CN1325046C - 可生物降解的多聚纳米微囊及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可生物降解的多聚纳米微囊及其应用。此纳米微囊适于包裹有治疗意义的试剂，以此增加其体内循环时间。
Description
技术领域
本发明与可改善体内循环时间的纳米微囊组分及其应用和制备方法有关。本发明中的纳米微囊组分适于包裹有治疗意义的试剂，包括大分子物质。
背景技术
红细胞(R B C)中的血红蛋白(Hb)是负责运输氧气的。当将血红蛋白从红细胞中抽提出来后，它可被消毒以除去HIV和其它感染源。不幸的是，当将抽提出来的血红蛋白灌输到人体时，它会在灌输进入受体的血液循环系统后降解成二聚体。游离血红蛋白尤其对肾有毒性。血红蛋白分子可被化学修饰以避免灌输后的降解。这些简单修饰后的血红蛋白已进入临床试验的最后一期。然而这种修饰的血红蛋白没有被膜覆盖，因此它必须被超纯化以避免引起不良反应。超纯化也会除去红细胞中那些所有对于防止氧化剂的有害效应而必需的酶。另外，修饰的血红蛋白在人体内的循环半衰期相当短，大约24小时。
血红蛋白只是机体需要的众多重要的生物大分子中的一个例子。在疾病事件中，经常需要向机体提供大分子物质，这些大分子或者是因为疾病造成其缺失，或者被证明对疾病有治疗功效。但在过去，以一种可接受的方式有效地传输这样的大分子进入到机体中从而获得所需要的治疗效果是有困难的。
过去，人们已经尝试微囊化血红蛋白以应用于体内(Chang，T.M.S，1964，Science 146，524；Chang，T.M.S，1997，“Blood Substitutes：Principles，methods，products and clinicaltrial”，vol.I，Karser publisher，Basel。)火棉胶、纤维素、1，6-环己烷二胺(HMDA)，交联蛋白、以双层磷脂一胆固醇膜复合到交联蛋白膜上形成的双层膜以及其它一些物质已经被用于包裹血红蛋白液滴(Chang，T.M.S，1997，“Blood Substitutes：Principles，methods，products and clinical trial”，vol.I，Karser publisher，Basel)。然而，这些直径大约1微米的人造细胞经静脉注射后，在宿主的循环系统中只能存活很短的一段时间。另外，这些人造细胞的多聚物膜会在体内积累。
然后人们的研究重点转移到使用磷脂制备包含血红蛋白的脂质体(Chang，T.M.S，1997，“Blood Substitutes：Principles，methods，products and clinical trial”，vol.I，Karserpublisher，Basel)。使用亚微米磷脂-胆固醇微囊(脂质体)可以延长血红蛋白在体内循环时的存活时间(Djorevich，L.et al.，1980，Exp.Hematol.8，584)。这些脂质体的缺点是缺乏稳定性和强度，而且磷脂膜对环境的降解具有敏感性。脂质体在储藏或在宿主循环系统中会降解。另外，磷脂膜在原本清除循环系统中的细菌和毒素的细胞中会积累，结果造成机体抵抗感染和毒素的能力显著降低。
随后，包含血红蛋白的可生物降解的多聚物膜发展起来了，这种技术在本专利所引文献中由本发明者的一个专利号为5,670,173的美国专利中已予以表述。在这里，制备了一个直径大约150纳米的可生物降解的聚乳酸膜(T.M.S.Chang and W.P.Yu，美国专利5,670,173，公布于1997年9月23日)。聚乳酸在使用后可转变成水和二氧化碳，因此，不会在体内积累。
如美国专利5,670,173号中所述，多聚物膜输入受体后循环半衰期平均短于2小时。因此，出于实用的目的，如血液代用品，人们后来决定选择使用具有较长循环半衰期的可生物降解多聚物膜。
相应的，人们高度希望获得具有改善体内循环时间的多用途的可生物降解纳米微囊。
同样高度希望获得具有至少6小时有效循环时间的可生物降解纳米微囊。
进一步希望获得具有至少14小时有效循环时间的可生物降解纳米微囊。
进一步希望获得具有至少24小时有效循环时间的可生物降解纳米微囊。
还进一步希望获得能对有治疗意义的试剂选择性通透的多用途的可生物降解纳米微囊。
还希望获得适合包囊有治疗意义的试剂并在体内传输的多用途的可生物降解纳米微囊。
更进一步希望获得适合在体内传输被包裹的有治疗意义的试剂并以可控制速度释放的纳米微囊组分。
发明内容
本发明提供了一种具有改善体内循环时间的多功能可生物降解纳米微囊。本发明中的可生物降解纳米微囊适合包裹有治疗意义的试剂，并且适合在体内传输此试剂。本发明中的可生物降解纳米微囊可以被应用于包裹多种有治疗意义的试剂，包括，但不限于大分子物质，如血红蛋白、酶、多肽、基因、聚合蛋白和聚合酶如聚血红蛋白等。
更适宜的是，本发明中的可生物降解纳米微囊适合多种被包裹的有治疗意义的试剂，包括大分子物质，在进入受体体内后的可控制释放。本发明中的纳米微囊组分还适合包裹达到治疗效果浓度的有治疗意义的试剂，并传输此试剂进入受体体内循环系统。
另外，本发明中的纳米微囊适于提供被包裹的有治疗意义的试剂在体内进行可控制释放。
依据本发明中一个实施例，提供了一种制备在体内循环半衰期至少35小时的纳米微囊的方法。这种纳米微囊已经显示可传输一种范例大分子以可控制速率进入体内循环，该大分子循环半衰期达到至少14小时。
依据本专利的许多新方法被用来以使纳米微囊组分适于以可控制速率在体内释放包裹的大分子。例如，本发明中的一个纳米微囊组分被改装以适于将包裹的蛋白以半衰期2小时的逐步释放方式改变成以半衰期至少24小时的速率释放。相应地，本发明提供了一种可以改善体内循环时间的纳米微囊组分，从而使包裹的有治疗意义的试剂在体内循环中保留较长一段时间。这样，本发明的纳米微囊为体内传输和控制释放多种以此法包裹的有治疗意义的试剂提供了一种通用的载体。
本发明的一个目的是提供一种具有改善体内循环时间的多用途的可生物降解纳米微囊。
本发明的另一个目的是提供一种具有至少35小时有效循环半衰期的可生物降解纳米微囊膜。
本发明的另一个目的是提供一种具有至少6小时有效循环半衰期的可生物降解纳米微囊组分。
本发明的另一个目的是提供一种具有至少14小时有效循环半衰期的可生物降解纳米微囊组分。
本发明的另一个目的是提供一种具有至少24小时有效循环半衰期的可生物降解纳米微囊组分。
本发明的另一个目的是提供一种可以选择性地通透有治疗意义的生物试剂的多用途的可生物降解纳米微囊。
本发明的另一个目的是提供一种适于多种有治疗意义的试剂体内可控制释放或传输的多用途的可生物降解纳米微囊组分。
本发明进一步的目的是提供一种制备具有改善体内循环时间的纳米微囊组分的方法。
