CN103524614A

CN103524614A - 改进的聚合血红蛋白制备方法

Info

Publication number: CN103524614A
Application number: CN201310522769.5A
Authority: CN
Inventors: 周文涛; 杨成民; 王劲峰; 刘嘉馨; 李燊; 王红; 李凤娟; 王翔; 陈刚
Original assignee: Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Priority date: 2013-10-30
Filing date: 2013-10-30
Publication date: 2014-01-22

Abstract

改进的聚合血红蛋白制备方法。以无基质人脱氧血红蛋白的重量/体积含量为4~14%的血红蛋白水性液替为原料，在惰性气体环境和搅拌条件下，经钛棒滤芯将醛基型双功能交联剂送入原料溶液，在0℃~10℃进行聚合反应，制备得到平均分子量为100-210kD，优选分子量为110-170kD的聚合血红蛋白，血红蛋白与醛基型双功能交联剂的摩尔比为4~8:1。该方法可制备得到平均分子量较低、分子量分布较窄和有效转化率可达69%的聚合血红蛋白产物，有效避免了目前聚合血红蛋白制备中的产物分子量不均一的问题，且操作简单，所需设备的成本低。

Description

改进的聚合血红蛋白制备方法

技术领域

本发明涉及一种聚合血红蛋白制备方法，特别是用于制备平均分子量较低、分子量分布较窄且有效转化率较高的聚合血红蛋白的方法。

背景技术

由于无基质血红蛋白不能直接应用于人体，因此血红蛋白类载氧体（HBOCs）已经成为目前国际血液代用品研究领域的主流方向。近几十年来，人们主要通过对血红蛋白进行聚合和五磷酸吡哆醛（PLP）修饰等方式来提高HBOCs制品的安全性和延长其在体内的作用时间。经过几十年的研究，该项领域的技术已取得了突破，美国、加拿大等国的部分研究制品已完成了Ⅲ期临床试用。但是，随着HBOCs在实验动物或者临床中应用考察，也出现了不同程度的问题，如平均动脉压升高、血管阻力上升、微循环血流量减小、组织血氧不足和免疫原性增大等不良反应。引起此类血管性疾病和免疫方面问题的原因很多，分子量过大是其中的原因之一。

美国FDA在对Biopure公司聚合牛血红蛋白Ⅲ期临床实验的批文中明确要求要降低制品的平均分子量。因此，尽管目前对HBOCs制品的最佳分子量还没有统一的公认标准，但适当降低HBOCs制品的分子量已经成为研究学者们的共识。这与血浆代用品如羟乙基淀粉制品分子量从早期的480kD(美国杜邦公司的HESSPan)逐渐下降至200kD(HES)和130KD(Voluven)，即从高分子量逐渐向中分子量发展的趋势相吻合。

戊二醛是一种广谱同型双功能交联剂，其分子结构中含有两个相同活性的醛基基团，可与血红蛋白分子中的氨基发生共价键合作用形成Schiff氏碱，在空间位置较为接近的两个含氨基的氨基酸残基之间搭桥，形成血红蛋白分子内和分子间的交联。由于血红蛋白分子中含有44个氨基，而且戊二醛中的醛基与血红蛋白分子中的氨基具有很高的反应活性，因而使得血红蛋白的交联聚合是一个非常复杂而快速的反应过程，并导致了目前此类反应存在一个技术难题是，如要求获得的产率高（即有效转化率高），则会使平均分子量过大，特别是超大分子产物的含量比例会增加，从而会导致制品保存不稳定，输用中也易于形成微血管流动不畅甚至栓塞。

为了制备分子量分布较均匀且平均分子量较小的HBOCs制品，US 4826811中提出了肾透析膜磷酸化和交联方法，US4001200提出了加入竞争型抑制剂且边加入交联剂边搅拌的交联方法，CN1420127A报道了凝胶柱上聚合方法等，其目的主要都是为使交联剂与血红蛋白能更好地均匀混合或接触。虽然这些方法都能取得一定的较好效果，但同时都存在制备周期长，步骤繁琐，成本高等不足。

发明内容

针对上述情况，本发明提供了一种改进的聚合血红蛋白制备方法，特别是用于制备平均分子量较低、分子量分布较窄且有效转化率较高的聚合血红蛋白的方法，可以满意地解决上述问题。

