CN114288317A - 一种用于治疗帕金森病的羊栖菜多糖纳米硒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于治疗帕金森病的羊栖菜多糖纳米硒及其应用,缩写为SFPS‑SeNPs,该纳米硒以羊栖菜多糖为模板,纳米粒子的粒径大小为58.3nm,呈球状,硒含量为13.47%。本发明所述的SFPS‑SeNPs在6‑羟基多巴胺(6‑hydroxydopamine,6‑OHDA)诱导的帕金森病大鼠模型中显示出一定的神经保护作用。在剂量为1mg Se/kg bw剂量时,帕金森病大鼠的运动行为、中脑黑质酪氨酸羟化酶阳性神经元数目以及氧化应激状态较模型组明显改善,SFPS‑SeNPs可以调控Nrf2/HO‑1信号通路,起到治疗帕金森病的作用。本发明可应用于治疗帕金森病的药物及功能性食品领域。
Description
技术领域
本发明属于应用于治疗帕金森病的药物及功能性食品领域,具体涉及一种用于治疗帕金森病的羊栖菜多糖纳米硒及其应用。
背景技术
帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)是一种常见于中老年人群的神经退行性疾病,表现为运动迟缓、步态失调、静止性震颤、僵直等运动症状,嗅觉减退、便秘、睡眠行为障碍(RBD)、焦虑抑郁等非运动症状,严重影响患者的生活质量(金国章.脑内多巴胺[M]第2版.上海:上海科学技术出版社,2010,265-370.)。帕金森病以黑质多巴胺能神经元进行性退变和路易小体形成的病理变化为显著特征。目前帕金森病不可被治愈,临床治疗主要以帕金森病症状的缓解为主,其中,左旋多巴是使用最多的药物,然而,该药物却具有副作用大和疗效有限的缺点(陈生弟.中国帕金森病治疗指南第三版[J].中华神经科杂志,2014,47,159-163.)。因此,帕金森病的预防和治疗仍需要重视,对于帕金森病治疗相关的药物研发也十分必要。
多巴胺的氧化应激学说在帕金森病的众多致病机制中占有重要地位,多巴胺的自身氧化以及环境诱导产生的自由基共同损伤多巴胺神经元,导致细胞质膜多聚不饱和脂肪酸和细胞蛋白质过氧化,多巴胺神经元细胞丧失生物酶活性,线粒体和溶酶体损伤,最终神经元自溶(金国章.脑内多巴胺[M]第2版.上海:上海科学技术出版社,2010,265-370.)。随着神经元不断退变,当多巴胺神经元损伤超过80%时,残存的多巴胺神经元的代偿能力不足以维持正常的躯体运动功能,就会导致帕金森症状。Nrf2/HO-1信号通路是一种综合的氧化还原敏感信号系统。当受到氧化应激后,Nrf2和HO-1相关蛋白活化,可以调控超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、谷胱甘肽S转移酶(Glutathione S-transferase,GSTs)等抗氧化酶系。Nrf/HO-1信号通路既能抑制细胞的氧化损伤,又能促使神经元存活,从而起到抗帕金森病活性的效果,是帕金森病研究中的一条重要的信号通路(赵燕芬,吴伟斌,梁结斐等.基于Nrf2/HO-1通路探讨石参有限成分对鱼藤酮诱导的帕金森病细胞模型的保护作用[J].实用医学杂志,2020,36(13),1745-1750.;J.Lee,K.Song,E.Huh,etal.Neuroprotection against 6-OHDA toxicity in PC12 cells and mice through theNrf2 pathway by a sesquiterpenoid from Tussilago farfara[J].RedoxBiol.2018.18,6-15.)。
四川农业大学的胡延春等人发明专利申请公开了一种组合物,该组合物包括纳米硒,葡萄糖,山梨醇等,可改善MPTP诱导的帕金森病小鼠模型的运动功能障碍、黑质致密部神经元和酪氨酸羟化酶阳性神经元,改善脑内氧化应激状态,起到缓解神经推行性病症的作用。然而,该专利并未给出该组合物的具体组合方式,复合物难以保证会在后续储存过程的稳定性问题,另外,该技术使用MPTP诱导C57BL/6雄性小鼠的亚急性模型进行,非进展性模型而且退行性神经疾病症状可逆,通常无帕金森病重要病理标志物——路易小体的产生,用此模型进行帕金森病以及神经退行性疾病的研究具有一定的局限性(胡延春.一种用于缓解退行性神经病变的组合物及应用[P].中国专利:2020.08.14.)。
