内酐单体溶解在与水互不相溶的有机溶剂中，使单体浓度为0.01mol/l～10.0mol/l，在氩气保护下，将α-氨基酸-N-羧酸内酐溶液加入壳聚糖水溶液中，α-氨基酸-N-羧酸内酐单体与壳聚糖中氨基多糖单元的摩尔比为0.5～20，有机溶剂与水的比例为0.1～5，反应2小时；

所说的有机溶剂选自醋酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷或甲苯等或它们的混合物；

4)将反应产物倒入N，N-二甲基甲酰胺/水混合溶液中，过滤，并依次用水、二甲基甲酰胺、丙酮溶液洗涤，经冷冻干燥得到糖肽缀合物微球或微囊。

本发明是建立在反应体系中水/油两相存在下，通过界面聚合，使壳聚糖上的氨基攻击α-氨基酸-N-羧酸内酐环状单体的开环聚合，形成壳聚糖-接枝聚肽材料。并利用水溶性壳聚糖本身具有一定乳化能力的特点，使在合成糖肽缀合物的同时，原位制备了微球或微囊。

本发明的优点在于：

(1)本发明提供了一种新型的以糖肽缀合物为主体材料的微球和微囊的制备方法。本发明以生物相容性良好的壳聚糖-接枝聚肽为主体材料，具有良好的组织相容性和可降解性，在体内不会造成组织的不良反应。

(2)本发明中，多糖和聚肽通过共价键形成高度交联的聚合物网络，相比通过弱相互作用的自组装技术形成的微囊，本发明提供的微球或微囊结构更为稳定，一旦反应完成，就不能被大部分有机溶剂溶解，也不能被一般浓度的酸、碱和盐破坏。

(3)本发明方法制备工艺简单、材料易得、聚合速率快、制备微球和微囊的过程在合成糖肽缀合物材料的过程中一步完成，并且无需外加乳化剂，反应条件温和，可望能够保持生物活性药物的活性。

(4)适用范围广。本发明制备的微球和微囊在酸性溶液和有机溶剂中均具有一定的溶胀性，制作工艺可适用于包埋蛋白类生长因子、抗癌剂、激素等多种酸溶性药物和油溶性药物。

(5)可控性。通过简单控制反应的组分比可以控制材料的糖基和聚肽的比例，并调控微球和微囊的降解性和溶胀性。通过控制反应条件可控制制备微球或微囊并控制微囊的壁厚。

附图说明

图1是实施例1的产物在光学显微镜下观察的微球在湿态下的图像。

图2是实施例1的产物冷冻干燥后在扫描电镜下观察的图像。

图3是实施例1的产物扫描电镜观察下的微球表面形貌。

图4是实施例2的产物冷冻干燥后在扫描电镜下观察的微囊图像。

图5是实施例2的产物扫描电镜下观察的微囊断面图像。

图6是实施例1和实施例3的产物微球在不同介质中的溶胀情况。

具体实施方式

下面通过本发明方法的具体实施例的详细描述来进一步阐述本发明，但这些实例并不用来限制本发明。

实施例1

取4克壳聚糖溶解于100ml去离子水(含2.8ml冰乙酸)，全部溶解后加入100ml无水乙醇、32ml吡啶，搅拌至澄清，然后加入3.6ml乙酸酐，室温下搅拌2小时。将反应液倒入乙醇中，抽滤，得到白色沉淀。粗产物用水溶解，离心除去不溶物，滤液加入200ml无水乙醇，离心分离后弃去上清液，沉淀物依次用丙酮和无水乙醚洗涤，室温真空干燥24h，得白色絮状固体。采用酸碱滴定法测定产物的脱乙酰度为43％。