本发明更进一步的目的是提供一种体内传输有治疗意义的试剂的方法。
本发明提供了一种适合包裹有治疗意义的试剂并增强体内循环时间的可生物降解的多聚纳米微囊膜组分，所述的纳米微囊膜组分由聚乳酸(PLA)和聚乙二醇(PEG)的共聚物组成，此共聚物溶于丙酮，不溶于水。
本发明另一方面提供了一种血红蛋白纳米微囊组分，所述的组分是由包裹具有有效治疗浓度的血红蛋白制剂的一种可生物降解的多聚纳米微囊膜组成；所述的纳米微囊膜包含聚乳酸和聚乙二醇的共聚物；所述的共聚物溶于丙酮，不溶于水；其中所述的纳米微囊组分适于增强所述的血红蛋白制剂的体内循环时间。
本发明中的血红蛋白纳米微囊组分可以包括其它一些已知的抑制高铁血红蛋白生成的生物试剂。而且，本发明中血红蛋白纳米微囊组分可以被调整成选择性地通透体内循环中存在的一些分子，从而阻止纳米微囊内的血红蛋白转变成高铁血红蛋白。
本发明的另一方面进一步提供了一种制备具有延长体内循环时间的纳米微囊组分的方法。所述的方法包括：(a)制备聚乳酸和聚乙二醇的共聚物混合物(PLA-PEG)；(b)加热所述的共聚物混合物；(c)加入包含有治疗意义的试剂的水溶液到所述的共聚物混合物中；(d)从所述的水溶液中沉淀出所述的共聚物混合物；和(e)从那里提取纳米微囊组分；这里所述的组分包括包裹了所述的有治疗意义的试剂的可生物降解的多聚纳米微囊膜。
本发明中制备具有延长体内循环时间的纳米微囊组分的方法可以进一步包括，将有治疗意义的试剂在和聚乳酸-聚乙二醇共聚物混合物混合之前先与一交联成分孵育。作为选择和另外，本分明中制备纳米微囊组分的方法可以进一步包括至少交联一部份包裹的有治疗意义的试剂到纳米微囊的内表面上，其中交联成分是在聚乳酸-聚乙二醇共聚物混合物和有治疗意义的试剂混合后加入的。
本发明中的交联成分可以是戊二醛。但是，业内人士都知道别的交联成份也是可以被应用的。
本发明的另外一个方面提供了一种可以延长有治疗意义试剂体内循环时间的传输系统。所述的系统包括：一种可生物降解的多聚纳米微囊组分，该组分由包裹有所述的有治疗意义的试剂的共聚物膜组成；此处所述的共聚物膜包括一种聚乳酸和聚乙二醇的共聚物；这种共聚物溶于丙酮不溶于水；所述的共聚物膜适应于传输已包囊的有治疗意义的试剂以可控速率释放进入体内循环。
本发明还更进一步提供了一套以逐级方式释放有治疗意义试剂的传输系统，所述的系统包括：多种可生物降解多聚纳米微囊组分，其中每一种微囊组分适应于以预先确定的不同速率在体内释放包裹的所述的有治疗意义的试剂；此处所述的每一种微囊组分包括一种由聚乳酸与聚乙二醇共聚物组成的共聚物膜，共聚物溶于丙酮不溶于水。
此外，本发明中的载药系统也可适应于选择性地通透存在于受药者体内循环系统的生物成分。本发明的具体实施例说明，所包囊的有治疗意义的试剂的质量和完整性也能够得以保持。
除此之外，本发明的载药系统也可能适应于把有治疗意义的试剂与别的生物成分包裹在一起。按照本发明的另外一个具体实施例，载药系统改进的体内稳定性是通过部份包囊的药或有治疗意义的试剂交链到纳米微囊内表面所提供。
本发明也提供了一种包含可生物降解多聚纳米微囊膜的纳米微囊组分，该膜包囊了一种具有有效治疗浓度的大分子；所述的纳米微囊膜包含一种由聚乳酸与聚乙二醇组成的共聚物；所述的共聚物溶于丙酮不溶于水；此处所述的纳米微囊组分适应于提高所述的大分子的体内循环时间。
下文定义了本发明所用的一些术语。
术语“治疗性试剂”是指当体内给药时有治疗潜力的任何试剂，包括，但不仅限于大分子物质，例如血红蛋白、蛋白质、酶、核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)和基因。
附图说明
图1以图形的方式示出按照本发明所得的多种纳米微囊组分的循环时间。
图2以图形的方式示出包囊于按照本发明所得的多种纳米微囊组分中的Hb的保留时间。
图3A和图3B示出按照本发明所得的多种纳米微囊组分的循环时间。
图4示出按照本发明所得的多种纳米微囊组分的循环时间。
图5以图形的方式示出非红细胞的血红蛋白(g/dl)历时浓度。
具体实施方式
本发明提供了增加体内循环时间的改进型的可生物降解的纳米微囊。更为可取的是，本发明的可生物降解的纳米微囊是多聚纳米微囊。本发明的可生物降解的纳米微囊适合于包囊有治疗意义的试剂并将其输入于受者体内循环。此外，本发明的纳米微囊组分适合于延长所包囊的试剂的体内循环时间。对于实际的治疗应用，例如血液代用品，纳米微囊组分的体内循环半衰期多于14小时为佳。因而，人们开展了与本发明相关的广泛研究和开发以设计一种具有增加体内循环时间的纳米微囊组分。此处说明了一个新型的策略，以血红蛋白为例但不仅限于血红蛋白，以提供一种具有延长体内循环时间并且/或者具有体内可控释放速率的血红蛋白纳米微囊组分。
本发明提供了一种新型的纳米微囊组分，可适于包囊和有效地运载有治疗意义的试剂。例如，与血红蛋白一起，纳米微囊组分可被用作血液代用品。通过增加所包囊试剂的体内循环时间，本发明的纳米微囊组分可以显著地增加包囊试剂在体内发挥功能的持续时间，因而增加了该成分的治疗效果。此外，本发明的纳米微囊组分可以有效地以可控方式输送给定剂量的有治疗意义的试剂，从而提高了剂量的效果同时总起来也减少了给药次数。
按照本专利所侧重的方面，具有治疗效果数量的血红蛋白被包囊于一个纳米微囊组分并适宜于输送至受者体内循环，在体内循环中给药。被包囊的血红蛋白发挥血液代用品的功能在体内运载氧气。而且，当包囊的血红蛋白从纳米微囊膜释放出来后，它继续.起到运输氧气的功能，这样就增加了包囊的血红蛋白在体内的作用总长度。
本发明进一步提供了一种新型的载药系统用来可控制地释放有治疗意义的试剂到体内循环。这种通过修改或调整本发明的纳米微囊组分从而达到以可控速率释放被包裹试剂的可行性，提供了一种新型治疗性的载药系统。而且，本发明的多种纳米微囊组分可一起联用以提供一种有效的逐级治疗性的载药系统。按照本发明的这一方面，每一纳米微囊组分适合于以预定的释放速率传输所包囊的有治疗意义的试剂。当多种纳米微囊组分同时输入体内时，因每一种具有其预定的释放速率，这样被包囊的有治疗意义的试剂在体内则会以逐步方式释放。
按照本发明的一个实施例，可生物降解的多聚纳米微囊提供的体内循环半衰期至少为35小时，这一点下文要进行讨论。本发明的纳米微囊组分适合于包囊各种不同的治疗试剂，包括大分子物质，例如血红蛋白、酶、RNA、DNA和包括非常大的聚血红蛋白和酶在内的其它蛋白质，并且在体内以可控的速率释放这些治疗试剂，因而提高了被包囊试剂的体内循环时间。本发明的纳米微囊组分更进一步地作为具有有效治疗浓度的治疗试剂的载体，提供体内控制释放。按照本发明，有治疗意义的试剂可以是但不限于大分子物质。