微量元素硒和羊栖菜多糖分别在治疗神经退行性疾病尤其是帕金森病方面具有重要作用(Ellwanger,J.H.,Franke,S.I.,Bordin,D.L.,et al.Biological functions ofselenium and its potential influence on Parkinson's disease[J].An Acad BrasCienc.88(3):1655-1674.)。羊栖菜多糖纳米硒作为一种以羊栖菜多糖为模板制备的硒纳米粒子,不仅解决了元素硒在毒性和稳定性上的劣势,在治疗帕金森病方面表现出其活性,可进一步开发成药品或功能食品。
发明内容
本发明公开了一种用于治疗帕金森病的羊栖菜多糖纳米硒及其应用,一种以羊栖菜多糖为模板制备的纳米硒,在剂量为1mg Se/kg时,可以有效改善6-OHDA诱导的帕金森病模型大鼠模型的运动行为,中脑黑质酪氨酸羟化酶阳性神经元以及脑内氧化应激状态,调控Nrf2/HO-1信号通路,起到治疗帕金森病的作用。本发明涉及应用于治疗帕金森病的医药及功能性食品领域。
本发明的技术方案如下:
一种用于治疗帕金森病的羊栖菜多糖纳米硒,所述羊栖菜多糖纳米硒是以羊栖菜多糖为模板合成的。
进一步地,所述羊栖菜多糖纳米硒在剂量为1mg Se/kg时,可有效改善6-OHDA诱导的帕金森病大鼠模型的运动行为。
进一步地,所述羊栖菜多糖纳米硒可有效改善帕金森病模型大鼠中脑黑质酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)阳性神经元。
进一步地,所述羊栖菜多糖纳米硒可显著改善帕金森病模型大鼠中脑内氧化应激状态。
进一步地,所述中脑内氧化应激状态的因子包括:超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)中的一种以上。
进一步地,所述羊栖菜多糖纳米硒是依赖调控Nrf2/HO-1信号通路实现改善帕金森病的。
进一步地,所述信号通路的关键因子主要包括:核转录因子NF-E2相关因子2(nuclear erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、血红素氧合酶1(Heme Oxygenase-1,HO-1)中的一种以上。
进一步地,所述羊栖菜多糖纳米硒以羊栖菜多糖为模板。
进一步地,所述羊栖菜多糖纳米硒的粒径大小为58.3nm,呈球状。
进一步地,所述羊栖菜多糖纳米硒的硒中硒的质量百分含量为13.47%。
本发明申请公开一种用于治疗帕金森病的羊栖菜多糖纳米硒(SFPS-SeNPs),该纳米硒粒子以羊栖菜多糖为模板,纳米粒子的粒径大小为58.3nm,呈球状,硒含量为13.47%。
本发明还提供了所述所述羊栖菜多糖纳米硒可应用于治疗帕金森病的药物或功能性食品中。
本发明利用6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)诱导SD大鼠构建了帕金森病大鼠模型,以1mg Se/kg bw剂量的SFPS-SeNPs灌胃喂养28天。结果表明,SFPS-SeNPs可改善帕金森病大鼠运动行为,大鼠旋转圈数降低约51%,TH阳性神经元较模型组增高65.5%。SFPS-SeNPs可以显著改善帕金森病模型大鼠的脑内氧化应激状态,中脑黑质内MDA含量减少,SOD和GSH-Px的活性升高,Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白表达量升高,起到治疗帕金森病的效果。
与现有技术相比,本发明具有如下优点和技术效果:
本发明首次以羊栖菜多糖为模板合成了羊栖菜多糖纳米硒,并且首次检测了羊栖菜多糖纳米硒在治疗帕金森病方面的活性,所述的羊栖菜多糖纳米硒具有治疗帕金森病的效果。
附图说明