在Ar保护下，在100ml三口烧瓶中配制0.1g/10ml上述壳聚糖水溶液。称取0.6825gL-亮氨酸-N-羧酸内酐单体溶于干燥的乙酸乙酯中配成0.5mol/1溶液，并转移至反应瓶中，使L-亮氨酸-N-羧酸内酐单体与壳聚糖中氨基多糖单元的摩尔比为8，并且体系中的油/水相体积比例为0.8。控制搅拌速度为800r/min，反应2h。将反应混合液倒入DMF中，生成白色沉淀，抽滤，依次用DMF/H₂O混合溶液、丙酮洗涤沉淀，冷冻干燥得白色微球。显微镜下观察所制备的微球在湿态时外观圆整，球形较好，尺寸较均匀，如图1。冷冻干燥后在扫描电镜下可见，所得微球能基本保持球形，直径在几十到一百微米之间(图2)，微球表面致密但不光滑(图3)。

实施例2

取4克壳聚糖溶解于100ml去离子水(含2.8ml冰乙酸)，全部溶解后依次加入100ml无水乙醇、32ml吡啶，搅拌至澄清，然后加入3.6ml乙酸酐，室温下搅拌3小时。将反应液倒入乙醇中，抽滤，得到白色沉淀。粗产物用适量去离子水溶解，离心除去不溶物，滤液加入200ml无水乙醇，离心分离后弃去上清液，沉淀物依次用丙酮和无水乙醚洗涤，室温真空干燥24h，得白色絮状固体。采用酸碱滴定法测定产物的脱乙酰度为43％。

在Ar保护下，在100ml三口烧瓶中配制0.1g/10ml上述壳聚糖水溶液。称取0.4263gL-亮氨酸-N-羧酸内酐单体溶于干燥的乙酸乙酯中配成0.14mol/1溶液，并转移至反应瓶中，使L-亮氨酸-N-羧酸内酐单体与壳聚糖中氨基多糖单元的摩尔比为5，并且体系中的油/水相的体积比例为2。控制搅拌速度为800r/min，反应2h。将反应混合液倒入DMF中，生成白色沉淀，抽滤，依次用DMF/H₂O混合溶液、丙酮洗涤沉淀，冷冻干燥得白色粉末。显微镜下观察所制备的微球在湿态时外观圆整，球形较好，尺寸较均匀，形貌类似于实施例1制备的微球。冷冻干燥后在扫描电镜下可见出现明显凹凸和塌陷，如图4，将其在冷冻状态下粉碎可见其内部为中空结构，如图5，壁厚为50μm左右。

实施例3

取4克壳聚糖溶解于100ml去离子水(含2.8ml冰乙酸)，全部溶解后依次加入100ml无水乙醇、32ml吡啶，搅拌至澄清，然后加入3.4ml乙酸酐，室温下搅拌4小时。将反应液倒入乙醇中，抽滤，得到白色沉淀。粗产物用适量去离子水溶解，离心除去不溶物，滤液加入200ml无水乙醇，离心分离后弃去上清液，沉淀物依次用丙酮和无水乙醚洗涤，室温真空干燥24h，得白色絮状固体。采用酸碱滴定法测定产物的脱乙酰度为50％。

在Ar保护下，在100ml三口烧瓶中配制0.1g/10ml上述壳聚糖水溶液。称取1.3382g N_ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸内酐单体溶于干燥的乙酸乙酯中配成0.87mol/l溶液，并转移至反应瓶中，使N_ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸内酐单体与壳聚糖中氨基多糖单元的摩尔比为8，并且体系中的油/水相体积比例为0.5。控制搅拌速度为800r/min，反应2h。将反应混合液倒入DMF中，生成白色沉淀，抽滤，依次用DMF/H₂O混合溶液、丙酮洗涤沉淀，冷冻干燥得白色微球。显微镜下观察所制备的微球外观圆整，球形较好，尺寸较均匀，形貌类似于实施例1制备的微球，直径在200到500μm。

