CN102370993A - 一种新型红细胞代用品-人工红细胞荧光纳米粒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种红细胞代用品-人工红细胞荧光纳米粒的制备方法。采用双功能试剂戊二醛交联技术将血红蛋白(Hb)与过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)以及碳酸酐酶(CA)交联生成PolyHb-SOD-CAT-CA复合体,并进一步通过聚乳酸、聚乙二醇共聚物(PLA-PEG)纳米粒包埋。复合体中的抗氧化酶SOD和CAT可消除输血过程中产生的氧自由基,从而避免了血液替换过程中极易出现的缺血再灌注损伤;碳酸酐酶使该红细胞代用品不仅具有携氧的性能,而且能输送二氧化碳;PLA-PEG微囊包埋既能延长这种人工血液制品的半衰期,又能增加其生物相容性。
Description
技术领域
本发明涉及红细胞代用品,具体涉及通过戊二醛交联及聚乳酸、聚乙二醇共聚物(PLA-PEG)纳米粒包埋牛血红蛋白与过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)以及碳酸酐酶(CA)交联生成PolyHb-SOD-CAT-CA复合体,以制备一种具有治疗意义人工红细胞纳米粒的方法。
背景技术
近年来,地震、海啸、台风等突发事件造成了大量人员死亡,其中无法及时输血抢救是原因之一。在我国,各大城市几乎都发生过“血荒”,一些手术不得不等待血液到来才能实施。血液的运输、保存都需要特殊的低温条件,而且保存期最多不过一个月,艾滋病、肝炎等病毒的输血传染更加加剧了安全血液紧缺的难题。多年来,人们一直在探索是否能够造出一种血液代用品,在紧急时刻不需验对血型即可直接使用,而且可以长期保存以备急需。
人体血液由血浆、红细胞、白细胞和血小板组成,成分非常复杂,要制造出一种完全代替血液的溶液非常困难,或者说几乎不可能;但研制一种在急需情况下代替血液中主要组分-红细胞作用的替代品却具有可行性。目前发展良好的红细胞代用品主要有全氟碳化合物、各种血红蛋白氧载体和血红蛋白微囊。
氟碳化合物产品主要用于临床急救手术的血液供给,如心肺分流术及冠状动脉成型术等。但是,全氟碳乳剂输入到体内后会引起短暂的流感样综合症,如发热、寒战、恶心等,这是由于血液中的氟碳化合物微粒被网状内皮系统的巨噬细胞吞噬,伴随前列腺素和某些具有致热活性的细胞活素释放,导致流感样综合症产生。
血红蛋白(Hb)是红细胞中执行载氧功能的蛋白,由4个亚基组成,亚基间的协同效应决定了血红蛋白的载氧功能。从红细胞中分离纯化的无基质血红蛋白(SFH)不能直接应用于人体,因为调节氧亲和力的重要化合物2,3-二磷酸甘油酸在纯化过程中被去除,导致SFH氧亲和力较高(P50约为13~16mmHg),很难在组织中释放氧。同时,SFH失去了胞膜和胞内还原酶系统的保护,会迅速离解成为α、β二聚体,并进一步被氧化,引起肾毒性。此外,血红蛋白失去红细胞抗氧化酶系统的调节作用,易氧化成高铁血红蛋白(MetHb),失去携氧能力并产生自由基。因此,SFH无法作为血液代用品直接应用。
发明内容
本发明的目的就是首先将高纯度的牛血红蛋白(Hb)用双功能试剂戊二醛交联起来,形成初步交联血红蛋白(Polyhemoglobin,PolyHb),从而解决了血红蛋白直接使用的不稳定和毒性问题;PolyHb进一步交联超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和碳酸酐酶(CA),形成PolyHb-SOD-CAT-CA复合体;交联形成的PolyHb-SOD-CAT-CA复合体,进一步通过具有良好生物相容性的通过聚乳酸、聚乙二醇共聚物(PLA-PEG)纳米粒包埋,形成纳米级的人工红细胞微体。
该产品优势在于:
