KR101571231B1 - 가용성 셀레노당단백질을 분리, 특성화 및 투여하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 가용성 셀레늄 조성물 및 이의 생산, 분리 및 정제 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 (예를 들면, 셀레늄 강화 효모로부터 셀레노당단백질 추출을 통해) 가용성 셀레노당단백질을 제조하는 방법, 수용성 셀레노당단백질 및 셀레늄 결핍 조성물의 혼합을 통해 셀레늄 결핍 조성물을 보충하는 방법, 상기 수용성 셀레노당단백질을 포함하는 조성물 및 이를 투여하는 방법에 관한 것이다.

Description

가용성 셀레노당단백질을 분리, 특성화 및 투여하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR SEPARATING, CHARACTERIZING AND ADMINISTERING SOLUBLE SELENOGLYCOPROTEINS}

이 출원은 2010년 3월 18일자 출원된 미국 가특허출원 제61/315,265호의 우선권을 주장하는 2011년 3월 18일자 출원된 미국특허출원 13/051,646호의 일부계속출원(CIP)이고 이의 우선권을 주장하며, 이들 각각은 여기에서 전부 참고로 인용된다.

본 발명은 가용성 셀레늄 조성물 및 이의 생산, 분리 및 정제 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 (예를 들면, 셀레늄 강화 효모로부터 셀레노당단백질의 추출을 통해) 수용성 셀레노당단백질(selenoglycoprotein)을 제조하는 방법, 수용성 셀레노당단백질과 셀레늄 결핍 조성물의 혼합을 통해 셀레늄 결핍 조성물을 보충하는 방법, 상기 수용성 셀레노당단백질을 포함하는 조성물 및 이를 투여하는 방법에 관한 것이다.

셀레늄(selenium)은 인간의 적절한 생리적 기능에 중요한 미량 원소이다. 셀레늄은 다양한 함량의 셀레늄을 함유할 수 있는 식이(diet)을 통해 섭취된다.

셀레늄은 생리적 대사, 성장, 생식 건강 및 면역을 유지하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 셀레늄은 예를 들어, 1-셀레노메티오닌, 셀레노시스테인 및 셀레노시스틴와 같은 아미노산을 포함하는 상이한 유기분자에 혼입된다. 따라서 셀레늄은 단백질의 구성성분의 일부가 될 수 있으며, 그중 대부분은 인체에 구조적으로 중요하다. 또한 셀레늄은 대사, 생식, 암의 예방 및 인간의 면역 방어에 영향을 미치는 다수의 효소에서 중요한 성분이다 (예를 들면, Rayman, M, Lancet 356:233-241 (2000) 참조).

낮은 수준의 셀레늄의 섭취로부터 생기는 잠재적인 건강 효과를 밝혀내기 위해 다수의 연구들이 시도되었다. 예를 들어, 무기 형태의 셀레늄의 낮은 농도는 약간의 잠재적 건강효과를 나타냈다 (예를 들면, Furnsinn et al., Int. J of Obesity and Related Metab. Dis., 19, 458-463 (1995) 참조). 그러나 높은 투여량 수준에서는 유익한 효과가 반전되고 위험한 독성이 나타난다.

지난 20년에 걸친 연구는 셀레늄이 영양 요구량보다 단지 5 내지 10배의 투여량으로 동물에게 제공하였을 때 암 발생율의 감소에 효과적이다고 제안하였다 (예를 들면, El-Bayoumy, The role of selenium in cancer prevention, Philadelphia, Lippincott, 1-15, 1991 참조). 동물 모델 시스템에서 셀레늄에 대한 화학예방 연구는 이 원소가 장기 시스템의 모두는 아니지만 대부분에 효과적이고 또한 발암효과에 대응하여 보호적이다고 지적하였다(예를 들면, El-Bayoumy, The role of selenium in cancer prevention, Philadelphia, Lippincott, 1-15, 1991 참조). 역학적 연구와 보완시험은 둘 다 간, 결장, 전립선 및 폐의 암 발생률을 낮추는 그의 효능을 지지했다 (예를 들면, Yu et al. Biol Trace Elem Res, 56: 117-124 (1997); Clark et al., J Am Med Assoc, 276: 1957-1963 (1996); Yoshizawa et al., J Natl Cancer Inst, 90: 1219-1224, (1998); Brooks, et al., J Urol, 166: 2034-2038, (2001) 참조). 다른 연구들은 암의 셀레늄 감소에 대한 유익한 효과를 입증하지 못했다 (예를 들면, Garland et al., J. Am. Coll Nutr., 12: 400-11 (1993); Ghadirian et al., Cancer Detect Prev, 24: 305-13 (2000) 참조).

여러 가지 형태의 셀레늄이 조사되었다. 이들은 소듐 셀레나이트 등의 무기 셀레늄, 및 셀레늄 효모를 포함한 유기 근원을 포함한다. 무기 셀레늄과 유기 셀레늄의 독성 사이에 상당한 차이가 있고, 무기 화합물은 일반적으로 흡수되고 덜 효율적으로 이용되고 또한 셀레늄 유기근원보다 더 독성이 있다.

본 발명은 가용성 셀레늄 조성물 및 이의 생산, 분리 및 정제 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 (예를 들면, 셀레늄 강화 효모로부터 셀레노당단백질의 추출을 통해) 수용성 셀레노당단백질을 제조하는 방법, 수용성 셀레노당단백질과 셀레늄 결핍 조성물의 혼합을 통해 셀레늄 결핍 조성물을 보충하는 방법, 상기 수용성 셀레노당단백질을 포함하는 조성물 및 이를 투여하는 방법에 관한 것이다.

따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 a) 셀레늄 강화 효모(selenium enriched yeast)를 제공하고, b) 상기 셀레늄 강화 효모를 산성 조건에 노출시킨 다음 원심분리하여 i) 산 불용성 물질을 포함하는 펠렛, 및 ii) 산성 조건 하에서 가용성인 셀레늄 강화 효모의 추출물을 포함하는 액상을 생성시키고, c) 상기 액상의 pH를 높여서 산성 조건 하에서 가용성인 셀레늄 강화 효모의 추출물을 포함하는 액상으로부터 셀레노당단백질(selenoglycoprotein)을 침전시키고, d) 상기 액상으로부터 상기 침전된 셀레노당단백질을 분리하는 단계를 포함하는 가용성 셀레노당단백질의 제조방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 산성조건에 셀레늄 강화 효모의 노출은 실온보다 높은 온도(예를 들면, 약 20~25℃ 이상)에서 일어난다. 본 발명은 셀레늄 강화 효모가 산성 조건에 노출되는 실온보다 더 높은 온도로 제한되지 않는다. 실제로, 이들로 제한되지 않지만, 약 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 90, 95, 97, 99℃ 또는 그 이상을 포함하는 다양한 온도가 사용될 수 있다. 마찬가지로, 본 발명은 셀레늄 강화 효모가 노출되는 산성 조건으로 제한되지 않은다. 일부 실시형태에서, 셀레늄 강화 효모는 pH가 약 6.5, 약 6, 약 5.5, 약 5, 약 4.5, 약 4, 약 3.5, 약 3, 약 2.5, 약 2, 약 1.5, 약 1, 또는 미만인 조건에 노출된다. 바람직한 실시형태에서, 셀레늄 강화 효모를 산성 조건에 노출하는 것은 셀레늄 강화 효모를 pH 1.5에 노출하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 산성 조건에 셀레늄 강화 효모의 노출은 일정 시간 동안 발생한다. 본 발명은 셀레늄 강화 효모가 산성 조건에 노출되는 시간의 양에 의해 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 셀레늄 강화 효모는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 또는 그 이상의 시간 동안 산성조건에 노출된다. 일부 실시형태에서, 셀레늄 강화 효모는 1 내지 24 시간 동안 산성조건에 노출된다. 일부 실시형태에서, 셀레늄 강화 효모는 5 내지 10 시간 동안 산성조건에 노출된다. 바람직한 실시형태에서, 셀레늄 강화 효모는 약 8 시간 동안 산성조건에 노출된다. 일부 실시형태에서, 산성조건은 산성 완충제의 사용 및/또는 산의 첨가에 의해 생성 및/또는 유지된다. 본 발명은 사용되는 산의 유형으로 제한되지 않는다. 실제로, 어떠한 산도 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서는, 어떠한 산도 사용할 수 있지만 산은 염산이다. 일부 실시형태에서, 셀레노당단백질은 액상의 pH를 상승시키고 산성 조건 하에서서 가용성인 셀레늄 강화 효모의 추출물을 포함하는 액상으로부터 침전된다. 일부 실시형태에서, 침전된 셀레노당단백질은 원심분리를 통해 액상으로부터 분리되어 침전된 셀레노당단백질의 펠렛을 형성한 다음, 침전된 셀레노당단백질로부터 액상을 제거한다. 본 발명은 추출물의 pH가 액상으로부터 셀레노당단백질을 침전하기 위하여 상승되는 양 또는 정도에 의해 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 액상의 pH는 1.85로 상승시킨다. 일부 실시형태에서, 액상의 pH는 3.0으로 상승시킨다. 일부 실시형태에서, 액상의 pH는 4.0으로 상승시킨다. 일부 실시형태에서, 액상의 pH는 6.0으로 상승시킨다. 일부 실시형태에서, 셀레노당단백질은 침전되고 다양한 pH 조건에서 액상으로부터 분리되어 가용성 셀레노당단백질의 여러 가지 pH 의존성 분획을 생성한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 산성 조건 하에서 가용성인 셀레늄 강화 효모 추출물을 포함하는 단일 액상을 사용하여 첫번째 pH (예를 들면, pH 1.85)에서 침전된 가용성 셀레노당단백질의 첫번째 분획, 두번째 pH (예를 들면, pH 3.0)에서 침전된 가용성 셀레노당단백질의 두번째 분획, 세번째 pH (예를 들면, pH 4.0)에서 침전된 가용성 셀레노당단백질의 세번째 분획, 및 네번째 pH (예를 들면, pH 6.0)에서 침전된 가용성 셀레노당단백질의 네번째 분획를 생성한다. 일부 실시형태에서, 액상의 pH를 높여서 액상으로부터 셀레노당단백질을 침전하는 것은 액상의 다수의 연속적인 pH 의존성 침전반응을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가용성 셀레노당단백질을 포함하는 조성물은 셀레노당단백질의 단일 pH 의존성 분획 (예를 들어, pH 4.0에서 침전된 산성 조건 하에서 가용성인 셀레늄 강화 효모의 추출물을 포함하는 액상으로부터 가용성 셀레노당단백질)만을 함유한다. 일부 실시형태에서, 가용성 셀레노당단백질을 포함하는 조성물은 셀레늄 강화 효모의 2개 이상의 pH 의존성 분획 (예를 들면, 두 개 이상의 상이한 pH 값에서 침전된 산성조건 하에서 가용성인 셀레늄 강화 효모의 추출물을 포함하는 액상으로부터 가용성 셀레노당단백질)을 함유한다.

일부 실시형태에서, 셀레늄 강화 효모는 2% 이하의 무기 셀레늄을 함유하는 건조된 생존불능의 셀레늄 강화 효모이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따라 제조된 가용성 셀레노당단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 가용성 셀레노당단백질을 포함하는 셀레늄 결핍 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 가용성 셀레노당단백질은 셀레늄 결핍 조성물에 첨가되고 및/또는 이와 혼합된다. 본 발명은 본 발명의 셀레노당단백질이, 이들로 제한되지 않지만, 식이성 보조식품(dietary supplements), 의약, 의약품, 식품, 동물사료 및 기타 유형의 재료를 포함하는 상기 조성물 또는 물질에 첨가되고 및/또는 이와 혼합되는 셀레늄 결핍 조성물 또는 물질의 형태로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 셀레노당단백질을 첨가 또는 혼합하는 것(예를 들면, 혼합하는 것)은 셀레노당단백질 및 하나 이상의 다른 유형의 셀레늄을 상기 조성물 내에 혼합하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 가용성 셀레노당단백질은 (예를 들면, 셀레늄의 총량을 증가하고 및/또는 보충하기 위해) 셀레늄을 함유하는 조성물에 첨가하고 및/또는 이와 혼합된다.

본 발명은 또한 가용성 셀레노당단백질 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 셀레노당단백질은 셀레노당단백질의 특이적 pH 의존성 분획이다. 본 발명은 사용된 담체의 유형으로 제한되지 않는다. 실제로, 이들로 제한되지 않지만, 덴드리머, 폴리머로좀(polymerosome), 나노 입자, 서방성 고분자, 나노 캡슐 및/또는 분자 각인 고분자(molecularly imprinted polymer)를 포함하는 다양한 담체가 사용될 수 있다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 담체는 서방성 고분자이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 담체는 분자 각인 고분자이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 담체는 셀레노당단백질을 캡슐화하는데 사용되는 폴리머좀이다. 본 발명은 사용되는 폴리머좀의 유형으로 제한되지 않는다. 실제로, 당업계에 알려진 임의의 폴리머좀이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리머좀은 폴리(에틸렌옥사이드)(PEO) 블록 공중합체를 포함한다. 그러나, 본 발명은 이들로 제한되지 않는다. 예를 들면 폴리(에틸에틸렌)(PEE), 폴리(부타디엔)(PB 또는 PBD), 폴리(스티렌)(PS), 및 폴리(이소프렌)(PI)를 포함하는 임의의 알려진 블록 공중합체가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 고분자는 폴리(ε-카프로락톤)(PLC)디블록 공중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리머좀은 폴리(에틸렌옥사이드)-블록-폴리(ε-카프로락톤)(PEO-b-PCL) 계 디블록 공중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리머좀은 트리블록, 테트라블록, 펜타블록, 또는 적어도 6개의 블록 공중합체인 블록 공중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리머좀은 폴리(락트산), 폴리(글리콜리드), 폴리(락트-코글리콜산) 및/또는 폴리(3-하이드록시부티레이트)와 PEO의 커플링으로부터 유도된다. 본 발명은 폴리머좀 캡슐화 셀레노당단백질의 크기에 의해 제한되지 않는다. 다양한 크기는, 이들로 제한되지 않지만, 직경 약 50-300 nm인 폴리머좀 캡슐화 셀레노당단백질을 포함하나, 더 큰 (예, 약 350 nm, 400 nm, 500 nm 또는 그 이상) 및 더 작은 (예, 약 40 nm, 30 nm, 20 nm, 또는 그 이하) 폴리머좀 캡슐화 셀레노당단백질도 사용될 수 있는, 본 발명의 조성물 및 방법에서 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 한 실시형태에 따른 산성추출 및 후속 침전에 의한 SEL-PLEX로부터 가용성 셀레노당단백질 (SGP)의 연속적인 제조를 도시한다.
도 2는 본 발명의 한 실시형태에 따른 셀레노당단백질의 pH 의존성 침천 공정을 도시한다.
도 3은 기본 대조군에 비하여 닭 가슴 골격근에서의 유전자 발현 수준에 대한 실시예 3의 표 3 및 4에 기술된 상이한 셀레늄 보조식품 치료의 효과를 나타내는 가열 지도(heat map)를 도시한다.
도 4는 가슴근육에서 프로파일된 유전자 발현에 대한 SGP 분획 pH 4.0 및 SEL-PLEX의 상이한 효과를 나타내는 벤 다이어그램(Venn diagram)이다.
도 5는 소듐 셀레나이트(SS), SEL-PLEX(SP) 및 셀레노당단백질(SGP) 분획 pH 4.0에 의해 통상적으로 조절되는 것으로 확인된 모범적인 유전자를 도시한다.
도 6은 소듐 셀레나이트(SS)가 아닌, SEL-PLEX (SP) 및 셀레노당단백질(SGP) 분획 pH 4.0에 의해 통상적으로 조절되는 것으로 확인된 모범적인 유전자를 도시한다.
도 7은 소듐 셀레나이트(SS) 또는 SEL-PLEX (SP)에 의해 조절되지 않고, 셀레노당단백질(SGP) 분획 pH 4.0에 의해 독특하게 조절되는 것으로 확인된 모범적인 유전자를 도시한다.
도 8은 소듐 셀레나이트(SS) 또는 SEL-PLEX (SP)에 의해 조절되지 않고, 셀레노당단백질(SGP) 분획 pH 4.0에 의해 독특하게 조절되는 것으로 확인된 모범적인 유전자를 도시한다.
도 9는 소듐 셀레나이트(SS) 또는 SEL-PLEX (SP)에 의해 조절되지 않고, 셀레노당단백질(SGP) 분획 pH 4.0에 의해 독특하게 조절되는 것으로 확인된 모범적인 유전자를 도시한다.
도 10은 소듐 셀레나이트(SS) 또는 SEL-PLEX (SP)에 의해 조절되지 않고, 셀레노당단백질(SGP) 분획 pH 4.0에 의해 독특하게 조절되는 것으로 확인된 모범적인 유전자를 도시한다.
도 11은 기본 대조군에 비하여 간 조직에서의 유전자 발현 수준에 대한 실시예 3의 표 3 및 4에 기술된 상이한 셀레늄 보조식품 치료의 효과를 나타내는 가열지도를 도시한다.
도 12는 2주 기간에 걸쳐 pH 5.1 및 pH 7.4에서 나노캡슐로부터 SGP의 방출을 도시한다.
도 13은 pH 7.4에서 폴리머좀 캡슐화 셀레노당단백질의 극저온 전자 터널링 현미경(cryo-TEM) 이미지를 도시한다.

정의

본 발명의 이해를 촉진하기 위해, 다수개의 용어와 문구들이 이하에 정의된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 모두 공유 "펩티드 결합"에 의해 결합되는 아미노산의 기본 서열을 언급한다. 일반적으로, 펩티드는 몇 개의 아미노산, 전형적으로 2-50개의 아미노산으로 구성되고, 단백질보다 더 짧다. 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 및 단백질을 포함한다.

용어 "당단백질(들)" 또는 "당펩티드(들)"은 폴리펩티드 사슬에 공유적으로부착된 하나 이상의 탄수화물 잔류물을 함유하는 단백질 또는 펩티드를 의미한다. 용어 "셀레노단백질(들)(selenoprotein(s))"또는 "셀레노펩티드(들)"은 하나 이상의 셀레늄 원자를 포함하는 단백질 또는 펩티드를 의미한다. 전형적으로 셀레늄 원자는 셀레노시스테인 및 셀레노메티오닌을 포함하는 셀레늄 함유 아미노산들 내의 단백질에 도입된다.

용어 "셀레노당단백질(들)(selenoglycoprotein(s))", "셀렌당펩티드(들)" 또는 "SGP(들)"은 하나 이상의 셀레늄 원자를 혼입하는 당단백질 또는 당펩티드를 의미한다. 전형적으로, "셀레노당단백질"은 하나 또는 그 이상의 셀레늄 함유 아미노산을 포함한다. "셀레노당단백질"은 임의의 수의 상이한 형태로 다수의 탄수화물을 포함할 수 있다.

용어 "샘플" 및 "시편(specimen)"은 그의 최고 넓은 의미로 사용되며 또한 임의의 근원으로부터 얻어지는 샘플 또는 시편을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "샘플"은 동물 (인간을 포함)에서 얻은 생물학적 샘플을 언급하는데 사용되며, 또한 액체, 고체 및 조직을 포함한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 뇌척수액(CSF), 장액성 액체, 소변과 타액, 혈액, 그리고 혈장, 혈청 등과 같은 혈액 제품을 포함한다. 그러나 이들 예는 본 발명에서 활용되는 샘플의 종류를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "효모" 및 "효모 세포"는 세포벽, 세포막 및 세포내 구성분을 갖는 왕국 균류(kingdom Fungi)로 분류되는 진핵 미생물을 의미한다. 효모는 특정 분류학 또는 계통발생 그룹을 형성하지 않는다. 현재 약 1,500 종이 알려져 있다, 그것은 모든 효모종의 1%만이 설명되어진 것으로 추정된다. 용어 "효모"는 종종 S. cerevisiae의 동의어로 간주되지만, 효모의 계통발생 다양성은 자낭균문 및 담자균문에서 자신의 위치로 표시된다. 용어 "효모"는 양조효모, 증류기 효모 및 베이커(Baker) 효모를 포함한다. 출아효모("참 효모")는 효모균목으로 분류된다. 효모종의 일부가 이분열에 의해 생식하더라도 대부분의 효모 종은 출아에 의해 무성으로 생식한다. 효모는 일부 종이 가성균사(pseudohyphae) 또는 거짓 균사(false hyphae)로 알려진 연결된 출아세포의 스트링(string)의 형성을 통해 다세포가 되더라도 단세포이다. 효모 크기는 종에 따라 크게 변할 수 있으며, 전형적으로 측정시 직경 3-4 ㎛이지만, 일부 종은 40 ㎛ 이상 도달할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "셀레늄 강화 효모" 및 "셀렌화 효모"는 무기 셀레늄 염을 함유하는 배지에서 배양되는 임의의 효모 (예를 들어, 출아효모(Saccharomyces cerevisiae))를 의미한다. 본 발명은 사용되는 셀레늄 염에 의해 제한되지 않는다. 실제로, 이들로 제한되지 않지만, 소듐 셀레나이트 또는 소듐 셀레네이트를 포함하는 다양한 셀레늄 염들이 본 발명에서 유용한 것으로 고려된다. 또한 자유 셀레노메티오닌 (예를 들면, 세포 또는 효모와 관련되지 않음)은 효모가 이런 형태의 셀레늄을 포함하기 때문에 셀레늄 강화 효모을 위한 셀레늄 근원으로서 사용할 수 있다. 배양 도중에, 셀레늄과 황 사이의 화학적 유사성 때문에, 효모는 세포 내에서 일반적으로 황 함유 유기 화합물인 경우에 황 대신에 셀레늄을 포함한다. 이러한 효모 제제에서 셀레늄 함유 화합물은 폴리 펩타이드/단백질 내에 포함되는 셀레노 메티오닌이다. 이러한 제제에서 셀레노메티오닌의 형태로 존재하는 총 세포 셀레늄의 양은 10 내지 100%, 20 내지 60%, 50 내지 75% 및 60 내지 75%로 변할 수 있지만, 그 범위 내일 수 있다. 셀렌화 효모 제제에서 유기 셀레늄의 나머지는 셀레노메티오닌 생합성을 위한 경로에서 중간체로 주로 만들어진다. 이들은 셀레노시스테인, 셀레노시스타티오닌, 셀레노호모시스테인 및 셀레노아데노실셀레노메티오닌을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 최종 제품에서 잔류 무기 셀레늄 염의 양은 일반적으로 매우 낮다 (예를 들면, <2 %).