按照本发明的一个实施例，纳米微囊可维持其体内半衰期在35小时，我们能够改变包裹的蛋白的释放速率：在大鼠中，从释放速率半衰期2小时逐级改变到释放速率半衰期至少24小时。正如下文继续讨论的，据信本发明获得的纳米微囊组分在人体内的半衰期将会更长。这样，本发明就提供了一种可在体内控制释放各种有治疗意义的试剂的多用途载药系统。
举例来说，一个有治疗意义的试剂可以被本发明的一种纳米微囊组分包囊并通过任何一种纳米微囊传输方法引入受者体内循环。例如，本发明的纳米微囊组分可以通过，但不仅限于，静脉内、肌肉内、腹膜内、或皮下传输，也可通过口腔或者皮肤吸收途径给药。纳米微囊组分可以经修饰以使被包囊的试剂以可控速率从纳米微囊载体释放。结果，有用的试剂被引入体内循环，以可控速率释药来达到所希望的治疗效果。如下文的示例，本发明纳米微囊组分的释放速率通过多种方式，使被包囊的治疗性试剂达到期望的释放速率。
按照本发明的例子说明，把血红蛋白包裹在纳米微囊载体中，这样在体内获得足够长的循环时间而达到治疗效果是可能的。因而，可以充分预期，本发明的纳米微囊组分事实上可以用来包囊包括具有有效治疗浓度的任何有治疗意义的试剂，其中包括大分子，来提供一个药物控释传输系统。
按照本发明，制备纳米微囊组分的方法应包括，但不仅限于此，改变纳米微囊膜的通透性；降低纳米微囊膜的降解速率；或增加被包囊的有治疗意义的试剂的分子大小来适应纳米微囊组分从而维持一个期望的循环半衰期和/或控释速率。
材料与方法
材料
聚乳酸
聚乳酸(PLA)从Polysciences Inc.(加拿大)获得。异丁基-2-氰基丙烯酸盐(IBCA)，表面活性剂(Tween 20TM，Span 85TM，Triton X100TM，和Pluronic F68TM)，乙烷基纤维素和L-α-卵磷脂(氢化的)及其它磷脂，例如二甾酰卵磷脂(DSPC)或DSPG和醋酸生育酚从Sigma化学公司(USA)获得。透析膜(Spectrapor 5TM)从Fisher科学公司购买。二乙醚、乙酰乙酸、环己烷和氯仿从BDH化学公司(加拿大)购买。所有其它化学药品，例如，甲氧基聚乙二醇(分子量2000，分子量3350)和2-乙基己酸亚锡，均是试剂级。
方法
制备血红蛋白溶液
无基质血红蛋白(Hb)根据标准方法制备(Chang，T.M.S，1997，“Blood Substitutes：Principles，methods，products and clinical trial”，vol.I，Karser publisher，Basel)。简单地说，无基质血红蛋白是通过低渗溶牛血细胞，并通过甲苯抽提、高速离心净化来制得。最终溶液含有10-15g Hb/dl。为了减少高铁血红蛋白的形成，操作过程在4℃下进行，血红蛋白溶液的pH值控制在7.4。
制备可生物降解的多聚纳米微囊组分(标准方法)
有机相：
溶解100mg(d.l)-聚乳酸(分子量为25000)(购自Polysciences，Warrington，PA)在8毫升(ml)的丙酮中。在超声波水浴器(非常低的能量)中溶解50毫克(mg)氢化的大豆卵磷脂(购自Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL)于4毫升乙醇中。上述两溶液混合后(加入任何一种至另一种)，用做有机相。
水相：
取0.04毫升Tween 20与25毫升的15％(g/dl)的血红蛋白溶液相混合。
制备
在磁力搅拌下[用Thermo-Swirl搅拌器(制造商为Precision Scientific Co.，Chicago)，设置于6档]，于4℃下将有机相缓慢(8毫升/分钟)注入水相。注射头用0.2毫升的移液管头制得。纳米微囊立刻形成，但是，继续维持搅拌悬浮液15分钟。所得的悬浮液为37毫升。在20℃和真空下通过旋转蒸发仪从上述悬浮液中除去部份有机溶剂，用时大约10分钟。这样就获得了33毫升的悬浮液(即除去4毫升有机溶剂)。剩余的悬浮液与15毫升的0.9％NaCl相混合。然后，有机溶剂和游离的血红蛋白通过超滤除去(用AmiconZM 500,000膜，分子量截留值为500,000)。悬浮液用0.9％NaCl通过超滤重复洗净。整个操作在4℃和氮气保护下完成。
按照上述标准程序制备的纳米微囊膜组分，经过按下文所述修改，用来提供具有改进循环时间和控制释放速率的本发明所述的纳米微囊组分。
以下文例子为证，例II列出了制备具有循环半衰期35小时的纳米微囊的方法。在该例中，尽管纳米微囊本身的循环时间半衰期为35小时，但所包裹物被发现会从纳米微囊漏出，其半衰期为2小时或更短。例III以对例II中膜特性修饰为示例，这种修饰后的纳米微囊可以保持被包囊的试剂存活更长时间。例IV示例了更进一步的修饰导致改进了被包囊试剂的保留时间。例IV结合了下述两种修饰方法：(1)例II和例III中纳米微囊膜的修饰方法；(2)对被包裹的试剂本身的修饰，例如以不同的聚合度交联大分子以在包裹之前提供较大的分子质量。每一个范例中都描述了修饰的细节。例II到IV中每一个范例都有许多不同的修饰方法和策略。
参考下列给定的范例来说明但不是限制它的范围将会更容易理解本发明。
例I
标准多聚纳米微囊的制备
我们首先改变五种多聚纳米微囊的膜组成，研究它们对循环时间的作用。
(1)聚乳酸(PLA)纳米微囊由上文提到的制备标准纳米微囊的方法制得。这些聚乳酸纳米微囊显示了大约2个小时的循环半衰期(见图1)。
(2)把磷脂加入由标准方法制备的纳米微囊聚合膜中仅会引起循环时间的轻微增加(此项在图1没有显示)。在这里，氢化大豆卵磷脂(HSPC)和二硬脂酰卵磷脂(DSPC)被引入到了聚乳酸纳米微囊中。
(3)把磷脂-聚乙二醇(PEG)引入到纳米微囊的多聚膜中并没有使体内循环时间明显增加(见图1-PLA+PEG-脂质曲线)。这里，1，2二硬脂酰甘油-3-磷酸二乙胺-N-聚乙二醇2000被引入到聚乳酸纳米微囊膜中。
(4)本发明也研究了纳米微囊对聚乙二醇的吸收。7％的聚乙二醇(分子量15000)被加入到聚乳酸纳米微囊中，置于混悬液中6小时。不幸的是，这样在循环时间上并没有引起明显增加(见图1-聚乙二醇吸附到聚乳酸上的曲线)。
(5)混合10克甲氧基聚乙二醇(分子量2000)和10克DL-乳酸，并在160℃和氮气保护下搅拌，制得标准聚乳酸-聚乙二醇共聚物。然后加入50微升的2-乙基己酸亚锡，在160℃下恒温下保持3小时。然而，该聚合物溶于水，因此不能用于血红蛋白聚乳酸纳米微囊中。这种组成被认为不适用封装水溶性大分子到纳米微囊中。
例II
包裹血红蛋白的纳米微囊组分的制备
(1)有机相
溶解100毫克如下文制备而得(见方法2)的聚乳酸-聚乙二醇共聚物到8毫升丙酮中。在超声水浴(非常低的能量)中溶解50毫克氢化大豆卵磷脂(购自Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL)到4毫升乙醇中。上述两种溶液混合，作为有机相使用。