实施例4

取4克壳聚糖溶解于100ml去离子水(含2.8ml冰乙酸)，全部溶解后依次加入100ml无水乙醇、32ml吡啶，搅拌至澄清，然后加入3.4ml乙酸酐，室温下搅拌1小时。将反应液倒入乙醇中，抽滤，得到白色沉淀。粗产物用适量去离子水溶解，离心除去不溶物，滤液加入200ml无水乙醇，离心分离后弃去上清液，沉淀物依次用丙酮和无水乙醚洗涤，室温真空干燥24h，得白色絮状固体。采用酸碱滴定法测定产物的脱乙酰度为50％。

在Ar保护下，在100ml三口烧瓶中配制0.1g/10ml上述壳聚糖水溶液。称取0.8315g N_ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸内酐单体溶于干燥的乙酸乙酯中配成0.11mol/l溶液，并转移至反应瓶中，使N_ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸内酐单体与壳聚糖中氨基多糖单元的摩尔比为5，并且体系中的油/水相体积比例为2.5。控制搅拌速度为800r/min，反应2h。将反应混合液倒入DMF中，生成白色沉淀，抽滤，依次用DMF/H₂O混合溶液、丙酮洗涤沉淀，冷冻干燥得白色粉末。显微镜下观察所制备的微球在湿态时外观圆整，球形较好，尺寸较均匀，形貌类似于实施例1制备的微球。冷冻干燥后在扫描电镜下可见出现明显凹凸和塌陷，类似于实施例2制备的微囊。

实施例5

取4克壳聚糖溶解于100ml去离子水(含2.8ml冰乙酸)，全部溶解后依次加入100ml无水乙醇、32ml吡啶，搅拌至澄清，然后加入3.6ml乙酸酐，室温下搅拌2小时。将反应液倒入乙醇中，抽滤，得到白色沉淀。粗产物用适量去离子水溶解，离心除去不溶物，滤液加入200ml无水乙醇，离心分离后弃去上清液，沉淀物依次用丙酮和无水乙醚洗涤，室温真空干燥24h，得白色絮状固体。采用酸碱滴定法测定产物的脱乙酰度为43％。

在Ar保护下，在100ml三口烧瓶中配制0.1g/10ml上述壳聚糖水溶液。称取0.6825gL-亮氨酸-N-羧酸内酐单体溶于干燥的二氯甲烷中配成0.5mol/l溶液，并转移至反应瓶中，使L-亮氨酸-N-羧酸内酐单体与壳聚糖中氨基多糖单元的摩尔比为8，并且体系中的油/水相体积比例为0.8。控制搅拌速度为800r/min，反应2h。将反应混合液倒入DMF中，生成白色沉淀，抽滤，依次用DMF/H₂O混合溶液、丙酮洗涤沉淀，冷冻干燥得白色微球。显微镜下观察所制备的微球外观圆整，球形较好，尺寸较均匀，形貌类似于实施例1所制备的微球。

实施例6

取4克壳聚糖溶解于100ml去离子水(含2.8ml冰乙酸)，全部溶解后依次加入100ml无水乙醇、32ml吡啶，搅拌至澄清，然后加入3.2ml乙酸酐，室温下强烈搅拌3小时。将反应液倒入乙醇中，抽滤，得到白色沉淀。粗产物用适量去离子水溶解，离心除去不溶物，滤液加入200ml无水乙醇，离心分离后弃去上清液，沉淀物依次用丙酮和无水乙醚洗涤，室温真空干燥24h，得白色絮状固体。采用酸碱滴定法测定产物的脱乙酰度为53％。

在Ar保护下，在100ml三口烧瓶中配制0.1g/10ml上述壳聚糖水溶液。称取0.6825gγ-苯甲酯-L-天冬氨酸-N-羧酸内酐单体溶于干燥的醋酸乙酯中配成0.14mol/l溶液，并转移至反应瓶中，使γ-苯甲酯-L-天冬氨酸-N-羧酸内酐单体与壳聚糖中氨基多糖单元的摩尔比为8，并且体系中的油/水相体积比例为2。控制搅拌速度为800r/min，反应2h。将反应混合液倒入DMF中，生成白色沉淀，抽滤，依次用DMF/H₂O混合溶液、丙酮洗涤沉淀，冷冻干燥得白色微球。显微镜下观察所制备的微球在湿态时外观圆整，球形较好，尺寸较均匀，形貌类似于实施例1所制备的微球，冷冻干燥后在扫描电镜下可见出现明显凹凸和塌陷，类似于实施例2制备的微囊。