본 명세서에서 사용되는 용어 "SEL-PLEX"는 효모의 성장속도에 대한 셀레늄염의 해로운 영향을 최소화하고 세포 유기 물질내에 무기 셀레늄의 최적 혼입을 가능하게 하는 방식으로 사탕수수 당밀과 셀레늄 염의 증가량을 제공하는 유가발효(fed batch fermentation)에서 배양되는 건조 생존불능 셀레늄 강화 효모 (수탁번호 CNCM I-3060의 출아효모(Sacchoromyces cerevisiae), Collection Nationale De Cultures De Microorganismes (CNCM), 파스퇴르 연구소, 파리, 프랑스)를 언급한다. 잔류 무기 셀레늄은 (예를 들면, 철저한 세척 공정을 사용하여) 제거되고, 총 셀레늄 함량의 2%를 초과하지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "유기 셀레늄"은 셀레늄 원자가 탄소원자에 직접 결합되어 있는 임의의 유기 화합물을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "무기 셀레늄"은 일반적으로 셀레늄이 -2, +4 및 +6 산화상태인 임의의 셀레늄 염 (예를 들면, 소듐 셀레나이트, 소듐 셀레네이트)을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "숙주"(host), "대상" 및 "환자"는 연구되고, 분석되고, 시험되고, 진단되거나 또는 치료되는 인간 및 동물을 비롯한 임의의 동물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 "숙주", "대상 " 및 "환자"는 달리 지시가 없는 한 서로 교환적으로 사용된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "w/w"("중량/중량")는 중량 기준으로 조성물 중의 특정물질의 양을 의미한다. 예를 들어, 0.02 중량% 식이 사료 보조식품을 포함하는 동물사료는 식이성 사료 보조식품의 질량이 동물 사료의 총 질량의 0.02% (예를 들면, 동물사료의 999,800 g중 식이 사료 보조식품 조성물 200 g)이다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "정제된" 또는 "정제하다"는 샘플로부터 구성분들의 제거를 의미한다. 예를 들어, 효모 세포벽은 비-효모 세포벽 구성분 (예를 들면, 플라즈마 막 및/또는 효모 세포내 구성분)을 제거함으로써 정제된다. 이들은 또한 효모 세포벽 이외의 오염 물질이나 다른 약제의 제거에 의해 정제된다. 샘플 중에 비-효모 세포벽 구성분 또는 비-효모 세포벽 오염물의 제거는 샘플 중에 효모 세포벽 또는 그의 구성분들의 % 증가를 초래한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "유효량"은 유익한 또는 원하는 결과를 얻기에 충분한 본 발명의 셀레노당단백질을 포함하는 조성물의 양을 의미한다. 유효량은 하나 이상의 투여, 적용 또는 복용량에서 투여할 수 있고, 특수한 제형 또는 투여 경로로 제한되는 것이 아니다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "생체이용률"(bioavailability)은 유기체에 사용할 수 있거나 또는 전신순환에 도달하는 분자 또는 구성분의 비율을 의미한다. 분자 또는 구성분이 정맥으로 투여되는 경우, 그의 생체이용률은 매우 높다. 그러나 분자 또는 구성분이 다른 경로 (예를 들면, 경구 등)를 통해 투여되는 경우, 그의 생체이용률은 (불완전한 흡수 및 처음 통과 대사로 인해) 감소한다. 영양 세팅에서 생체이용률은 영양소의 흡수 및 이용의 비율을 의미한다. 동일한 영양소의 상이한 형태는, 예를 들면, 상이한 생체이용률을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "사료", "식품", "동물 사료"및 "식물"(feedstuff)은 동물에 의해 소비되고 동물의 식이에 에너지 및/또는 영양소를 돕는 물질(들)을 의미한다. 그의 예로는 총 배합 사료 (TMR), 목초(들), 펠렛 (들), 농축물(들), 사료 프리믹스(들), 공제품(들), 곡물(들), 양조 곡물 (distiller grain), 당밀, 섬유(들), 사료(들), 잔디(들), 건초, 커넬(들), 잎, 고기, 가용성(들) 및 보조식품(들)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "식품 보조제", "식이성 보조식품", "식이성 보조 식품 조성물" 등은 인간 또는 동물의 식단의 일부로 사용되는 식이 또는 영양 보조식품으로서, 예를 들면 동물 사료에 대한 첨가제로서 제형화된 식품제품을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "투여" 및 "투여하는"은 대상 (예를 들어, 대상 또는 생체내, 생체외, 또는 체외 세포, 조직 및 기관)에 약제, 전구 약제 또는 기타 약제, 또는 치료적 치료 (예들 들어, 본 발명의 조성물)를 제공하는 행위를 의미한다. 인체에 대한 전형적인 투여경로는 눈 (안과), 입 (구강), 피부 (국소 또는 경피), 코 (비강), 폐 (흡입), 구강 점막 (볼), 귀, 직장, 질을 통해, 주사 (예를 들면, 정맥내, 피하, 종양내, 복강내 등) 등으로 이루어질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "동시투여"(co-administration) 및 "동시 투여하는"은 적어도 두 개의 약제(들) (예를 들면, 본 발명의 셀레노당단백질 및 하나 이상의 다른 약제, 예를 들면 항생제, 치료제 (예를 들면, 약물 또는 제약), 또는 다른 생물학적 활성 화합물) 또는 치료법을 대상에게 투여하는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 두 개 이상의 약물 또는 치료법의 동시 투여는 동시발생적이다. 일부 실시형태에서, 첫번째 약제/치료법은 두번째 약제/치료법 이전에 투여된다. 당해 분야의 기술자들은 사용되는 다양한 약제 또는 치료법의 제형 및/또는 투여경로가 변할 수 있다는 것을 이해하고 있다. 동시투여를 위한 적절한 복용량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제 또는 치료법을 동시투여하는 경우, 각각의 약제 또는 치료법은 단독으로 이들의 투여에 적절한 것보다 낮은 복용량에서 투여된다. 약제 또는 치료법의 동시투여가 잠재적으로 유해한 (예를 들면, 독성) 약제(들)의 필요한 복용량을 낮추는 경우 및/또는 두개 이상의 약제의 동시투여가 다른 약제의 동시 투여를 통해 약제 중의 하나의 유리한 효과로 대상에게 민감성을 주는 경우의 실시형태에서 특히 바람직하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "치료" 또는 문법상의 동의어는 질환 (예를 들면, 신경변성질환)의 개선 및/또는 반전을 포함한다. 따라서 본 발명의 스크리닝 방법에서 사용될 때 질환과 관련된 모든 매개변수의 개선을 일으키는 화합물은 치료 화합물로서 확인할 수 있다. 용어 "치료"는 치료적 치료 및 예방적 또는 예방적 조치를 모두 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법에 의한 치료로부터 혜택을 누릴 수 있는 대상들은 이미 질병 및/또는 장애 (예들 들면, 신경변성질환, 당뇨병 또는 인지기능의 결여 또는 손실)를 가진 대상들 뿐만 아니라 질환 및/또는 장애를 (예를 들면, 본 발명의 예방적 치료를 사용하여) 예방할 수 있는 대상들을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "질병 위험"은 특정 질병들을 경험하는 체질의 대상 (예를 들면, 인간)을 의미한다. 이러한 체질은 유전적 (예를 들어, 유전성 장애와 같은 질환을 경험하는 특정 유전경향)이거나 또는 다른 요인 (예를 들어, 나이, 체중, 환경 조건, 환경에 존재하는 유해 물질에 노출 등)에 기인할 수 있다. 따라서 본 발명은 특정의 위험으로 제한되는 것이 아니며, 또한 본 발명은 임의의 특정 질병으로 제한되는 것이 아니다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "질병으로 고통하는"은 특정의 질병을 겪고 있는 대상(예를 들어, 인간)을 의미한다. 본 발명은 임의의 특정 증상 또는 징후로 제한되는 것이 아니고, 질병으로 제한되는 것도 아니다. 따라서 본 발명은 광범위한 질환 (예를 들면, 무증상 징후 내지 완전 성숙한 질환)을 겪고 있는 대상을 포함하며, 여기서 상기 대상은 특정 질환과 관련된 징후 (예를 들면, 표시 및 증상)의 적어도 일부를 나타낸다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "질환" 및 "병적인 상태"는 살아있는 동물의 정상상태의 임의의 손상 또는 정상 기능의 수행을 방해하거나 변형하는 그의 기관 또는 조직의 어느 것과 관련되어 있는 상태, 징후 및/또는 증상을 설명하기 위해 서로 교환적으로 사용되며, 또한 환경적인 요인 (예를 들면, 방사선, 영양실조, 산업재해, 또는 기후), 특정의 감염인자 (예를 들면, 벌레, 박테리아, 또는 바이러스), 유기체의 고유 결함(예를 들면, 다양한 유전 이상), 또는 이들 및 다른 인자들의 조합에 대한 반응일 수 있다.

용어 "화합물"은 질환, 질병, 병, 또는 신체기능의 장애를 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있는 임의의 화학성분, 약제, 의약 등을 의미한다. 화합물은 공지된 및 잠재적 치료 화합물을 포함한다. 화합물은 본 발명의 스크리닝 방법을 사용하여 스크리닝 함으로써 치료제인 것으로 결정할 수 있다. "공지의 치료 화합물"은 이러한 치료에 효과적인 것으로 (예를 들면 동물 시험 또는 인간에 대한 투여와 이전의 경험을 통하여) 나타난 치료적 화합물을 의미한다. 다시 말하면, 공지의 치료적 화합물은 질환 (예를 들면, 암, 신경변성 등)에 유효한 화합물로 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "키트"는 시약 및 다른 물질의 조합과 관련하여 사용된다. 이 키트는 영양분과 같은 시약 및 약물은 물론 투여 수단을 포함할 수 있다는 것으로 고려된다. 용어 "키트"는 시약 및/또는 다른 물질의 특수한 조합으로 제한되는 것이 아니다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "독성"은 독성물의 투여전에 동일 세포 또는 조직에 비하여 대상, 세포 또는 조직에 대한 임의의 유해한 또는 해로운 영향을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적 조성물"은, 활성 약제 (예를 들면, 셀레노당단백질을 포함하는 조성물)과 불활성 또는 활성 담체의 조합물을 의미하며, 이는 생체내, 생체외 또는 체외에서 진단적, 예방적 및/또는 치료적 용도에 특히 적합한 조성물을 만든다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용가능한" 또는 "약리학적으로 허용가능한"은 대상에게 투여하였을 때 실질적으로 역반응, 예를 들면, 독성, 알레르기 또는 면역 반응을 생기게 하지 않는 조성물을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "국소적으로"는 피부 및 점막세포와 조직의 표면 (예를 들어, 폐포, 볼, 혀, 저작 또는 비점막, 및 중공기관 또는 체강에 붙어있는 다른 조직과 세포)에 본 발명의 조성물을 적용시킴을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는, 이들로 제한되지 않지만, 인산 완충식염액, 물, 에멀젼(예를 들어, 오일/물 또는 물/오일 에멀젼), 및 다양한 종류의 습윤제, 임의의 및 모든 용매, 분산매체, 코팅물, 라우릴 황산나트륨, 등장 및 흡수 지연제, 붕괴제 (예를 들어, 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜) 등을 포함하는 표준 약제학적 담체의 어느 것을 의미한다. 본 조성물은 또한 안정제 및 보존제를 포함할 수 있다. 담체, 안정제 및 보조제의 예는 예를 들면 여기에서 참고로 인용하는 문헌[Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, Pa. (1975)]에 기술되어 있다. 일부 실시형태에서, 식료품 (예를 들어, 식이성 물질 및/또는 치료)는 (예를 들어, 본 발명의 셀렌당단배질 조성물의) 담체로서 작용한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 표적 대상 (예를 들면, 포유류 대상, 및/또는 생체내 또는 체외, 세포, 조직, 또는 기관)에서 생리학적으로 내성이 있는 본 발명의 화합물의 임의의 염 (예를 들어, 산 또는 염기와의 반응에 의해 얻어진 것)을 의미한다. 본 발명의 화합물의 "염"은 무기 또는 유기 산 및 염기로부터 유도될 수 있다. 산의 예로는 염산, 브롬화수소산, 황산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-술폰산, 타타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본래 약제학적으로 허용가능하지 않은 옥살산과 같은 다른 산들이 본 발명의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용가능한 산 부가염을 얻는데 중간체로서 유용한 염의 제조에 사용될 수 있다. 염기의 예로는 알칼리 금속 (예를 들면, 나트륨) 수산화물, 알칼리 토금속 (예를 들어, 마그네슘) 수산화물, 암모니아, 및 식 NW₄ ⁺의 화합물 (식중, W는 C_{1 - 4}알킬임) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 염의 예는 아세테이트, 아디페이트, 알긴네이트, 아스파테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 비설페이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 플루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 클로라이드, 브로마이드, 요다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말리에이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 옥살레이트, 팔모에이트, 펙티네이트, 페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타타레이트, 티오시아네이트, 토실레이트, 운데카노에이트 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 염의 다른 예로는 Na⁺, NH₄ ⁺, 및 NW₄ ⁺ (여기서, W는 C_{1 -4} 알킬 그룹임) 등과 같은 적절한 양이온과 결합된 본 발명의 화합물의 음이온을 포함한다. 치료적 사용을 위해, 본 발명의 화합물의 염은 약제학적으로 허용가능한 것으로 고려된다. 그러나 비-약제학적으로 허용가능한 산과 염기의 염은 또한 예를 들면 약제학적으로 허용가능한 화합물의 제조 또는 정제에서 활용될 수 있다. 치료적 사용을 위해, 본 발명의 화합물의 염은 약제학적으로 허용가능한 것으로 고려된다. 그러나 비약제학적으로 허용되는 산과 염기의 염은 예를 들면 약제학적으로 허용가능한 화합물의 제조 또는 정제에 활용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "건조"는 스프레이 건조, 동결건조, 공기 건조, 진공 건조 또는 물질 중에 액체를 감소시키거나 제거하는 임의의 다른 종류의 공정을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "스프레이 건조"는 뜨거운 기체를 사용하여 액체를 함유하는 물질을 건조시켜 액체를 증발시키고 물질중에 액체를 줄이거나 제거하는 방법을 의미한다. 다시 말하면, 상기 물질은 가열된 건조 공기를 기초로 분사 또는 분무 방식으로 건조된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "냉동진공 건조" 및 용어 "동결 건조" 및 용어 "저온 건조"는 승화에 의해 냉동 상태의 물질로부터 용매의 제거를 의미한다. 이것은 그의 공융점 이하로 건조할 물질을 동결한 다음 승화의 잠열을 제공함으로써 수행된다. 진공 및 열입력의 정밀한 제어는 다시 제품 용융을 하지 않고 냉동 상태에서 건조를 허용한다. 실제적인 적용에서, 공정은 가속화되고 감압 조건 하에서 정밀하게 제어된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "건조 자유 유동 분말"은 자유 유동 건조 분말, 예를 들면 큰 덩어리의 방해없이 용기, 백, 그릇 등에 부을 수 있는 분말을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "분쇄"는 충격, 전단, 또는 마찰에 의해 입자 크기를 감소시키는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "세척"은 (임의 유형의 용질 (예를 들면, 증류수, 완충제 또는 용매) 또는 혼합물)을 사용하여 불순물을 제거 또는 세정하는 것을 의미하거나 또는 제제의 원치않는 가용성 성분 (예를 들면, 효모 세포 벽)을 세척하여 샘플로부터 비효모 세포벽 성분들을 제거할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리머좀"은 (예를 들면, 물질을 캡슐화하는데 사용될 수 있는) 수용액 중에 합성 폴리머로부터 조립된 소포를 의미한다. 폴리머좀은 소포막을 형성하기 위해 양친매성 합성블록 공중합체를 사용하여 만들 수 있으며 또한 50 nm 내지 5 ㎛ 또는 그 이상 범위의 반경을 가질 수 있다. 대부분의 폴리머좀은 그의 코어 중에 수용액을 함유하고 또한 약물, 효소, 다른 단백질과 펩티드뿐만 아니라 DNA와 RNA 단편과 같은 민감한 분자들을 캡슐화하고 보호하는데 유용하다. 폴리머좀 막은 생물학적 시스템에서 발견되는 것들과 같은 외부 물질로부터 캡슐화 물질을 분리하는 물리적 장벽을 제공한다. 본 발명의 실시형태에서 활용되는 폴리머좀의 예는 물론 그의 합성은 예를 들면 미국특허 제7,867,512호, 제7,682,603호 및 제6,835,394호에서 발견될 수 있으며, 이들 특허의 각각은 본 명세서에서 전부 참고로 인용된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "폐기물"은 원하지 않거나 쓸모없는 물질을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "폐수"는 인위적 기원의 영향에 의해 품질이 악영향을 받는 임의의 물이다.

[발명의 상세한 설명]

I. 서론

셀레늄은 신체의 글루타티온(GSH) 및 주요 셀레늄 함유 항산화제 효소, 글루타티온 퍼옥시다제(GPX) 및 티오레독신 환원효소와 상호작용하여 모든 살아있는 조직에서 항산화제 방어 메커니즘의 측면을 조절하는데 관여하는 미량 원소이다 (예를 들면, Goehring et al., J. Anim. Sci. 59, 725-732 (1984); Gerloff et al., J. Anim. Sci. 70, 3934-3940 (1992) 참조; 여기에서 전부 참고로 인용됨). 글루타티온 및 GPX는 지질 산화를 개시하고 전달할 수 있는 자유 라디칼 공격들을 없앰으로써 막 인지질의 불포화 결합의 완전성을 보호하는 능력을 갖는다 (예를 들면, Meister and Anderson, Annu. Rev. Biochem. 52, 711-760 (1983); Deleve and Kaplowitz, Pharm. Ther. 52, 287-305 (1991); Palmer and Paulson, Nutr. Rev. 55, 353-361 (1997) 참조; 여기에서 전부 참고로 인용됨).

셀레늄은 또한 여러 가지 역학 연구에서 암 위험이 감소하는 것과 연관되어 있었다 (예를 들면, Salonen et al., Am. J. Epidemiol. 120: 342-349 (1984); Willett et al., Lancet 2: 130-134 (1983); Virtamo et al., Cancer 60: 145-148 (1987) 참조; 여기에서 전부 참고로 인용됨). 천연 및 합성 기원의 다양한 셀레늄 화합물들은 광범위한 투여량에서 동물 연구에서의 종양 진전을 억제하는 것으로 나타났다 (예를 들면, Ip,. J. Nutr. 128: 1845-1854 (1998) 참조; 여기에서 전부 참고로 인용됨). 대부분의 동물 연구는 발암 예방에서 셀레늄의 약리학적 복용량(> 2 ㎎/㎏)을 사용하였지만 (예를 들면, Ip,. J. Nutr. 128: 1845-1854 (1998) 참조), 셀레늄 결핍은 또한 유방(예를 들면, Ip and Daniel, Cancer Res. 45: 61-65 (1985) 참조; 여기에서 전부 참고로 인용됨) 및 UVB-유도성 피부 발암 (예를 들면, Pence et al., 102: 759-761 (1994) 참조; 여기에서 전부 참고로 인용됨)을 증가시키는 것으로 나타났다.

효모 세포벽 단백질은 화학 결합에 의해 세포벽 다당류에 결합되어 있고 또한 효모 세포벽 단백질을 용액 중에 방출하기 위하여 이들 결합은 파괴할 필요가 있다. 효모 세포벽으로부터 단백질 추출을 위한 표준방법은 물에 불용성인 글루칸 다당류로부터 단백질을 분리하기 위해 원심분리하기 전에 알칼리 가수분해 (pH 11.5, 80℃)를 사용하여 결합을 파괴할 수 있다.

본 발명의 실시형태의 개발 도중에 실시된 실험은 알칼리 가수분해의 표준 방법을 사용하여 셀레노당단백질을 추출하려는 시도로 수행되었다. 알칼리 가수분해를 사용하여 효모 세포벽에서 셀레노당단백질을 추출하는 이러한 시도들은 실패하였다. 알칼리 가수분해를 사용하여 효모 세포벽에서 셀레노당단백질을 추출하는 실패는 셀레노당단백질의 파괴에 기인하는 것으로 나중에 알게 되었다. 셀레노당단백질을 추출하는 나중의 시도들은 변형된 알칼리 가수분해 과정 (pH 11.5, 60℃)를 사용하여 수행하였다. 이들 시도 또한 효모 세포벽으로부터 셀레노당단백질을 추출하는데 실패하였다. 전형적인 알칼리성, 효모 단백질 추출방법은 효모로부터 셀레노당단백질을 추출하는 것을 시도할 때 실시하지 않았다. 따라서 추가적인 실험들은 산성 추출(pH 5, 80℃)을 사용하여 셀레노당단백질을 추출하려고 시도했던 본 발명의 실시형태의 개발 도중에 수행하였다. 여기에서 설명되는 바와 같이, 산성 추출 방법은 성공적이었고, 셀레노당단백질은 파괴되지 않았고 또한 추출은 가능하였다.