本发明改进的聚合血红蛋白制备方法，是以无基质人脱氧血红蛋白（即T态学血红蛋白）的重量/体积含量为4~14%的血红蛋白溶液为原料，在惰性气体环境和搅拌条件下，经钛棒滤芯将醛基型双功能交联剂送入原料溶液，在0℃~10℃进行聚合反应，制备得到平均分子量为100-210kD，优选分子量为110-170kD的聚合血红蛋白，原料溶液中的血红蛋白与醛基型双功能交联剂的摩尔比为4~8:1，优选为5~7:1。

聚合反应中所用的醛基型双功能交联剂，除优选常用的戊二醛为交联剂外，根据需要也可以使用如开环棉子糖、双阿司匹林等也具有高活性的二醛类交联剂。，交联剂的用量过大会更易于形成平均分子量较高的产物，但用量过低则会降低有效转化率。

所说作为原料的血红蛋白溶液，优选采用以生理盐水与无基质人脱氧血红蛋白配制成的血红蛋白液体。此外，也可以由以超纯水或者PBS溶液等配置的血红蛋白液体作为原料。由于生理盐水可具有与血红蛋白在体内同样的离子浓度，有利于其功效的更好发挥，且廉价易得。

上述方法中所说的无基质人脱氧血红蛋白，可以采用中国专利CN1333296A的方法制备得到的包括由人外周血红蛋白（包括过期的血红蛋白），人胎盘血血红蛋白，特别是由提取了干细胞后的人胎盘血等多种血液来源提取得到的相应血红蛋白。由于胎盘血的血红蛋白以HbF（α2γ2）为主，HbF氧亲和力高，可以携带更多的氧进入缺氧组织，而且胎盘血红细胞的含量高（比成人静脉血高出30~50%），可以分离到更多的血红蛋白，而免疫原性又远低于成人外周血。因此以人胎盘血红蛋白为原料提取的血红蛋白不仅更为理想，也是开发利用人胎盘血的一种有价值的途径。本发明上述制备方法的原料，优选该人胎盘血血红蛋白。

上述方法中所说的用于送入交联剂的钛棒滤芯，是目前已有报道和/或使用的主要用于粗过滤的产品，在医药领域中已有很多的报道和使用（如CN1813746，CN1965816，CN202349500U等）。特别是其钛合金材料比较稳定，耐酸碱等腐蚀，不会影响血红蛋白及其它反应试剂的活性。由于钛棒的表面上有许多密集的小孔，交联剂通过这些无数的小孔被送入血红蛋白原料溶液中，是保证其能以更加迅速和均匀的方式分散到血红蛋白溶液中的重要条件。在配合相应的搅拌条件，是实现本发明制备平均分子量较低、分子量分布较窄且有效转化率较高的聚合血红蛋白产物的重要保证。

以戊二醛等同型双功能交联剂通过聚合反应制备聚合血红蛋白，是目前的一种常用方法。由于该交联聚合反应的复杂和快速导致的分子量易过大和分布不均匀，是其实际应用中的重要制约因素，而本发明通过利用钛棒滤芯加入交联剂，并配合相应的搅拌，使交联剂能较迅速而均匀地在血红蛋白溶液中分散，特别是在不影响搅拌和安全的情况下尽量靠近钛棒滤芯的附近进行搅拌（如采用转子型磁力搅拌器等），并通过控制血红蛋白与交联剂的适当比例，以及适当的反应温度，可以将交联聚合反应的速度控制在可以接受的范围内，通过对如反应物的聚合程度等反应进程的监测，和/或在此基础上对反应时间的控制，可以在使所得的聚合血红蛋白产物平均分子量较小和有效转化率较高间，得到了满意的平衡，解决了目前制备方法周期长，步骤繁琐，成本高等问题。

在上述方法的基础上，可以进一步单独或任意组合方式采用的优选方式还可包括：

所述的血红蛋白原料溶液中无基质人脱氧血红蛋白的含量优选为4~8%。实验显示，原料溶液中的血红蛋白含量一般不宜过高，以避免在聚合反应过程中易形成平均分子量较高而转化率较低产品的倾向。但原料溶液中的血红蛋白浓度过低时，由于会相对提升溶液中的溶氧量，从而可能增加高铁血红蛋白产生的几率。

所述的交联聚合反应的温度优选为2~10℃；更好的反应温度为2~6℃。反应温度过低，例如温度低于0℃时，血红蛋白溶液可能会凝固，无疑会影响反应的进行。实验结果显示，反应温度过高，尽管聚合反应是在惰性气体保护的环境中，但仍会增大已混入反应溶液的氧使血红蛋白转变为高铁血红蛋白而失去活性的速度和比例而带来不利。