①分子量增大的血红蛋白可在血红蛋白浓度较高时仍保持低渗透压,并防止血红蛋白透出血管壁,半衰期延长;
②牛血红蛋白比人血红蛋白更稳定,而且不需要2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)来调节载氧能力,聚合后其值P50接近天然血红蛋白;
③不需验对血型即可直接使用;
④可以长期保存以备急需;
⑤无艾滋病、肝炎等病毒污染;
⑥动物血红蛋白来源广泛,价格低廉;
⑦交联后牛血红蛋白基本无免疫原性;
⑧PolyHb-SOD-CAT能在较大程度上消除了氧自由基及过氧化物,另外,它还能抑制聚合血红蛋白制备过程中高铁血红蛋白的形成,不仅在血液替换时能预防缺血再灌注损伤(I/R-I)的发生,还有潜力成为I/R-I治疗剂,以治疗其他原因造成的I/R-I;
⑨交联的碳酸酐酶(CA)对碳酸和重碳酸离子起到迅速转换的作用,在血液中维持酸碱平衡,并帮助排除二氧化碳;
⑩PLA-PEG纳米粒包埋增加了该红细胞代用品的稳定性,延长其体内半衰期。
附图说明
图1为人工红细胞纳米粒制备原理图
具体实施方式:
实施例1:无基质血红蛋白(Hb)的制备
无基质血红蛋白是通过低渗溶牛血红细胞,并通过甲苯抽提、高速离心净化、离子交换层析来制得。最终溶液含有0.1-0.15g/mL血红蛋白。为了减少高铁血红蛋白的形成,操作过程在4℃,通氮气环境下进行,血红蛋白溶液的pH值为7.4。
(1)、牛血红细胞的分离
取新鲜牛血分装入数个无菌处理过的离心管中,4000xg离心10分钟。取出后,吸出上层血浆和中层白细胞,下层红细胞以0.9%生理盐水混匀,4000xg离心10分钟。弃上清,下层红细胞再以生理盐水洗涤,重复三次,获得红细胞。
(2)、红细胞的裂解和离心去基质
将所获洗涤红细胞与12.5mM、pH 7.4的磷酸钾缓冲液以体积比1∶2充分混匀,静置30分钟裂解红细胞,得到红细胞溶血液。溶血液中脂类基质通过加入1/2体积冰冷的甲苯萃取两次去除。再将溶血液倒入高速离心容器中,15000xg离心2小时去除细胞碎片,取上清血红蛋白溶液作进一步处理。
(3)、血红蛋白的纯化
上清血红蛋白溶液以50mM、pH 7.4的磷酸钾缓冲液平衡后进行离子交换层析,洗脱收 集后进行超滤处理,滤出限30KDa,最后得到纯化的无基质血红蛋白溶液。
实施例2与超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和碳酸酐酶(CA)交联的多聚血红蛋白PolyHb-SOD-CAT-CA复合体的制备
以300,000U过氧化氢酶∶15,000U超氧化物歧化酶∶100U碳酸酐酶∶1g血红蛋白的比例向纯化的血红蛋白溶液中加入三种酶。交联前以摩尔比(赖氨酸∶血红蛋白)10∶1加入1.3M赖氨酸振荡1小时,然后以摩尔比17∶1(戊二醛∶血红蛋白)加入0.5M戊二醛,交联10-24小时,以HPLC监测分子交联程度,当达到所需交联程度后,向溶液中加入2M赖氨酸溶液终止交联反应。Lactate Ringer溶液过夜透析后,通过Sephadex G-25色谱柱脱除过量的修饰剂和其他的小分子物质。操作过程在4℃,通氮气保护环境下进行。
实施例3聚乳酸、聚乙二醇共聚物(PLA-PEG)纳米粒包埋PolyHb-SOD-CAT-CA复合体制备人工红细胞纳米粒
(1)、PLA-PEG共聚物的制备
1.5克DL一聚乳酸(分子量16,000)和0.75克甲氧基聚乙二醇(分子量2,000)在真空中干燥过夜。在氮气保护下加温到180℃保持2小时。在加人10μL的2-乙基己酸亚锡之后,混合物在氮气保护下加温到180℃保持3小时,得到最终的聚合物PLA-PEG共聚物,PLA-PEG共聚物可溶于丙酮。
(2)、人工红细胞纳米粒的制备