따라서 일부 실시형태에서 본 발명은 셀레노당단백질들(SGP),셀레노당단백질(SGP) 조성물을 수득하는 새로운 방법 (예를 들면, 산성추출 방법 (예를 들어, pH 의존성 셀레노당단백질 분획)을 사용하여 얻어짐), 캡슐화 셀레노당단백질 (SGP)을 포함하는 조성물, 및 (예를 들면, 대상 (예, 인간, 동물 등)에게 생체내 유익(예를 들면, 유전자 발현 프로파일의 변화)을 제공하기 위해) 상기 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명의 실시형태의 개발 도중에 수행된 실험들은 본 발명의 조성물 (예를 들면, SGP(예를 들면, 본 발명의 방법에 의해 분리됨)을 포함함) 및 방법이 대상에게 생물학적으로 이용가능한 셀레늄을 제공하기 위해 사용될 수 있다(예를 들면, 대상 내에 조직 및/또는 근육의 셀레늄 함량을 증가시키고 (예를 들면, 그리하여 대상의 건강의 안정화 및/또는 증가를 유도한다)는 것을 입증하였다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 SGP를 수득하는 방법, 캡슐화 (예를 들면, 폴리머좀 캡슐화) SGP를 포함하는 조성물 및 이를 사용하여 세포기능을 변경하는 방법 을 제공한다 (예를 들면, 그리하여 대상의 시스템 (예를 들면, 근골격계, 신경학적 시스템, 신경계, 내분비계, 신진대사 시스템 및/또는 면역계를 포함하나, 이들로 제한되지 않음)에 유리한 효과를 제공한다). 본 발명은 또한 SGP 단독으로 또는 질환 (예를 들면, 암 성장 및/또는 전이)를 치료 또는 예방하기 위한 하나 이상의 다른 활성 약제와 함께 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 동물(예를 들면, 가축) 건강을 향상시키기 위해 SGP를 사용하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 식품 제품 (예를 들면, 고기, 유제품, 계란 등)의 건강 및/또는 영양 가치를 보충, 증진 또는 향상시키기 위하여 사용된다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 SGP를 포함하는 조성물, 및 (예를 들면, 면역계를 자극하기 위한, 신경변성 질환을 위한, 인지기능을 증강하기 위한, 암, 종양성장 및/또는 전이 등의 치료 또는 예방을 위한) 치료적, 영양적 보조식품 및/또는 예방적 치료로서 상기 조성물을 사용하는 방법 및 상기 조성물의 제조, 생산, 정제, 분리, 추출 및/또는 특성화의 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 SGP를 제공하거나, 동물에게 사료를 주고 및/또는 동물 사료를 보충하기 위해 SGP를 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 가용성 셀레늄 조성물 (예를 들면, SGP) 및 이의 사용, 생산 및 정제 방법을 제공한다. 예를 들면 일부 실시형태에서 본 발명은 가용성 SGP (예를 들면, pH 의존성 SGP 분획의 발생 (예, 분리 및 특성화)를 기술하는 실시예 1-2 참조), 및 이의 투여를 위한 조성물 및 방법 (실시예 3-4 참조)를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 다양한 경로 (예를 들면, 경구, 정맥내 등)를 통하여 대상에게 투여되는 가용성 형태의 셀레늄 (예를 들면, 유기 셀레늄 (예를 들면, SEL-PLEX 또는 다른 셀레늄 강화 효모)의 pH 의존성 SGP 분획)을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 낮은 섬유 가용성 셀레늄 (예를 들면, 유기 셀레늄) 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 가용성 유기 셀레늄 전달 시스템 (예를 들면, 폴리머좀 캡슐화 셀레노당단백질, 나노캡슐, 고분자 등)을 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

셀레늄(예를 들면, 무기 셀레늄 (예를 들면, 소듐 셀레나이트(Na₂SeO₃))을 함유하는 배지에서 성장한 효모 (예를 들어, Saccharomyces cerevisiae)는 셀레늄 (예를 들면, 무기 셀레늄)를 대사하고 시스테인 및 메티오닌 내에 황 대신에 셀레늄을 혼입하여, 셀레노아미노산(SeCys 및 SeMet)을 함유하는 단백질을 생산한다 (Demirci et al. J. Agric. Food Chem. 47, 2496-2500 (1999)., Demirci & Pometto. J. Agric. Food Chem. 47, 2491-2495 (1999), Ouerdane & Mester. J.Agric.Food Chem. 56,11792-11799, (2008), 이들 각각은 여기에서 전부 참고로 인용됨). ALLTECH, Inc. (Nicholsville, KY, 미국)는 "유기 셀레늄"을 함유하는, 사료 및 식품 영양 보조제로서 SEL-PLEX란 이름으로 판매되는 분무 건조 셀레늄 강화 효모를 생산하고 있다 (예를 들면, Korhola et al. Res. 18, 65-68, (1986) 참조, 여기에서 전부 참고로 인용됨). SEL-PLEX에서 셀레늄의 최소농도는 1500ppm이고 또한 단백질은 그의 독점적인 담체이다 (예를 들면, Surai. Nottingham University Press 2002, 234-236 (2002), Kelly & Power. J. Dairy Sci. 78, 237-242 (1995), McSheehy et al. Analyst 130, 35-37 (2005) 참조, 여기에서는 전부 참고로 인용됨). 효모 세포 벽 만난과 연관된 효모 세포 및 단백질의 내부에 존재하는 효모:단백질에서 두개의 단백질 풀이 있다 (예를 들면,Sedmak. 미국특허출원 공개 제2006/0263415호 참조, 여기에서 전부 참고로 인용됨). 상업적 SEL-PLEX의 약 17.0%는 물에 가용성이며, 이 물질은 SEL-PLEX에 존재하는 총 셀레늄의 6.5% 미만을 함유한다. SEL-PLEX 및 소듐 셀레나이트가 셀레늄의 근원으로서 사용되는 닭 사료 연구는 SEL-PLEX에 의해 닭 가슴살 근육내에 훨씬 더 좋은 셀레늄 이동을 나타냈다. SEL-PLEX의 경구투여를 위한 다양한 생체활성이 발견되었다 (예를 들면, Rayman. The Lancet 356, 233-241 (2000), McKenzie Trends in Immunology 19, 342-345 (1998), Tapiero. Biomedicine & Pharmacotherapy 57, 134-144 (2003), Combs & Grey Pharmacol. Ther. 79, 179-192 (1998), Clark et. al. J. Am. Med. Assoc. 276, 1957-1963 (1996) 참조, 여기에서 전부 참고로 인용됨).

일부 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 SGP와 함께 보충되거나 또는 그렇지 않으면 이를 함유하는 대상 식품 (예를 들면, 사료)를 공급하므로써, 셀레늄 (예를 들면, 무기 셀레늄 (예를 들면, 소듐 셀레나이트))를 함유하는 배지 중에 성장한 효모 (예를 들면, Saccharomyces cerevisiae)로부터 가용성 셀레노당단백질(SGP)의 분리 및 물리적 및 화학적 특성화, 및 조직 (예를 들면, 인간, 동물, 닭 등)에 "유기 셀레늄" 전달에서 이들의 활발한 참여를 제공한다 (예를 들면, 실시예 1-4 참조). 본 발명은 활성, 가용성 셀레늄 성분 (예를 들면, 셀레늄 강화 효모 (예를 들면, SEL-PLEX)의 pH 의존성 SGP)의 조직 표적, 정맥내, 경구, 및 경피 전달을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 "유기 셀레늄" 전달 시스템의 서방성 형태(예를 들어, 나노 캡슐, 폴리머 구, 및 폴리머좀 강화 SGP)를 제공한다 (예를 들면, 실시예 5-9 참조). 일부 실시형태에서, 본 발명은 폴리머좀 캡슐화 SGP를 함유하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서 본 발명은 폴리(에틸렌 옥사이드)-블록-폴리(ε-카프로락톤)(PEO-b-PCL)계 폴리머좀 내부에 SGP를 캡슐화함으로써 SGP의 개선된 수송 및 증진된 생체 분포를 제공한다.

효모 세포의 세포내 성분들로부터 세포 벽을 추출하여 다양한 효모 세포 성분의 분리가 기술되어 있다 (예를 들면, Otero et al. J. Chem. Tech. Biotechnol. 66, 67-71 (1996) 참조, 여기에서 전부 참고로 인용됨). 이들 분리 기술은 분무 건조 셀레늄 효모의 추출에 적용되지 않았다. 효모로부터 당단백질의 추출 분야에서 사용되는 통상적인 알칼리성 조건 (pH 9.0-14.0) (예를 들면, Roberge et. al. J.Agric. Food Chem. 51, 4191-4197 (2003) 참조, 여기에서 전부 참고로 인용됨)은 SeH 또는 SeMe 치환체가 셀레노시스틴 또는 셀레노메티오닌 아미노산으로부터 제거되었기 때문에 실패하였다. 다시 말하면, 원하는 치환체들이 분해되었으며, 그 결과 원래의 SGP에 존재하는 셀레늄은 셀레노단백질을 함유하는 효모의 추출에 적용하였을 때 알칼리성 조건에서 시도된 추출 도중에 없어졌다 (예를 들면, 실시예 8의 표 12 참조).

따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 셀레노당단백질 조성물 (예를 들면, 여기에서 기술된 셀레노당단백질의 pH 의존성 분획을 포함함) 및 이를 사용하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 셀레노당단백질(예를 들면, 셀레늄 강화 효모로부터)을 생산, 정제, 단리, 추출, 분리, 침전 및/또는 특성화하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 SGP (예들 들면, 의약품, 영양 개선제, 보조제, 식품 등)을 포함함)를 포함하는 식이성 보조식품 조성물을 포함하는 가용성 셀레늄 조성물(예를 들면, SGP (예를 들면, pH 의존성 SPG 분획))을 대상에게 전달하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 셀레늄 (예를 들면, SGP (예를 들면, 폴리머좀, 나노캡슐, 나노입자, 고분자 등))의 개선된 전달 (예를 들면, 직접 전달, 서방성 전달 등)을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물 및 방법은, 이들로 제한되지 않지만, 식이 (예를 들면, 식품과 혼합 또는 그렇지 않으면 동물에 공급), 예방적, 치료적 적용은 물론 연구 적용을 포함하는 다양한 적용에 활용된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 동물 사료 조성물(예를 들어, SGP (예를 들면, 가용성 SGP (예를 들면, 가용성 유기 셀레늄))을 포함함), 이 조성물을 제조하는 방법 및 동물에게 상기 조성물을 제공함을 포함하는 동물에게 영양제(예를 들면, SGP (예를 들면, 가용성 SGP (예를 들면, 가용성 유기 셀레늄))을 포함함)을 제공하는 방법을 제공한다.

II. 추출, 분리, 정제 및 사용

본 발명의 일부 실시형태에서, 가용성 셀레늄은 셀레노당단백질(SGP) 형태로 얻어진다. 일부 실시형태에서, SGP는 셀레노단백질의 일반적 근원으로부터 추출된다(예를 들면, 셀레늄 강화 효모 (예를 들면, SEL-PLEX)). 일부 실시형태에서, SGP의 추출 및/또는 정제는 하나 또는 그 이상의 pH 의존 추출/침전 단계 (예를 들어, 실시예 1 및 2에서 기술된 바와 같음)을 포함한다. 일부 실시형태에서, SGP의 추출 및/또는 정제는 하나 또는 그 이상의 pH 의존 분획 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서 본 발명은 SGP (SGP를 변성 및/또는 파괴하지 않고)를 용해하기 위하여 셀레늄 강화 효모 (예를 들면, SEL-PLEX)의 산성 추출을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 (예를 들어, 실시예 1-2에 기술된 바와 같이) 산성 추출물로부터 SGP의 pH 의존 침전이 셀레노당단백질의 증가된 함량, 비소화성 섬유의 감소된 함량 및 셀레늄의 높은 농도(예를 들면, SEL-PLEX에 존재하는 것보다 더 높은 셀레늄의 농도)을 제공한다. 따라서 일부 실시형태에서, 본 발명은 셀레늄 강화 효모로부터 추출된 SGP를 제공하며, 여기서 SGP의 셀레늄 함량은 SGP가 추출되는 물질의 셀레늄 함량(예를 들면, 중량/중량%, ppm 등)보다 더 크다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 셀레늄 강화 효모 (예를 들면, SEL-PLEX) 모체 근원으로부터 셀레늄의 생체이용률에 비하여 대상에게 투여하였을 때 동일한 수준 또는 고도로 유사한 수준의 생체이용률을 나타내는 셀레늄 강화 효모 (예를 들면, SEL-PLEX)의 pH 의존성 SGP 분획 (예를 들면, pH 4,0 또는 pH 6.0 분획) 형태의 셀레늄을 제공한다 (예를 들면 실시예 3, 표 5 참조).

일부 실시형태에서, SGP는 셀레노단백질(예를 들면, 셀레늄 강화 효모 세포 (예를 들면, SEL-PLEX)의 일반적 근원으로부터 추출된다. 일부 실시형태에서, 셀레노단백질 근원 중의 셀레노단백질의 부분은 SGP(예를 들면, 0.1% ... 0.2% ... 0.5% ... 1.0% ...2.0% ... 5.0% ... 10%... 20%...50% 또는 그 이상의 SGP)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 셀레노단백질 근원은 Se-함유 배지(예를 들면, 셀렌 풍부 배지)의 존재하에 성장된 세포 (예를 들어, 효모 세포)를 포함한다. 일부 실시형태에서, Se-함유 세포 (예를 들면, 효모세포)는 셀레노단백질을 추출, 분리, 및/또는 정제하도록 처리하여 셀레노단백질 근원 또는 셀레노단백질 풍부 조성물 (예를 들면, SGP-풍부 조성물)을 생기게 한다. 일부 실시형태에서, 셀레노단백질 및 SGP를 포함하는 샘플은 SGP가 풍성하다.

일부 실시형태에서, 셀레노단백질 근원 또는 셀레노단백질 풍성 조성물 (예를 들면, 셀레늄 강화 효모 근원 (예를 들면, SEL-PLEX))은 단리, 정제, 분리 및/또는 추출된 SGP를 생성하도록 하나 이상의 단계로 처리한다. 일부 실시형태에서, 셀레노단백질 근원은 단백질 슬러리, 혼합물, 용해물 및/또는 용액을 생산하도록 (예를 들면, 액체 담체 (예를 들면, 물, 완충제, 염 등)중에) 혼합된다. 일부 실시형태에서, 셀레노단백질 근원 (예를 들면, 셀레늄 강화 효모 근원 (예를 들면, SEL-PLEX))은 고온 (예, 동결 이상, 실온 이상, 30℃ ...40℃...50℃...60℃...70℃...80℃...90℃ 또는 그 이상)에서 혼합한다. 일부 실시형태에서, 셀레노단백질 근원 (예를 들면, 셀레늄이 풍부한 효모 근원 (예를 들면, SEL-PLEX))은 낮은 pH (예를 들면, 산성 조건 (예를 들면, pH 약 0.5, 약 1.0, 약 1.5, 약 2.0, 약 3.0, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0 또는 약 6.5))에서 혼합한다. 일부 실시형태에서, 셀레노단백질 근원 (예를 들면, 셀레늄 강화 효모 근원 (예를 들면, SEL-PLEX))은 온화하게 혼합하거나, 급속하게 혼합하거나, 철저하게 혼합하거나, 또는 격렬하게 혼합하거나 또는 기타 혼합한다. 일부 실시형태에서, 셀레노단백질 근원(예를 들면, 셀레늄이 풍부한 효모 근원(예를 들면, SEL-PLEX))은 낮은 pH (예를 들면, 산성 조건 (예를 들면, pH 약 0.5, 약 1.0, 약 1.5, 약 2.0, 약 3.0, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0 또는 약 6.5) 및 고온(동결 이상, 실온 이상, 30℃...40℃...50℃...60℃...70℃...80℃...90℃ 또는 그 이상))에서 혼합한다. 일부 실시형태에서, 혼합물의 pH는 산 또는 염기의 첨가를 통하여 유지된다.

일부 실시형태에서, 셀레노단백질 함유 혼합물은 원심분리하여 액체/가용성 및 고체/불용성 상을 분리한다. 일부 실시형태에서, 원심분리 속도는 상을 분리하기에 충분한 것이 선택된다. 일부 실시형태에서, 액상은 가용성 SGP를 포함한다. 일부 실시형태에서, 액상의 pH는 SGP의 일부를 침전하도록 조절한다(예를 들면, 올린다). 일부 실시형태에서, 액체 분획의 pH는 상승된 pH가 아닌 원래의 pH에서 가용성이었던 SGP를 침전하기 위하여 약간 또는 적당히 상승시킨다 (예를 들면, pH는 약 0.1...0.2...0.5 ...1.0...2.0으로 상승시킨다). 일부 실시형태에서, 액체 분획의 pH는 원래의 pH에서 가용성인 SGP의 상당한 부분을 침전하도록 현저하게 상승시킨다 (예를 들면, pH는 약 1.0...2.0...3.0...4.0...5.0...6.0으로 상승시킨다). 일부 실시형태에서, 셀레노당단백질은 침전하고 다양한 pH 조건에서 액상으로부터 분리하여 가용성 셀레노당단백질의 복수개의 pH 의존성 분획을 발생시킨다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 산성 조건 하에서 가용성인 셀레늄 강화 효모의 추출물을 포함하는 단일 액상은 첫번째 pH (예를 들면, pH 1.85)에서 침전된 가용성 셀레노당단백질의 첫번째 분획, 두번째 pH (예를 들면, pH 3.0)에서 침전된 가용성 셀레노당단백질의 두번째 분획, 세번째 pH (예를 들면, pH 4.0)에서 침전된 가용성 셀레노당단백질의 세번째 분획, 및 네번째 pH (예를 들면, pH 6.0)에서 침전된 가용성 셀레노당단백질의 네번째 분획을 생성시키기 위하여 사용된다. 일부 실시형태에서, 액상의 pH를 상승시켜서 액상으로부터 셀레노당단백질을 침전하는 것은 액상의 복수개의 연속적인 pH 의존 침전반응을 포함한다.

일부 실시형태에서, 침전된 SGP는 (예를 들면, 별도의 액상 및 고체상을 생산하기에 충분한 속도로) 원심분리하여 pH 조절된 액체 분획으로부터 분리된다. 일부 실시형태에서, 액상으로부터 분리된 SGP는 동결 건조하여 고형 SGP 분획을 생성한다. 일부 실시형태에서, 액상의 pH를 상승시키고 원심분리하여 SGP 분획을 분리하는 과정을 반복하여, 상이한 용해도(예를 들면, pH 1.5 이하에서 용해... pH 2 이하에서 용해 ... pH 3 이하에서 용해 ... pH 4 이하에서 용해 ... pH 5 이하에서 용해 ... pH 6 이하에서 용해 등)의 SGP 분획을 생성하도록 반복한다. 일부 실시형태에서, 하나의 pH 조절 및 원심분리 단계는 원하는 용해도(예를 들면, pH 1.5 이하에서 용해... pH 2 이하에서 용해 ... pH 3 이하에서 용해 ... pH 4 이하에서 용해 ... pH 5 이하에서 용해 ... pH 6 이하에서 용해 등)의 SGP을 생성하도록 반복한다. 일부 실시형태에서, 최종 SGP 분획의 제거 후에 잔류하는 액상은 셀레노단백질 또는 SGP의 추가 생산에 사용되는 세포 성장 배지의 구성분으로서 유용성을 발견한다. 일부 실시형태에서, 가용성 셀레노당단백질을 포함하는 조성물은 셀레노당단백질 (예를 들면, pH 4.0에서 침전된 산성조건 하에서 가용성인 셀레늄 강화 효모 추출물을 포함하는 액상으로부터 가용성 셀레노당단백질)의 단지 하나의 pH 의존성 분획만 함유한다. 일부 실시형태에서, 가용성 셀레노당단백질을 포함하는 조성물은 셀레노당단백질 (예를 들면, 두개 이상의 상이한 pH값에서 침전된 산성 조건 하에서 가용성인 셀레늄 강화 효모의 추출물을 포함하는 액상으로부터 가용성 셀레노당단백질)의 두개 이상의 pH 의존성 분획을 함유한다.

바람직한 실시형태에서, 셀레노단백질 근원 (예를 들어, 셀레늄 강화 효모 (예를 들어, SEL-PLEX))로부터 SGP의 추출 및 SGP의 혼합물의 pH 의존성 분획화의 과정 (예를 들면, 도 2 및 3 참조)은 두 단계를 포함한다 (예를 들어, 실시예 1-2, 도 1 및 2 참조). 첫번째 단계에서, 0.3N HCl (pH 1.5) 중에 셀레늄 강화 효모의 현탁액을 교반하고 80℃에서 8 시간 동안 가열한다. 혼합물의 pH는 추출의 첫 번째 시간 동안 농축된 염산을 첨가하여 pH 1.5로 유지된다. 8 시간 후에, 혼합물을 원심분리하고 액상을 분리한다. 용액의 pH는 2.0N NaOH를 첨가하여 1.85로 조절하며 또한 이 pH에서 제한된 용해도를 갖는 SGP는 용액으로부터 침전하고 두번째 원심분리에 의해 액체 (pH 1.85)로부터 분리된 다음에 동결건조하여 pH 1.85의 고형 SGP 분획을 생성한다. 일부 실시형태에서, 액체 (pH 1.85)는 첫번째 원심분리로부터 고체 (pH 1.5)와 혼합하며, 이것은 혼합물의 pH를 pH 1.6으로 변화시키게 한다. pH 1.6에서 가용성인 SGP의 대부분은 과정의 이 단계에서 생성된 폐기류의 양을 증가시키지 않고, 액상으로 이송된다. 과정 중의 이 단계에서 대부분의 부산물은 두 번째 원심분리에서 고체이다. 폐고형물의 흐름은 추출을 위해 취한 셀레늄 강화 효모의 약 56.5중량%를 차지하며 또한 38.91%의 단백질 및 2477ppm의 셀레늄을 함유하는 가치있는 셀레늄 효모 세포벽 물질을 함유한다. 일부 실시형태에서, 이러한 고체는 동물 식이에서 환경친화적인 영양 보조물로서 (예를 들면, 단독으로 또는 다른 물질(예를 들면, 셀레늄 강화 효모)과 함께) 사용된다. 두 번째 단계 (예를 들어, 도 3 참조)에서, 두 번째 원심분리(도 2 참조)로부터 액상 (pH 1.6)은 믹서로 이송되며, pH는 2.0N NaOH를 첨가하여 pH 3.0으로 조절하고, 이러한 pH에서 제한된 용해도를 갖는 SGP는 용액으로부터 침전하며, 세번째 원심분리에 의해 액체 (pH 3.0)로부터 분리하고, 마지막으로 동결건조하여 pH 3.0의 고형 SGP 분획을 생성한다. 세 번째 원심분리로부터 액상 (pH 3.0)은 믹서로 이송되고, pH는 2.0N NaOH를 첨가하여 pH 4.0으로 조절하고, 이러한 pH에서 제한된 용해도를 갖는 SGP는 용액으로부터 침전하고, 네번째 원심분리에 의해 액체 (pH 4.0)로부터 분리하고, 마지막으로 동결건시켜 pH 4.0의 고형 SGP 분획을 생성한다. 네번째 원심분리로부터 액상(pH 4.0)은 믹서로 이송되고, pH는 2.0N NaOH를 첨가하여 pH 6.0으로 조절하고, 이러한 pH에서 제한된 용해도를 갖는 SGP는 용액으로부터 침전하고, 네번째 원심분리에 의해 액체 (pH 6.0)으로부터 분리한 다음 동결건조하여 pH 6.0의 고형 SGP 분획을 생성한다. 과정의 두 번째 단계에서 생산된 유일한 폐기류는 (추출에서 사용된 셀레늄 강화 효모의 중량과 비교하여) 13.4 중량%의 고체를 함유하는 폐수류이며, 이중에서 단백질 분획은 약 13.3 중량%를 차지하고, 염화 나트륨 3.6 중량%를 차지하고 또한 글루코오스 및 만노스 모노- 및 올리고사카라이드는 80 중량% 이상을 차지한다. pH 6.0 및 셀레늄 농도 242 ppm을 갖는 이러한 "폐수" 류는 재순환할 수 있거나 또는 그렇지 않으면 셀레늄 효모의 새로운 배치의 제조에 재사용할 수 있다 (예를 들면, 성장 배지에 사용할 수 있다).