(2)水相
取0.04毫升TWEEN 20，与25ml 15％(g/dl)血红蛋白溶液混合。
(3)制备
4℃时，在磁力搅拌下〔Thermo-Swirl搅拌器(制造商为Precisoin ScientificCo.，Chicago)，设定在6档〕，缓慢注射(8毫升/分钟)有机相到水相中(注射头由0.2ml移液管头制成)。纳米微囊立即形成，但是，继续搅拌悬浮液15分钟。制备的悬浮液为37毫升。
用旋转蒸发仪在20℃下经大约10分钟脱除上述悬浮液中的部份有机溶剂。获得的悬浮液为33毫升(也就是说，脱除了4毫升有机溶剂)。剩下的悬浮液与15毫升0.9％NaCl混合。然后有机溶剂和游离的血红蛋白用超滤装置除去(用Amicon ZM 500,000膜，分子量截留在500,000)。悬浮液通过超滤反复用0.9％NaCl溶液冲洗。
操作在4℃和氮气保护下进行。
随后确定了一个适宜的纳米微囊聚合物应溶于丙酮而不溶于水。我们对下面的新共聚物经过了研究，希望能用于本发明中的纳米微囊的制备：
方法1-1克D，L-聚乳酸(分子量10,000)和0.5克聚乙二醇(分子量3350)在真空中干燥过夜，加入5毫升丙酮，在氮气保护下将混合物加热到100℃等待1小时。加入20微升的2-乙基己酸亚锡后，混合物在氮气保护下升温到180℃等待6小时。最终的聚合物溶于丙酮。这种共聚物随后与血红蛋白一起以上文所述方法用来制备可降解纳米微囊组分。然而，这种聚乳酸-聚乙二醇共聚物的制备(PEG-PLA方法1)并没有足够地增加循环半衰期(见图1)。
方法2-1.5克DL-聚乳酸(分子量10,000)和0.75克甲氧基聚乙二醇(分子量2000)在真空中干燥过夜。在氮气保护下加温到180℃保持2小时。在加入10微升的2-乙基己酸亚锡之后，混合物在氮气保护下加温到180℃保持3小时。最终的聚合物溶于丙酮。如上文所述，这种共聚物随后与血红蛋白一起以上文所述方法用来制备可降解纳米微囊组分。我们将该制品(PLA-PEG方法2)用于大鼠，测得循环半衰期大约35小时(见图1)。因此，这种聚乳酸-聚7二醇共聚物可以作为新的改进型可生物降解多聚纳米微囊的候选物。
方法3-我们进行了另一项研究以测定使用更高分子量的聚乙二醇是否能进一步增加循环时间。将2克DL-聚乳酸(分子量10,000)和1克聚乙二醇(分子量3350)在真空中干燥过夜，加入5毫升丙酮，混合物在氮气保护下加温到100℃保持1小时。然后，混合物在氮气保护下加温到180℃保持10小时。此共聚物溶于丙酮。此共聚物随后与血红蛋白一起按上文所述方法用来制备可生物降解纳米微囊组分，这种制备并没有足够地增加循环半衰期(图1)。
例III
采用PLA-PEG共聚物作为纳米微囊载体
当我们获得具有充分循环半衰期的纳米微囊后，我们随后以血红蛋白这个大分子为例来研究这种纳米微囊制品。根据上述我们获得的具有35小时循环半衰期的聚乳酸-聚乙二醇共聚物制品(方法2)，我们进一步研究了这一制品用作在体内传输血红蛋白的纳米微囊膜载体。根据本发明，血红蛋白作为大分子的一个例子用来表明本发明中纳米微囊可作为有治疗意义试剂的载体的特性。然而，本发明并不仅限于血红蛋白。
我们成功得制备了血红蛋白纳米微囊(如上文所述)。
这些纳米微囊显示了大约35小时的循环半衰期，类似于那些不合血红蛋白的纳米微囊。然而，微囊化的血红蛋白在注入体内循环后有渗漏的迹象，并且渗漏后很快消失。在纳米微囊载体中的血红蛋白组分的循环半衰期小于2小时，然而，纳米微囊本身继续循环，半衰期为35小时，纳米微囊的膜慢慢地降解和变得泄漏。
如表1所示，我们采用了各种方法解决本发明中大分子组分从纳米微囊中渗漏的问题。血红蛋白纳米微囊是用已详细叙述的制备聚乳酸-聚乙二醇纳米微囊的方法制备而得。随后，得到的血红蛋白纳米微囊用戊二醛进行交联。这样做的目的是在纳米微囊内部交联血红蛋白以产生更大分子，比如聚血红蛋白，从而降低它们从纳米微囊中释放的速率。另外，血红蛋白分子在纳米微囊内表面附近交联，这样就降低了纳米微囊膜的渗透性。表1以血红蛋白为例，显示了为变化本发明中纳米微囊组分释放速率所采用的多种途径，包括改变：(1)以交联基团与血红蛋白之比所表示的戊二醛的量；(2)以交联时间表示的交联过程的持续程度和(3)所使用的戊二醛的浓度。所得到的血红蛋白聚乳酸-聚乙二醇纳米微囊的循环半衰期如T1/2列所示。
表1
用于增加血红蛋白在聚乳酸-聚乙二醇纳米微囊内保留时间的实验步骤
| 过程 | 交联试剂/Hb(Xlk/Hb)比率 | 交联时间(Xlkt) | 交联浓度(Xlkc) | T1/2 |
| 交联前Hb-纳米微囊980914 | 1.3小时 |
| Hb-纳米微囊981027 | 8∶1 | 2小时 | 0.5M | 4.0 |
| Hb-纳米微囊990119 | 8∶1 | 2小时 | 0.5M | 6.5 |
| Hb-纳米微囊990126 | 16∶1 | 3小时 | 0.25M | 10.0 |
| Hb-纳米微囊990202C2 | 6∶1 | 5小时 | 0.25M | 14.0 |
| Hb-纳米微囊990302 | 16∶1 | 5小时 | 0.5M | 16.0 |
| Hb-纳米微囊990304 | 16∶1 | 20小时 | 0.5M | 12.4小时 |
当提高交联时间到5小时，交联试剂的浓度到0.5M时，血红蛋白聚乳酸-聚乙二醇纳米微囊的循环半衰期就增加到16小时(见图2)。与未交联的血红蛋白纳米微囊的循环时间为2小时相比，这是一个重大的改进。这比交联血红蛋白溶液在大鼠体内循环时间8到12小时要长。更进一步，因为在大鼠体内的循环半衰期一般要比在人体内短很多，这个结果提示以本发明所使用的纳米微囊组分可在人体内显著提高循环半衰期。然而，我们将继续设计新的途经来降低血红蛋白注入体内后从纳米微囊中释放的速率。
血红蛋白纳米微囊的交联步骤
为了强化纳米微囊膜，我们采用包括交联在内的不同方法。下面所列表2显示了不同方法的研究概述，并在图3A和3B中得到了表明。
表2总结了更进一步研究纳米微囊强度的实验，这些研究运用了表1中所提及的交联聚乳酸-聚乙二醇血红蛋白微囊的方法。如表2所示，“Xlink”指表1中戊二醛和血红蛋白的比例；“PLA-PEG”是指制备聚乳酸-聚乙二醇血红蛋白纳米微囊中聚乳酸/聚乙二醇的分子量；“交联时间”指与交联剂的交联反应时间；“分离”指如前所述的制备聚乳酸-聚乙二醇血红蛋白纳米微囊的详细方法中浓缩纳米微囊的步骤；“乙醇”指制备过程中使用乙醇的情况。表2的第一列提供了列2到6的结果总结。比如15KX(12∶1)0.25F是指：聚乳酸的分子量为15Kd(戊二醛与血红蛋白比率为12∶1)，反应时间为0.25小时，通过过滤分离。
表2
| 方法 | Xlink | (PLA-PEG) | 交联时间(小时) | 分离 | 乙醇 |
