CN113604461A - 固定化酶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种固定化酶及其制备方法和应用，该固定化酶包括：水凝胶中空纤维管，所述水凝胶中空纤维管具有纤维网状的管壁和所述管壁围合形成的管腔；以及酶，其中，所述酶固定于所述水凝胶中空纤维管的管壁内。利用同轴打印技术，实现将酶固定于水凝胶中空纤维管中，回收简单方便，扩展了固定化酶的应用范围，且能够有效提高酶与底物的结合，提高酶的反应效率。该固定化酶可广泛用于化妆品、食品、环保和医药等领域，具有广泛应用前景。

Description

固定化酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于酶固定技术领域，具体涉及一种固定化酶，以及该固定化酶的制备方法，还涉及该固定化酶的应用。

背景技术

酶是一类具有高效性、专一性等特点的生物催化剂，通常在常温、常压等温和条件下发挥催化作用。然而酶离开其特定环境后，稳定性较差，很难重复利用，而这些应用中的问题可通过酶固定化技术来克服。

酶固定化技术是指将游离酶束缚在一定空间或不溶性载体上，进而限制游离酶的自由流动，使其长时间发挥催化作用并可回收利用的生物技术。酶固定后,与固定基质间相互作用可能会改变酶催化活性中心以外的空间结构,由此改善酶在强pH、高温或有机溶剂中的稳定性,同时还可以从酶反应体系中分离目标产物。这样,固定化酶可通过简单的机械分离或离心被移除，从而不再需要使用复杂的透析等产物分离技术。总之，酶固定化最大优势在于可产生一种新的酶系统，该系统可在连续催化反应循环中重复使用，降低生产成本。由于固定化酶的一系列优势，现已广泛应用于医药、食品、水处理等产业领域。

目前固定化酶技术主要包含：吸附法、包埋法、交联法和共价结合法。其中，吸附法主要基于物理吸附，酶与底物反应过程中，酶容易脱落。交联法和共价结合法主要基于化学键固定，固定后酶的空间构象发生改变从而导致活性中心不能暴露，影响酶与底物结合。目前基于凝胶微球包埋技术固定化的酶稳定性较高，活性也较高。然而，若凝胶微球尺寸比较小，进行酶回收时则比较繁琐，若凝胶微球尺寸比较大，中心处的酶无法与底物结合，此外还会出现底物抑制效应，从而影响酶反应效率。此外，传统的包埋法还存在只有小分子底物和产物可以通过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是大分子的酶并不适合，从而限制了固定化酶的应用范围。

发明内容

有鉴于此，本发明有必要提供一种固定化酶及其制备方法和应用，该固定化酶将酶固定在水凝胶中空纤维管的管壁内，回收简单方便，可用于大分子底物和产物的扩散，能够有效提高酶与底物的结合，从而提高酶的反应效率。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明首先提供了一种固定化酶，包括：