일부 실시형태에서, pH 4.0에서 침전된 SGP는 셀레늄 강화 효모 (SEL-PLEX)에 비하여 (예를 들면, 근육 조직으로) 우수한 셀레늄 전달을 나타내며 또한 셀레늄의 무기형태 (예를 들어, 소듐 셀레나이트)에 비하여 훨씬 우수한 전달을 나타낸다 (예를 들면, 실시예 3 참조). 추가적으로, pH 의존성 셀레노당단백질 분획(예를 들면, pH 6.0)은 셀레늄 강화 효모 (예를 들어, SEL-PLEX)와 구조적으로 다르고, 훨씬 더 적은 양의 출발 물질(셀레늄 강화 효모)을 필요로 하면서, 유사한 양의 셀레늄의 전달을 가능하게 한다.

일부 실시형태에서, SGP 추출과정은 4 또는 그 이하의 pH 조절 및 상기 과정중의 원심분리 단계(예를 들면, pH 1 조절 및 원심분리 단계, pH 2 조절 및 원심분리 단계, pH 3 조절 및 원심분리 단계, pH 4 조절 및 원심분리 단계)를 포함한다.

III. 동물 사료

동물 사료는 사육 가축 (예를 들면, 소, 염소, 양, 말, 가금류, 버팔로, 알파카, 라마, 당나귀, 노새, 토끼, 닭, 거위, 칠면조, 또는 돼지)을 먹이기 위하여 사용되는 임의의 사료를 언급한다. 동물 사료는 흔히 건초, 짚, 목초, 압축 및 펠렛화 사료, 기름 및 혼합 식량, 또한 발아 곡물과 콩류를 포함한다. 세계적인 동물 사료 산업은 약 2%의 연간 성장률로, 2006년 635만 톤의 사료를 소비하였다. 인간 식품이 아닌 사료를 성장시키기 위한 농업토지의 사용은 논란이 될 수 있으며, 곡물(옥수수)와 같은 사료의 일부 유형은 또한 인간 식품으로 사용할 수 있는 반면, 잔디와 같은 다른 것은 그렇지 않을 수 있다. 동물에 에너지원을 공급하는 외에도, 동물 사료는 또한 신체에 이용되는 영양소 (예를 들어, 셀레늄)를 제공한다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 통상적인 동물 사료에 비하여 전체 비용을 감소시키고, 사료 전환을 증가시키고 또한 사료를 먹는 가축으로부터 유도된 동물 제품 (예를 들면, 고기, 계란, 유제품 등)의 질을 유지하고 및/또는 개선하는 영양 조성물 (예를 들면, 표준 사료 조성물보다 상승된 농도의 셀레늄 (예를 들면, 가용성 셀레늄))을 포함하는 동물사료 조성물을 발생시키는 가용성 셀레늄 조성물 (예를 들면, SGP)를 제공한다.

예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 발명은 동물 사료와 함께 결합되고 및/또는 동물 사료내에 혼입한 다음 동물에게 투여하여 (예를 들면, 공급하여) (예를 들면, 다른 형태의 보충 셀레늄 (예를 들면, 셀레늄 강화 효모 (예를 들어, SEL-PLEX))로 식이 공급한 동물에 비하여) 동물의 성장에 대한 동등한 또는 우수한 효과를 제공할 수 있는 SGP를 포함하는 식이성 보조식품 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 식이성 보조식품 조성물은 본 조성물을 먹는 대상 (예를 들면, 인간 또는 동물)에서 (예를 들면, 혈액 및/또는 혈청에 위치한) 순환 셀레늄의 양을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 더 높은 비율의 투여된 셀레늄은 다른 셀레늄 제형 (예를 들면, 소듐 셀레나이트 또는 셀레늄 강화 효모 (예를 들면, SEL-PLEX))에서보다 본 발명의 가용성 셀레늄 조성물 (예를 들면, SGP)에서 생체이용 가능하다. 즉, 일부 실시형태에서, 본 발명은 다른 형태의 셀레늄 (예를 들면, 셀레늄 강화 효모)에 비하여 대상에게 이용가능 (예를 들면, 생체 이용가능)하게 만드는 더 높은 비율 및/또는 비의 셀레늄을 함유하는 셀레노당단백질을 포함하는 조성물을 제공하며, 이것은 본 발명의 셀레노당단백질을 포함하는 조성물이 (예를 들면, 유사한 생체이용률 양을 얻기 위하여) 더 적은 양으로 필요하다는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 식이성 보조식품 조성물 (예를 들면, 본 발명의 SGP를 포함함)은 본 조성물을 먹는 대상 (예를 들면, 인간 또는 동물)에서 (예를 들면, 근육 또는 다른 조직에 위치하는) 셀레늄의 양을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, SGP 및/또는 가용성 셀레늄 투여는 혈청, 지방조직, 근육조직 등에 증가된 셀레늄 생체이용률을 생기게 한다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 식이성 보조식품 조성물을 포함하는 식이를 동물에게 공급하는 단계를 포함하는, 동물에게 공급된 식이 중에 영양소를 동물이 이용하는 효율을 증가시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 보조 식품 조성물은 이들의 식이에 존재하는 영양소를 가공처리하고 이용할 수 있는 동물의 능력을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 식이성 보조식품 조성물은 본 조성물을 받는 대상에서 순환하는 항산화제 (예를 들면, 혈액 및/또는 혈청에 존재하는 셀레늄)의 양을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 식이성 보조식품 조성물은 본 조성물을 먹는 대상에서 항산화제(예를 들면, 셀레늄 지방 조직, 근육 등에 존재하는 셀레늄)의 양을 증가시킨다.

IV. 의약품, 영양 개선제, 및 보조식품

영양 셀레늄 수준은 FDA (21 CFR 101.9(c)(8)(iv), 1994년 1월 참조)에 의해 확립되었다. 인간과 동물은 셀레늄의 무기 및 유기 두 형태의 제한된 양을 안전하게 대사할 수 있으며 또한 비-메틸화 셀레늄을 모노- 또는 디- 또는 트리메틸화 유도체로 전환할 수 있고, 여기서 모노메틸화 유도체는 가장 독성이 있다 (예를 를면, Bedwal, R. S., et al., Medical Hypotheses, 41 (2):150-159 (August 1993) 참조). FDA는 여성을 수유하기 위한 셀레늄에서 70 밀리그램의 기준 일일섭취량(RDI) 및 성인을 비-수유하기 위한 55 밀리그램의 RDI를 채택하였다. 하루에 600 밀리그램의 셀레늄 투여량이 안전한 것으로 보고되었다 (예를 들면, Ferris G. M. Lloyd, et al., App. Clin. Biochem.,26:83-88 (1989) 참조). 대략 이러한 투여량에서, 효소 글루타티온 환원효소의 정상활성은 간 및 백혈구내에서 셀레노글루타티온을 셀렌화수소로 전환하고 또한 궁극적으로 배설된다. 따라서, 이러한 낮은 투여량에서, 신체는 유리금속 형태로 존재하는 셀레늄을 안전하게 대사하여 배설할 수 있다. 그러나 많은 미량원소 (예를 들면, 셀레늄)에서와 같이, 높은 투여량 수준 또는 농도에서 유익한 효과가 반전되어 위험한 독성이 나타난다 (예를 들면, Furnsinn, C. et al., Internat'l J. of Obesity and Related Metab. Dis., 19(7):458-463 (1995) 참조).

자연형태로 셀레늄의 투여는, 비교적 낮은 농도로 투여하였을 때, 셀레늄이 유익한 건강 효과를 제공하지만, 더 높은 농도에서 셀레늄이 급격한 독성을 나타내어 잠재적인 건강 유익이 상실되고 독성이 주요한 관심사가 되기 때문에, 과학적 및 의학적 교환(trade-off)을 포함한다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 대상에게 유익한 효과를 제공하는 특정한 형태의 셀레늄 (예를 들어, SGP, 수용성 셀레늄)를 제공한다. 증거는 유기 형태의 셀레늄 (예를 들면, 셀레노메티오닌 및 셀레늄 강화 효모)가 유기 형태보다 덜 독성이고 더 양호하게 흡수할 수 있다는 것을 보여주었다 (예를 들면,., Mahan, Proceedings of the 15th Annual Symposium Nottingham University Press, Nottingham, UK, pp. 523-535 (1999) 참조). 그럼에도 불구하고, 일부 실시형태에서, 여러 형태의 셀레늄이 (예를 들면, 대상에게 유익한 건강 효과를 제공하기 위하여) 서로 조합되게 사용된다. 셀레늄의 천연 근원은 셀레늄 강화 (예를 들면, 셀렌화) 효모를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 사용된 효모주는 제한되지 않는다.

본 발명의 특정의 바람직한 실시형태에서, SGP (예를 들어, 실시예 1-2에 기술된 바와 같이 셀레늄 강화 효모 (예를 들면, SEL-PLEX)로부터 유도됨)는 본 발명의 제형 및 조성물을 위해 선택된 셀레늄 형태이다. 일부 실시형태에서, 수용성 셀레늄 및/또는 SGP를 포함하는 조성물은 셀레늄의 다른 형태에 비하여 셀레늄의 더욱 생물학적으로 이용가능한 형태를 제공한다. 그러나 또한 수용성 셀레늄의 유도체 또는 변형 및/또는 SGP, SEL-PLEX, 또는 셀레늄 강화 효모의 다른 형태, 셀레노메티오닌, 셀레노시스테인, 셀레나이트 화합물, 셀레네이트 화합물, 또는 그의 유도체, 염 또는 변형을 포함하는 셀레늄의 다른 형태가 본 발명에서 사용된다. 따라서 일부 바람직한 실시형태에서, 이들 형태의 셀레늄의 각각은 제형의 성분으로서 사용할 수 있다. 이와는 달리, 상술한 형태의 셀레늄의 각각은 약물 또는 치료제에 (예를 들면, 화학적으로 또는 물리적으로) 결합되어 셀레늄 약물 유도체를 형성할 수 있다. 그 외에, 조성물 및 제형은 셀레늄의 한 형태로 국한되지 않는다. 실제로, 조성물 또는 제형은 셀레늄의 여러 형태 (예를 들어, SGP 및 SEL-PLEX, 또는 Sod-sel 및 수용성 셀레늄)를 포함할 수 있다.

본 발명의 다양한 실시형태에서 활용되는 셀레늄의 다른 형태는 미국특허 6,911,550호, 6,197,295호, 5,221,545,6호 및 6,576,233호, 및 미국 특허출원 공개 2001-0043925호, 2005-0069594호, 2005-0089530호 및 2008-0107755호에 기술되어 있으며, 이들은 여기에서 전부 참고로 인용된다.

따라서, 본 발명은 셀레늄의 하나 또는 그 이상의 형태 (예를 들어, SGP, 가용성 셀레늄 (예를 들면, 수용성 셀레늄) 등)을 단독으로 또는 적어도 하나의 다른 약제 예를 들어 안정화 화합물, 다른 치료제(들), 영양소(들) 및/또는 미네랄과 함께 포함하는 약제학적, 영양학적 및/또는 보조식품 조성물 (예를 들면, 사료 및/또는 식이성 조성물 또는 치료)를 제공하며, 또한 이들은, 이로 제한되지 않지만, 식염수, 완충 식염수, 덱스트로오스, 물 등을 포함하는 임의의 멸균성, 생체적합성 담체 중에 투여할 수 있다.

본 발명의 방법은 질병 (예를 들면, 신경변성 질환, 암 등)을 (예를 들면, 예방적으로 또는 치료적으로) 치료하거나 또는 생리학적 상태를 변경하여 사용할 수 있다. 셀레늄 (예를 들면, 가용성 셀레늄 (예를 들면, 수용성 셀레늄), SGP))은 생리 식염수와 같은 약제학적으로 허용가능한 담체중에 대상 (예를 들면, 환자)에게 정맥내 투여할 수 있다. 화합물의 세포내 전달을 위한 표준 방법 (예를 들면, 리포좀을 통해 전달)이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 당해 분야에서 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 제형은 비경구 투여, 예를 들면 정맥내, 피하, 근육내, 및 복강내 투여에 유용하다. 일부 실시형태에서, 조성물 (예를 들어, SGP 및/또는 이를 포함하는 약제학적 제형)은 경구로 투여한다.

의료 업계에 잘 알려진 바와 같이, 임의의 하나의 대상을 위한 투여량은 환자의 사이즈, 신체 표면적, 나이, 투여하고자 하는 특수한 화합물, 성별, 투여의 시간 및 경로, 일반 건강 등을 포함하는 여러 가지 요인에 따라 달라질 수 있으며, 다른 약물과의 상호 작용으로 동시에 투여한다.

따라서, 일부 실시형태에서, 셀레늄 (예를 들면, 가용성 셀레늄 (예를 들면, 수용성 셀레늄), SGP 등)을 포함하는 조성물 및/또는 제형이 대상에게 단독으로 투여하거나 또는 셀레늄의 다른 형태, 약물, 소분자와 함께 투여되거나 또는 부형제(들) 또는 다른 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합되는 약제학적 조성물에서 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 담체는 약제학적으로 불활성이다. 다른 실시형태에서, 셀레늄 (예를 들면, 가용성 셀레늄 (예를 들면, 수용성 셀레늄), SGP 등)을 포함하는 조성물은 단독으로 질병 또는 장애로 고통하는 개개의 대상에게 투여한다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 셀레늄 (예를 들면, 가용성 셀레늄 (예를 들면, 수용성 셀레늄), SGP 등)을 포함하는 조성물은 단독으로 일반 건강의 증진 또는 신체 시스템의 건강을 위해 개개의 대상에게 투여한다. 셀레늄 (예를 들면, 가용성 셀레늄 (예를 들면, 수용성 셀레늄), SGP 등)을 포함하는 조성물은 단독으로 또는 셀레늄의 하나 이상의 다른 형태와 함께 일일 소비를 위해 영양 음료 또는 식품 (예를 들면, ENSURE, POWERBAR, 등), 종합 비타민, 영양제품, 식품제품 등에 첨가할 수 있다.

치료 (예를 들면, 노화와 관련된 유전자 발현 및/또는 암 및/또는 종양 성장또는 전이와 관련된 유전자 발현의 조절)에 의해 변경하고자 하는 표적에 따라서, 이들 제약, 보조식품, 및/또는 영양 조성물을 제형화하여 전신적으로 또는 국소적으로 투여한다. 제형화 및 투여를 위한 기술은 "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Publishing Co, Easton Pa.)의 최신 간행본에서 발견할 수 있다. 적절한 경로는 예를 들면 근육, 피하, 골수강내, 척수강내, 뇌실내, 정맥내, 복강내, 또는 비강내 투여를 포함하는 비경구 전달은 물론 경구 또는 경점막 투여를 포함할 수 있다.

주입에 있어서, 셀레늄 함유 조성물 (예를 들어 가용성 셀레늄 (예를 들어, 수용성 셀레늄), SGP 등)은 수용액으로, 바람직하게는 행크스(Hanks)액, 링거액 또는 생리적 완충식염수와 같은 생리학적으로 적합한 완충제로 제형화된다. 조직 또는 세포 투여에 있어서, 침투하고자 하는 특정의 장벽에 적합한 침투제가 제형에서 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 알려져 있다.

다른 실시형태에서, 셀레늄 함유 조성물 (예를 들어 가용성 셀레늄 (예를 들어 수용성 셀레늄), SGP 등)은 경구 투여에 적합한 투여량으로 당업계에 잘 알려진 약제학적으로 허용가능한 담체를 사용하여 제형화된다. 이러한 담체는 셀레늄 함유 조성물 (예를 들어 가용성 셀레늄 (예를 들어 수용성 셀레늄), SGP 등)을 치료하고자 하는 환자에 의한 경구 또는 비내 흡입을 위한, 정제, 알약, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화할 수 있게 한다.

본 발명에서 사용하기에 적합한 약제학적 조성물은 활성성분 (예를 들면, 셀레늄 함유 조성물 (예를 들면, 가용성 셀레늄 (예를 들면, 수용성 셀레늄), SGP 등)이 의도하는 목적을 달성하는데 유효한 량으로 함유되는 조성물을 포함한다. 예를 들면, 약제학적 약제의 유효한 량은 특이적 유전자 (예를 들어, KTLG, GRB2, DNAJ3, TGFB1, MAPK8, C1R, UBE4A, SMPX, USP22, 및/또는 PTP4A1)의 발현을 변경하는 량일 수 있다. 유효한 양의 결정은 당업자의 능력 범위 내에 있다.

본 발명은 또한 (예를 들면, 암/종양 진행 및/또는 전이를 예방하거나 느리게 하기 위해) 암의 예방적 및/또는 치료적 치료에 사용하기 위한 pH 의존성 SGP 및 이를 함유하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 바람직한 실시형태에서, 셀레늄 강화 효모의 pH 의존성 SGP 분획 (예를 들면, SEL-PLEX)는 대상에게 투여하여 암 성장 및/또는 전이와 관련된 유전자의 발현 (예를 들면, 원하는 방식으로) 조절한다. 여기에서 기술된 바와 같이, 특정의 가용성 SGP 분획은 생물학적 특성 (예를 들면, 유전자 발현을 조절할 수 있는 능력)을 가지며, 가용성 SGP 분획이 유도되는 모체 물질은 갖지 않는 것으로 확인되었다 (예를 들면, 실시예 4 및 도 7-11 참조). 바람직한 실시형태에서, 셀레늄 강화 효모 (예를 들어, SEL-PLEX)의 pH 의존성 분획은 pH 4.0 의존성 분획이지만, 다른 분획 (예를 들면, pH 3.0, pH 6.0 등)도 또한 본 발명의 조성물 및 방법에 활용된다.

활성 성분에 추가하여, 이들 셀레늄 (예를 들면, 가용성 셀레늄 (예를 들면, 수용성 셀레늄), SGP 등) 함유 약제학적 조성물은 약제학적으로 사용될 수 있는 제제 내에 활성성분을 처리하는 것을 촉진하는 부형제 및 보조제를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유할 수 있다. 경구 투여를 위해 제형화된 제제는 정제, 당제, 캡슐제, 용액제 형태일 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 자체 알려진 방식으로 (예를 들면, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 분말화, 유화, 캡슐화, 봉입(entrapping) 또는 동결건조 공정에 의해) 제조할 수 있다.

비경구 투여용 약제학적 제형은 수용성 형태로 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 추가적으로, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 오일상 주사 현탁액으로 제조 할 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 매개체는 참기름과 같은 지방유, 또는 에틸 올레이트 또는 트리글리세라이드와 같은 합성 지방산 에스테르, 또는 리포좀을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 또는 덱스트란과 같은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 고농축 용액의 제조를 허락할 수 있는 화합물의 용해도를 증가시키는 적절한 안정화제 또는 약제를 함유할 수 있다.

경구용 약제학적 제제는, 필요에 따라, 정제 또는 당의정 코어를 얻기 위하여 적절한 보조제를 첨가한 후에 활성 화합물을 부형제와 결합시키고, 선택적으로 수득된 혼합물을 분쇄하고, 과립의 혼합물을 처리하여 얻을 수 있다. 적절한 부형제는 락토오스, 수쿠로오스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함하는 탄수화물 또는 단백질 충전제; 옥수수, 밀, 쌀, 감자 등으로부터 전분; 메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스, 또는 나트륨 카르복시 메틸셀룰로오스와 같은 셀룰로오스; 및 아라비아 및 트라가칸트를 포함하는 고무; 및 젤라틴 및 콜라겐과 같은 단백질이다. 필요에 따라, 분해제 또는 가용화제, 예를 들면 가교결합 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 알긴산 나트륨과 같은 그의 염이 첨가될 수 있다.

당의정 코어는 농축된 당용액과 같은 적절한 피복제와 함께 제공되며, 이들은 또한 아라비아 고무, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 이산화 티탄, 래커 용액 및 적합한 유기용매 또는 용매 혼합물을 포함할 수 있다. 염료 또는 안료는 제품 식별을 위한 정제 또는 당의정 피복제에 첨가하거나 또는 활성 화합물의 양(즉, 투여량)을 특성화할 수 있다.

경구적으로 사용될 수 있는 약제학적 제제는 젤라틴으로 만든 압입 캡슐(push-fit capsule) 뿐만 아니라, 젤라틴으로 만든 연질 밀봉 캡슐 및 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 피복제를 포함한다. 압입 캡슐은 충전제 또는 락토오스 또는 전분과 같은 결합제, 활석 또는 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제, 및 선택적으로 안정제와 혼합된 활성성분을 함유할 수 있다. 연질캡슐에서 활성 화합물은 안정제의 존재 하에 또는 부재 하에 지방오일, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 액체 중에 용해하거나 현탁할 수 있다.

약제학적으로 허용가능한 담체로 제형화된 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 제조하여, 적절한 용기에 넣고, 지시된 증상의 치료를 위해 표시될 수 있다. 셀레늄을 포함하는 조성물 또는 제형의 경우, 표지에 지시된 증상은 질환 또는 장애 (예를 들면, 암, 신경변성 질환 및/또는 인지기능)의 예방적 또는 치료적 치료와 관련된 증상의 치료를 포함할 수 있다.