| 5K | 5000/2000 | 过滤 | |||
| 5KX(12∶1)0.25F | 12∶1 | 5000/2000 | 0.25 | 过滤 |
| 5KX(8∶1)2.5F | 8∶1 | 5000/2000 | 2.5 | 过滤 | |
| 5KX(27∶1)0.1F | 27∶1 | 5000/2000 | 0.1 | 过滤 | |
| 5KX(27∶1)0.1F-1 | 27∶1 | 5000/2000 | 0.1 | 过滤 | |
| 5KX(36∶1)5F | 36∶1 | 5000/2000 | 5 | 过滤 | |
| 5KX(36∶1)5F-1 | 36∶1 | 5000/2000 | 5 | 过滤 | |
| 5KX(36∶1)5F-2 | 36∶1 | 5000/2000 | 5 | 过滤 | |
| 5KX(16∶1)5F | 16∶1 | 5000/2000 | 5 | 过滤 | |
| 5KX(16∶1)20F | 16∶1 | 5000/2000 | 20 | 过滤 | |
| 5KX(8∶1)5F | 8∶1 | 5000/2000 | 5 | 过滤 | |
| 5KX(8∶1)20F | 8∶1 | 5000/2000 | 20 | 过滤 | |
| 5KX(8∶1)20F-1 | 8∶1 | 5000/2000 | 20 | 过滤 | |
| 5KX(8∶1)20G-2 | 8∶1 | 5000/2000 | 20 | 胶透析 | |
| 5KX(8∶1)20G | 8∶1 | 5000/2000 | 24 | 胶透析 | |
| 5KX(8∶1)21GA30 | 8∶1 | 5000/2000 | 21 | 胶透析 | 30％ |
| 5KX(8∶1)20GA25 | 8∶1 | 5000/2000 | 20 | 胶透析 | 25％ |
| 5KX(8∶1)20GA20 | 8∶1 | 5000/2000 | 20 | 胶透析 | 20％ |
| 15KX(8∶1)24G | 8∶1 | 15000/2000 | 24 | 胶透析 | |
| 15KX(8∶1)48G | 8∶1 | 15000/2000 | 48 | 胶透析 | |
| 15KX(8∶1)48G-1 | 8∶1 | 15000/2000 | 48 | 胶透析 | |
| 15KX(8∶1)48G-2 | 8∶1 | 15000/2000 | 48 | 胶透析 | |
| 15KPOLYHb | 聚血红蛋白 | 15000/2000 | 聚血红蛋白 | 胶透析 |
血红蛋白纳米微囊的循环时间
200克大鼠的全血量大约为12毫升。30％的最高负荷量是注入大鼠占总血量30％的纳米微囊混悬液，也就是3.5毫升。30％的最高负荷量的结果显示在图3A和3B中。图3A和图3B显示了用表2的方法所得到的循环时间，这些循环时间的最好结果是当所用纳米微囊组分中的聚乳酸的分子量范围在5K-15K区间时取得的。
如图3A和3B所示，在最初的6个小时，血红蛋白纳米微囊循环得很好。然而，当注入后24小时后取样分析，血红蛋白纳米微囊只剩下15％-25％。纳米微囊组分的半衰期从原来的小于2小时(见5K曲线)提高到大约14-16小时。
生物降解能力
使用透析胶吸收方法可将游离的血红蛋白和游离的交联血红蛋白与聚乳酸-聚7二醇血红蛋白纳米微囊分离开来。当把注入体内2小时后的血红蛋白纳米微囊样品置于这个装置中，没有游离的血红蛋白被分离出来，表明血红蛋白纳米微囊保持完整状态。当在透析管中把血红蛋白纳米微囊混于血浆，在6小时后没有游离的血红蛋白被提取出来。在这之后，游离的血红蛋白慢慢地出现于悬置液中，被凝胶所萃取，显示在血浆中六小时后由于生物降解，聚乳酸膜的完整性开始缓慢得到破坏。
聚合物组成
鉴于聚乳酸的分子量越大，生物降解越缓慢，分子量为15-25K的聚乳酸被用来制备聚乙二醇-聚乳酸共聚物。使用更高分子量的聚乳酸要求加热到200℃来完成聚乙二醇-聚乳酸共聚反应，这样有可能导致聚乳酸分子的分解。以聚苯乙烯为标准的体积排阻色谱，Mn＝6900，Mw＝8600，Mz＝7000，Mw/Mn＝1.24显示聚乳酸-聚乙二醇共聚物的分子量减少到只有6900。于是，我们观察到了聚乳酸分子的大幅度分解。
从分子量15000到25000的聚乳酸得到的结果在图4A及4B中列举了出来。除了下面要讨论的15K聚血红蛋白的个例(见15K聚血红蛋白曲线)，我们没有观察到循环周期的延长。
例IV
带有聚血红蛋白的聚乳酸-聚乙二醇共聚纳米微囊的应用
聚血红蛋白是以血红蛋白分子聚合形成的尺寸较大的大分子。最好每个聚血红蛋白是由4至5个血红蛋白分子通过化学键连接在一起。
我们已经表明聚乙二醇-聚乳酸纳米微囊(空的或装有血红蛋白的)的循环半衰期为35个小时。然而，由于随着时间流逝微囊内部血红蛋白的泄漏，在血红蛋白纳米微囊中的血红蛋白的循环半衰期会相对较短些。因此，我们研究了包裹分子量大约在240000到360000之间的聚血红蛋白的应用前途。与较小的分子量大约64000的内源血红蛋白相比，这样会面临较少的泄漏问题。正如图4A和4B中15K聚血红蛋白曲线所示，这样明显地把循环半衰期从原来的1-2小时延长到了14个小时。因此，本发明提供了延长包裹有治疗意义试剂的纳米微囊组分体内循环时间的方法。比如，一个大分子能够交联以形成更大的分子并随后被本发明所述的一种纳米微囊组分所包裹。此外，其它有意义的大分子也可与血红蛋白混合以形成聚血红蛋白复合物。
根据本发明，交联有治疗意义的试剂可以在封入微囊前或后进行。另外，被包裹的试剂也可以被交联到纳米微囊膜的内表面上。
(1)含有较少单体血红蛋白分子的聚血红蛋白的应用
我们研究了膜组分的变化以改进纳米微囊的循环时间以及改善在循环中纳米微囊内血红蛋白的保留情况。结果，我们把注意力集中到制备注入体内后能够保持一定血红蛋白水平以携氧的纳米微囊上。这是通过前面方法所述降低纳米微囊的生物降解性，改变微囊的渗透性，比如用交联试剂交联某些被包裹试剂到纳米微囊膜上和/或使用较大分子用以被纳米微囊所包裹来改进血红蛋白纳米微囊的。结果，本发明的纳米微囊组分适于提供：(1)被包裹试剂在体内的更高起始浓度，以及(2)延长被包裹试剂的循环时间。
在前面的研究中，我们分析了血红蛋白浓度的消逝曲线的斜率并外推至零点以计算循环半衰期。这种方法可用于比较和筛选用不同配方制成的大量不同种血红蛋白纳米微囊。但是，这种分析方法更适于观察载药系统的释放速度。按照本发明的其中一个方面，我们研究了在循环中供氧的血红蛋白的实际量。相应地测定了在循环中存留的血红蛋白的实际量而不是曲线的斜率。
