CN112618705A - 一种人源性血红蛋白类氧载体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例提供了一种人源性血红蛋白类氧载体及其制备方法和应用,采用本申请的制备方法制备的人源性血红蛋白中,二聚体的含量不超过血红蛋白总摩尔数的30%,具有更高的载氧能力和更低的肾毒性,能够用于作为血液代用品。
Description
技术领域
本发明涉及血红蛋白类氧载体技术领域,特别是涉及一种人源性血红蛋白类氧载体及其制备方法和应用。
背景技术
输血是临床重要的救助治疗措施,但同时存在着需进行交叉配型、存在各种病毒交叉感染的危险、血源紧张、贮存期较短等诸多限制。血红蛋白类氧载体(Hemoglobin-Based Oxygen Carriers,HBOCs)是一种新兴的具有携氧功能的血液代用品,具有可长时间保存、无需配型、便于运输、感染风险低等优点,其表现出良好治疗效果的同时也存在诸多问题,诸如在氧化应激、影响血管收缩、产生肾毒性损伤等毒副作用。Polymerizedhemoglobin-superoxide dismutase-catalase-Carbonic Anhydrase(PolyHb-SOD-CAT-CA)是一种为解决上述问题进行优化的HBOCs产品。
PolyHb-SOD-CAT-CA是一种血红蛋白与超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和碳酸酐酶(CA)复合而成的血红蛋白类氧载体,常见的同类研究所采用的原料多来自其他哺乳动物,其中以牛血最为成熟。虽然牛血红蛋白与人血红蛋白同源性较高(α亚基同源性88.7%、β亚基83.7%同源),且来源充足,在现有的研究中已取得较好效果,但牛血红蛋白作为来自其他动物的异源性蛋白,生物相容性仍有待验证,在免疫原性及病毒传播等方面存在潜在的风险;且PolyHb-SOD-CAT-CA的制备在聚合过程中,异源蛋白在聚合时容易产生新的抗原位点,从而有引起免疫反应的风险。采用人源性血红蛋白制备PolyHb-SOD-CAT-CA的问题在于,人源性血红蛋白是以四聚体的形式存在和发挥作用,而在体外其极易降解成为二聚体形式,二聚体的存在一方面影响了PolyHb-SOD-CAT-CA的携氧效果,另一方面二聚体还具有肾毒性,使得人源性血红蛋白难以应用于PolyHb-SOD-CAT-CA的制备。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人源性血红蛋白类氧载体及其制备方法和应用。
本申请第一方面提供了一种人源性血红蛋白类氧载体,包括人源性血红蛋白、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和碳酸酐酶,其中,所述人源性血红蛋白中,二聚体的含量不超过血红蛋白总摩尔数的30%。
本申请第二方面提供了一种人源性血红蛋白类氧载体的制备方法,其包括:
(1)将人源血液进行清洗、破膜、有机溶剂萃取,取水相,离心,取上清液,得到血红蛋白溶液;
(2)调节反应体系的pH为7-9,向所述血红蛋白溶液中加入浓度为1.5-2.5mol/L的赖氨酸,搅拌并加入浓度为0.5-1.5%(w/v)的戊二醛,其中,戊二醛与血红蛋白的摩尔比为(15-20):1,赖氨酸与血红蛋白的摩尔比为(0-10):1;
(3)在2℃-25℃的反应温度下进行聚合反应,反应时间2-6小时;
(4)加入浓度为1.5-2.5mol/L的赖氨酸终止反应,其中,赖氨酸与血红蛋白的物质的量之比为(180-220):1;
(5)离心,取上清液,获得人源性血红蛋白类氧载体溶液。
本申请第三方面提供了本申请第一方面所提供的人源性血红蛋白类氧载体作为血液代用品的用途。