약제학적 조성물은 염으로 제공될 수 있으며, 이들로 제한되지 않지만, 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타타르산, 말산, 숙신산 등을 포함하는 많은 산과 함께 형성할 수 있다. 염은 상응하는 유리 염기 형태인 수성 또는 다른 양성자 용매 중에 더욱 용해하는 경향이 있다. 다른 경우에, 바람직한 제제는 사용전에 완충제와 함께 결합되는 4.5 내지 5.5의 pH 범위에서 1 mM-50 mM 히스티딘, 0.1% - 2% 수크로오스, 2% - 7% 만니톨 중에 동결건조 분말일 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용되는 임의의 화합물의 경우, 치료학적으로 유효한 투여량은 세포 배양 분석으로부터 초기에 평가할 수 있다. 다음에, 바람직하게는 투여량은 바람직한 순환 농도 범위를 달성하기 위해 동물모델 (특히 쥐 모델)로 제형화할 수 있다.

치료학적으로 유효한 투여량은 (예를 들면, 유전자 발현의 변경을 통해) 질병 상태 또는 상태의 증상을 경감하거나 또는 예방하는 양을 의미한다. 이러한 화합물의 독성 및 치료적 효능은 예를 들면 LD₅₀ (개체군의 50 %에 대한 치사량) 및 ED₅₀ (개체군의 50%에서 치료학적으로 유효한 투여량)을 결정하기 위해, 세포 배양 또는 실험동물에서 표준 의약품 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성과 치료효과 간의 투여량 비는 치료 지수이고, 이것은 비 LD₅₀/ED₅₀로 표현될 수 있다. 큰 치료지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 이들 세포배양 분석 및 추가적인 동물연구에서 얻어진 데이터는 인간 사용을 위한 투여량의 범위를 정하는데 사용할 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 독성이 적거나 없는 ED₅₀을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있는 것이 바람직하다. 투여량은 사용된 투여형태, 환자의 민감성, 및 투여경로에 따라 이 범위 내에서 변한다.

정확한 투여량은 치료하고자 하는 환자의 관점에서 의사에 의해 또는 대상에 의해 선택될 수 있다. 투여량 및 투여는 활성 부분의 충분한 수준을 제공하거나 또는 원하는 효과 (예를 들면, 대상에서 유전자 발현의 변경)를 유지하기 위해 조절할 수 있다. 고려될 수 있는 추가적인 요인들은 질병 상태의 중증도; 나이, 체중, 및 환자의 성별; 식이, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 민감도 및 치료에 대한 내성/반응을 포함한다. 지속성 약제학적 조성물은 특수한 제형의 반감기 및 소거율(clearance rate)에 따라 3 내지 4일마다. 매주, 두 주마다 한번 또는 매월 한 번 투여할 수 있다.

일부 실시형태에서, 셀레늄 (예를 들면, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP 등)은 하루에 25 내지 600 ㎍의 일일 투여량으로 투여된다 (예를 들면, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, 및/또는 SGP는 매일 대상에게 25 내지 600㎍의 셀레늄을 제공하는 방식으로 대상에게 투여된다). 바람직한 실시형태에서, 셀레늄은 하루에 50 내지 200 ㎍의 일일 투여량으로 투여된다. 다른 바람직한 실시형태에서, 셀레늄은 하루에 100 내지 200 ㎍의 일일 투여량으로 투여된다. 25 내지 600㎍을 벗어나는 투여량이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 셀레늄 (예를 들면, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP 등)의 단일 투여량은 하루에 한 번씩 투여된다. 다른 실시형태에서, 2, 3, 4, 또는 그 이상의 투여량이 매일 (예를 들면, 아침에 한 번 및 밤에 한 번, 또는 4 내지 6 시간마다 한 번) 투여할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 셀레늄 (예를 들면, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP 등)은 대상에게 3개의 별도 투여량으로, 3개 이상의 별도 투여량, 2개의 별도 투여량, 또는 2개 미만의 별도 투여량으로 투여한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 일일 투여량은 서방성 캡슐로 투여된다. 임의의 바람직한 실시형태에서, 일일 투여량은 셀레늄 (예를 들면, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP 등) 25-75㎍이다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 일일 투여량은 셀레늄 (예를 들면, 유기 셀레늄, 셀렌화 효모, SEL-PLEX, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP 등) 200㎍이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 국소 또는 전신 치료가 요구되는지 여부에 따라 여러 가지 방법으로 치료하고자 하는 영역에 따라 투여할 수 있다. 투여는 국소적 (안과 및 질과 직장 전달 등의 점막 포함), 폐 (예를 들어, 분무기; 기관지, 비강, 표피 및 경피에 의한 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 공기주입), 경구 또는 비경구일 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입; 두개내, 예를 들면, 척수강내 또는 뇌실내, 투여를 포함한다. 셀레늄을 포함하는 조성물 및 제형은 경구 투여에 특히 유용한 것으로 추정된다.

국소 투여를 위한 셀레늄 함유 (예를 들면, SGP 함유) 약제학적, 영양약학적 및/또는 보조식품 조성물 및 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적제, 좌제, 스프레이, 액제 및 분말제를 포함할 수 있다. 통상적인 약제학적 담체, 수성, 분말 또는 오일상 베이스, 증점제 등이 필요하거나 바람직 할 수 있다.

경구 투여를 위한 조성물 및 제형은 분말 또는 과립, 물 또는 비수성 매체 중의 현탁액 또는 용액, 캡슐, 향낭 또는 정제를 포함한다. 증점제, 향미제, 희석제, 유화제, 분산보조제 또는 결합제가 바람직 할 수 있다.

비경구, 척수강내 또는 뇌실내 투여를 위한 조성물 및 제형은 완충제, 희석제 및 다른 적절한 첨가제, 예를 들면, 이들로 제한되지 않지만, 침투 강화제, 담체 화합물 및 다른 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 또한 함유할 수 있는 멸균성 수용액을 포함할 수 있다.

따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적, 영양약학적, 및/또는 보조식품 조성물은, 이들로 제한되지 않지만, 용액, 에멀젼 및 리포좀 함유 제형을 포함할 수 있다. 이들 조성물은, 이로 제한되지 않지만, 미리 형성된 액체, 자가 유화 고체 및 자기 유화 반고체를 포함하는 다양한 성분들로부터 생성할 수 있다.

단일 투여량 형태로 편리하게 존재할 수 있는 본 발명의 약제학적, 영양약학적, 및/또는 보조식품 제형은 제약업계에 잘 알려진 통상적인 기술에 따라 제조할 수 있다. 이러한 기술은 활성성분을 약제학적 담체(들) 또는 부형제(들)과 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로 제형은 활성성분들을 액상 담체 또는 미세하게 분할된 고형담체 또는 이들 둘다와 균일하고 단단하게 결합시킨 다음, 필요에 따라 제품을 형성함으로써 제조된다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 셀레늄(예를 들면, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP) 함유 조성물은, 이로 제한되지 않지만, 정제, 캡슐, 액체 시럽, 연질 젤, 좌제 및 관장제와 같은 많은 가능한 투여 형태의 어느 것으로 제형화할 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 서방성 나노입자 (예를 들면, 나노캡슐), 소포, 리포좀, 고분자 (예를 들면, 분자 각인 고분자 (MIP)), 생분해가능한 서방성 고분자, 폴리카티온 고분자 등으로 제형화할 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 수성, 비수성 또는 혼합 매체중에 현탁액으로서 제형화 될 수 있다. 수성 현탁액은 예를 들어 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 추가로 함유할 수 있다. 현탁액은 또한 안정제를 함유할 수 있다. 본 발명의 한 실시형태에서, 약제학적 및/또는 보조식품 조성물은 제형화되어 기포제로 사용될 수 있다. 기포제는 에멀젼, 마이크로 에멀젼, 크림, 젤리 및 리포좀과 같은 제형들을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 성질이 기본적으로 유사하면, 이들 제형은 성분들 및 최종 제품의 일관성에 따라 변한다.

본 발명의 셀레늄 (예를 들면, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP 등) 함유 조성물은 종래 약제학적 조성물에서 통상 발견되는 다른 보조성분들을 추가로 함유할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 이 조성물은 추가적, 적합성, 약제학적 활성물질 예를 들면 항소양제, 수렴제, 국소 마취제 또는 항염증제를 함유할 수 있거나, 또는 본 발명의 조성물의 다양한 투여형태, 예를 들면 염료, 향미제, 보존제, 항산화제, 유백제, 증점제 및 안정제를 물리적으로 제형화하는데 유용한 추가적인 물질을 함유할 수 있다. 그러나 이러한 물질은, 첨가하였을 때, 본 발명의 조성물의 성분들의 생물학적 활성을 부당히 방해해서는 안된다. 제형은 멸균화할 수 있으며, 필요에 따라, 제형의 핵산(들)과 해롭게 상호작용하지 않는 보조제, 예를 들면, 윤활제, 방부제, 안정제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제, 착색제, 향미제 및/또는 방향족 물질 등과 혼합할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 (a) 셀레늄(예를 들어, SGP (예를 들어, pH 의존성 SGP 분획), 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SEL-PLEX)의 하나 이상의 형태 및 (b) 하나 이상의 다른 약제(예를 들면, 영양소, 미네랄, 치료제 등)을 함유하는 약제학적, 영양약학적 및/또는 보조식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 셀레늄(예를 들어, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP 등)을 포함하는 화합물과 하나 이상의 추가 활성제 (예를 들면, 치료제 (예를 들면, 암 치료제, 알츠하이머 치료제), 항산화제 등)의 동시투여를 포함하는 방법을 포함한다. 실제로, 본 발명의 추가 양상은 본 발명의 셀레늄(예를 들어 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP (예를 들면, pH 의존성 SGP 분획)을 포함하는 조성물을 예방적 또는 치료적 약제학적 조성물, 영양약학적 및/또는 보조식품과 동시투여함으로써 치료제 및/또는 약제학적, 영양약학적 및 또는 보조식품 조성물을 증진하는 방법을 제공하는 것이다. 동시 투여 절차에 있어서, 약제는 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 화합물들은 다른 활성제(들) 이전에 투여된다. 제형 및 투여 양상은 위에서 설명된 것들 중의 어느 하나일 수 있다. 그 외에, 두 개 이상의 동시투여된 약제는 각기 다른 양상 또는 다른 제형을 사용하여 투여할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 암 치료제와 동시투여한다.

따라서, 일부 실시형태에서, 셀레늄 (예를 들어, SGP (예를 들어, pH 의존성 SGP분획), 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SEL-PLEX)를 포함하는 조성물이 종양 세포 증식 및 혈관신생을 억제하고 및/또는 암환자의 종양세포 사멸을 유도하기 위하여 전신적으로 또는 국소적으로 투여된다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 셀레늄 강화 효모(예를 들면, SEL-PLEX)의 pH 의존성 SGP 분획(pH 4.0)을 포함하는 조성물은 암/종양 성장 및/또는 전이와 관련된 하나 이상의 유전자의 발현이 대상에서 유리한 방식으로 조절 (예를 들면, 상향 조절 또는 하향조절)되도록 하는 조건 하에서 대상에게 투여된다 (예를 들면 실시예 4 참조). 이 조성물은 정맥내, 경막내, 복강내 뿐만 아니라 구강내 투여할 수 있다. 더욱이 이들은 단독으로 또는 항증식성 약제와 조합하여 투여할 수 있다.

조합이 고려되는 경우, 본 발명은 조합의 특정 성질에 의해 제한되어야 하는 것이 아니다. 발명은 간단한 혼합물뿐만 아니라 화학 하이브리드로서 조합을 고려한다. 후자의 일예는 셀레늄의 하나 이상의 형태를 포함하는 조성물이 표적 담체에 또는 활성 제약에 공유적으로 결합되는 경우이다. 공유 결합은 많은 시판중인 가교결합 화합물 중의 어느 하나에 의해 수행할 수 있다.

본 발명은 치료적 제제의 특정 성질에 의해 제한되어야 하는 것이 아니다. 예를 들어, 이러한 조성물은 생리학적으로 허용가능한 액체, 겔 또는 고형담체, 희석제, 보조제 및 첨가제와 함께 제공 될 수 있다.

이러한 치료적 제제는 다른 치료약제와 유사한 방식으로 가정 또는 농장 사육 동물와 같은 수의학용으로 및 인간의 임상용으로 포유류에 투여할 수 있다. 일반적으로, 치료 효과에 필요한 투여량은 사용 형태 및 투여 양상뿐만 아니라 개별 호스트의 특수화 요구사항에 따라 달라질 것이다.

이러한 조성물은 전형적으로 액체 용액 또는 현탁액으로, 또는 고체 형태로 제조된다. 암을 위한 경구 제형은 일반적으로 이러한 전형적으로 사용되는 첨가제, 예를 들면 결합제, 충전제, 담체, 보존제, 안정화제, 유화제, 완충제 및 부형제, 예를 들면 만니톨, 유당, 전분, 스테아린산 마그네슘, 나트륨 사카린, 셀룰로오즈, 탄산 마그네슘 등의 제약 등급을 포함할 것이다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 알약, 캡슐, 서방성 제형 또는 분말 형태를 가지며 또한 전형적으로 1% - 95%, 바람직하게는 2% -70%의 활성성분을 함유한다.

이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사제로서 제조되며; 주사 이전에 액체 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 종종 생리학적으로 허용가능하고 적합성이 있는 희석제 또는 부형제와 혼합된다. 적절한 희석제 및 부형제는 예를 들면, 물, 식염수, 덱스트로오스, 글리세롤 등, 및 이들의 조합물이다. 그 외에, 필요에 따라, 이러한 조성물은 소량의 보조물질 예를 들어 습윤제 또는 유화제, 안정화제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다.

광범위한 치료제가 본 발명에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 셀레늄의 하나 이상의 형태를 포함하는 조성물과 동시투여할 수 있는 임의의 치료는 본 발명에서 사용하기에 적합하다.

본 발명의 일부 실시형태는 셀레늄의 하나 이상의 형태 및 적어도 하나의 항암제 (예를 들면, 화학요법 약물 및/또는 방사선 치료법과 같은 통상적인 항암제)를 포함하는 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명에 사용하기에 적합한 항암제 메커니즘은, 이들로 제한되지 않지만, 세포자멸을 유도하는 약제, 핵산 손상을 유도하는/이의 원인이 되는 약제, 핵산 합성을 억제하는 약제, 미세관 형성에 영향을 미치는 약제, 및 단백질 합성 또는 안정성에 영향을 미치는 약제를 포함한다.

본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기에 적합한 항암제의 부류는, 이들로 제한되지 않지만, 다음을 포함한다: 1) 알칼로이드; 예를 들면, 미세소관 억제제 (예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 빈데신 등), 미세소관 안정제 (예를 들어, 파클리탁셀(탁솔) 및 도세탁셀 등), 및 에피포도필로톡신 (예를 들면, 에토폭시드(VP-16), 및 테니폭시드(VM-26) 등)과 같은 국소이성화 효소 억제제를 포함하는 크로마틴 기능 억제제, 및 국소 이성화 효소 I를 표적으로 하는 약제 (예를 들면, 캄프토테신 및 이시리노테칸 (CPT-11) 등); 2) 공유 DNA-결합제 (알킬화제); 예를 들면, 질소 머스타드 (예를 들어, 메클로르에타민, 클로람부실, 시클로포스파미드, 이포스파미드 및 부설판(미레란) 등), 니트로소우레아 (예를 들면, 카르무스틴, 로무스틴, 및 세무스틴 등), 및 다른 알킬화제 (예를 들면, 다카르바진, 하이드록시메틸멜라민, 티오테파, 및 미토시신 등); 3) 비공유 DNA-결합제 (항종양 항생제); 예를 들면, 핵산 억제제 (예를 들면, 닥티노마이신 (악티노마이신 D) 등), 안트라사이클린 (예를 들면, 다우노루비신 (다우노마이신 및 세루비딘), 독소루비신 (아드리아마이신), 및 이다루비신 (이다마이신) 등), 안트라센디온 (예를 들면, 안트라사이클린 유사체, 예를 들어 (미톡산트론) 등), 블레오마이신(블렌옥산), 등, 및 플리카마이신 (미트라마이신), 등; 4) 항대사물질, 예를 들면, 항폴린산제 (예를 들어, 메토트렉세이트, 폴렉스 및 Mexate 등), 퓨린 항대사물질 (예를 들면, 6-머캅토퓨린(6-MP, 퓨린톨), 6-티오구아닌 (6-TG), 아자티오프린, 아실클로비르, 간시클로비르, 클로로데옥시아데노신, 2-클로로데옥시아데노신 (CdA), 및 2'-데옥시코포르마이신 (펜토스타틴) 등), 피리미딘 길항제 (예를 들면, 플루오로피리미딘 (예를 들면, 5-플루오로우라신 (아드루실), 5-플루오로데옥시우리딘 (FdUrd) (Floxuridine)) 등), 및 시토신 아라비노시드 (예를 들면, 시토사르 (아라-C) 및 플루다라빈 등); 5) 효소; 예를 들면, 글루코코르티코이드, 예를 들면 안티에스트로겐 (예를 들면, 타목시펜 등), 비스테로이드성 항안드로겐 (예를 들면, 플루타미드 등), 및 아로마타제 억제제 (예를 들면, 아나스트로졸 (아리미덱스), 등); 7) 백금 화합물 (예를 들어, 시스플라틴 및 카보플라틴, 등); 8) 항암제, 독소 및/또는 방사성 핵종과 결합된 모노클론 항체 등; 9) 생물학적 반응 개질제 (예를 들어, 인터페론 (예를 들어, IFN-α 등) 및 인터루킨 (예를 들면, IL-2 등) 등); 10) 양자 면역요법; 11) 조혈성장 인자; 12) 종양 세포 분화 (예를 들면, 모든-트란스-레티노산 등); 13) 유전자 요법 기술; 14) 안티센스 치료법 기술; 15) 종양 백신; 16) 종양 전이에 대한 치료법(예를 들면, 바티미스타트 등); 및 17) 혈관신생의 다른 억제제.

바람직한 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 셀레늄의 하나 이상의 형태 및 세포사멸을 유도하거나 및/또는 암세포 증식을 방지하는 적어도 하나의 통상적인 항암제를 포함하는 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 대상은 전이를 특징으로 하는 질병을 가지고 있다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 Bcl-2 패미리 단백질(들) (예를 들어, Bcl-2 및/또는 Bcl-X_L)의 과발현을 특징으로 하는 대상에게 셀레늄의 하나 이상의 형태 및 탁산 (예를 들면, 도세탁셀)을 함유하는 조성물의 유효량을 투여함을 제공한다.

탁산 (예를 들어, 도세탁셀)은 효과적인 부류의 항암제 화학요법제이다 (예를 들어, K. D. Miller and G. W. Sledge, Jr. Cancer Investigation, 17:121-136 (1999) 참조). 본 발명은 임의의 특정한 메커니즘으로 제한되는 것이 아니지만, 탁산 매개 세포 사멸은 세포내 미세소관 안정화 및 이후의 세포 사멸 경로의 유도를 통하여 진행하는 것으로 생각된다 (예를 들어, S. Haldar et al., Cancer Research, 57:229-233 (1997) 참조). 일부 다른 실시형태에서, 시스플라틴 및 탁솔은 본 발명의 셀레늄의 하나 이상의 형태를 포함하는 조성물과 함께 사용하기 위해 구체적으로 고려된다. 일부 실시형태에서, 암 치료법과 관련하여 일상적으로 사용되는 임의의 약제는 본 발명에서 사용할 수 있다. 셀레늄의 하나 이상의 형태를 포함하는 상술한 조성물로 투여하기에 적합한 통상적인 항암제는, 이들로 제한되지 않지만, 5-플루오로우라실, 에토포시드, 캄프토테신, 메토트렉세이트, 악티노마이신-D, 미토마이신 C, 또는 더욱 바람직하게, 시스플라틴을 포함한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 치료학적 치료는 본 발명의 상승적, 항종양제를 유도하는 DNA 손상을 촉진하기 위하여 핵산 (예를 들면, DNA)을 직접 가교결합하는 하나 이상의 약제를 추가로 포함한다. 예를 들어, 시스플라틴 및 다른 DNA 알킬화제와 같은 약제가 사용될 수 있다. DNA를 손상하는 약제는 또한 DNA 복제, 유사 분열 및 염색체 분리를 방해하는 화합물을 포함한다. 이러한 화학요법 화합물은, 이들로 제한되지 않지만, 독소루비신으로 또한 알려진 아드리아마이신, 에토포시드, 베라파밀, 포도필로톡신 등을 포함한다. 이들 화합물은 종양의 치료를 위한 임상 세팅에 널리 사용되고 있으며 또한 아드리아마이신의 경우 21일 간격으로 25-75 Mg/M² 에서, 에토프사이드의 경우 35-50Mg/M² 까지 범위의 투여량으로 또는 경구적으로 정맥 투여량의 두배로 정맥내 볼러스 주사(bolus injection)를 통하여 투여된다.

핵산 전구체 및 소단위(subunit)의 합성 및 충실도를 방해하는 약제는 또한 DNA 손상을 유도하고 또한 본 발명에서 화학요법제로 사용된다. 다수의 핵산 전구체가 개발되었다. 광범위한 테스트를 거쳐 쉽게 사용할 수 있는 약제가 특히 유용하고, 용이하게 이용가능하다. 따라서, 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 약제는 종양 조직에 우선적으로 사용되어, 이 약제를 종양 세포를 표적화하는데 특히 유용하게 만든다. 공급된 투여량은 3 내지 15 mg/kg/일 범위일 수 있지만, 다른 투여량도 질환의 단계, 치료법에 대한 세포의 순종성, 약제에 대한 저항정도 등을 포함하는 다양한 인자들에 따라 현저하게 변할 수 있다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명에서 사용되는 항암제 (예를 들면, 여기에서 언급되는 항혈관신생 인자)는 셀레늄의 하나 이상의 형태를 포함하는 조성물과 함께 동시투여에 수정 가능한 것이거나 또는 그렇치 않으면 항암효과의 충실도의 손실 없이 대상, 조직 또는 세포에 이들이 공급될 수 있도록 셀레늄의 하나 이상의 형태를 포함하는 조성물과 결합된다. 암치료제, 예를 들면 백금 복합체, 베라파밀, 포도필로톡신, 카보플라틴, 프로카르바진, 메클로르에타민, 시클로포스파미드, 캄프토테신, 이포스파미드, 멜파란, 클로르암부실, 비술판, 니트로스우레아, 아드리아마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 블레오마이신, 플리코마이신, 미토마이신, 에토포시드(VP16), 타목시펜, 탁솔, 트란스플라티늄, 5-플루오로우라실, 빈크리스틴. 빈블라스틴 및 메토트렉세이트 및 다른 유사한 항암제의 더욱 자세한 설명에 대해서는, 당업자들은, 이로 제한되지는 않지만, 의사용 첨부문서집 및 Goodman and Gilman's "Pharmaceutical Basis of Therapeutics" ninth edition, Eds. Hardman et al., 1996을 포함하는 다수의 지침 메뉴얼을 언급하고 있다.