水凝胶中空纤维管，所述水凝胶中空纤维管具有纤维网状的管壁和所述管壁围合形成的管腔；

以及酶，其中，所述酶包埋固定于所述水凝胶中空纤维管的管壁内。

进一步的，所述中空纤维管的材质选自海藻酸钠水凝胶、壳聚糖水凝胶中的至少一种。

进一步的，所述酶选自胰蛋白酶、果胶酶、糖苷酶、碱性蛋白酶中的至少一种。

本发明进一步提供了一种固定化酶的制备方法，包括下列步骤：

提供第一溶液和第二溶液，其中，第一溶液为交联剂溶液，第二溶液为聚合物和酶的混合溶液；

将所述第一溶液引为内鞘流，所述第二溶液引为外鞘流，进行同轴打印，制得酶固定在水凝胶中空纤维管管壁内的固定化酶。

进一步的，所述第一溶液中，所述交联剂选自氯化钙，所述氯化钙的浓度为1％-3％(w/v)；

所述第二溶液中，所述聚合物选自海藻酸钠，所述海藻酸钠的浓度为1％-3％(w/v)，所述酶的浓度为0.05-10mg/mL。

进一步的，所述第一溶液为交联剂和惰性增稠剂的混合溶液。

进一步的，所述第一溶液中，所述惰性增稠剂的浓度为1-20％。

进一步的，所述第一溶液的流速为1-3mL/min，所述第二溶液的流速为1-3mL/min。

本发明还提供了如前述任一项所述的固定化酶在化妆品中的应用。

本发明进一步提供了一种抗氧化活性肽的制备方法，包括下列步骤：

提供海藻蛋白粗提液；

向所述海藻蛋白粗提液中加入如前述所述的固定化酶，震荡酶解后，取出所述固定化酶，制得海藻蛋白多肽，其中，所述固定化酶为海藻酸钠水凝胶中空纤维管固定化的胰蛋白酶。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明中所述的固定化酶，将酶固定在水凝胶中空纤维管的管壁内，具有较高的比表面，能有效提高酶与底物的结合，从而提高酶与底物的反应效率；酶在中空纤维的包裹下，酶的稳定性比游离状态下明显提高。且中空纤维管状结构的存在能够在不影响酶活的情况下制成大尺寸的水凝胶结构，从而便利酶催化后的回收，不需要繁琐的手段。

本发明利用同轴打印技术进行固定化酶的制备，从而顺利将酶包埋固定在水凝胶中空纤维管的管壁内，且制备方法简单，自动化程度高，能够大批量生产，可有效实现大规模产业化。

附图说明

图1为本发明一较佳实施例中制备固定化酶的同轴打印系统结构示意图；

图2为本发明实施例1和对比例1中的绝对酶活的测试结果对比图。

图中：10-第一注射装置；

20-第二注射装置；

30-同轴针筒、31-内针筒、32-外针筒；

40-同轴针头、41-内针头、42-外针头。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将结合具体的实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明第一方面提供了一种固定化酶，包括：

水凝胶中空纤维管，所述水凝胶中空纤维管具有纤维网状的管壁和所述管壁围合形成的管腔；

以及酶，其中，所述酶包埋固定于所述水凝胶中空纤维管的管壁内。

本发明固定化酶通过将酶包埋固定在水凝胶中空纤维管的管壁内，该水凝胶中空纤维管的尺寸可达100-5000μm，回收简单方法，回收时直接将包埋酶的水凝胶结构取出即可，且适用于大分子底物和产物的扩散，扩展了固定化酶的应用范围。由于具有较高的比表面且内侧中空结构，能够有效提高酶与底物的接触，从而提高酶与底物的反应效率，并且在水凝胶的包裹下，酶的稳定性比游离状态下明显提高。

进一步方案，本发明中水凝胶中空纤维管的材质没有特殊的限制，任意通过交联形成的水凝胶结构材料均可，可以是海藻酸钠水凝胶或含有其的复合材料，也可以是壳聚糖水凝胶或含有其的复合材料，优选的，本发明中所述的水凝胶中空纤维管的材质选自海藻酸钠水凝胶、壳聚糖水凝胶中的至少一种，更优选的，在本发明的一个或多个实施例中，所述水凝胶中空纤维管材质为海藻酸钠。

进一步方案，本发明中采用的酶没有特殊的限制，可以是本领域中任意的酸性酶、中性酶或碱性酶，具体实例包括但不限于胰蛋白酶、果胶酶、糖苷酶、碱性蛋白酶，在本发明的一个或多个实施例中，所述酶选自胰蛋白酶。