采用本申请的方法制备的人源性血红蛋白类氧载体,能够有效减少制备过程中二聚体的产生,产物中血红蛋白二聚体的含量不超过血红蛋白总量的30%,进而能够有效提高携氧能力,降低肾毒性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1显示了实施例1、3、4(反应时间分别为2h、4h、6h)的人源性血红蛋白类氧载体中高铁血红蛋白含量变化;
图2显示了实施例2和实施例5、6(反应温度分别为4℃、15℃、25℃)的人源性血红蛋白类氧载体中高铁血红蛋白含量变化;
图3显示了实施例2(pH=8.0)及实施例7-10(pH分别为7.0、7.5、8.5、9.0)的人源性血红蛋白类氧载体中高铁血红蛋白含量变化;
图4显示了实施例2(戊二醛与血红蛋白摩尔比15:1)及实施例11-13(戊二醛与血红蛋白摩尔比分别为5:1、10:1、20:1)的人源性血红蛋白类氧载体中高铁血红蛋白含量变化;
图5显示了实施例2(赖氨酸与血红蛋白摩尔比7:1)及实施例14-16(赖氨酸与血红蛋白摩尔比分别为0、14:1、21:1)的人源性血红蛋白类氧载体中高铁血红蛋白含量变化;
图6显示了实施例1、3、4(反应时间分别为2h、4h、6h)的人源性血红蛋白类氧载体中SOD、CAT和CA的酶活回收率;
图7显示了实施例2、5、6(反应温度分别为4℃、15℃、25℃)的人源性血红蛋白类氧载体中SOD、CAT和CA的酶活回收率;
图8显示了实施例2(pH=8.0)及实施例7-10(pH分别为7.0、7.5、8.5、9.0)的人源性血红蛋白类氧载体中SOD、CAT和CA的酶活回收率;
图9显示了实施例2(戊二醛与血红蛋白摩尔比15:1)及实施例11-13(戊二醛与血红蛋白摩尔比分别为5:1、10:1、20:1)的人源性血红蛋白类氧载体中SOD、CAT和CA的酶活回收率;
图10显示了实施例2(赖氨酸与血红蛋白摩尔比7:1)及实施例14-16(赖氨酸与血红蛋白摩尔比分别为0、14:1、21:1)的人源性血红蛋白类氧载体中SOD、CAT和CA的酶活回收率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本申请第一方面提供了一种人源性血红蛋白类氧载体,包括人源性血红蛋白、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和碳酸酐酶,其中,所述人源性血红蛋白中,二聚体的含量不超过血红蛋白总摩尔数的30%。
发明人在研究中发现,本申请的人源性血红蛋白类氧载体,采用人源性血红蛋白,因此具有更好的生物相容性和更低的抗原性;更重要的是,发明人通过对聚合条件进行优化,减少了人源性血红蛋白在体外降解为二聚体的形式,使所述人源性血红蛋白类氧载体中二聚体的含量不超过血红蛋白总摩尔数的30%,因此使得本申请的人源性血红蛋白类氧载体具有更高的携氧能力和更低的肾毒性。
本申请第二方面提供了一种人源性血红蛋白类氧载体的制备方法,其包括:
(1)将人源血液进行清洗、破膜、有机溶剂萃取,取水相,离心,取上清液,得到血红蛋白溶液;
(2)调节反应体系的pH为7-9,向所述血红蛋白溶液中加入浓度为1.5-2.5mol/L的赖氨酸,搅拌并加入浓度为0.5-1.5%(w/v)的戊二醛,其中,戊二醛与血红蛋白的摩尔比为(15-20):1,赖氨酸与血红蛋白的摩尔比为(0-10):1;
(3)在2℃-25℃的反应温度下进行聚合反应,反应时间2-6小时;
(4)加入浓度为1.5-2.5mol/L的赖氨酸终止反应,其中,赖氨酸与血红蛋白的物质的量之比为(180-220):1;
(5)离心,取上清液,获得人源性血红蛋白类氧载体溶液。