V. 산화 방지제

본 발명의 실시형태에서, 산화 방지제는 본 발명의 조성물 또는 제형과 함께 동시투여된다. 본 발명은 또한 사용된 항산화제의 종류로 제한되지 않는다. 실제로, 다양한 산화 방지제가 본 발명에서 유용한 것으로 고려된다. 예를 들면, 이들로 제한되지 않지만, 알킬화 디페닐아민, N-알킬화 페닐렌디아민, 페닐-.알파.-나프틸아민, 알킬화 페닐-.알파.-나프틸아민, 디메틸퀴놀린, 트리메틸디히드로퀴놀린 및 이로부터 유도된 올리고머 조성물, 힌더리드 페놀(hindered phenolics), 알킬화 하이드로퀴논, 하이드록실화 티오디페닐 에테르, 알킬리덴비스페놀, 티오프로피오네이트, 금속성 디티오카르바메이트, 1,3,4-디메르캅포티아다이졸 및 유도체, 유용성 구리 화합물 등등, Naugalube.RTM. 438, Naugalube 438L, Naugalube 640, Naugalube 635, Naugalube 680, Naugalube AMS, Naugalube APAN, Naugard PANA, Naugalube TMQ, Naugalube 531, Naugalube 431, Naugard BHT, Naugalube 403, 및 Naugalube 420, 아스코르브산, 알파-토코페롤을 포함한 토코페롤, 설프히드릴 화합물 및 그의 유도체와 같은 수용성 항산화제 (예를 들면, 아황산수소나트륨 및 N-아세틸-시스테인), 리포산 및 디하이드로리포산, 레스베라트롤, 락토페린, 아스코르빈산 유도체 (예를 들면, 아스코빌 팔미테이트 및 아스코르빌 폴리펩티드), 부틸화 히드록시톨루엔, 레티노이드 (예를 들면, 레티놀 및 레티닐팔미테이트), 토코트리에놀, 유비퀴논, 플라보노이드와 이소플라보노이드와 그의 유도체(예를 들면, 제니스테인 및 디아드제인)를 포함하는 추출물, 레스베라트롤 등을 포함하는 추출물, 포도씨, 녹차, 소나무 껍질, 프로폴리스,Irganox 1010, 1035, 1076, 1222 (시바 스페셜티 케미칼 주식회사 제조), Antigene P, 3C, FR, Sumilizer GA-80 (스미토모 화학 산업 주식회사 제조), 베타 카로틴, 리코펜, 비타민 C, E 및 A, 및 기타 물질을 포함한다.

본 발명을 실시하기 위하여 메카니즘을 이해할 필요는 없고 또한 본 발명이 임의의 특정 작용 메카니즘으로 제한되지 않지만, 일부 실시형태에서 셀레늄 함유 조성물 (예를 들어, 가용성 셀레늄, SGP)을 대상에게 투여하면 대상에서의 유전자 발현 프로파일 (예를 들어, TGFB1, MAPK8, C1R, UBE4A, SMPX, USP22, 및 PTP4A1)을 변경한다. 일부 실시형태에서, 셀레늄 (예를 들어 가용성 셀레늄, SGP) 함유 조성물을 대상에게 투여하면 대상의 DNA 손상(예를 들면, 뇌 조직 (예를 들면, 신피질), 근육 조직, 지방 조직 등에서)의 수준을 감소시킨다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 셀레늄(예를 들어, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP, SEL-PLEX 등) 함유 조성물을 세포에 투여하는 것을 포함하는 H₂O₂ 세포독성에 대한 세포의 민감도를 감소시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 셀레늄(예를 들면, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP, SEL-PLEX 등)을 포함하는 조성물 (예를 들면, 영양 보조식품)을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 대상에서 (예를 들면, 산화 스트레스를 경험하는 대상에서) 수퍼옥사이드 라디칼을 감소시키는 방법을 추가로 제공한다. 더욱이, 일부 실시형태에서, 본 발명은 셀레늄 (예를 들면, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP, SEL-PLEX 등)을 포함하는 특정의 조성물을 받는 대상이 산화 스트레스를 처리할 수 있는 향상된 능력을 가지고 있다는 것을 제공한다. 본 발명을 실시하기 위하여 메카니즘을 이해할 필요는 없고 또한 본 발명이 임의의 특정 작용 메카니즘으로 제한되지 않지만, 일부 실시형태에서 셀레늄 (예를 들면, 셀레늄(예를 들어, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP, SEL-PLEX 등)을 포함하는 식이성 보조식품)을 받는 대상은 대상에서 수퍼옥사이드 라디칼의 수준을 변경하기 (예를 들어 감소시키기) 위하여 셀레늄 (예를 들면, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP, SEL-PLEX 등)의 형태를 선택할 수 있는 능력으로 인하여 산화 스트레스에 대처하는 향상된 능력을 갖는다.

본 발명의 조성물 및 방법은, 이로 제한되지 않지만, 연구 및 임상 진단학을 포함하는 다양항 세팅에 사용될 것으로 고려된다.

VI. 담체

일부 실시형태에서, 본 발명은, 이로 제한되지 않지만, 나노입자 (예를 들면 나노캡슐), 소포, 리포좀, 고분자 (예를 들면, 분자 각인 고분자 (MIP), 서방성 고분자, 폴리카티온 고분자, 및/또는 폴리머로좀을 포함하는 하나 이상의 담체를 통해 셀레늄 (예를 들면, 셀레노당단백질)의 전달을 제공한다. 일부 실시형태에서, 셀레늄 담체는 대상(예를 들면, 인간 또는 동물)에서 셀레늄 함유 화합물 (예를 들면, 수용성 셀레늄, SGP)의 투여, 표적화, 및/또는 시간내 방출을 제공한다. 일부 실시형태에서, 담체 (예를 들면, 서방성 고분자, 나노캡슐, MIP, 폴리머로좀 등)은 대상에게 셀레늄 함유 화합물 (예를 들면, 유기 셀레늄, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP, SEL-PLEX 등)의 전달을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 담체 (예를 들면, 서방성 고분자, 나노캡슐, MIP, 폴리머로좀 등)는 대상에게 셀레늄 함유 화합물 (예를 들면, 유기 셀레늄, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP, SEL-PLEX 등)의 생체이용률을 증가시킨다.

본 발명은 사용되는 담체의 종류로 제한되지 않는다. 실제로 다양한 담체, 예를 들면, 이들로 제한되지 않지만, 덴드리머, 폴리머로좀, 나노입자, 서방성 고분자, 나노캡슐, 분자 각인 고분자 및/또는 다른 유형의 담체 (예를 들면, 여기에서 기술된 담체의 어느 하나)가 사용될 수 있다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 담체는 서방성 고분자이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 담체는 분자 각인 고분자이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 담체는 셀레노당단백질을 캡슐화하는데 사용되는 폴리머좀이다. 본 발명은 사용된 폴리머좀의 종류로 제한되지 않는다. 실제로 당업계에 알려진 폴리머좀이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리머좀은 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO)블록 공중합체를 포함한다. 그러나, 본 발명은 그렇게 제한되지 않는다. 임의의 알려진 블록 공중합체, 예를 들면, 폴리(에틸에틸렌)(PEE), 폴리(부타디엔) (PB 또는 PBD), 폴리(스티렌)(PS), 및 폴리(이소프렌)(PI)가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 중합체는 폴리(ε-카프로락톤)(PCL)디블록 공중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리머좀은 폴리(에틸렌옥사이드)-블록-폴리(ε-카프로락톤)(PEO-b-PCL)계 디블록 공중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리머좀은 트리블록, 테트라블록, 펜타블록, 또는 적어도 6개의 블록 공중합체인 블록 공중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리머좀은 폴리(락트산), 폴리(글리콜리드), 폴리(락트-코글리콜산) 및/또는 폴리(3-하이드록시부티레이트)를 PEO와 커플링시킴으로써 유도된다. 본 발명은 폴리머좀 캡슐화 셀레노당단백질의 크기로 제한되지 않는다. 다양한 크기는 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용되며, 이것은 예를 들면, 이들로 제한되지 않지만, 직경 약 50 내지 300 nm인 폴리머좀 캡슐화 셀레노당단백질을 포함하지만, 더 큰 (예를 들면, 약 350 nm, 400 nm, 500 nm 또는 그 이상) 및 더 작은 (예를 들면, 약 40 nm, 30 nm, 20nm, 또는 그 이하) 폴리머좀 캡슐화 셀레노당단백질이 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 다른 형태의 셀레늄(예를 들면, 셀레늄 강화 효모, SEL-PLEX, 또는 무기 셀레늄 단일 투여 캡슐 또는 알약)에 비하여 유기 셀레늄 (예를 들면, 분자 각인 고분자(MIP), 서방성 고분자 등)의 일정한 및 안전한 공급을 제공하기 위하여 SGP 조절 방출성 나노캡슐 및 MIP구를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용성, 가용성 및/또는 SGP는 여기에서 개선된 전달 방법을 통하여 셀레늄의 효율적인 캡슐화 및 전달에 사용된다 (예를 들면, 나노입자 (예를 들면, 나노캡슐), 소포, 고분자 (예를 들면, 분자 각인 고분자 (MIP), 서방성 고분자, 등) 및/또는 폴리머로좀). 일부 실시형태에서, 여기에서 개선된 전달 방법은 캡슐화 셀레늄 (예를 들면, SGP 또는 가용성 셀레늄)의 생체이용률을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 여기에서 개선된 전달 방법은 용액, 대상, 혈청 등 중에 셀레늄의 느린 방출 (예를 들면, 12 시간, 24 시간, 2 일, 1 주, 2 주, 3 주, 10 주 등)을 제공한다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 셀레늄 함유 조성물(예를 들면, 유기 셀레늄, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP 등)을 위한 담체로서 서방성 고분자를 제공한다. 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA)와 같은 서방성 고분자, 또는 폴리에틸렌이민(PEI)와 같은 폴리카티온 고분자가 담체로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 서방성 고분자는 셀레늄 함유 조성물 (예를 들면, 유기 셀레늄, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP, SEL-PLEX 등)의 조절된 전달을 제공한다. 일부 실시형태에서, 조절된 전달은 천연이든 합성이든 고분자 (예를 들면, PEI)가, 셀레늄 함유 조성물 (예를 들면, 유기 셀레늄, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP, SEL-PLEX 등)을 미리 정해진 방식으로 물질로부터 방출하도록 하는 방식으로, 셀레늄 함유 조성물 (예를 들면, 유기 셀레늄, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP, SEL-PLEX 등) 및 선택적으로 다른 활성 또는 비활성 약제와 적절히 결합된다. 셀레늄 함유 조성물 (예를 들면, 유기 셀레늄, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP, SEL-PLEX 등)의 방출은 장기간에 걸쳐 일정할 수 있거나, 그것은 장기간에 걸쳐 주기적일 수 있거나, 또는 환경이나 다른 외부 사건에 의해 촉발될 수 있다. 일부 실시 형태에서 전달을 조절하면 더욱 효과적인 치료법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 전달을 조절하면 과소량 및 과대량 투여 가능성을 제거한다. 조절된 전달 시스템을 사용하는 다른 이점은 원하는 범위 내에서 셀레늄 수준의 유지, 더 적은 투여의 필요성, 및 증가된 환자 수용상태를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 셀레늄 함유 조성물 (예를 들면, 유기 셀레늄, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP, SEL-PLEX 등)의 담체로서 폴리머로좀을 제공한다. 일부 실시형태에서, 폴리머로좀은 소포막을 형성하기 위해 양친매성 합성 블록 공중합체를 사용하여 제조되고 또한 약 50 nm 내지 약 10 um 또는 그 이상 범위의 반경을 갖는다 (예를 들어, Discher et al. Journal of Physical Chemistry B (2002), 106(11), 2848-2854 참조, 여기에서 전부 참고로 인용됨). 일부 실시형태에서, 폴리머좀은 이들의 코어중에 수용액을 함유하고 또한 분자들, 예를 들면 셀레늄 함유 조성물 (예를 들면, 유기 셀레늄, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP, SEL-PLEX 등) 및 선택적으로 하나 이상의 약물, 효소, 다른 단백질 및 펩티드, 및 DNA 및 RNA 단편을 캡슐화하고 보호하는데 유용하다. 일부 실시형태에서, 폴리머좀 막은 생물학적 시스템에서 발견되는 것과 같은 외부 물질로부터 캡슐화 물질을 분리하는 물리적 장벽을 제공한다. 일부 실시형태에서, 폴리머로좀은 이들의 코어 내의 함유물(예를 들면, 셀레늄 함유 조성물 (예를 들면, 유기 셀레늄, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP, SEL-PLEX 등))의 시간내 방출을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 폴리머로좀을 구성하기 위해 합성 고분자의 사용은 고안자가 막의 특성을 조절할 수 있게 하며, 따라서 침투성, 방출 속도, 안정성 및 다른 특성을 조절한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 셀레늄 (예를 들면, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP) 함유 조성물은 폴리(에틸렌옥사이드)-블록-폴리(ε-카프로락톤)(PEO-b-PCL) 기본 폴리머좀 내부에 캡슐화될 수 있다. 본 발명을 실시하기 위해 메카니즘을 이해할 필요는 없고 또한 본 발명이 임의의 특정한 작용 메카니즘으로 제한되지 않지만, 일부 실시형태에서, PEO는 수득된 담체에 개선된 생체외 화학적 및 기계적 안정성, 증가된 생체내 생체이용률 및 지연된 혈액순환 반감기를 제공한다. PCL, 즉 잘 알려진 삽입형 바이오물질은 폴리머좀 막을 형성하고, 그의 에스테르 결합의 가수분해에 의해 수득된 생성물의 완전한 및 안전한 생체내 분해를 촉진한다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명의 셀레늄 함유 조성물 (예를 들면, 셀레노당단백질)은 폴리(락트산), 폴리(글리콜라이드), 폴리(락트-코글리콜산) 또는 폴리(3-하이드록시부티레이트)와 PEO의 커플링으로부터 유도된 다른 생분해성 블록고분자의 혼합물 또는 순수한 유도체로부터 합성된 폴리머좀으로 캡슐화될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 셀레늄 함유 조성물 (예를 들면, 유기 셀레늄, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP, SEL-PLEX 등)을 위한 담체로서 나노캡슐(Couvreur et al. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 2002;19(2):99-134,., 여기에서 전부 참고로 인용됨)을 제공한다 (예를 들면, 여기에서 전부 참고로 인용되는 미국특허 제7,498,045호 참조). 일부 실시형태에서, 나노캡슐은 나노 캡슐의 생분해시 셀레늄 함유 조성물 (예를 들면, 유기 셀레늄, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP, SEL-PLEX 등)의 제어 방출을 제공한다. 일부 실시형태에서, 나노캡슐은 약 2 내지 약 100 시간 (예를 들면, 약 2 시간...4 시간...6 시간...12 시간...24 시간...48 시간...96 시간 등)의 생분해 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 생분해성 나노캡슐은 투여시 대상의 생체내 순환 형태로, 셀레늄 함유 조성물 (예를 들면, 유기 셀레늄, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP, SEL-PLEX 등) 및 선택적으로 마크로분자를 포함하는 다양한 다른 캡슐화 치료학적 약제의 조절된 방출에 적합하다. 본 발명의 나노 캡슐 조성물은 치료적으로 유효한 농도의 셀레늄 함유 조성물 (예를 들면, 유기 셀레늄, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP 등)을 캡슐화하고 이를 수령자의 생체내 순환에 전달하는데 적합하다. 일부 실시형태에서, 나노캡슐은 셀레늄 함유 조성물 (예를 들면, 유기 셀레늄, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP, SEL-PLEX 등)을 캡슐화하며 예를 들면 폴리락트산고분자와 폴리에틸렌글리콜의 공중합체를 포함하는 막이다. 일부 실시형태에서, 나노캡슐은 단량체의 계면중합 또는 예비성형된 고분자의 계면 나노침착에 의해 형성된다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 셀레늄 함유 조성물 (예를 들면, 유기 셀레늄, 가용성 셀레늄, 수용성 셀레늄, SGP, SEL-PLEX 등)을 위한 담체로서 분자 각인 고분자를 제공한다 (Mosbach. Trends in Biochemical Sciences, Vol. 7, pp. 92-96, 1994., Wulff. Trends in Biotechnology, Vol. 11, pp. 85-87, 1993., Andersson, et al., Molecular Interactions in Bioseparations (Ngo. T. T. ed.), pp. 383-394, 미국특허 제5,959,050호, 여기에서 모두 참고로 인용됨).

실시예

다음 실시예들은 본 발명의 특정의 바람직한 실시형태 및 양상을 입증하고 더욱 예시하기 위해 제공되는 것이지, 그의 범위를 제한하는 것으로 해석되는 것이 아니다.

실시예 1

A. 산성 추출 및 이후의 침전에 의해 SEL-PLEX로부터 가용성 셀레노당단백질의 순차적 제조

기계적 교반기, 온도계 및 전기 담요가 장착된 4L 3목 반응기 (추출기 # 1 , 도 1 참조)는 3L의 탈이온화 H₂O 및 50 ml의 0.3N HCl로 충전하였다. 반응기를50℃ 이상으로 가열하고 1600 rpm으로 교반하면서 600g의 SEL-PLEX를 조금씩 첨가하였다. 대략 1 시간 후, 온도는 80℃에 도달하였고 혼합물의 pH는 2.23이었다. pH는 13.5mL의 0.3N HCl을 첨가함으로써 1.5로 감소하였다. 반응용기는 7 시간 동안 가열 및 교반하면서 유지하였다. 혼합물의 pH는 pH 수준이 1.5에서 남아있도록 보장하기 위해 대략 한 시간마다 확인하였다. 산성 반응후 혼합물 (pH 1.5)은 4개의 1L 원심분리기 병에 분배하고 8℃에서 20분 동안 4000 RCF에서 원심분리(원심 분리기 #1, 도 1 참조 ) 하였다. 상청액 (pH 1.5) 및 고체 펠렛을 수집하였다. 상청액을 빙욕(4℃)중의 3L 3목 반응기(믹서 # 1 , 도 1 참조 )에 첨가하고, 2N NaOH를 함유하는 낙하 깔대기, 기계적 교반기 및 pH 전극을 장착하였다. 혼합물의 pH가 1.85에 도달할 때까지 교반하면서 2N NaOH를 이 용액에 적가하였다. NaOH를 첨가하는 도중에, 백색 침전물이 형성되었다. 교반은 30분 동안 계속하였고 혼합물은 다시 원심분리(원심분리기 #2, 도 1 참조 )하여 상층액 및 셀레노당단백질 펠렛을 형성시켰다. 셀레노당단백질 펠렛을 수집하고 동결건조(동결건조기 #1, 도 1 참조)하여1.635g의 백색 침전물을 수득하였다. pH 1.85에서 상청액 및 pH 1.5에서 형성된 펠렛을 반응 용기(믹서 # 2, 도 1 참조 )에 첨가하고, 빙수욕(4℃)에 넣었다. 이 혼합물을 30분 동안 교반한 다음 원심분리(원심 분리기 #3 , 도 1 및 도 2 참조)하여 pH 1.7에서 습윤 잔사 고체 및 상청액을 형성시키고, 나중에 이후의 pH 의존성 침전에 의한 SGP를 발생시키기 위해 사용하였다 (예를 들면, 이후에 기술하는 바와 같이 pH 3.0, pH 4.0 및 pH 6.0 SGP 분획).

B. 셀레노당단백질의 pH 의존성 침전

pH 1.6의 상청액을 반응기(믹서 # 3, 도 2 참조)에 넣고 2N NaOH을 혼합물의 pH가 3.0에 도달할 때까지 교반하면서 용액에 첨가하였다. 교반을 30분 동안 계속하고 혼합물을 원심분리(원심분리기 #4, 도 2 참조)하여 상청액 및 셀레노당단백질을 형성시켰다. pH 3.0에서 셀레노당단백질 펠렛 (SGP pH 3.0)을 수집하고, 동결건조(동결 건조기 # 2, 도 2 참조 )하여 밝은 회색 침전물을 수득하였다. pH 3.0의 상청액을 반응기(믹서 #4 , 도 2 참조)에 넣고, 2N NaOH를 용액의 pH가 4.0으로 증가할 때까지 용액에 첨가하였다. 교반을 30분 더 계속하고 혼합물은 원심분리(원심분리기 # 5, 도 2 참조)하여 상청액 및 셀레노당단백질을 형성하였다. pH 4.0에서 셀레노당단백질 펠렛 (SGP pH 4.0)을 수집하고 동결건조(동결건조기 #3, 도 2 참조)하여 밝은 회색 침전물를 수득하였다. pH 4.0에서의 상청액을 반응기 (믹서 #5, 도 2 참조)에 넣고, 2N NaOH를 용액의 pH가 6.0으로 증가할 때까지 용액에 첨가하였다. 교반을 30분 더 계속하고 혼합물을 원심분리(원심 분리기 #6, 도 2 참조)하여 상청액 및 셀레노당단백질을 형성시켰다. pH 6.0에서의 셀레노당단백질(SGP pH 6.0)을 원심분리 (원심분리기 #6, 도 2 참조)하여 상청액 및 셀레노당단백질 펠렛을 형성시켰다. pH 6.0에서의 셀레노당단백질(SGP pH 6.0)을 수집하고 동결건조 (동결건조기 #4, 도 2 참조)하여 엷은 회색 침전물을 수득하였다. 형성된 이후의 침전물은 원심분리로 수집하였다. 마지막 원심분리로부터 pH 6.0의 폐수류는 약간의 셀레노-펩타이드, 만노오스 및 글루코오스 올리고사카라이드를 함유하였다 (예를 들면, 이것은 효모성장 배지 또는 다른 영양물질의 제조에 이용할 수 있다). 이 방법은 독성 폐기물을 생산하지 않았으며 또한 환경친화적이었다.