本发明第二方面提供了一种固定化酶的制备方法，包括下列步骤：

提供第一溶液和第二溶液，其中，第一溶液为交联剂溶液，第二溶液为聚合物和酶的混合溶液；

将所述第一溶液引为内鞘流，所述第二溶液引为外鞘流，进行同轴打印，制得酶固定在水凝胶中空纤维管管壁内的固定化酶。

本发明基于同轴打印技术实现了固定化酶的制备方法，该制备方法能够顺利将酶包埋在水凝胶中空纤维管的管壁内，且制备手段简单，自动化程度高，能够大批量生产，从而有效实现产业化规模。可以理解的是，本发明采用的同轴打印技术没有特别的限定，本领域中常规的同轴打印系统均可用于本发明的制备方法中，图1中示出了本发明一个或多个实施例中采用的同轴打印系统，如图1中所示的，其包括第一注射装置10、第二注射装置20、同轴针筒30和同轴针头40，其中，第一注射装置10和第二注射装置20均为注射泵，分别用于将第一溶液和第二溶液注射引流至指定位置。进一步的，同轴针筒30由内针筒31和外针筒32组成，该外针筒32设于内针筒31的外侧，且外针筒32与内针筒31同轴，在内针筒31的内部形成内鞘流，在外针筒32和内针筒31之间形成外鞘流；同轴针头40由内针头41和外针头42组成，外针头42设于内针头41的外侧，其外针头42与内针头41同轴，其中，外针头42与外针筒32连通，内针头41与内针筒31连通。在本发明的一个或多个实施例中，如图1所示的，将第一注射装置10与内针筒31的输入端通过管道连通，将第一溶液引为内鞘流，将第二注射装置20与外针筒32的输入端通过管道连通，将第二溶液引为外鞘流，将同轴针筒30的输出端连通同轴针头40，在同轴针筒30和同轴针头40内，第一溶液和第二溶液相互不接触，当第一溶液和第二溶液从同轴针头40流出时，两者接触的瞬间，两种溶液反应形成中空纤维管状的水凝胶，同时将酶包埋固定在中空纤维管的管壁中，实现了酶的固定化。可以理解的是，图1中的同轴打印系统仅为了使得本发明的技术方案更加清楚做出的示例，其他能够实现同样效果的同轴打印系统均可用于本发明固定化酶的制备中，这里不再具体阐述。本发明中的制备方法除了能高效快速进行酶固定以外，还可以包埋能够表达酶的细菌和真菌，包埋固定后，这些细菌和真菌能够源源不断的表达酶，对后续的应用产生便利，并且能够进一步提高酶活及其稳定性。

进一步方案，本文中所述的“交联剂”指的是能够引发聚合物交联形成水凝胶材料的助剂，具体可提及的实例包括但不限于氯化钙、氯化钡等，优选的，本发明中的交联剂采用本领域中较常使用的氯化钙；本文中所述的“聚合物”指的是任意能够在交联剂作用下交联形成水凝胶材料的单体，根据最终水凝胶材料的不同进行选择，具体可提及的实例包括但不限于海藻酸钠或含有其的复合物、壳聚糖或含有其的复合物，优选的，本发明中的聚合物采用海藻酸钠或壳聚糖。本发明中第一溶液中交联剂的浓度，以及第二溶液中聚合物和酶的浓度可以根据需要进行调整，故没有特殊的限制，通过调整浓度实现水凝胶中空纤维管尺寸、固定酶的包埋量的调整，在本发明的一个或多个实施例中，所述第一溶液中，交联剂的浓度为1％-3％(w/v)；

所述第二溶液中，所述聚合物的浓度为1％-3％(w/v)，所述酶的浓度为0.05-10mg/mL。

进一步方案，本发明中水凝胶中空纤维管成型可以通过控制第一溶液和第二溶液的流速实现，此外，为了提高操作性，在本发明的一个或多个实施例中，所述第一溶液为氯化钙和惰性增稠剂的混合溶液，这里所述的“惰性增稠剂”指的是能够增加溶液粘稠度且不会与交联剂、聚合物发生反应的惰性成分，比如说甘油、PEG、普朗尼克等，该惰性成分不参与反应，仅在打印过程中起到支撑作用，调整液体的粘稠度，提高制备过程的可操作性，后期在冰箱中放置一段时间后即会自动流出。在本发明的一个或多个实施例中，第一溶液中添加普朗尼克作为惰性材料。

进一步方案，所述第一溶液中，所述惰性增稠剂的质量浓度为1-20％。

进一步方案，本发明中的流速没有特殊的限制，可根据需要进行调整，通过对流速进行调整，从而制备处中空纤维管状水凝胶，优选的，第一溶液的流速为1-3mL/min，第二溶液的流速为1-3mL/min；在本发明的一个或多个实施例中，所述第一溶液的流速为2mL/min，所述第二溶液的流速为1mL/min。

本发明第三方面提供了如本发明第一方面任一项所述的固定化酶在制备化妆品中的应用，可以理解的是，本发明中所述的固定化酶除了可以应用于化妆品中，还可以根据实际需求选择固定不同的酶后应用于食品、轻工、医药、化工、分析、环保、能源和科学研究等领域。

本发明第四方面提供了一种抗氧化活性肽的制备方法，包括下列步骤：

提供海藻蛋白粗提液；

向所述海藻蛋白粗提液中加入如本发明第一方面所述的固定化酶，震荡酶解后，取出所述固定化酶，制得海藻蛋白多肽，其中，所述固定化酶为海藻酸钠水凝胶中空纤维管固定化的胰蛋白酶。