发明人在研究中发现,人源性血红蛋白相比于其他物种来源的血红蛋白在体外更容易降解为二聚体的形式,因此难以用于制备血红蛋白类氧载体;更重要的是,由于人源性血红蛋白被提取后,主要以二聚体的形式存在,因此采用人源性血红蛋白聚合得到PolyHb-SOD-CAT-CA的过程中,其聚合条件与以四聚体形式存在的血红蛋白存在很大差异,发明人通过调整聚合反应条件,综合考虑了聚合反应的pH值、反应温度、反应时间,以及交联剂和抑制剂等各方面的因素,使得采用本申请的制备方法制备的人源性血红蛋白类氧载体中,二聚体形式存在的人源性血红蛋白的含量不超过血红蛋白总摩尔数的30%。
本申请对步骤(1)中提取血红蛋白溶液的条件(包括清洗、破膜、萃取剂离)不做限定,只要能够实现本发明本发明的目的即可,本领域技术人员可采用现有技术得到血红蛋白溶液,例如,采用生理盐水清洗,采用纯净水破膜,采用正己烷进行萃取等。
本申请的人源性血红蛋白类氧载体中的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和碳酸酐酶均为在体内与血红蛋白结合的酶,在步骤(1)中提取血红蛋白时,与血红蛋白同时被提取出来。
本申请对步骤(2)中调节pH的方式不做限定,只要能够实现本发明的目的即可,发明人发现,步骤(1)中得到的血红蛋白溶液通常pH较低,因此在此步骤中通常需要通过加入碱溶液以提高反应体系的pH,例如可采用氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液等。
发明人在研究中发现,戊二醛作为聚合反应的交联剂,赖氨酸可以竞争性抑制戊二醛的交联作用,戊二醛用量过多或者赖氨酸用量过少,会导致超大分子的产生,造成粘度上升与免疫原性问题;而戊二醛用量过少或者赖氨酸用量过多,则会有大量二聚体形式存在。本申请发明人在研究中发现,当戊二醛与血红蛋白的摩尔比为(15-20):1,赖氨酸与血红蛋白的摩尔比为(5-10):1时,二聚体含量不高于30%,而且可以减少超大分子的生成;进一步地,由于戊二醛用量越高、赖氨酸用量越少,SOD、CAT、CA的酶活回收率越高,因此,在本申请第二方面的一些优选的实施方式中,步骤(2)中,赖氨酸、戊二醛与血红蛋白的摩尔比优选为(6.5-7.5):(15-20):1。
在本申请第二方面的一些实施方式中,步骤(2)中,所述反应体系的pH为7-8,发明人在研究中发现,在此pH范围内,SOD、CAT、CA具有较高的酶活回收率。
在本申请第二方面的一些实施方式中,步骤(3)中,所述反应温度为2℃-6℃,发明人在研究中发现,在此反应温度下,超大分子和MetHb的生成量更低。
在本申请第二方面的一些实施方式中,步骤(3)中,所述反应时间为2-4小时,发明人在研究中发现,在此反应时间内,高铁血红蛋白生产量更低,而且酶活回收率处于更高的水平。
在本申请第二方面的一些实施方式中,还包括所述人源性血红蛋白类氧载体的精制:
(6)将所述人源性血红蛋白类氧载体溶液在2-6℃下,2500-3500rpm离心15-30分钟;
(7)取上清液进行超滤离心,其中,超滤离心的条件包括:超滤离心管的截留分子量为50-100KD,离心温度2-6℃,转速2500-3500rpm,离心时间15-30分钟;
(8)重复超滤离心5-7次;
(9)取上清液,于生理盐水中进行透析,透析温度2-6℃,透析时间20-30小时。
在本申请第二方面的一些实施方式中,所述人源血液选自脐带血或外周血中的至少一种。发明人在研究中发现,脐带血中的血红蛋白以Hbf为主,对2,3-二磷酸甘油酸亲和力较低,较之成人血具有更高的氧亲和力,且每年有大量新生儿出生,人脐带血通常被废弃,来源充足,因此可作为人源性血红蛋白类氧载体制备的原料血液来源。
在本申请第二方面的一些实施方式中,步骤(1)和步骤(5)的离心条件各自独立地包括:离心温度2-6℃,转速6000-10000rpm,离心时间30-60分钟。
本申请第三方面提供了本申请第一方面所提供的人源性血红蛋白类氧载体作为血液代用品的用途。