실시예 2

가용성 SGP 분리 및 특성화

SEL-PLEX의 산성추출에 의해 형성된 pH 1.5에서 고체 잔류물을 함유하는 펠렛은 본 방법에서 사용되는 물의 용적을 줄이고 펠렛 내에 트래핑된 대부분의 SGP를 용해하기 위하여 두 번째 추출 (실시예 1 참조)로부터 pH 1.85에서 상청액으로 세척하였다. pH 1.6에서 세 번째 원심분리 이후에 고체 잔류물은 상당한 양의 셀레늄을 함유하고 또한 추출이라고 생각하는 물질을 완전히 사용하여, 분부 건조하기 전에, 셀레늄 효모의 새로운 배치와 혼합할 수 있다.

총 셀레늄, % 단백질 농도 및 SGP 분획의 각각의 중량은 SEL-PLEX (표 1 참조)로부터 3번의 연속 추출후 평균하였다. 추출된 SGP 분획은 2.0 내지 2.5 중량%의 SEL-PLEX 및 미리 추출된 SEL-PLEX중에 존재하는 4.3 내지 5.75%의 총 셀레늄을 구성하였다.

SGP 분획의 pH와 단백질 중량 사이에 정적 상관관계가 있었고, 정반대도 총 셀레늄 농도에 대해 사실이었다 (표 1 참조).

SGP 분획에 대한 평균 단백질 중량은 대략 65 내지 90 중량%이었고, 분획의 동일한 세트에 대한 셀레늄의 농도는 약 2900 ppm 내지 4900 ppm 범위였다. SGP 분획은 4 내지 37 중량%의 탄수화물 성분을 함유하였다.

표 1. 600g의 SEL-PLEX의 3개의 후속 추출로부터 평균 결과

SEL-PLEX의 산성추출에 의해 형성된 pH 1.5에서 SGP 분획의 겔 전기영동은 고분자량 단백질이나 큰 탄수화물 성분을 함유하는 단백질에 해당하는 밴드가 존재하지 않는다는 것을 나타냈다. 저분자량 분획을 지배하는 비슷한 크기분포는 모세관 전기영동을 사용하여 검출하였고, 5.1 kDa 내지 12.2 kDa의 저분자량 분백질은 혼합물의 90% 이상을 함유하였다.

BIO-RAD P10 겔 (6시간 이하의 유지시간) 및 BIO-RAD P30 겔 (1시간 미만의 유지시간)상에 pH 3.0, 4.0 및 6.0에서 세 개의 SGP 분획의 크기 배제 크로마토그래피는 유지시간 5 내지 10분으로 초기 피크, 및 보유시간 35 내지 60분으로 광범위한 나중 피크를 생기게 하였다. 초기 피크는 현저하게 더 많은 단백질: 64.74 내지 75.24%, 및 현저하게 더 높은 셀레늄 농도: 2972 내지 4252 ppm을 함유하였다. 나중 피크에서 단백질의 함량은 31.66 내지 54.95%로 휠씬 더 낮았고, 셀레늄 농도는 1193 내지 1858 ppm으로 현저하게 더 낮았다. 이러한 유형의 크로마토그래피는 조 분획으로부터 높은 함량의 Se를 갖는 SGP를 생산하였고, 3개의 혼합물에서 탄수화물 성분의 낮은 동질성을 입증하였다.

SEL-PLEX의 트립신 소화로부터 0.1M AcONH4 (pH 7.5)의 다양한 펩티드를 사용하여, SUPERDEX 펩타이드10/300 GL 수지 (AMERSHAM 생명과학, 분별범위 7.0-100 kDa)에 대한 크기 배제 크로마토그래피는 SGP 샘플에 대한 유사한 세트의 피크 (10-100 kDa 및 > 100 kDa) 및 SEL-PLEX에 대해 완전히 상이한 용출 패턴을 생기게 하였다. 20 분 이하의 용출 시간을 갖는 "초기" 피크만 셀레늄을 함유하였다. 셀레늄 함유 용출물을 수집하고, 동결건조하고, SEC ICP MS, MALDI TOF MS 및 나노 ESI MS/MS 기술을 사용하여 분석하였다. 결과는 보충적었고, 셀레늄 함유 펩타이드의 검출, 식별 및 서열화를 허락하였다. 검출된 단백질의 확인은 SwissProt 데이터 베이스 검색에 의해 얻어졌다 (표 2 참조).

표 2. SEL-PLEX 추출물의 트립신 소화에서 확인된 셀레노-펩타이드 및 셀레노단백질

이 방법의 가장 놀라운 특성은 pH 의존성 침전으로부터 상이한 SGP 분획의 크로마토그래피 분리 (예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피)에 의해 얻어진 다양한 분획의 단백질 조성이 적용된 전기영동 방법 (예를 들면, 겔 전기영동 및 모세관 전기영동)에 따라, 동일하거나 매우 유사하였다는 것이었다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 셀렌 강화 효모로부터 셀레노당단백질의 추출은 낮은 pH (예, 1.5)에서 성공적이었다. 본 발명을 실시하기 위하여 메카니즘을 이해할 필요는 없고 본 발명이 임의의 특정 작용 메카니즘으로 제한되지 않지만, 일부 실시형태에서 SGP 추출에 사용된 산성 조건 하에서, 단백질 코어는 현저하게 가수분해되지 않고 이들의 원래 형태로 거의 살아있었다. 일부 실시형태에서는, SEL-PLEX (예를 들어, SGP pH 3.0, SGP pH 4.0, SGP pH 6.0)의 pH 의존성 셀레노당단백질 분획을 생성시킨 다음 (예를 들면, 대상에게 (예를 들면, 경구 경로를 통해) 유기 셀레늄을 공급하기 위해) 대상에게 (예를 들면, 그 자체로 또는 다른 약제와 함께) 투여한다.

실시예 3

생체이용률 비교

병아리는 닭 가슴살 근육 중의 셀레늄 함량을 측정하여 SEL-PLEX 산성추출물의 pH 의존성 침전으로부터 셀레늄의 생체이용률을 비교하기 위하여 7개의 상이한 식이 치료 (표 3, 4 참조) 로 8일 동안 공급하였다.

표 3. 기초 식이의 조성 및 영양소 상세

표 4. 식이 치료

표 5에 나타낸 바와 같이, SGP 분획 pH 4.0 또는 pH 6.0으로 보충된 규정사료를 먹인 닭은 SEL-PLEX (SP) 보조 규정사료를 먹인 닭에 비하여 가슴 근육 조직내에 거의 동일한 양의 셀레늄 증착을 축적하였다. 대조군에 비하여, 상기 SP 규정사료를 먹인 닭 및 SGP 분획 pH 4.0 또는 pH 6.0으로 보충된 규정사료를 먹인 닭에서의 조직 Se 수준은 소듐 셀레나이트로 보충된 사료를 먹인 닭에 비해 2배 이상 높았다. 따라서 본 발명은 일부 실시형태에서 SP는 물론 SP 딸 SGP 분획 (예를 들면, pH 4.0 및 pH 6.0)이 대상에게 투여하였을 때 생체이용 가능하다는 것을 제공한다 (예를 들면, 일부 실시형태에서 SP, SGP pH 4.0 또는 SGP pH 6.0은 (예를 들면, 대상의 조직에 대한 셀레늄의 공급에 의해 입증된 바와 같이) 대상에게 투여하였을 때 무기 셀레늄 (예를 들면, 소듐 셀레나이트)보다 더욱 (예를 들면, 2배 이상) 생체 이용가능하다).

표 5. 근육 셀레늄 농도에 대한 식이성 셀레늄 근원의 효과

* 다른 문자를 갖는 값은 결과가 통계적으로 유의미하다는 것을 나타낸다((P <0.05).

실시예 4

A. 육계의 가슴 근육에서 유전자 발현 프로파일에 대한 상이한 식이성 셀레늄 근원의 효과

실시예 3에서 인용된 닭의 가슴 근육 조직은 다음과 같은 식이 치료로 이끌어내는 유전자 발현 프로파일에서의 유사점과 차이점을 평가하는데 사용되었다: 치료 1 - 기초 (대조군); 치료 2 - 대조군 + 0.3 ppm 소듐 셀레나이트 (SS); 치료 3 - 대조군 + 0.3 ppm SEL-PLEX; 치료 6 - pH 4.0에서 SEL-PLEX (SP)로부터 추출된 0.3 ppm SGP 분획. SGP 분획 pH 4.0은 SP로 얻어진 것에 비하여 가슴 조직에서 거의 동일한 수준의 셀레늄 침착이 생기기 때문에 분석하였다. 따라서 실험은 SP 분획 pH 4.0을 받는 동물이 SP 식이 동물에서 관찰된 유사한 생체내 효과 (예를 들면, 유전자 발현 변화)를 경험하였는지, 또는 현저한 또는 유사한 차이점이 존재하였든지 여부를 결정하기 위하여 본 발명의 실시형태의 개발 도중에 수행하였다.

동물 및 조직 샘플링:

나이 18일에, (상기 표 3과 4에서 기술된) 각각의 치료그룹으로부터 5 마리의 닭을 무작위로 선정하고, 아르곤 질식 후 자궁경부 탈골에 의해 안락사시켰다. 가슴 근육 조직의 샘플 (1 g)을 신속하게 제거하고 액체 질소에 급속 냉동시켰다. 샘플은 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다.

마이크로 어레이 분석:

총 RNA는 제조 업체의 프로토콜에 따라 TRIZOL 시약 (Invitrogen, 칼스배드, CA)를 사용하여 동결조직으로부터 분리하였고, RNEASY 키트 (QIAGEN, 발렌시아, CA)를 사용하여 정제하였다. 총 RNA는 260 nm에서 흡광도로 정량하였고, 통합성(integrity)은 아가로오스 겔 전기영동 및 28S와 18S 밴드의 브롬산 에티디움 염색에 의해 확인하였다.

마이크로어레이 프로파일링은 제조업체의 권장 프로토콜에 따라 AFFYMETRIX (Santa Clara, CA) 진칩 치킨 게놈 어레이(Genechip Chicken Genome Array)를 사용하여 수행하였다.

데이터를 처리하고 각각의 프로브 세트를 AFFYMETRIX MAS5.0 발현 개략 알고리즘을 사용하여 신호 대 소음 강도의 비를 기준으로 P (존재), M (경계) 또는 A (부존재)로서 표시하였다.

생물정보학 분석:

GeneSpring GX 10.0 (실리콘 제네틱스, 레드우드, CA)을 사용하여 마이크로데이터를 정성하고 정규화하고 통계적 및 유전자 발현 패턴 분석을 수행하였다.

잘못된 발견의 가능성을 최소화하기 위해 낮은 신호강도를 갖는 프로브 세트 (MAS5.0 알고리즘에 의해 '부존재'로 표시)를 추가 분석에서 제외하였다. 다음에 여과된 유전자 발현 프로파일은 그룹들 사이에 별도로 발현된 프로브 세트를 확인하기 위한 일방향 ANOVA에 처리한 다음 사후의 테스트를 하여 대조군에 비하여 셀레늄 처리에 의해 현저하게 변화된 유전자를 결정하였다. 대조군 (P≤0.05)으로부터 차별화되고 상응하는 신호강도 폴드 변화 (FC) ≥ 1.2를 갖는 유전자만 변화되는 것으로 간주되었다.

가슴 근육 조직에서 유전자 발현 프로파일에 대한 식이치료의 효과를 가시적으로 표현하기 위하여, 상이하게 발현된 것으로 확인된 693개의 유전자(ANOVA, P＜ 0.05)는 어레이 및 유전자에 기초한 무감독 계층적 클러스터링으로 처리하였다. 상기에서 상세하게 설명한 바와 같이, SGP 분획 pH 4.0은 SP로부터 직접 유도하였고, SP 또는 SGP 분획 pH 4.0를 받은 식이치료 그룹은 닭 가슴 근육조직 내에 거의 동일한 수준의 셀레늄 침착율 (생체이용률)을 나타냈다 (상기 표 5 참조). 따라서 셀레늄 치료 그룹 (SP 및 SGP 분획 pH 4.0)은 동일하거나 고도로 유사한 유전자 발현 변화를 나타내는 것으로 기대되었다. 그러나 아주 놀랍게도, 유전자 발현 프로파일에 대한 분명한 식이 효과는 두개의 치료 그룹 사이에 관찰되었다 (도 3 참조). 구체적으로, 극적인 차이는 SGP 분획 pH 4.0 치료 그룹에 비하여 SP 치료그룹의 유전자 발현 프로파일 사이에서 관찰되었으며, 여기서 분석된 대부분의 유전자는 두개의 치료 그룹에 상이하게 반응하였다. SP 치료 대 SGP 분획 pH 4.0 치료에 의해 야기된 유전자 발현 프로파일에서의 이런 큰 변화는 전적으로 예상되지 못하였으며 또한 미량 원소 생물학에 관하여 지금까지 이용할 수 없는 안목을 제공한다.

예를 들어, 693개의 상이하게 조절된 유전자 (P <0.05, ANOVA)는 어레이와 유전자에 기초한 무감독 계층적 클러스터링으로 처리하였다. 도 3에 도시된 가열 지도에서, 정규화 발현 유전자 프로파일은 각각의 유전자의 평균값에 비하여 발현 변화를 반영하는 색으로 표시한다: 백색, 흑색 또는 회색은 발현강도의 수준이 각각 감소, 상승 또는 무변화를 나타낸다. 가열 지도의 상부에 대한 계통수는 치료들 사이의 발현 프로파일의 유사성 정도를 반영하는 반면, 좌측에 대한 계통수는 모든 치료에 걸쳐 개개 유전자의 발현 프로파일에서 차이를 나타낸다. 도 3에 도시된 계통수의 길이는 클러스터 잎들 사이의 비유사성의 수준에 상응한다 (짧은 계통수는 더 높은 수준의 유사성을 나타낸다).

유방 근육에서 유전자 발현 프로파일에 대한 SGP 분획 pH 4.0 및 SP의 상이한 효과는 도 4에 도시된 Venn 다이아그램으로 나타낸 바와 같은 SGP 분획 pH 4.0 (pH 4), SP 및 소듐 셀레나이트 (SS)에 의해 현저하게 변화된 (P <0.05, FC> 1.2) 유전자의 수를 비교하여 추가로 분석하였다. 여기에는 SP, PH4 및 SS에 의해 각각 현저하게 변화된 198, 173 및 283개의 유전자가 있었다. 통상 모든 3개의 Se 치료 그룹에 의해 조절된 단지 21개의 유전자, 및 통상 SP 또는 SGP 분획 pH 4.0에 의해 유일하게 변화된 152 및 127개의 유전자가 있었다.

예를 들면, 다양한 셀레늄 치료의 결과로서 닭 가슴 근육조직에서 상이하게 또는 일반적으로 조절되는 것으로 확인된 여러 가지 유전자는 도 5-7에 도시되어 있다.

베타-유도 (TGFBI 68 kDa), 변형 성장인자는 세포-매트릭스 상호작용, 세포접착, 이동 및 분화에 관여하는 것으로 생각된다. 이 유전자의 돌연변이는 여러 가지 유형의 각막 변성증과 연관되어 있다. 미토겐-활성화 단백질 키나제 8 (MARK8, 또한 JNK1으로 알려져 있음)은 MAP 키나제 패미리의 멤버이다. MAP 키나제는 다중 생화학 신호를 위한 적분점으로 작용하며, 또한 증식, 분화, 전사 조절 및 발전 등 다양한 세포질 과정에 관련되어 있다. MA{PK8은 또한 세포내 산화 스트레스 반응, 면역 반응은 물론, 인슈린 신호 경로를 통한 탄수화물 및 단백질대사에서 중요한 역할을 한다. MAPK8의 과도한 활성화는 인슐린 수용체 기질 1 (IRS1)를 통하여 인슐린 저항을 유도할 수 있다는 것이 알려져 있다.

도 5는 일반적으로 SS, SP 및 SGP 분획 pH 4.0에 의해 조절된 유전자 (예를 들어, TGFBI 및 MAPK8)의 예를 제공한다. 도 6은 일반적으로 SS가 아닌 SP와 SGP 분획 pH 4.0으로 조절된 유전자(예를 들어, 보체 구성요소 1R(C1R) 및 유비퀴인화 인자 E4A (UBE4A))의 예를 제공한다. 보체 구성분 1R (C1R)는 원래의 면역 시스템과 병원균 제거의 보체 카스케이트와 관련된 단백질이다. 유비퀴틴에 의한 단백질의 변형은 분해를 위해 비정상적 또는 일시적 단백질을 표적화하기 위한 중요한 세포 메카니즘이다. UBE4A는 E4 유비퀴틴 인자로 기술되는 U-상자 형 유비퀴틴 리가아제를 인코딩한다. UBE4A은 성장 및/또는 분화를 포함하는 유비퀴틴 이외의 상이한 생화학적 과정에 역할을 하는 것으로 생각된다.

도 7은 SGP 분획 pH 4.0으로 독특하게 조절되는 유전자 (예를 들어, 작은 근육 단백질, X-결합 (SMPX)및 유비퀴틴 특이적 펩티다제 (USP22))의 예를 제공한다. 작은 근육 단백질, X-결합 (SMPX)는 횡문근로 특이적으로 발현되는 작은 단백질이고 근육 수축에 중요한 역할을 한다. 유비퀴틴 특이적 펩티다제 22(USP22)는 유비퀴틴 의존성 단백질 이화작용 과정에 관여하는 유전자이다. USP22는 종양성장의 양성 조절인자인 것으로 나타났다. USP22의 발현 증가는 암의 진행과 관련되어 있다. USP22의 발현을 감소시키거나 분해하는 능력은 종양 성장 및/또는 암 진행의 억제를 제공할 수 있다. 예를 들어, USP22의 발현이 감소하면 Mdm2 및 사이클린 E의 발현을 하향 조절하여, p53 및 p21의 하향조절된 발현을 생기게 하고, 이는 세포 순환 억제 및 인간 방광 종양 세포 증식의 억제를 유도한다.

근육 조직에서 pH 4.0 분획에 의해 유발되는 독특한 유전자 발현 패턴의 추가 검사는 이 분획에서 셀레늄의 화학적 형태의 잠재적인 치료용도를 위한 (예를 들면, 종양 진행 및/또는 전이를 방지하거나 느리게 하기 위한) 추가적인 증거를 제공한다.

예를 들면, KITLG (c-KIT 리간드) 유전자는 생식 세포 및 신경 세포 발달 및 조혈에서 자궁내 역할을 하는 다면적 인자인 티로신 키나제 수용체의 리간드를 인코딩하며, 이 과정은 세포이동에서의 역할을 반영하는 것으로 믿어진다. 최근에, 고환 암의 위험증가와 관련되어 있는 것으로 생각되는 KITLG 유전자의 변화가 발견되었다 (Kanetsky et al., 2009). 더욱이, KITLG, KIT 종양 유전자 제품의 동족 수용체의 발현이 혐색소성 신장세포 암종에서 문서로 기록되고 KITLG과 KIT의 발현은 모두 NIH3T3 섬유아세포의 변형 및 작은 세포 폐암의 종양 형성에 관여하는 것으로 알려져 있다 (Yamazaki et al., 2003).

놀랍게도, pH 4.0 분획을 투여한 대상으로부터 근육조직은 KITLC 유전자를 현저하게 하향조절하였지만, 그의 발현수준은 SP, pH 4.0 분획에 대한 모체 물질을 포함하는 다른 셀레늄 치료에 의해 영향받지 않는 것으로 관찰되었다.

전이는 대부분의 인간 암에서 사망의 주요원인이며, 원발성 종양으로부터의 세포가 세포외 매트릭스를 통하여 이동하고, 새로 형성된 혈관 (종양 혈관신생)을 통해 순환을 입력하고 증식이 다시 시작되는 원격 사이트(혈관외유출)로 전한다.

성장 인자 수용체 - 결합 단백질 2 (GRB2)는 세포 내 신호 전달에 중요한 분자이다. 그것은 세포주기 진행과 액틴 기반 운동성을 위해 중요하며, 그 결과 상피 형태 형성, 혈관 신생 및 혈관생성과 같은 더욱 복잡한 공정에 중요하다. 이러한 중요한 기능은 GRB2가 국소 침입과 전이를 통해 고체 종양의 확산을 방지하기 위해 고안된 전략을 위한 치료 표적을 만든다. 실제로, 효과적인 항-전이성 전략을 나타낼 수 있다고 느끼고 있기 때문에 Grb2를 차단하거나 대항하는 방법들을 찾아내는데 현재 많은 노력들이 이루어지고 있다 (Giubellino, Burke and Bottaro, 2008).

도 9에 도시된 바와 같이, Grb2는 pH 4.0 - 치료된 동물 대 대조군 및 다른 셀레늄 치료, 예를 들면 소듐 셀레나이트 및 pH 4.0용 모체 셀레늄 물질; Sel-Plex에서 현저하게 하향 조절되었다.

pH 4.0 분획의 잠재적인 항암 활성은 중요한 암 관련 유전자의 하향 조절로 국한되지 않는다. 예를 들면, 유방암 세포에 있는 DNAJA3의 발현을 감소시키면 인터루킨-8의 수준이 증가시킴으로써 이들의 이동을 향상시키는 것으로 관찰되었다 (Kim et al., 2005). 이러한 및 다른 결과들은 암세포에서 Tid1 (DNAJA3)의 수준을 증폭하면 이들의 운동성 및 전이하는 능력을 부정적으로 조절한다는 것을 제시한다.

DNAJA3은 pH 4.0에 대한 반응에 대한 실험에서 근육조직 중에 튼튼하게 하향 조절되었지만 (도 10), 다른 셀레늄 근원을 받는 동물로부터 근육 조직에서 조건들을 조절하는 것에 대하여 미반응으로 잔류하였다.