运用60毫升/千克作为大鼠的血液容量，并已知输入的血红蛋白纳米微囊的量，就可以算出每次输入后血红蛋白的可能最高量。然后，就可跟踪血红蛋白在循环中的浓度。我们知道血红蛋白血浆代用品在大鼠体内的循环半衰期要比在人体内短很多。因此，我们做出了把在大鼠身上的实验结果的重要性推广到人时所需的基线标准。我们同时还进行了由戊二醛交联的聚血红蛋白的研究。已知这些聚血红蛋白在人体内的循环半衰期是大约24小时，我们获得了外推到人的直接理论基础。但是，我们知道大鼠具有较为活跃的网状皮内细胞系统(RES)，用于除去像纳米微囊这样的微粒。因此，当将血红蛋白纳米微囊外推到人时，循环半衰期会比实际在老鼠体内的时间还要长得多。
(2)应用聚血红蛋白的基线研究
为了得到有效的对比，所有用大鼠的研究实验方案相同。聚血红蛋白和血红蛋白纳米微囊悬浮液都调整到具有相同的10g/dl的血红蛋白浓度。聚血红蛋白和血红蛋白纳米微囊的输入体积相同，并且都是总血量的30％(即30％的最高负荷量)。
表3表明在大鼠体内使用30％最高负荷量的聚血红蛋白制品(血红蛋白含量为10g/dl)的结果是：最大非红细胞血红蛋白浓度为3.35g/dl，在14小时内降低到1.67g/dl，为其最高浓度的一半〔见聚血红蛋白(17∶1)〕。从这里开始，聚血红蛋白(17∶1)作为基线与其它血红蛋白的制品进行比较，包括比较不同方法制备的非红细胞血红蛋白循环达到浓度1.67g/dl所用的时间。因此，在聚血红蛋白(10∶1)的例子里，最高非红细胞血红蛋白浓度是3.10g/dl，在10.4小时内降低到了1.67g/dl。
使用30％最高负荷量的包裹血红蛋白(10∶1)的结果是最高非红细胞血红蛋白水平只有3.05g/dl(标准误差为0.03)(见表3)。这里的血红蛋白先通过戊二醛交联，所用戊二醛与血红蛋白的比例为10∶1，然后再由聚乳酸-聚乙二醇纳米微囊包裹。非红细胞血红蛋白浓度在大鼠内经过12.3小时降低到1.67g/dl(等同于人体内21小时)。
基于体重、血液体积、血浆体积以及稀释系数的计算表明血红蛋白纳米微囊的最高非红细胞血红蛋白浓度至少是3.6g/dl，而不是在表3中包裹血红蛋白(10∶1)的3.05g/dl。这似乎表明输入的血红蛋白纳米微囊的相当一部分(大约16％)在几乎刚输入后就被除去了。因此，下一步工作是要尝试避免这种情况。
在以上的制备中，血红蛋白在被包入纳米微囊前首先交联成聚血红蛋白。
聚血红蛋白较大的分子尺寸会延迟血红蛋白在循环过程中因为纳米微囊膜的降解而泄漏，从而延长其循环半衰期(见表3)。以聚血红蛋白(10∶1)为基础，我们更详细地分析了上述聚血红蛋白制品中的聚血红蛋白的分子质量分布。随后，如下文例子所述，我们提高了聚合程度来明显降低单四聚体血红蛋白的量(见聚血红蛋白17∶1)，然后再进行包裹。
(i)“包裹血红蛋白(17∶1)”配方
在下面关于血红蛋白纳米微囊的配方中，我们用到了聚血红蛋白“包裹血红蛋白(17∶1)”。在此配方中，交联试剂(戊二醛)与血红蛋白的比例在交联反应以形成聚血红蛋白过程中为17∶1。100毫克聚乳酸-聚乙二醇共聚物和50毫克磷脂溶解于3毫升乙醇和6毫升丙酮的混合溶液中。然后，该溶液在连续磁力搅拌下被缓慢注入到25毫升上述含有0.24％的Tween20的聚血红蛋白溶液中。乙醇和丙酮扩散入水相就形成微粒。在4℃下通过在盐溶液中的透析，就能容易地除去水相中的乙醇和丙酮。
表3
| 分子式 | 最高血红蛋白浓度 | 降到1.67gm/dl的时间(小时) |
| 聚血红蛋白(17∶1)： | 3.35g/d1 | 14.0(老鼠)24(人) |
| 聚血红蛋白(10∶1)： | 3.10g/dl | 10.4(老鼠)17(人) |
| 包裹血红蛋白(10∶1)： | 3.05g/dl | 12.3(老鼠)21(人) |
| 包裹血红蛋白(17∶1)： | 3.58g/dl | 17.1(老鼠)29(人) |
| 包裹血红蛋白1.5(5k)： | 3.60g/dl | 20.0(老鼠)34(人) |
| 包裹血红蛋白1.0(15k)XL： | 3.60g/dl | 20.3(老鼠)35(人) |
| 包裹血红蛋白1.0(15k)： | 337g/dl | 21.2(老鼠)36(人) |
| 包裹血红蛋白1.5(15k)： | 3.65g/dl | 23.3(老鼠)39.9(人) |
| 包裹血红蛋白1.5(15k)XL： | 3.66g/dl | 24.2(老鼠)41.5(人) |
正如表3中所示，灌输2分钟后，最高非红细胞血红蛋白浓度是3.58g/dl(标准误差为0.04)。这明显高于前面所讲的血红蛋白纳米微囊[包裹血红蛋白(10∶1)]的3.05g/dl(标准误差为0.04)。这也接近非红细胞血红蛋白浓度的最高可能起始值。此外，消逝曲线的斜率也更慢，但更重要的是与早前血红蛋白纳米微囊(包裹血红蛋白(10∶1)在大鼠和人体内分别是12.3和21.1小时相比，非红细胞血红蛋白水平在老鼠和人体内分别用了17.1和29.3小时才降低到1.67g/dl。这个非常明显的增长通过逐步改变配方的方式更进一步得到提高，直到达到最大浓度3.66g/dl(标准误差为0.03)，以及通过24.2小时(大鼠)或41.5小时(人)后才降到1.67g/dl(例如，从包裹血红蛋白1.5 Conc.(5k)到包裹血红蛋白1.5 Conc.(15k)XL)。
(ii)“1.5 Conc(5k)”配方
“1.5 Conc(5k)”配方是由与上面“包裹血红蛋白(17∶1)”配方相似的方法制备的，只是聚乳酸-聚乙二醇共聚物的浓度提高到1.5，以得到一个更厚的纳米微囊膜，使其生物降解较慢，从而能够具有较长的循环时间。其结果是循环时间得到了进一步延长。输入样品2分钟后，非红细胞血红蛋白的最大值达到3.60g/dl(标准误差为0.01)，而较早的血红蛋白纳米微囊只有3.05g/dl(标准误差为0.04)(见表3)。消逝曲线的斜率情况也变得更慢，但更重要的是非红细胞血红蛋白水平在老鼠与人的体内分别经过20.0和34.3小时降低到1.67g/dl的水平(见图5)。
(iii)“2.0 Conc(5k)”配方
“2.0 Conc(5k)”配方是在上述“1.5Conc(5k)”配方的基础上，提高了聚合物的浓度用以更进一步改进纳米微囊膜稳定性。然而，这种方式形成的血红蛋白纳米微囊存在聚集成团的倾向，因此没有被选中用于动物试验。
(iv)“1.0 Conc(5k)(XL-Ecap，XL4)”配方