实验结果显示，达到所说分子量的产物，上述聚合反应的时间一般可为30~150分钟；更优选的聚合反应时间为60~90分钟。

如上述，在通过钛棒滤芯送入交联剂时，同时配合搅拌，通过使交联剂更均匀的分散，既可以控制反应速度，也有利于提高聚合产物分子量的均一性。因此，搅拌速度过慢无疑会减弱其应具有的这些有利作用。此外，血红蛋白是产物中具有生物学活性的重要和主要成分，为避免对其生物学活性造成过多不利影响（包括血红蛋白变性等），过高的搅拌速度同样是应尽量避免的。实验结果显示，所说送入交联剂和进行聚合反应时的搅拌速度，一般可优选为250-1000rpm；更好的搅拌速度可控制为500-750rpm。

聚合反应中的聚合血红蛋白产物达到所预期的分子量，聚合反应完成后，可以通过采用中国专利文献CN101200499A的方式加入硼氢化钠溶液（含1.56wt%硼氢化钠的0.001M/L的氢氧化钠溶液），或目前已有报道和/或使用的其它适当方式终止反应，然后按常规方式进行后续的进一步处理

实验表明，本发明上述方法可制备得到平均分子量较低且分子量分布较窄的100-210kD，特别是110kD-170kD的聚合血红蛋白产物，有效转化率可达到69.0%，而且该方法操作简单，是解决戊二醛制备聚合血红蛋白聚合产物不均一缺陷的一种有效方式。。

以下结合附图所示实施例的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。

附图说明

图1是不同含量浓度血红蛋白溶液原料对本发明制备方法影响的HPLC示意图。其中：1a为较低含量浓度时的HPLC图；1b为适中的含量浓度时的HPLC图；1c为较高含量浓度时的HPLC图。

图2是不同交联剂与血红蛋白摩尔比对本发明制备方法影响的HPLC示意图。其中：2a为较低摩尔比时的HPLC图；2b为适中摩尔比时的HPLC图；2c为较高摩尔比时的HPLC图。

图3是聚合血红蛋白的有效转化率随时间的变化曲线。

图4是原料无基质人胎盘血红蛋白与本发明产物的全波长扫描图谱对照图。其中：4a为原料血红蛋白的全波长扫描图谱；4b为聚合产物的全波长扫描图谱。

图5是原料无基质血红蛋白与本发明产物的圆二色谱对照图。其中：5a为无基质血红蛋白圆二色谱图；5b为聚合产物的圆二色谱图。

具体实施方式

实施例1

量取4℃的100ml游离浓度为5.5%的无基质人胎盘血红蛋白液体（生理盐水配制，以下同），加入到150ml的已经充满N₂的置于冰浴中的抽滤瓶中，通氮大约30min，使血红蛋白的处于脱氧状态；将装有血红蛋白的抽滤瓶放入置于磁力搅拌器上方，搅拌速度为750rpm，继续通氮20-25min，以通过钛棒的加样方式加入戊二醛，使得戊二醛与血红蛋白的摩尔比为5.5:1，30min取样，并加入一定量的NaBH₄溶液，待无气泡产生后，密封，放入4℃的冰箱内，待检测。结果如图1a所示。

图1是不同含量浓度血红蛋白溶液原料对本发明制备方法影响的HPLC示意图。其中，1a为较低含量浓度时的HPLC图；1b为适中的含量浓度时的HPLC图；1c为较高含量浓度时的HPLC图。对比这些图可以看出，随着血红蛋白浓度的不断提升，聚合血红蛋白的有效转化率和平均分子量在不断的提升。

图4是原料无基质人胎盘血红蛋白与本例聚合产物的全波长扫描图谱对照图。由原料血红蛋白的全波长扫描图谱4a与聚合产物的全波长扫描图谱4b对照可以看出，原料无基质人胎盘血红蛋白与聚合产物的全波长扫描出峰时间和出峰形状一致，因而可以判定聚合过程没有产生其他的物质。

图5是原料无基质血红蛋白与聚合产物的圆二色谱对照图。对照无基质血红蛋白圆二色谱图5a和聚合产物的圆二色谱图5b可以看出，原料无基质人胎盘血红蛋白与聚合产物的圆二色谱出峰时间和出峰形状一致，可以判定血红蛋白的二级结构在聚合过程没有被破坏。