B. 육계의 간 유전자 발현 프로파일에 상이한 셀레늄 치료의 효과

SP 및 SGP 분획 pH 4.0의 예기치않은 분별 유전자 발현 효과를 더욱 특성화하고 또한 유전자의 조절이 다른 조직으로 확장되었는지를 결정하기 위하여, 발현 연구는 실시예 4(a)에서 상기 기술된 바와 같이 수행하였다. 가슴 근육 조직 대신에, 간 조직을 수집하여 실시예 3에서 인용된 동일한 닭에서 분석하였다. SS, SP 및 SGP 분획 pH 4.0 보충된 치료 그룹 외에도, 추가적인 치료 그룹 (SGP 분획 pH 1.85 (pH 1.85), SGP 분획 pH 3.0 (PH3), 및 SGP 분획 pH 6.0 (pH6)으로부터 닭의 간 유전자 발현 프로파일을 특성화하고 대조 처리 그룹과 비교하였다.

실시예 4(A)에 인용된 동일한 실험 프로토콜에 따라서, 각각의 치료그룹의 대상으로부터 간 유전자 발현 프로파일의 분석은 상이한 식이 치료 그룹 (P <0.01, ANOVA)으로 현저하게 변경된 1520개의 유전자를 확인하였다. 이러한 유전자의 무감독 계층적 클러스터링 분석은 도 11에 도시되어 있으며 또한 셀레늄의 상이한 근원이 유전자 발현을 조절할 수 있는 능력에서 상당한 정도의 변동을 유도한다는 추가적인 증거를 제공한다. 도 1의 가열 지도는 각각의 유전자의 평균값에 비하여 발현 변화를 반영하는 색상의 정규 유전자 발현 프로파일을 나타내며; 백색, 흑색 또는 회색은 각각 발현강도의 수준에서 감소, 증가 또는 변화 없음을 나타낸다. 가열 지도의 상부에 대한 계통수는 치료들 사이의 발현 프로파일에서 유사성의 정도를 나타내는 반면, 좌측에 대한 계통수는 모든 치료에 걸쳐 개개 유전자의 발현 패턴에서 차이를 나타낸다. 도면에 도시된 계통수의 길이는 클러스터 잎 사이의 비유사성의 수준에 상응한다 (짧은 계통수는 더 높은 수준의 유사성을 나타낸다).

SP와 SGP 분획 pH 4.0 사이의 차이는 물론 SGP 분획 pH 3.0과 SGP 분획 pH 6.0 사이의 차이는 극적이며, 단지 소수의 유전자들이 통상 각각의 셀레늄 근원에 의한 치료에 의해 조절된다. 일반적으로, 유전자 발현에 대한 SGP 분획 pH 1.85에 의한 치료의 효과는 SP와 다른 SGP 치료 그룹에 속한다 (도 11 참조). 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 SEL-PLEX (예를 들면, 이를 함유하는 식이 및/또는 이의 투여)에 의한 치료 대 SEL-PLEX에서 추출된 SGP 분획 (예를 들어, 이를 함유하는 식이 및/또는 이의 투여)가, 비록 셀레늄의 상이한 근원이 셀레늄의 생체이용률 면에서 유사한 효과를 나타낸다 할지라도, 상이한 생물학적 생체이용률을 나타낸다.

실시예 5

셀레노당단백질의 폴리머좀 캡슐화

pH 4.0 및 6.0에서 침전된 SGP의 1:1 혼합물 (예를 들면, 실시예 1 및 2 참조)은 폴리머로좀으로 캡슐화하였다. 혼합물의 셀레늄 농도는 3,054 ppm이었고 79.96%의 단백질 함량을 함유하였다.

셀레노당단백질 캡슐화 폴리머로좀을 생성하기 위하여, 혼합물은 pH 5.1, 6.2 및 7.4의 수성 완충제 중에 용해하고 현탁액을 진탕 플랫폼에서 하룻밤 혼합하였다. 용해되지 않은 SGP는 원심분리로 제거하였다. 폴리머로좀을 만들기 위하여, PEO(2k)-b-PCL(12k)계 디블록 공중합체를 유기 용매 (예를 들어, 메틸렌 클로라이드, 테트라하이드로 퓨란, 또는 디메틸 설폭사이드)중에 용해하여 유기용액 중에 1 mM PEO-b-PCL 고분자를 수득하였다. 이어서 이 용액을 거친 TEFLON 스트립 (약 1" x 1" x 1/16" 두께)에 침착하고 바이얼의 바닥에 놓고, 거친 면을 위로 향하게 하였다. 용매는 상온에서 24 내지 48 시간 동안 진공하에 증발시키고, 1 내지 10 mg의 공중합체의 건조필름을 얻었다.

다음에 이들 필름은 pH 4.0 및 6.0에서 셀레노당단백질의 1:1 비를 함유하는 수용액 2~3 mL로 수화한 다음, 1-2 시간 동안 20 ~ 100 Hz에서 욕 초음파발생장치에서 초음파처리하였다. 초음파 처리가 완료된 후, 바이얼은 즉시 1-2 분 동안 소용돌이 교반시켜 PEO-b-PCL-기본 고분자 베시클의 수성 코어 중에 셀레노당단백질을 캡슐화한 폴리머좀을 형성시켰다. 이어서 폴리머좀은 LIPOSOFAST 압출기를 사용하여 원하는 구공 크기의 폴리카보네이트 막을 통해 빠른 속도로 압출시켜, 원하는 평균 직경, 이 경우에 50-300nm 범위의 폴리머좀을 얻었다. 이어서 압출된 폴리머좀은 모든 캡슐화되지 않는 셀레노당단백질이 제거되도록 24 시간 동안 pH 7.4의 등장 완충제에 대하여 용액 교환용 투석 카세트에 주입하였다.

pH 7.4에서 폴리머좀 캡슐화 셀레노당단백질의 샘플은 10 ㎎/㎖의 출발 셀레노당단백질 농도로 제조하고, 등장 PBS 완충제에 대하여 투석하였다. 이 실시예는 21,000 x와 52,000 x의 배율에서 cryo-TEM으로 영상화하여, 폴리머좀 내부에 성공적인 셀레노당단백질 캡슐화의 가시적 확인을 얻었다 (도 13 참조). Cryo-TEM은 이들의 순수한 수화 상태에서 극저온 온도에서 시료를 영상화하여, 바람직하지 않은 구조적 변화를 방지하였다. 일반적으로, 100 nm 부근 또는 약간 작은 크기의 균일한 구형 폴리머좀은 영상화 샘플에서 관찰되었다. 어떤 경우에는, 비정질 재료의 대략 구형 집합체가 폴리머좀에 추가하여 관찰되었다. 이들 집합체는 폴리머좀 코어로부터 방출된 셀레노당단백질로 이루어질 수 있고, 샘플이 영상화될 때까지 폴리머좀의 내측에서 외측까지 pH의 차이로 인하여 더욱 침전한다.

pH 5.1, 6.2 및 7.4에서 폴리머좀 캡슐화 셀레노당단백질은 셀레늄 농도를 측정하여 더욱 특성화하였다 (표 6 참조). 각각의 폴리머좀 캡슐화 셀레노당단백질 샘플 1 ml을 냉동건조하여 백색 분말 침전물을 형성하고 나중에 증량하여 200 배 배율에서 검사하였다. 폴리머좀 캡슐화 셀레노당단백질의 전체량은 100℃ 내지 175℃의 온도에서 농축된 산: 과염소산, 질산 및 염산을 사용하여 용해하였다. 용액은 탈이온(DI)수를 사용하여 50ml로 희석하고 MILLENIUM EXCALIBUR 기구 및 방법론을 사용하여 분석하였다.

표 6. 캡슐화 결과

실시예 6

나노 캡슐로부터 셀레노당단백질의 방출

10 mg/ml의 SGP 현탁액으로 제조하고 각각 pH 7.4 및 5.1의 완충제에 대하여 투석된, 상기 표 6에서 나노캡슐 제형 #1 및 3으로부터 셀레노당단백질(SGP)의 방출은 370℃에서 14일에 걸쳐 검색하였다. 나노캡슐-캡슐화 셀레노당단백질로부터 셀레노당단백질의 방출을 검색하기 위하여, 투석된 현탁액은 막 원심분리 (300kD의 분획분자량을 갖는 원심분리 튜브를 사용하였다)에 의해 농축하였다. 농축된 현탁액은 등장 완충제 (pH 5.1 또는 7.4)에 분주하고 각 시점에 대한 N=2 샘플로 37℃에서 유지시켰다. 나노캡슐로부터 셀레노당단백질의 %방출을 평가하기 위해, 샘플을 원심분리하여 각각의 시점에서 순수한 나노캡슐을 분리하였다. 나노캡슐이 셀레노당단백질 샘플로부터 효과적으로 분리되었다는 것을 확인하기 위하여, 동적 광산란 측정은 분리된 소포 (잔류) 및 자유 용액 (여과물)상에서 수행하여 입자 크기를 측정하였다. 유리 용액의 UV 흡광도를 280 nm에서 측정하였고 셀레노당단백질의 %방출은 (A 샘플 - A 초기) / (A 최종 - A 초기)로서 계산하였고, 여기서 A 초기는 0일에서 흡광도이고, A 최종은 샘플들이 가용화 되어 완전한 방출을 하였을 때 연구의 종료시에 흡광도이다 (도 12 참조). 14일 기간에 걸쳐, pH 5.1에서 대략 70%의 SGP는 일정 상태에서 나노캡슐로부터 방출하였고, 여기서 약 50%는 pH 7.4에서 방출하였다. 더 낮은 pH에서 SGP의 초기 방출은 나노캡슐 막의 산 촉매 가수분해 이후에 나노캡슐 막에 걸쳐 셀레노당단백질의 일정한 확산으로 기인하는 것으로 생각된다. 이들 방출 프로파일은 PEO-b-PCL 기반 폴리머좀 내부에 캡슐화된 독소루비신, 암 치료의 것과 매우 유사하다 (예를 들면, Ghoroghchian et al. Macromolecules, 2006, 39 (5), 1673-1675 참조). 이들 데이터는 비교적 높은 부하 농도에서도 셀레노당단백질의 캡슐화가 음의 방식으로 방출 패턴에 영향을 주지 않는다는 것을 확인한다.

실시예 7

셀레노당단백질(SGP) 서방성 고분자의 제조

고분자 A의 합성. pH 4.0 및 6.0에서 침전된 SGP의 1:1 혼합물 (실시예 5 참조)는 SGP 서방성 고분자의 제조에서 사용하였다. 150 mg의 SGP는 2 ml의 메타크릴산 및 1 ml의 탈이온수 중에 용해하였다. 약간의 가열은 용해를 촉진하기 위해 적용하였다. 0.5 ml의 용액의 샘플은 10 mg의 AIBN을 함유하는 5ml의 바이얼에 넣고, 1 분 동안 소용돌이 교반하고, 튜브로부터 공기를 진공하에 제거하고 질소로 대체하였다. 튜브의 내용물은 70℃에서 2 시간 동안 가열된 실험실 오븐 속에 튜브를 넣어서 중합시켰다. 튜브를 파괴하고 고분자를 얇은 부분으로 절단하고, 높은 진공하에서 건조시켰다.

고분자 B의 합성. 0.064 ml의 메타크릴산, 0.091 ml의 2-하이드록시에틸-메타크릴레이트, 1.427 ml의 에틸렌글리콜 디메틸아크릴레이트 및 100mg AIBN의 혼합물을 5 ml 바이얼에 넣고 자석 교반기로 교반한 다음, 75 mg의 SGP를 1.5 ml 아세트산과 0.75 ml의 탈이온수의 혼합물 중에 용해시켰다. 바이얼 중에 공기는 질소로 대체하고, 바이얼은 밀봉하고 70℃에서 4 시간 동안 오일 욕에 넣었다. 바이얼을 깨뜨리고 고분자 모노리트를 도자기 모르타르 중에 분말로 분쇄하였다. 휘발물은 높은 진공하에 고분자로부터 제거하였다.

SGP 시간 방출. 동일한 SGP 서방성 프로토콜은 고분자 (A 및 B)의 각각에 적용시켰다. 333.7±0.1mg의 고분자는 구연산 완충제 (pH 5.0)를 함유하는 15 ml 원심분리 튜브 속에 넣었고 튜브는 4 시간 동안 가볍게 흔들었다. 이어서 튜브는 원심분리하고, 고분자 펠렛을 두개의 8ml 용적의 탈이온수로 세척하면서 튜브를 수집한 다음 냉동건조하였다. Se 분석용 동결건조 샘플로부터 ~21 mg을 취하였다. SGP 추출은 두 번 더 반복하였다. 샘플의 중량을 기록하였다. 모든 샘플은 이들 치료 중에 중량을 상실하였다 (표 8, 9 참조).

표 8

표 9

방출된 SGP의 농도를 평가하기 위하여, 상청액의 280 nm에서 UV 흡광도를 측정하고 동일한 완충제에서 제조한 SGP 검정곡선과 비교하였다 (표 10 참조).

표 10.

원자 흡수 분광법 (EXCALIBUR 방법 및 장비를 사용함)을 적용시켜 서방성 고분자중의 Se 잔류물의 농도를 측정하였다 (표 11 참조).

표 11.

잔류물 펠렛 중의 Se 농도의 측정에 따르면, SGP의 36.08%는 3번 4 시간 세척 (총 12 시간) 후에 고분자 A로부터 방출하였다. 동일 치료 중에, SGP의 30.11%를 고분자 B로부터 방출하였다.

실시예 8

세포내 효모단백질의 알칼리 추출

200.0g의 SEL-PLEX를 pH 11.5에서 1L의 0.1M 수산화 나트륨과 혼합하고, 60℃에서 8 시간 동안 가열하였다. 이어서 혼합물을 14,000 x g/10min/10℃에서 원심 분리하여 상청액과 펠렛을 형성하였다. 펠렛을 400ml의 탈이온수로 세척하고 동결건조하여 54.5 g의 중량을 얻었다 (표 12 참조). pH 11.5에서 상청액 및 사용된 세척액을 함께 혼합하였다. pH는 농축 염산을 사용하여 중화에 의해 pH 6.6으로 감소 하였다. 소량의 침전물 및 맑은 상청액이 중화 도중에 형성되었다. 침전물을 원심분리에 의해 분리하고, 상청액을 AMICON 10kDa 한외여과 장치를 사용하여 농축하였다. 농축물을 2개의 탈이온수 100 ml로 세척하고 냉동건조하여, 64.0 g의 갈색 고체를 얻었다. 잔류 여액을 결합하고 (총 부피 2 리터) 및 셀레늄 농도를 분석하였다. 분리된 침전물은 셀레늄과 질소/단백질을 위해 분석하였다 (표 12 참조).

표 12 : 알칼리 추출

여과물 분석은 10kDa 막을 통해 초여과에 의해 회수되지 않은 셀레늄의 48.7% 손실과 덩어리의 40.7%의 손실을 나타냈다. Me-Se-1 및 HSe-1의 β-친핵성/열적 제거 및 셀레늄 함유 펩타이드로부터 이들 작용기의 산화 형태는 SGP의 최초 화학 구조의 변성 및 여과물 중에 덩어리 및 셀레늄의 손실을 초래하였다. 당해 분야에서 통상 실시되는 생산 공정은 유해할 수 있거나 (예를 들면, 환경에 유해한) 해로운 효과를 가질수 있는 폐기류를 초래한다. 반면, 본 발명의 방법은 (예를 들면, 대규모 상업적 공정에서) 셀레늄 강화 효모로부터 SGP의 산성 추출 및 pH 의존성 분별을 제공한다. 변화하는 온도 조건에서, 알칼리 가수분해를 사용하는 기존의/통상적인 기술은 효모세포로부터 셀레노당단백질의 추출에 실시하지 않은 것으로 나타났다. 본 명세서에서 설명한 바와 같이, 산성 추출을 사용하여 효모세포로부터 SGP의 추출은 성공적인 것으로 발견되었다.

참고 문헌

다음 문헌들은 여기에서 충분히 명시된 것처럼 전부 참고로 포함된다.

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Claims (28)

1. pH 0.5 내지 pH 6.5를 갖는 액상 내에 존재하는 가용성 셀레노당단백질(selenoglycoprotein)의 분획을 포함하는 조성물로서,
   상기 가용성 셀레노당단백질의 분획이 셀레늄 강화 효모로부터 가용성 셀레노당단백질의 산성 추출 후 가용성 셀레노당단백질의 pH 의존성 침전을 통하여 얻어지는 것이고,
   상기 분획에 대하여 단백질 중량은 적어도 65 내지 90 중량%인, 조성물.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 상기 pH 의존성 침전이 산성 조건 하에서 가용성인 셀레늄 강화 효모의 추출물을 포함하는 액상으로부터 가용성 셀레노당단백질의 일부가 침전하는 수준으로 pH를 상승시키고 침전된 셀레노당단백질을 수집하는 것을 포함하는 것인 조성물.
4. 제 3항에 있어서, pH 수준이 4.0으로 상승된 것인 조성물.
5. 제 3항에 있어서, pH 수준이 6.0으로 상승된 것인 조성물.
6. 제 1항에 있어서, 상기 가용성 셀레노당단백질이
   a) 셀레늄 강화 효모를 제공하고,
   b) 상기 셀레늄 강화 효모를 산성 조건에 노출시킨 다음 원심분리하여
   i) 산 불용성 물질을 포함하는 펠렛, 및
   ii) pH 0.5 내지 pH 6.5를 갖는 산성 조건 하에서 가용성인 셀레늄 강화 효모의 추출물을 포함하는 액상을 생성시키고,
   c) 상기 액상의 pH를 상승시켜서 산성 조건 하에서 가용성인 셀레늄 강화 효모의 추출물을 포함하는 액상으로부터 셀레노당단백질을 침전시키고,
   d) 상기 액상으로부터 상기 침전된 셀레노당단백질을 분리하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 조성물.
7. 제1항에 따른 가용성 셀레노당단백질 및 담체를 포함하는 조성물.
8. 제 7항에 있어서, 상기 담체가 폴리머좀, 서방성 고분자, 나노캡슐, 및 분자 각인 고분자(molecularly imprinted polymer)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 조성물.
9. 제 7항에 있어서, 상기 담체가 서방성 고분자인 조성물.
10. 제 7항에 있어서, 상기 담체가 셀레노당단백질을 캡슐화하기 위해 사용된 폴리머좀인 것인 조성물.
11. 제 10항에 있어서, 상기 폴리머좀이 폴리(에틸렌옥사이드)(PEO) 블록 공중합체를 포함하는 것인 조성물.
12. 제 10항에 있어서, 상기 폴리머좀이 폴리(ε-카프로락톤)(PCL) 디블록 공중합체를 포함하는 것인 조성물.
13. 제 10항에 있어서, 상기 폴리머좀이 폴리(에틸렌옥사이드)-블록-폴리(ε-카프로락톤)(PEO-b-PCL)계 디블록 공중합체를 포함하는 것인 조성물.
14. 제 10항에 있어서, 상기 폴리머좀이 폴리(락트산), 폴리(글리콜라이드), 폴리(락트-코글리콜산) 또는 폴리(3-하이드록시부티레이트)와 PEO의 커플링으로부터 유도된 것인 조성물.
15. 제 10항에 있어서, 셀레노당단백질을 캡슐화하는 폴리머좀의 평균 직경이 50-300 nm인 것인 조성물.
16. a) 셀레늄 강화 효모를 제공하고,
    b) 상기 셀레늄 강화 효모를 산성 조건에 노출시킨 다음 원심분리하여
    i) 산 불용성 물질을 포함하는 펠렛, 및
    ii) pH 0.5 내지 pH 6.5를 갖는 산성 조건 하에서 가용성인 셀레늄 강화 효모의 추출물을 포함하는 액상을 생성시키고,
    c) 상기 액상의 pH를 높여서 산성 조건 하에서 가용성인 셀레늄 강화 효모의 추출물을 포함하는 액상으로부터 셀레노당단백질을 침전시키고,
    d) 상기 액상으로부터 상기 침전된 셀레노당단백질을 포함하는 분획을 분리하는 것을 포함하며, 여기서 상기 분획에 대한 단백질 중량은 적어도 65 내지 90 중량%인,
    가용성 셀레노당단백질의 분획의 제조방법.
17. 제 16항에 있어서, 상기 산성 조건이 산성 완충제를 사용하거나 산을 첨가하여 얻어진 것인 방법.
18. 제 17항에 있어서, 상기 산이 염산인 것인 방법.
19. 제 16항에 있어서, 상기 셀레늄 강화 효모를 산성 조건에 노출하는 것이 셀레늄 강화 효모를 1.5의 pH 수준으로 노출시킴을 포함하는 것인 방법
20. 제 16항에 있어서, 상기 셀레늄 강화 효모가 1 내지 24 시간 동안 산성 조건에 노출되는 것인 방법.
21. 제 16항에 있어서, 상기 셀레늄 강화 효모가 8시간 동안 산성 조건에 노출되는 것인 방법.
22. 제 16항에 있어서, 상기 셀레늄 강화 효모를 산성 조건에 노출시키는 것이 실온 이상의 온도에서 일어나는 것인 방법.
23. 제 22항에 있어서, 상기 온도가 50℃ 내지 100℃인 것인 방법.
24. 제 22항에 있어서, 상기 온도가 80℃인 것인 방법.
25. 제 16항에 있어서, 셀레노당단백질이 다양한 pH 조건에서 액상으로부터 침전하여 가용성 셀레노당단백질의 다중 pH 의존성 분획을 생성하는 방법.
26. 제 22항에 있어서, 상기 가용성 셀레노당단백질의 다중 pH 의존성 분획이 1.85, 3.0, 4.0 및 6.0의 pH 값에서 생성되는 것인 방법.
27. 제 16항에 있어서, 액상으로부터 침전된 셀레노당단백질을 포함하는 분획을 분리하는 것이 원심분리하여 침전된 셀레노당단백질의 펠렛을 형성한 다음 침전된 셀레노당단백질로부터 액상을 제거하는 것을 포함하는 것인 방법
28. 제 16항에 있어서, 상기 셀레늄 강화 효모가 2% 이하의 무기 셀레늄을 함유하는 건조된, 생육불능의 셀레늄 강화 효모인 것인 방법.

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