上述步骤中，海藻蛋白粗提液的获得没有特殊的限制，可以采用本领域中常规的粗提手段，比如在本发明的一个或多个实施例中，称取适量的海藻干粉，用蒸馏水在4℃环境下浸泡3天，反复冻融后，离心，取上清即获得海藻蛋白粗提液。此外，在制得海藻蛋白肽的步骤中，震荡酶解的参数没有特殊的限制，可根据海藻蛋白粗提液的量进行调整，在本发明的一个或多个实施例中，于37℃震荡酶解24h。

海洋藻类是一种含量丰富、分布广泛的天然资源，富含多种微量元素、糖类和蛋白质。海洋藻类提取物有助于修复受损肌肤细胞，具有皮肤保湿滋润、修护再生、镇静舒缓、柔嫩平滑等功效，使皮肤重回健康平衡状态；此外，还能在皮肤外表形成一层隔离膜，加强皮肤本身的防御系统，抵御紫外线伤害。通过将中空纤维水凝胶固定化酶应用于海藻蛋白多肽的制备，实现对藻类的深层处理，从而显著提高了藻类蛋白的利用与吸收。

下面结合具体的实施例对本发明的技术方案进行进一步清楚完整的说明。

实施例1

提供第一溶液和第二溶液

配置氯化钙浓度为3％(w/v)的第一溶液，配置海藻酸钠浓度为3％(w/v)、胰蛋白酶浓度为1mg/mL的第二溶液。

固定化酶的制备

采用图1中所示的同轴打印系统，将第一溶液引为内鞘流且流速为2mL/min，第二溶液引为外鞘流且流速为1mL/min，进行同轴打印，制得酶固定在水凝胶中空纤维管管壁内的固定化酶。

应用实施例1

获得海藻蛋白粗提液

称取适量的海藻干粉，用蒸馏水在4℃环境下浸泡3天，反复冻融后，离心，取上清得到海藻蛋白粗提液。

海藻蛋白多肽的制备

取海藻蛋白粗提液放入三角烧瓶中，加入实施例1中制得的固定化胰蛋白酶，震荡酶解24小时(37℃)，取出固定化的胰蛋白酶后，即获得海藻蛋白多肽。

对比例

本对比例采用本领域中常规的胶珠包埋法获得固定化酶，其制备方法可参见《海藻酸钠固定化果胶酶的研究》，原料组成均与实施例1相同。

测试实施例1和对比例1中的绝对酶活，其结果如图2中所示的，可以看出，实施例1中的的固定化酶的绝对酶活明显高于对比例。

酶活的具体测试方法如下：

(1)试剂配制:

①1mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0):称取三经甲基氨基甲烧(Tris)121.14g,溶于900mL水中,用浓盐酸调pH值到8.0,加水用容量瓶定容至1L,4℃保存,用时稀释20倍,制成pH8.0、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液。

②BApNA底物溶液:称取0.0435g溶于10mL二甲基亚砜,4℃保存。

③10％三氯乙酸:10g三氯乙酸,溶于100mL去离子水,4℃保存

(2)测定步骤:

①将50微升酶液溶入1850微升缓冲液中,混合均勾,并在37摄氏度下预热2min。

②向上述混合液中加入100微升底物(20mmol/L),在37℃下反应20min；

③反应时间结束,向反应体系中加入200微升三氯乙酸(10％)终止反应,对照管为预先加入三氯乙酸(10％)破坏了酶活力的反应体系。

④反应液冷却至室温,在波长为410nm的条件下测定其光吸收值。

每个样品设一个对照,三个平行样。将每秒钟转换1微摩尔底物BApNA所需的酶量定义为1个酶活力单位。

实施例2

提供第一溶液和第二溶液

配置氯化钙浓度为3％(w/v)、普朗尼克含量为5％的第一溶液，配置海藻酸钠浓度为3％(w/v)、胰蛋白酶浓度为10mg/mL的第二溶液。

固定化酶的制备

采用图1中所示的同轴打印系统，将第一溶液引为内鞘流且流速为3mL/min，第二溶液引为外鞘流且流速为3mL/min，进行同轴打印，制得酶固定在水凝胶中空纤维管管壁内的固定化酶。