在血红蛋白纳米微囊悬浮液形成后向其中加入戊二醛来修饰“包裹血红蛋白(17∶1)”配方，这样就形成了“1.0 Conc(5k)(XL-Ecap，XLl4)”配方。这种配方中通过交联任何血红蛋白纳米微囊表面血红蛋白以进一步改进膜的稳定性。如表3中所示的血红蛋白纳米微囊“包裹血红蛋白(17∶1)”经过如下的进一步处理。把交联剂戊二醛加入到血红蛋白纳米微囊悬浮液，这就交联了任何靠近纳米微囊表面的血红蛋白以进一步增强纳米微囊膜的稳定性。24小时后向其中加入2M的赖氨酸(赖氨酸/血红蛋白摩尔比为100∶1)来中止血红蛋白的聚合。这种方法与“1.5 Conc(5k)”配方中使用1.5倍浓度聚合物延长循环时间的程度相同。这样，在输入2分钟后，最高非红细胞血红蛋白浓度同样有很明显地提高：为3.60g/dl(标准误差为0.01)，而前面所述的血红蛋白纳米微囊时的浓度3.05 g/dl(标准误差为0.04)(见表3)。消逝曲线的斜率也非常缓慢，但是更重要的是非红细胞血红蛋白水平在老鼠和人体内分别经历20.3和34.8小时才降到1.67g/dl(见表3和图5)。
(v)“1.0 Conc(15k)”配方
我们同样研究了通过提高聚乳酸分子量来改善血红蛋白纳米微囊膜稳定性的可能。为此，我们用15k聚乳酸替代了“包裹血红蛋白(17∶1)”配方中的5k聚乳酸。结果与“包裹血红蛋白(17∶1)”配方相比，我们观察到循环半衰期明显的延长。因此，输入2分钟后，与早前血红蛋白纳米微囊的3.05g/dl(标准误差为0.04)相比，这里非红细胞血红蛋白的最高浓度是3.57g/dl(标准误差为0.05)。消逝曲线的斜率也变得很慢，但更重要的是非红细胞血红蛋白水平在老鼠和人体内分别经过21.2和36.6小时才降低到1.67g/dl的水平(见表3，图5)。
(vi)“1.5 Conc(15k)”配方
我们紧接着既使用较高分子量的聚乳酸(15K)也提高了聚合物的浓度(提高到1.5倍)。这是通过使用上面所述“1.0 Conc.(15k)”配方，所不同的是使用1.5倍的聚合物浓度。这种配方结合了下述三个方面：(1)使用含单个四聚体血红蛋白量低的特制的聚血红蛋白(2)使用1.5倍浓度的聚乳酸-聚乙二醇共聚合物以及(3)使用了大分子量的聚乳酸(15k)。
这样就更进一步地明显延长了循环周期。在输入2分钟后，与前面血红蛋白纳米微囊的3.05g/dl(标准误差为0.04)相比，非红细胞血红蛋白的最高浓度是3.6458g/dl(标准误差为0.02)。消逝曲线的斜率也变得很慢，但更重要的是非红细胞血红蛋白水平在老鼠和人体内分别经过23.3和39.9小时才降低到1.67g/dl的水平(见表3，图5)。
(vii)“1.5 Conc(15k)(XL-Ecap，XL4)”配方
最终，我们结合了所有上述可以增加循环时间的方法：(1)利用含单四聚体血红蛋白量低的特制聚血红蛋白；(2)利用1.5倍浓度聚乳酸-聚乙二醇共聚物；(3)利用更大分子量(15k)的聚乳酸以及(4)用戊二醛进一步交联血红蛋白纳米微囊。
当以上因素中只有3种共同作用时，循环周期与前面相比略有延长。因此，在输入2分钟后，与早前血红蛋白纳米微囊的3.05克/100毫升(标准误差为0.04)相比，非红细胞血红蛋白的最大浓度是3.6583g/dl(标准误差为0.03)，消逝曲线的斜率也相对慢得很多，但更重要的是，非红细胞血红蛋白水平在大鼠和人体内分别经过24.2和41.5小时才降低到1.67g/dl(见表3，图5)。
如果把上述结果类推到人体，可以预期，最近描述的血红蛋白纳米微囊(“1.5 Conc(15k)(XL-Ecap，XL4)”配方)的有功能活性的循环半衰期将达到41小时。这是一个非常明显且重要的对循环半衰期的延长，可以使被包裹的血红蛋白具有更长时间的功能，从而提供了一种非常有前景的血液替代品。与聚血红蛋白相比，血红蛋白纳米微囊在人体内可能有更长的循环周期。这是因为老鼠的网状内皮细胞系统(RES)在除去像纳米微囊这样的微粒方面比清除聚血红蛋白溶液效率更高。聚血红蛋白纳米微囊的另外一个优势在于即使聚血红蛋白在输入后泄露，它仍将继续发挥作用，不会导致任何副作用。完全可以预计，本发明的纳米微囊可用作其它修饰血红蛋白，包括重组血红蛋白和其它有治疗意义的试剂的有用载体。
例V
高铁血红蛋白的阻止和转化
随着在体内37℃下循环的血红蛋白量的增加，高铁血红蛋白的量会稳定增长。在红细胞内，酶系统阻止了血红蛋白向高铁血红蛋白的氧化。在缺少这些酶的情况下，高铁血红蛋白随着体内循环时间的增加而形成。相应地，当血红蛋白应用于本发明中涉及的纳米微囊时，本发明提供的另外的实施例可用来抑制高铁血红蛋白的累积。
本发明的一个实施例是把所有正常存在于红细胞中的酶与血红蛋白一起放入纳米微囊。本发明的另一个实施例是提供了一种纳米微囊的组分，该组分对于一些外部因子，如自然存在于血液中可以在体内抑制高铁血红蛋白累积的维生素C或谷胱甘肽，具有渗透性。例如，本发明的纳米微囊的成分可以这样制备，使它保留了象血红蛋白这样的大分子。同时，它也可以选择性地透过一些小分子，比如维生素C或谷胱甘肽。
目前，本发明中被纳米微囊包裹的血红蛋白在输入到37℃人体中后会缓慢地转换为高铁血红蛋白。与血红蛋白不同，高铁血红蛋白不再能携带和输送氧气。如果纳米微囊膜如上文所述能制备成具有选择透过性，这样在保留血红蛋白的同时，微囊膜可以允许维生素C、谷胱甘肽或其它类似的物质从循环的血浆中扩散到纳米微囊内。因为这些分子有助于防止血红蛋白向高铁血红蛋白的转化，这样就增强了血红蛋白携带和输送氧气的能力。
我们制备了包含有血红细胞中所有酶的血红蛋白纳米微囊。该微囊的制备使用了除了血红细胞膜外的所有内容物。基于这个目的，我们可以用上文提到的任何步骤，尤其是那些使体内循环的半衰期延长的方法来制备血红蛋白纳米微囊。我们制备的血红蛋白纳米微囊具有较高的高铁血红蛋白水平(7％)。然后我们在37℃下加热这些纳米微囊，并且跟踪高铁血红蛋白所占百分比的变化。
当悬浮于含有100mg/dl毫升葡萄糖的林格乳酸溶液中时，高铁血红蛋白在6小时增加了2.5％。另一方面，当悬置在含有100mg/dl葡萄糖和0.02mM还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的林格乳酸溶液中时，高铁血红蛋白在第一个小时内增加，恰如上文所述。然而，当葡萄糖和还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸进入纳米微囊开始多种酶反应，高铁血红蛋白在5小时内以1.5％的速率递减。这个结果非常令人兴奋，因为它显示出我们仅仅需要把新鲜的红细胞内容物中正常量的高铁血红蛋白还原酶装入微囊。这样，100毫克葡萄糖(以血糖提供)和0.02mM还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在悬置介质中不仅可以阻止高铁血红蛋白的形成，而且可以把高铁血红蛋白转换回血红蛋白。通过进一步优化还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的浓度，这种效果会进一步加强。