以下,基于实施例对本申请进行具体地说明,但本申请并不限于这些实施例。
人源性血红蛋白类氧载体聚合度测定:
以Waters 2695型分析型高效液相色谱仪与Zenix SEC-300色谱柱测定,以pH=7.0的150mmol/L PB作为流动相,流速0.5mL,检测波长280nm;以分子量为600KDa、240KDa、150KDa、66KDa、30KDa的Marker上样检测,以分子量大小作为横坐标,出峰时间作为纵坐标建立标准曲线。
将实施例1-15的人源性血红蛋白类氧载体溶液稀释至1g/L后,经0.22um微孔过滤膜过滤,上样体积10uL,运行时间30min。得到分子量分布曲线,根据所述分子量分布曲线获得样品中分子量在600KDa、240KDa、150KDa、66KDa、30Kda的分子所占面积的百分比,即为分子量分布中,各分子量分子百分比;根据标准曲线计算样品的平均分子量、有效转化率,有效转化率为去除了超大分子与未聚合小分子的部分所占比例,超大分子为分子量大于600KDa的分子,未聚合小分子为分子量小于50KDa的分子。
聚合率=(1-未聚合小分子面积的百分比)×%100%;
平均分子量=Σ分子量大小*该分子量所占面积百分比;
有效转化率=(1-超大分子占面积百分比-未聚合小分子占面积百分比)/1×100%。
人源性血红蛋白类氧载体载氧能力测定:
以Hemoxtm-Analyzer血氧分析仪进行测定实施例1-15的人源性血红蛋白类氧载体的P50值和希尔系数(Hill)。具体包括:打开“stir”选项,样品加入5mL Hemox solution中,同时加入20uL BSA-20Additive A与10uL AFA-25anti-foaming,封口摇匀,按下“flush”选项将样品吸入仪器样品室。通入压缩空气30min并升温至37℃,调整“PO2”按钮至140,调整“S1”按钮至2-3之间,调整“S2”按钮至相同数字,使“H.V”至-200到-300之间。关闭空气并通入氮气,待氧分压至120mmHg时开始记录脱氧曲线,得到P50值与希尔系数。
高铁血红蛋白含量的测定:
通过三波长法进行测定,氧合血红蛋白(oxyhemoglobin,HbO2)、脱氧血红蛋白(deoxyhemoglobin,DHb)、高铁血红蛋白(methemoglobin,MetHb)分别在560nm、576nm、630nm波长下有特殊吸收峰,以700nm为本底吸收,通过测定样品中血红蛋白在560nm、576nm、630nm、700nm四个波长下的吸光度,根据Lambert-Beer定律A=lg(1/T)=Kbc,可得到如下公式
[OxyHb]=[1.013*(A576-A700)-0.3269*(A630-A700)-0.7353*(A560-A700)]*10-4
[DeoxyHb]=[1.3373*(A560-A700)-0.7479*(A576-A700)-0.737*(A630-A700)+]*10-4
[MetHb]=[2.985*(A560-A700)+0.194*(A576-A700)-0.4023*(A630-A700)-]*10-4
[MetHb%]=[MetHb]/([OxyHb]+[DeoxyHb]+[MetHb])
于pH=7.4等渗PBS溶液4mL中加入待测样品100uL混匀,测定560nm、576nm、630nm、700nm四个波长下的吸光度通过上述公式计算高铁血红蛋白含量。
酶活测定:
以SIGMA 19160SOD试剂盒测定超氧化物歧化酶活性(即酶活浓度)。