实施例3

提供第一溶液和第二溶液

配置氯化钙浓度为2％(w/v)、普朗尼克含量为10％的第一溶液，配置海藻酸钠浓度为2％(w/v)、胰蛋白酶浓度为5mg/mL的第二溶液。

固定化酶的制备

采用图1中所示的同轴打印系统，将第一溶液引为内鞘流且流速为1mL/min，第二溶液引为外鞘流且流速为1mL/min，进行同轴打印，制得酶固定在水凝胶中空纤维管管壁内的固定化酶。

实施例4

提供第一溶液和第二溶液

配置氯化钙浓度为1％(w/v)、普朗尼克含量为10％的第一溶液，配置海藻酸钠浓度为3％(w/v)、胰蛋白酶浓度为0.05mg/mL的第二溶液。

固定化酶的制备

采用图1中所示的同轴打印系统，将第一溶液引为内鞘流且流速为2mL/min，第二溶液引为外鞘流且流速为2mL/min，进行同轴打印，制得酶固定在水凝胶中空纤维管管壁内的固定化酶。

实施例5

提供第一溶液和第二溶液

配置氯化钡浓度为2％(w/v)、普朗尼克含量为5％的第一溶液，配置海藻酸钠浓度为3％(w/v)、胰蛋白酶浓度为4mg/mL的第二溶液。

固定化酶的制备

采用图1中所示的同轴打印系统，将第一溶液引为内鞘流且流速为3mL/min，第二溶液引为外鞘流且流速为3mL/min，进行同轴打印，制得酶固定在水凝胶中空纤维管管壁内的固定化酶。

实施例6

提供第一溶液和第二溶液

配置氯化钡浓度为2％(w/v)、甘油含量为20％的第一溶液，配置海藻酸钠浓度为3％(w/v)、胰蛋白酶浓度为3mg/mL的第二溶液。

固定化酶的制备

采用图1中所示的同轴打印系统，将第一溶液引为内鞘流且流速为3mL/min，第二溶液引为外鞘流且流速为2mL/min，进行同轴打印，制得酶固定在水凝胶中空纤维管管壁内的固定化酶。

实施例7

提供第一溶液和第二溶液

配置氯化钙浓度为2％(w/v)、甘油含量为20％的第一溶液，配置海藻酸钠浓度为3％(w/v)、糖苷酶浓度为1mg/mL的第二溶液。

固定化酶的制备

采用图1中所示的同轴打印系统，将第一溶液引为内鞘流且流速为3mL/min，第二溶液引为外鞘流且流速为2mL/min，进行同轴打印，制得酶固定在水凝胶中空纤维管管壁内的固定化酶。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种固定化酶，其特征在于，包括：

水凝胶中空纤维管，所述水凝胶中空纤维管具有纤维网状的管壁和所述管壁围合形成的管腔；

以及酶，其中，所述酶包埋固定于所述水凝胶中空纤维管的管壁内。

2.如权利要求1所述的固定化酶，其特征在于，所述水凝胶中空纤维管的材质选自海藻酸钠水凝胶、壳聚糖水凝胶中的至少一种。

3.如权利要求1所述的固定化酶，其特征在于，所述酶选自胰蛋白酶、果胶酶、糖苷酶、碱性蛋白酶中的至少一种。

4.一种固定化酶的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

提供第一溶液和第二溶液，其中，第一溶液为交联剂溶液，第二溶液为聚合物和酶的混合溶液；

将所述第一溶液引为内鞘流，所述第二溶液引为外鞘流，进行同轴打印，制得酶固定在水凝胶中空纤维管管壁内的固定化酶。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一溶液中，所述交联剂选自氯化钙，所述氯化钙的浓度为1％-3％(w/v)；

所述第二溶液中，所述聚合物选自海藻酸钠，所述海藻酸钠的浓度为1％-3％(w/v)，所述酶的浓度为0.05-10mg/mL。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一溶液为交联剂和惰性增稠剂的混合溶液。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述第一溶液中，所述惰性增稠剂的质量浓度为1-20％。

8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一溶液的流速为1-3mL/min，所述第二溶液的流速为1-3mL/min。

9.如权利要求1-3任一项所述的固定化酶在化妆品中的应用。

10.一种抗氧化活性肽的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

提供海藻蛋白粗提液；

向所述海藻蛋白粗提液中加入如权利要求1所述的固定化酶，震荡酶解后，取出所述固定化酶，制得海藻蛋白多肽，其中，所述固定化酶为海藻酸钠水凝胶中空纤维管固定化的胰蛋白酶。

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