当悬置在含有100mg/dl葡萄糖和0.02mM还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的林格乳酸溶液中时，高铁血红蛋白增加的速率同其悬置于在含有100mg/dl葡萄糖的林格乳酸溶液中时一样。这是因为，与还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)不同，较大的辅因子还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)不能渗入纳米微囊。因为还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)无法渗透，它可以被装入纳米微囊内部。这样避免再提供外部辅因子的需要，而且使反应可以像在红细胞内部一样进行。循环的血液包含了差不多100mg/dl葡萄糖。葡萄糖可进入纳米微囊与还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和多酶体系一起发挥作用。对于红细胞，血糖可以通过红细胞膜转运进入红细胞。
血浆中含有防止高铁血红蛋白形成的物质，如维生素C和谷胱甘肽。我们把本发明中的血红蛋白纳米微囊悬置于维生素C、谷胱甘肽或亚甲基蓝溶液中。血红蛋白纳米微囊膜对所有这些物质具有透过性。结果，在输入后，纳米微囊中的血红蛋白就会曝露于血液循环中抑制高铁血红蛋白形成的这些因子中。依据本发明的一个实施例，其它通常存在于红细胞中的物质，包括但不限于酶，如过氧化氢酶、过氧化歧化酶和高铁血红蛋白还原酶及其它的辅因子等可以同血红蛋白一起被包入微囊中。
我们完全可以预期：本发明适用于制备纳米微囊用来包裹具有有效治疗浓度的，有治疗意义的其它试剂，包括大分子物质。
相应地，本发明所述的纳米微囊的组成可以包含多种有治疗意义的试剂和/或分子，对药物接受者产生一个期望的结果。而且，本发明所述的纳米微囊组分可以选择性地透过有治疗意义的试剂和/或分子，以使它们透过纳米微囊膜与包入微囊的试剂相互作用。
本发明提供了一个有效传输系统来将微囊中包裹的试剂传输到体循环中。本发明也提供了一个适于将具有治疗意义的试剂逐步释放到体内循环的传输系统。按照这个实例，这一系列纳米微囊组分中，每一个都有一个可预先确定的释放速率，来释放微囊中的有治疗意义的试剂。将所有这些不同组分同时注入体内，就会达到一个可控的逐步的释放过程。
尽管本发明是通过实施例来描述的，人们应该理解本发明可以进一步修饰。本发明申请有意涵盖任何在基本发明原理内的变化、应用或改编，包括可知的或惯例的属于本发明范畴的偏离，也包括对前面阐述的以及后面附加权利要求内容中所讲的关键部分的偏离。
Claims (15)
1、一种用于包裹大分子物质并增强体内循环时间的可生物降解的多聚纳米微囊组分的制备方法，其包括：
(a)将分子量为5-15K的聚乳酸(PLA)和聚乙二醇(PEG)以2∶1的重量比进行混合，然后在氮气存在下恒温180℃2小时，之后在存在作为催化剂的2-乙基己酸亚锡的条件下恒温180℃3小时以形成共聚物；
(b)将含有大分子物质的水溶液加入到上述混合物中；或将大分子物质预先交联，然后将其水溶液加入到上述混合物中；或将含有大分子物质的水溶液加入到上述混合物中，然后加入交联试剂将被包裹的大分子物质交联到纳米微囊的内膜；
(c)从上述水溶液中沉淀出共聚物以获得纳米微囊组分；
(d)从中分离出纳米微囊组分；
其中所述的组分包括一种可降解的包裹大分子物质的多聚纳米微囊膜；所述的大分子物质选自蛋白质分子、酶、多肽、RNA、DNA、聚合蛋白或聚血红蛋白。
2、一种用于包裹大分子物质并增强体内循环时间的可生物降解的多聚纳米微囊组分的制备方法，其包括：
(a)将分子量为15-25K的聚乳酸(PLA)和聚乙二醇(PEG)以2∶1的重量比进行混合，然后在氮气存在下恒温200℃2小时，之后在存在作为催化剂的2-乙基己酸亚锡的条件下恒温200℃3小时以形成共聚物；
(b)将含有大分子物质的水溶液加入到上述混合物中；或将大分子物质预先交联，然后将其水溶液加入到上述混合物中；或将含有大分子物质的水溶液加入到上述混合物中，然后加入交联试剂将被包裹的大分子物质交联到纳米微囊的内膜；
(c)从上述水溶液中沉淀出共聚物以获得纳米微囊组分；
(d)从中分离出纳米微囊组分；
其中所述的组分包括一种可降解的包裹大分子物质的多聚纳米微囊膜；所述的大分子物质选自蛋白质分子、酶、多肽、RNA、DNA、聚合蛋白或聚血红蛋白。
3、根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述的聚乙二醇分子量为2000。
4、根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述的聚乙二醇分子量为3350。
5、根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述的共聚物溶于丙酮，不溶于水。
6、根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述的共聚物还包括一种脂质成分。
7、根据权利要求6所述的制备方法，其中所述的脂质成分是磷脂。
8、根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述的交联试剂与大分子物质的水溶液混合2小时。
9、根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述的交联试剂与大分子物质的水溶液混合5小时。
10、根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述的交联试剂是戊二醛。
11、根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述的交联试剂的浓度为0.25M。
12、根据权利要求10所述的制备方法，其中交联试剂是0.5M的戊二醛。
13、根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述的交联试剂与大分子物质的比例为6∶1。
14、根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述的交联试剂与大分子物质的比例为16∶1。
15、根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述的纳米微囊组分包含一种或多种抑制高铁血红蛋白生成的过氧化氢酶、过氧化歧化酶、高铁血红蛋白还原酶、NADH或NADPH。
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