图1为实施例1制备的羊栖菜多糖纳米硒的粒径分布图。
图2为实施例1制备的羊栖菜多糖纳米硒的透射电子显微镜图和扫描电子显微镜图。
图3分别为假手术组、模型组、羊栖菜多糖纳米硒组大鼠在喂养28天后旋转行为结果计数分析柱状图。
图4分别为假手术组、模型组和羊栖菜多糖纳米硒组大鼠黑质酪氨酸羟化酶阳性相对光密度值柱状图。
图5分别为假手术组、模型组和羊栖菜多糖纳米硒组大鼠中脑黑质MDA含量分析结果柱状图。
图6分别为假手术组、模型组和羊栖菜多糖纳米硒组大鼠中脑黑质SOD活性分析结果柱状图。
图7分别为假手术组、模型组和羊栖菜多糖纳米硒组大鼠中脑黑质GSH-Px活性的分析结果柱状图。
图8分别为假手术组、模型组和羊栖菜多糖纳米硒组大鼠Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白表达分析结果柱状图。
具体实施方式
以下结合具体实例对本发明作进一步说明,但本发明的实施和保护范围不限于此。
实施例1
羊栖菜多糖纳米硒的合成
采用化学还原法制备SFPS-SeNPs,将浓度为1mg/mL的羊栖菜多糖溶液、20mmol/L的亚硒酸钠溶液、80mmol/L的抗坏血酸溶液按体积比8:1:1(v/v/v)混合,在磁力搅拌的作用下,在黑暗条件、50℃条件下磁力搅拌反应4h,形成颜色稳定的橘红色溶液。将反应液移至截留分子量为3.5kDa的透析袋中,在4℃冰箱中透析72h后冻干,得到羊栖菜多糖纳米硒复合物粉末,-20℃保存。分别采用激光粒度分析仪、透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)和电子耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)对SFPS-SeNPs的粒径、形状和硒含量进行表征。激光粒度分析仪、TEM和SEM的分析结果分别如图1和图2显示,由图1可知,SFPS-SeNPs的粒径大小在58.3nm,由图2可知,SFPS-SeNPs呈规则的圆球形。ICP-OES分析硒含量结果表明冻干后SFPS-SeNPs中硒的质量百分含量为13.47%。
实施例2
帕金森病模型大鼠的建立
手术前将配制好的6-OHDA试剂于冰上解融(避光操作),手术器械消毒、备好。麻醉好的大鼠绑定在多功能脑立体定位仪上,右手持手术刀沿正中线切开头部皮肤,暴露出骨膜,轻轻切开骨膜,使前后囟呈现的更加完整、清晰。纯双氧水擦拭骨面,以前囟为准,按照Paxinos Watson图谱明确右侧纹状体(caudate putamen,CPu)两个坐标的位置,采用两点注射:右侧黑质致密部(SNc)、中脑腹侧被盖区(VTA)。SNc:前囟后(5.0±0.1)毫米,矢状缝右侧(1.5±0.1)毫米,硬脑膜下(7.8±0.1)毫米;VTA:前囟后(4.6±0.1)毫米,中线右侧(0.9±0.1)毫米,硬脑膜下(7.3±0.1)毫米。
用牙科钻于手术要求部位钻开颅骨(尽量避免伤及硬脑膜),用5μL微量进样器将6-OHDA溶液注入右侧纹状体(速度为1.0mm/min),缓慢进针,每孔4μL,注射速度为1μL/min,注射完毕后留针5min,然后以1.0mm/min的速度缓慢退针,同样的方法注射另一点。手术完成后,用医用明胶海绵填塞颅骨孔,缝合切口皮肤,肌肉注射青霉素(8万单位/只,持续注射7天),放入提前准备好的笼中,待动物清醒后送回饲养笼中。假手术组只注射含0.2mg/mL抗坏血酸的生理盐水,其余步骤与造模组相同。次日,观察大鼠并记录大鼠活动情况。
造模后一周用阿扑吗啡(apomorphine,APO)进行行为学评价以检测模型是否成功,成功的实验动物进行后续的实验分组。依照国际通用标准,对注射过6-OHDA的大鼠,于术后第2周开始筛选,即每周一次腹腔注射阿扑吗啡(0.5mg/kg bw、浓度为0.5mg/ml)诱导其向健侧旋转,共筛选3周,每次记录30min,旋转210圈以上即>7r/min为PD模型鼠。
实施例3
SFPS-SeNPs对帕金森病模型大鼠的神经保护作用