有机相:150毫克PLA-PEG共聚物溶于8毫升丙酮,与溶于4毫升乙醇的50毫克氢化的大豆卵磷脂混合,加入0.05%香豆素-6作为荧光标记物。
水相:取0.04毫升吐温20与25毫升的0.15g/mL的血红蛋白溶液相混合。
制备:在磁力搅拌下4℃下将有机相缓慢注人水相,注射头用0.2毫升的移液管头制得,纳米粒微囊立刻形成,继续维持搅拌悬浮液15分钟。所得的悬浮液为37毫升。在4℃和真空下通过旋转蒸发仪从上述悬浮液中除去部份有机溶剂,用时大约10分钟。这样就获得了33毫升的悬浮液(即除去4毫升有机溶剂)。剩余的悬浮液与15毫升的0.9%生理盐水相混合。然后,有机溶剂和游离的血红蛋白通过超滤除去(用Amicon超滤膜,分子量截留值为500,000),悬浮液用0.9%生理盐水通过超滤重复洗净,整个操作在4℃和氮气保护下完成。
Claims (6)
1.一种通过戊二醛交联及聚乳酸、聚乙二醇共聚物(PLA-PEG)纳米粒包埋牛血红蛋白与过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)以及碳酸酐酶(CA)交联生成PolyHb-SOD-CAT-CA复合体,以制备一种具有治疗意义人工红细胞纳米粒的方法。
2.如权利要求1所述PolyHb-SOD-CAT-CA复合体,其特征在于:
(1)通过戊二醛交联牛血红蛋白与过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)以及碳酸酐酶(CA)生成;
(2)过氧化氢酶∶超氧化物歧化酶∶碳酸酐酶∶血红蛋白的比例为300,000U∶15,000U∶100U∶1g;
(3)PolyHb-SOD-CAT能在较大程度上消除了氧自由基及过氧化物,另外,它还能抑制聚合血红蛋白制备过程中高铁血红蛋白的形成,不仅在血液替换时能预防缺血再灌注损伤(I/R-I)的发生,还有潜力成为I/R-I治疗剂,以治疗其他原因造成的I/R-I;
(4)交联的碳酸酐酶(CA)对碳酸和重碳酸离子起到迅速转换的作用,在血液中维持酸碱平衡,并帮助排除二氧化碳。
3.如权利要求1所述戊二醛交联反应,其特征在于:
(1)戊二醛与血红蛋白摩尔比为17∶1;
(2)交联反应操作过程在4℃,通氮气保护环境下进行;
(3)交联反应前赖氨酸与血红蛋白摩尔比为10∶1。
4.如权利要求1所述聚乳酸、聚乙二醇共聚物(PLA-PEG),其特征在于:
(1)PLA-PEG共聚物可溶于丙酮;
(2)PLA-PEG制备采用的DL一聚乳酸分子量为6,000-16,000;
(3)PLA-PEG制备采用的甲氧基聚乙二醇分子量为2,000-5,000;
(4)PLA-PEG制备采用2一乙基己酸亚锡催化反应。
5.如权利要求1所述人工红细胞纳米粒,其特征在于:
(1)人工红细胞纳米粒包埋材料由PLA-PEG共聚物与氢化的大豆卵磷脂混合反应生成;
(2)人工红细胞纳米粒包埋材料采用0.05%香豆素-6作为荧光标记物;
(3)人工红细胞纳米粒制备整个操作过程在4℃和氮气保护下完成;
(4)纳米粒包埋PolyHb-SOD-CAT-CA增加了该复合体的稳定性,延长其体内半衰期。
6.如权利要求1所述牛血红蛋白,其特征在于:
(1)通过低渗溶牛血红细胞制备得到;
(2)牛血红蛋白制备步骤包括:甲苯抽提、高速离心净化、离子交换层析;
(3)牛血红蛋白制备采用低渗溶液为12.5mM、pH 7.4的磷酸钾缓冲液;
(4)牛血红蛋白制备整个操作过程在4℃和氮气保护下完成;
(5)牛血红蛋白比人血红蛋白更稳定,而且不需要2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)来调节载氧能力,聚合后其值P50接近天然血红蛋白;
(6)交联后牛血红蛋白基本无免疫原性。
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