参考Guo C等的《Extraction of superoxide dismutase,catalase,andcarbonic anhydrase from stroma-free red blood cell hemolysate for thepreparation of the nanobiotechnological complex of polyhemoglobin–superoxidedismutase–catalase–carbonic anhydrase》(Artificial Cells,Nanomedicine,andBiotechnology,2015,43(3),157–162)中的方法测定过氧化氢酶活性和碳酸酐酶活性。
酶回收率=(反应前酶活浓度×反应前体积)/(反应后酶活浓度×反应后体积)。
实施例1
(1)将人脐带血等量分装至200mL血袋中,重量平衡后于2500rpm、4℃离心7分钟,弃上清液,加入预冷的生理盐水洗涤后并在2500rpm、4℃下离心7分钟后弃上清液,待上清液清澈且在全波长扫描下吸收峰等同于生理盐水。加入2倍体积的纯水静置30分钟使红细胞破膜,于8000rpm、4℃条件下离心45分钟后弃沉淀;
将0.5倍体积的正己烷作为萃取剂加入破膜液中,充分混匀后静置后于4℃下萃取2h。待离心管中的水相与有机相完全分层后收集水相,所得水相经真空旋蒸以去除其中的有机物残留后,于8000rpm、4℃条件下离心45分钟后弃沉淀,如此重复操作两次,得到血红蛋白溶液;
(2)调节反应体系的pH=8,向血红蛋白溶液中加入赖氨酸,其中赖氨酸与血红蛋白摩尔比为7:1,在充分搅拌状态下分批逐滴加入戊二醛,戊二醛与血红蛋白摩尔比为15:1;
(3)在4℃的反应温度下搅拌反应,反应时间2小时;
(4)加入2mol/L赖氨酸终止反应,其中赖氨酸与血红蛋白摩尔比为200:1;
(5)8000rpm、4℃条件下离心45分钟后弃沉淀,得到人源性血红蛋白类氧载体溶液;
(6)将人源性血红蛋白类氧载体溶液在4℃下,3000rpm离心20分钟;
(7)取上清液进行超滤离心,其中,超滤离心的条件包括:超滤离心管的截留分子量为50KD,离心温度4℃,转速3000rpm,离心时间20分钟;
(8)重复超滤离心5次;
(9)取上清液,于生理盐水中,在4℃下透析20小时。
实施例2-4
分别调整步骤(3)中反应时间为3小时、4小时和6小时,其余与实施例1相同。
实施例5-6
分别调整步骤(3)中反应温度为15℃、25℃,其余与实施例2相同。
实施例7-10
分别调整步骤(2)中的pH为7.0、7.5、8.5、9.0,其余与实施例2相同。
实施例11-13
分别调整步骤(2)中戊二醛与血红蛋白的摩尔比为5:1、10:1、20:1,其余与实施例2相同。
实施例14-16
分别调整步骤(2)中赖氨酸与血红蛋白的摩尔比为0、14:1、21:1,其余与实施例2相同。
实施例1-16的人源性血红蛋白类氧载体分子量分布、聚合率、平均分子量、有效转化率以及P50值和Hill值的结果见表1。
实施例1-16的人源性血红蛋白类氧载体中高铁血红蛋白含量结果如图1-5所示。
实施例1-16的人源性血红蛋白类氧载体中酶活回收率结果如图6-10所示。
从表1的实施例1-4中可以看出,在2h-6h内,随着聚合时间的增加,血红蛋白(Hb)聚合率逐渐上升,当达到4h时,聚合率由2h时的70.47%达到4h时的80.42%,4-6h聚合率变化幅度较小,6h时聚合率为83.26±0.21%,由于无超大分子产生,此时有效转化率等于聚合率。从结果中可以看出,反应4小时后集合率趋于稳定,出于生产效率和成本考虑,优选反应时间为2-4小时。
从表1的实施例2及实施例5、6可以看出,在4℃-25℃,随着温度上升,Hb的聚合率由73.5%上升至82.17%,同时从4℃到25℃,超大分子所占比大幅上升,由0上升至48.25±0.76%,由于有超大分子的产生,在15℃和25℃时虽然聚合率升高,但是有效转化率大幅降低,由此说明,温度升高会导致超大分子(分子量大于600KDa)的产生,超大分子的产生会造成粘度上升与免疫原性问题,因此优选地,反应温度应适当降低,本申请优选的反应温度为2-6℃。