取12只模型大鼠,分为模型组和羊栖菜多糖纳米硒组,另假手术组6只大鼠做对照。具体实验设计如下:(1)模型组:生理盐水灌胃;(2)假手术组:生理盐水灌胃;(3)羊栖菜多糖纳米硒组:按1mg Se/kg·d bw的剂量灌胃羊栖菜多糖纳米硒。各组灌胃体积均按1mL/100g进行,实验进行28天。
3.1SFPS-SeNPs对帕金森病模型大鼠旋转行为的影响
28天后,所有动物在进行处死之前都要进行旋转测试。大鼠腹腔注射0.5mg/kg的阿扑吗啡(apomorphine,APO),腹腔注射的体积一般在1.0ml/100g,30min内记录对侧旋转数。来自鼠标意外死亡的数据将从分析中排除。APO诱导的旋转行为可以用来评估6-OHDA诱导的帕金森病模型大鼠的致病程度,一般r>7r/min即视为患帕金森病,一定时间内,大鼠向健侧旋转的圈数越多,大鼠的患病程度越深。
灌胃SFPS-SeNPs治疗28d后,结果如图3所示,假手术组并未产生旋转行为,模型组旋转行为明显,而将SFPS-SeNPs作用于帕金森病模型大鼠后,旋转圈数减少约60%,此旋转病态行为明显改善。
3.2SFPS-SeNPs对帕金森病模型大鼠中脑黑质TH阳性神经元的影响
行为学检测完毕后,各组大鼠禁食8h,随后采用戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后经左心室插管依次灌流生理盐水及含40g/L多聚甲醛的0.1mol/L的磷酸缓冲盐溶液(PBS,pH值为7.2-7.4)固定组织。断头取脑,固定24h,作连续冰冻冠状切片,片厚4μm,随后依次封闭内源性过氧化物酶,0.01M柠檬酸钠缓冲溶液进行抗原修复,0.05g/mL羊血清室温封闭非特异性蛋白,添加TH多克隆抗体(稀释体积比为1:200)于湿盒中室温1小时,然后4℃过夜,从冰箱中取出需37℃复温45min,二抗(山羊抗兔IgG(HL)RP标记抗体)(稀释体积比为1:1000)37℃孵育,进行链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结反应(SP反应),随后加入3-二氨基联苯胺染色液(DAB染液),观察染色情况,最后苏木素复染、乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片,在显微镜下观察TH阳性细胞形态及数目。
对免疫组化切片的相对光密度值进行分析,结果如图4所示,模型组的相对光密度值较假手术组降低44%,结果具有显著性,说明模型建立成功;SFPS-SeNPs组较模型组增高40%,结果具有显著性。
3.3SFPS-SeNPs对帕金森病模型大鼠中脑黑质MDA含量、GSH-Px活性和SOD活性的影响
每组取剩余大鼠,用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后处死,新鲜取脑。将脑组织定位取出黑质后,把损毁侧黑质部分剪切成小块,取一半(另一半用于Nrf2、HO-1蛋白检测)精密称重,按质量(g):体积(mL)=1:9比例加9倍生理盐水,冰水浴条件下机械匀浆,制备成匀浆液,以4 000r/min离心15min,取上清液保留备用。采用丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA比色法)、总超氧化物歧化酶检测试剂盒(NBT核黄素微板法)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒(比色法)分别检测丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。
如图5、图6和图7所示,经过6-OHDA的诱导,帕金森病模型大鼠黑质内与氧化应激相关的脂质过氧化物MDA较假手术组升高约60%,而与抗氧化相关的酶SOD、GSH-Px的活力下降50~60%。通过羊栖菜多糖纳米硒的治疗,MDA显著减少至与假手术组含量近乎相同,同时,SOD和GSH-Px酶活增高明显,其中SOD活性较模型组增加82%,GSH-Px较模型组增加95%,中脑内氧化应激状态明显改善。
3.4SFPS-SeNPs对帕金森病模型大鼠中脑Nrf2、HO-1蛋白表达的影响
蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)的分析方法如下:取另一半黑质放于预冷的玻璃匀浆器中,按说明加入蛋白裂解液,匀浆器充分研磨,加裂解液于4℃、12000r/min离心15min,取上清液。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度,每孔上样5mg/ml。制备聚丙烯酰胺凝胶进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),浓缩胶(50g/L)80V、30~40min,分离胶(10g/L)120V、60~70min。电泳后将蛋白转至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,牛血清白蛋白封存60min,4℃一抗封闭过夜,(Nrf2抗体,体积比1:1000稀释;HO-1,体积比1:1000稀释;GAPDH,体积比1:1000稀释),TBST缓冲液洗膜,加入二抗(山羊抗兔抗体,体积比1:1000稀释;山羊抗鼠抗体,体积比1:5000稀释),常温孵育60min,TBST缓冲液漂洗,化学发光凝胶成像仪显影,分析目的条带灰度值。
Western Blot的分析结果(图8)表明,模型组大鼠中脑黑质Nrf2和HO-1的表达较假手术组显著下降,而使用羊栖菜多糖纳米硒的Nrf2和HO-1的表达较模型组显著升高。定量分析可得,相对于假手术组,模型组的Nrf2和HO-1的表达量分别下降57.8%和47.6%,而使用羊栖菜多糖纳米硒对帕金森病模型大鼠进行治疗后,两蛋白的相对表达量分别升高65.1%和34.5%。
综上,本发明的羊栖菜多糖纳米硒复合物可以改善帕金森病大鼠的运动行为,增加其中脑黑质内TH阳性神经元的数目,改善中脑内氧化应激状态,调控Nrf2/HO-1信号通路,起到治疗帕金森病的作用。
Claims (10)
1.一种用于治疗帕金森病的羊栖菜多糖纳米硒,其特征在于,所述羊栖菜多糖纳米硒是以羊栖菜多糖为模板合成的。
2.根据权利要求1所述一种用于治疗帕金森病的羊栖菜多糖纳米硒,其特征在于,所述羊栖菜多糖纳米硒在剂量为1mg Se/kg时,可有效改善6-OHDA诱导的帕金森病大鼠模型的运动行为。
3.根据权利要求1所述一种用于治疗帕金森病的羊栖菜多糖纳米硒,其特征在于,所述羊栖菜多糖纳米硒可有效改善帕金森病模型大鼠中脑黑质酪氨酸羟化酶阳性神经元。
4.根据权利要求1所述一种用于治疗帕金森病的羊栖菜多糖纳米硒,其特征在于,所述羊栖菜多糖纳米硒可显著改善帕金森病模型大鼠中脑内的氧化应激状态。
5.根据权利要求4所述一种用于治疗帕金森病的羊栖菜多糖纳米硒,其特征在于,所述中脑内氧化应激状态的因子包括:超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛中的一种以上。
6.根据权利要求1所述一种用于治疗帕金森病的羊栖菜多糖纳米硒,其特征在于,所述羊栖菜多糖纳米硒是依赖调控Nrf2/HO-1信号通路实现改善帕金森病。
7.根据权利要求6所述一种用于治疗帕金森病的羊栖菜多糖纳米硒,其特征在于,所述信号通路的关键因子主要包括:核转录因子NF-E2相关因子2、血红素氧合酶1中的一种以上。
8.根据权利要求1所述一种用于治疗帕金森病的羊栖菜多糖纳米硒,其特征在于,所述羊栖菜多糖纳米硒的粒径大小为58.3nm,呈球状。
9.根据权利要求1所述一种用于治疗帕金森病的羊栖菜多糖纳米硒,其特征在于,所述羊栖菜多糖纳米硒中硒的质量百分含量为13.47%。
10.权利要求1所述一种用于治疗帕金森病的羊栖菜多糖纳米硒的应用,其特征在于,所述羊栖菜多糖纳米硒可应用于治疗帕金森病的药物或功能性食品中。
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PB01 | Publication | ||
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