实施例7

本实验主要用于研究微球在酸溶液和有机溶剂中的溶胀性。

将按照实施例1和实施例3制备好的微球称取适量，分别记作微球1和微球2。将其分别放入去离子水、pH＝5，pH＝3的盐酸溶液、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中浸泡48h，取出洗涤后吸干表面水份，称重。按照下式计算出其溶胀率：

$\frac{\mathrm{Wwet}-\mathrm{Wdry}}{\mathrm{Wdry}}\×100\%$

其中，W_wet-溶胀前微球质量；W_dry-溶胀后微球质量

结果如图6所示。由图6不难发现，两种微球在水、不同pH的盐酸溶液以及有机溶剂(DMF)均有一定的溶胀性，其中在DMF中的溶胀率最高；并且接枝聚N_ε-苄氧羰基-L-赖氨酸的微球比接枝L-亮氨酸的微球溶胀率更高，在DMF中可达到560％。实验说明通过调节不同的聚肽组分，可以控制微球的溶胀性能。

Claims (4)

1.制备糖肽缀合物微球或微囊的方法，包括以下几个步骤：

1)将乙醇和吡啶依次加入壳聚糖/醋酸溶液，然后加入乙酸酐反应，将反应液倒入乙醇中，过滤，得到壳聚糖凝胶，干燥，并经水/乙醇提纯得到水溶性壳聚糖；

2)将α-氨基酸单体加入溶剂四氢呋喃溶液中，在氩气保护下，加入三光气，并升温至50～60℃反应，将反应液倒入正己烷中，在0～25℃下静置，过滤，得到白色固体结晶：α-氨基酸-N-羧酸内酐单体；

3)将步骤1)得到的水溶性壳聚糖溶解在水中，配成浓度为0.01g/ml～5g/ml的壳聚糖水溶液；将步骤2)得到的α-氨基酸-N-羧酸内酐单体溶解在与水互不相溶的有机溶剂中，使单体浓度为0.01mol/l～10.0mol/l，在氩气保护下，将α-氨基酸-N-羧酸内酐溶液加入壳聚糖水溶液中，α-氨基酸-N-羧酸内酐单体与壳聚糖中氨基多糖单元的摩尔比为0.5～20，有机溶剂与水的比例为0.1～5，反应2小时；

4)将反应产物倒入N，N-二甲基甲酰胺/水混合溶液中，过滤，并依次用水、二甲基甲酰胺、丙酮溶液洗涤，经冷冻干燥得到糖肽缀合物微球或微囊；

步骤1)中，乙醇和吡啶的体积比为：乙醇∶吡啶＝2～5∶1；吡啶在壳聚糖/醋酸溶液中的浓度为1～5mol/L；乙酸酐的体积用量为壳聚糖/醋酸溶液的1～5％，反应时间为1～4小时。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，α-氨基酸单体与三光气的摩尔比例为，α-氨基酸单体∶三光气＝1∶0.3～3。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的α-氨基酸-N-羧酸内酐单体选自N_ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-羧酸内酐、N_ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-羧酸内酐、L-亮氨酸-羧酸内酐、L-异亮氨酸-羧酸内酐、L-丙氨酸-羧酸内酐、γ-苯甲酯-L-天冬氨酸-羧酸内酐、γ-苯甲酯-L-谷氨酸-羧酸内酐、γ-甲酯-L-谷氨酸-羧酸内酐、γ-乙酯-L-谷氨酸-羧酸内酐或O，O’-二苄氧羰基-3，4-二羟基-L-苯丙氨酸-羧酸内酐。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的有机溶剂选自醋酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷或甲苯或它们的混合物。

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