CN114716726A - 一种大孔丝素蛋白水凝胶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种大孔丝素蛋白水凝胶的制备方法，属于生物高分子材料技术领域。本发明通过冷冻光交联法制备丝素蛋白水凝胶，该方法能有效利用丝素蛋白自身氨基酸的交联反应，实现大孔结构的固定，无需引入额外的交联剂；并且制得的水凝胶具有较大的贯通孔结构和较强的抗压缩能力。同时，光交联反应速度快，可以在数分钟内完成交联，使用可见光不会对细胞或生物活性分子造成损伤。该水凝胶制备方法简单易行，适用于生物医学领域。

Description

一种大孔丝素蛋白水凝胶的制备方法
技术领域
本发明属于生物高分子材料技术领域，具体涉及一种具有贯通孔的大孔丝素蛋白水凝胶的制备方法。
背景技术
水凝胶是亲水性三维聚合物网络，在保持结构完整性的同时，能够吸收大量水。由于具有与细胞外基质相近的物理化学性质和良好的生物相容性，水凝胶自1960年开始作为生物材料用于医疗及生命科学研究，广泛用于组织工程、药物输送、可植入设备、生物传感器和生物纳米技术等领域。
蚕丝作为一种廉价易得的生物聚合物，在中国有着长期的使用历史，也是构建水凝胶体系的重要原料。蚕丝由提供承载能力的半结晶丝芯(即丝素蛋白)和起到胶粘剂作用的丝胶外层组成，其中家蚕丝素蛋白的分子结构包含轻链(26kDa)和重链(391kDa)，通过C端单个二硫键连接。丝素蛋白的机械性能与其重链嵌段共聚物的独特排列方式密切相关，其包含11个短的亲水区和12个疏水区，交替排列，疏水区形成致密的晶体结构，提供材料的高强度，亲水的无规则结构域使其具有抗拉伸能力。天然蚕丝在Na2CO3溶液中煮沸脱胶，并用溴化锂溶解后获得可溶的再生丝素蛋白溶液，该溶液可用于进一步加工成多种形态，例如纤维、薄膜或块状物等。再生丝素蛋白制品具有较低的免疫原性，良好的柔韧性和抗拉伸强度，可控的生物降解能力，且降解产物无细胞毒性。
制备丝素蛋白水凝胶，根据交联方法可分为物理交联和化学交联。
物理交联法通过氢键、离子键和疏水相互作用将聚合物网络连接在一起形成凝胶，丝素蛋白中的无规卷曲构象转变为稳定的β-折叠，疏水链段自组装形成稳定的凝胶。再生丝素蛋白溶液于室温下静置即可自组装形成水凝胶，但一般需要耗时21天以上。许多方法可以加速溶液-凝胶转变，包括但不限于涡旋、超声、温度、渗透应力、pH、CO2酸化、非溶剂诱导相分离等方法。中国专利(CN 109851819 B)采用1～200r/min的速度搅拌丝素蛋白溶液30～600s，搅拌后溶液注入模具5小时内即可形成凝胶。丝素蛋白溶液中加入阴离子表面活性剂或非离子表面活性剂，混合均匀后，对溶液施加一定的剪切力，即可在2h内形成凝胶态(中国专利CN106139257A)。中国专利(CN110172163B)采用超声处理，可保证丝素蛋白充分形成结晶完成物理交联。此类方法制备凝胶不引入外源物质，且反应条件温和，具有较好的生物相容性，受生成晶体的影响凝胶的机械性能较差。
化学交联法通过在聚合物链之间生成共价键使丝素蛋白溶液转变为凝胶。常用的交联剂包括：戊二醛、京尼平、碳二亚胺试剂等，也包括利用光引发剂实现的自由基聚合反应形成水凝胶。中国专利(CN 111110926 A)中4～6wt％丝素蛋白溶液与1wt％京尼平溶液以体积比(1～4)：1混合，成胶时间可控制在30s～5min。中国专利(CN 113604056 A)中明胶、海藻酸钠、丝素蛋白以2.5％、1％、1％(w/v)混合，加入1％质量分数1％体积分数的戊二醛，常温搅拌交联30分钟，透析24小时即可获得凝胶填充剂。中国专利(CN 113651974 A)在丝素蛋白与明胶混合溶液中加入一定量光引发体系，通过一定量的可见光辐照即可获得稳定的水凝胶。常用的光引发体系包括低氧化态过渡金属盐与过硫酸盐等。化学交联法制备水凝胶的交联速度明显高于物理交联法，且不产生大尺寸的晶体结构，可有效改善材料的力学性能，制备的水凝胶一般为光学透明，可适用于多种应用。但化学交联中使用的交联剂引发了对生物安全性的担忧，交联中使用的酶可能引发体内的免疫反应，而光交联中如果使用紫外线照射凝胶，可能会一定程度损害其中包埋的细胞的活性。