实施例2

量取4℃的100ml游离浓度为6.0%的无基质人胎盘血红蛋白液体，加入到150ml的已经充满N₂的置于冰浴中的抽滤瓶中，通氮大约30min，使血红蛋白处于脱氧状态；将装有血红蛋白的抽滤瓶放置于磁力搅拌器上方，搅拌速度为600rpm，继续通氮20-25min，以通过钛棒加样的方式加入戊二醛，使得戊二醛与血红蛋白的摩尔比为6.5:1，90min取样，并加入一定量的NaBH₄溶液，待无气泡产生后，密封，放入4℃的冰箱内，待检测。结果见图2c所示。

图2是不同交联剂与血红蛋白摩尔比对本发明制备方法影响的HPLC示意图。其中，2a为较低摩尔比时的HPLC图；2b为适中摩尔比时的HPLC图；2c为较高摩尔比时的HPLC图。对比这些图可以看出，随着血红蛋白浓度的不断提升，聚合血红蛋白的有效转化率和平均分子量在不断的提升。

实施例3

量取4℃的100ml游离浓度为6.0%的无基质人胎盘血红蛋白溶液，加入到150ml的已经充满N₂的置于6℃的抽滤瓶中，通氮大约30min，使血红蛋白的处于脱氧状态；将装有血红蛋白的抽滤瓶放入置于磁力搅拌器上方，搅拌速度为500rpm，继续通氮20-25min，以通过钛棒加样的方式加入戊二醛，使得戊二醛与血红蛋白的摩尔比为6.0:1，60min取样，并加入一定量的NaBH₄溶液，待无气泡产生后，密封，放入4℃的冰箱内，待检测。结果同图2b所示一致。

实施例4

量取4℃的100ml游离浓度为6.0%的无基质人胎盘血红蛋白溶液，加入到150ml的已经充满N₂的置于2℃的抽滤瓶中，通氮大约30min，使血红蛋白的处于脱氧状态；将装有血红蛋白的抽滤瓶放入置于磁力搅拌器上方，搅拌速度为600rpm，继续通氮20-25min，以通过钛棒加样的方式加入戊二醛，使得戊二醛与血红蛋白的摩尔比为6.5:1，分别在30min、60min、90min、120min时取样，并加入一定量的NaBH₄溶液，待无气泡产生后，密封，放入4℃的冰箱内，检测有效转化率。结果如图3所示。

图3是聚合血红蛋白的有效转化率随时间的变化曲线。图中清楚显示，30min与60min相比，聚合血红蛋白的有效转化率有显著性提升，且差异有统计学意义；但是60min、90min、120min的差异则无统计学意义，提示60min后再延长时间已无更大实际意义，因此将有效转化的聚合时间一般确定为60min即可。

实施例5

量取4℃的100ml游离浓度为6.0%的无基质成人外周血血红蛋白溶液，加入到150ml的已经充满N₂的置于6℃的抽滤瓶中，通氮大约30min，使血红蛋白的处于脱氧状态；将装有血红蛋白的抽滤瓶放入置于磁力搅拌器上方，搅拌速度为700rpm，继续通氮20-25min，以通过钛棒加样的方式加入戊二醛，使得戊二醛与血红蛋白的摩尔比为5.5：1，在60min时取样，并加入一定量的NaBH₄溶液，待无气泡产生后，密封，放入4℃的冰箱内，检测分子量分布。结果与图2b所示一致。

Claims

1.改进的聚合血红蛋白制备方法，其特征是以无基质人脱氧血红蛋白的重量/体积含量为4~14%的血红蛋白溶液为原料，优选为以生理盐水与无基质人脱氧血红蛋白配制成的血红蛋白液体为原料，在惰性气体环境和搅拌条件下，经钛棒滤芯将醛基型双功能交联剂送入原料溶液，在0℃~10℃进行聚合反应，制备得到平均分子量为100-210kD，优选分子量为110-170kD的聚合血红蛋白，原料溶液中的血红蛋白与醛基型双功能交联剂的摩尔比为4~8:1，所说的醛基型双功能交联剂优选戊二醛。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是所说血红蛋白原料溶液中无基质人脱氧血红蛋白的含量为4~8%。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征是所说的血红蛋白与醛基型双功能交联剂的摩尔比为5~7:1。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征是所说的反应温度为2~10℃。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征是所说的反应温度为2~6℃。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征是所说的聚合反应时间为30~150分钟。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征是所说的聚合反应时间为60~90分钟。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征是所说送入交联剂并进行聚合反应的搅拌速度为250-1000rpm。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征是所说的搅拌速度为500-750rpm。

10.如权利要求1至9之一所述的制备方法，其特征是所说的聚合反应完成后，以加入硼氢化钠溶液方式终止反应。