从表1的实施例2及实施例7-10可以看出,pH在7-9范围内具有较高的聚合率,其中pH在7.0-7.5之间,Hb的聚合率随pH值的升高而升高,由pH=7.0时的73.69%上升至75.24%,pH在7.5-9.0之间,Hb的聚合率随pH值的升高而逐渐降低至pH=9.0时的70.19%。
从表1的实施例2及实施例11-13可以看出,在戊二醛与Hb摩尔比为5-20范围内,随着戊二醛加量的增大,聚合率逐渐上升,由20.98%上升至84.81%,然而在戊二醛与Hb摩尔比为20时有大量超大分子产生(56.88±0.21%),因此有效转化率大幅降低至27.93%,此外,当戊二醛与血红蛋白的摩尔比在(15-20):1时,二聚体的含量低于30%。
从表1的实施例2及实施例14-16可以看出,在赖氨酸与Hb摩尔比范围在0-21范围内,随着赖氨酸加量的增大,Hb聚合率逐渐下降,聚合率由74.98%下降至58.18%。由于有超大分子的产生,赖氨酸与血红蛋白摩尔比为0时生成了较多超大分子(18.27±0.18),有效转化率降低(56.71%);此外,由于赖氨酸抑制了戊二醛的交联作用,因此随着赖氨酸的加入量的增多,聚合率和有效转化率逐渐减小,其中以二聚体形式存在的血红蛋白(30KDa)含量升高,因此在本申请一些优选地实施方式中,赖氨酸与血红蛋白的摩尔比为(5-10):1。
P50(血红蛋白氧饱和度为50%时的氧分压)和希尔系数反映了人源性血红蛋白类氧载体载氧能力,P50值和希尔系数越小,说明氧亲和力越高,相对的载氧能力越强,血红蛋白在体内释放更少的氧,有利于减少氧化应激的损伤,然而氧亲和力过高又会影响供氧能力。从表1中各实施例的P50和Hill结果看,本申请的人源性血红蛋白类氧载体具有合适的P50值和Hill值,进而具有较好的载氧能力。
发明人在研究中还发现,血红蛋白在体外由于失去体内的还原酶系统的调节,血红蛋白容易氧化成没有载氧能力高铁血红蛋白,降低人源性血红蛋白类氧载体的载氧能力,因此在制备过程中应当尽量减少高铁血红蛋白的产生。
实施例1-16的人源性血红蛋白类氧载体中高铁血红蛋白含量结果如图1-5所示,图1-图5中均以实施例2步骤(1)得到的得到血红蛋白溶液作为对照,图中标记为“聚合前”。
从图1中可以看出,聚合时间越长,MetHb的含量越高,结合聚合率,反应时间优选2-4小时。
从图2中可以看出,反应温度越高,MetHb的含量越高,反应温度在4℃左右,MetHb的含量相对较低,本申请优选的反应温度为2-6℃。
从图3中可以看出,反应体系pH值在7-9时,MetHb的含量均较低,占全部类型血红蛋白的2%-2.5%左右。
从图4和图5中可以看出,戊二醛与血红蛋白的摩尔比为(15-20):1,赖氨酸与血红蛋白的摩尔比为7:1左右时,MetHb的含量均低于3%。
实施例1-16的酶活回收率结果如图6-10所示。
从图6中可以看出,2-4小时内,SOD回收率升高,4-6小时,SOD回收率下降;CAT回收率随反应时间延长逐渐下降,CA回收率随时间变化不大,由此优选反应时间为2-4小时。
从图7中可以看出,反应温度在4-25℃下,SOD、CAT、CA的回收率在50-60%左右。
从图8中可以看出,pH对酶活回收率影响较大,SOD、CAT和CA的酶活回收率在pH 7-7.5时,逐渐升高,而pH在7.5-9时,酶活回收率逐渐降低;因此,本申请优选反应体系的pH为7-8。
从图9中可以看出,随着戊二醛用量的增加,酶活回收率逐渐增加。
从图10中可以看出,随着赖氨酸用量的增加,酶活回收率下降。
戊二醛作为交联剂,用量越高,聚合度越高,赖氨酸作为戊二醛的抑制剂,其用量越高,聚合度越低,从图9和图10可以看出,在一定程度内增加人源性血红蛋白类氧载体的聚合程度有利于提高酶活回收率。
综合以上结果可以看出,反应时间2-4小时内,在保证较高聚合度的情况下,高铁血红蛋白生产量较低,而且酶活回收率处于更高的水平;反应温度2-6℃时,超大分子和MetHb的生成量更低;pH在7-8时,具有更高的酶活回收率;戊二醛用量越多,赖氨酸用量越少,人源性血红蛋白类氧载体的聚合度越高,而且酶活回收率也越高,因此优选赖氨酸、戊二醛与血红蛋白的摩尔比为(6.5-7.5):(15-20):1。
采用本申请的方法制备的人源性血红蛋白类氧载体中,血红蛋白二聚体的含量不超过血红蛋白总量的30%,进而能够有效提高携氧能力,降低肾毒性,因此能够用作血液代用品。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等,均包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种人源性血红蛋白类氧载体,包括人源性血红蛋白、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和碳酸酐酶,其中,所述人源性血红蛋白中,二聚体的含量不超过血红蛋白总摩尔数的30%。
2.一种人源性血红蛋白类氧载体的制备方法,其包括:
(1)将人源血液进行清洗、破膜、有机溶剂萃取,取水相,离心,取上清液,得到血红蛋白溶液;
(2)调节反应体系的pH为7-9,向所述血红蛋白溶液中加入浓度为1.5-2.5mol/L的赖氨酸,搅拌并加入浓度为0.5-1.5%(w/v)的戊二醛,其中,戊二醛与血红蛋白的摩尔比为(15-20):1,赖氨酸与血红蛋白的摩尔比为(0-10):1;
(3)在2℃-25℃的反应温度下进行聚合反应,反应时间2-6小时;
(4)加入浓度为1.5-2.5mol/L的赖氨酸终止反应,其中,赖氨酸与血红蛋白的物质的量之比为(180-220):1;
(5)离心,取上清液,获得人源性血红蛋白类氧载体溶液。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其中,步骤(2)中,赖氨酸、戊二醛与血红蛋白的摩尔比为(6.5-7.5):(15-20):1。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其中,步骤(2)中,所述反应体系的pH为7-8。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其中,步骤(3)中,所述反应温度为2℃-6℃。
6.根据权利要求2所述的制备方法,其中,步骤(3)中,所述反应时间为2-4小时。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的制备方法,其中,还包括所述人源性血红蛋白类氧载体的精制:
(6)将所述人源性血红蛋白类氧载体溶液在2-6℃下,2500-3500rpm离心15-30分钟;
(7)取上清液进行超滤离心,其中,超滤离心的条件包括:超滤离心管的截留分子量为50-100KD,离心温度2-6℃,转速2500-3500rpm,离心时间15-30分钟;
(8)重复超滤离心5-7次;
(9)取上清液,于生理盐水中进行透析,透析温度2-6℃,透析时间20-30小时。
8.根据权利要求2所述的制备方法,其中,所述人源血液选自脐带血或外周血中的至少一种。
9.根据权利要求2所述的制备方法,其中,步骤(1)和步骤(5)的离心条件各自独立地包括:离心温度2-6℃,转速6000-10000rpm,离心时间30-60分钟。
10.权利要求1所述的人源性血红蛋白类氧载体作为血液代用品的用途。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210409 |
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