传统水凝胶通常孔径较小(纳米级)，而许多生物医学应用对水凝胶孔径具有特殊要求，比如，对于体外组织培养，小孔径会限制细胞运动、扩散以及营养物质和代谢废物的分子扩散。因此，水凝胶的孔隙结构控制以及具有大孔径贯通孔结构的水凝胶制备仍然是本领域的技术热点。目前已有多项公开专利与技术用于制备大孔水凝胶，传统的方法一般选择明胶微球、果糖微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球等作为致孔剂，这种方法将水凝胶前驱体注入致孔剂模板中，待凝胶形成后，浸泡于水/PBS溶液中除去致孔剂(中国发明专利CN113952508 A、CN 111978588 A)。中国发明专利(CN 109970998 A)提出一种以Pickering乳液法制备Gel-MA大孔水凝胶的方法，即水相中加入十二烷构成的油相，高速搅拌制备稳定均一的Pickering乳液，成胶后洗去作为模板的十二烷油滴即可获得大孔水凝胶。此类方案中致孔剂难以被完全去除，残留的致孔剂可能对细胞产生不利影响，且产生的部分大孔无法联通。中国发明专利(CN 12225937 A、CN 113896932 A)采用气泡致孔法，在制备凝胶的溶液中加入发泡剂或通入气体，由溶液中的气泡在凝胶过程中形成大孔，此方法产生的孔贯通性较差，且凝胶强度较低。
冷冻凝胶法不需要引入专门的制孔剂，而是利用溶剂冷冻形成的冰晶进行制孔。其原理是在低温条件下溶液中产生冰晶，冰晶生长最终相互连接，高分子链和单体被浓缩在冰晶间的微液相中，并在其中进行交联。在凝胶过程中冰晶充当致孔剂，产生高度互联的贯通大孔，无致孔剂残留。由于冷冻浓缩效应，凝胶孔壁致密且交联密度高，具有更优秀的力学性能，可以承受较大程度的拉伸和压缩而不被破坏，更易于制备孔径大、孔隙结构丰富的凝胶体系。同样的，有效、可控的交联过程仍然是冷冻凝胶构建的关键。
中国发明专利(CN 112759774 A)提及一种丝素蛋白-明胶复合冷冻凝胶的制备方法，利用自由基聚合反应制备凝胶，但需分别对明胶和丝素蛋白改性，再利用引入的丙烯酰胺等基团进行交联，操作繁琐，引入大量外源基团。非专利文献1(Han L,Li P,Tang P,etal.Mussel-inspired cryogels for promoting wound regeneration throughphotobiostimulation,modulating inflammatory responses and suppressingbacterial invasion[J].Nanoscale,2019,11(34):15846-15861)中提及一种丝素蛋白-壳聚糖复合冷冻凝胶支架的制备方法，在丝素蛋白和壳聚糖的混合溶液中加入戊二醛，-20℃冷冻24小时即可获得冷冻凝胶；但非专利文献2(Wang B,Yang C.Purified silk fibroin-L-asparaginase bioconjugates show increased thermostability and resistance totrypsin digestion[J].Engineering in Life Sciences,2011,11(1):44-51)发现凝胶交联中戊二醛用量影响偶联在凝胶中的L-天冬酰胺酶的活性，且戊二醛具有较强的细胞毒性，引发生物安全方面的担忧。
综上，着眼于生物医学工程领域对于结构稳定、生物相容性好、易于加工的超大孔丝素蛋白水凝胶材料的需求，本发明希望发展一种无需制孔剂、无需交联剂、且过程可调控的大孔丝素蛋白构建方法。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的主要目的是提供一种冷冻条件下利用光引发催化蛋白质酪氨酸间双酚交联的大孔丝素蛋白水凝胶制备方法。该光氧化交联法可有效利用丝素蛋白自身氨基酸的交联反应实现大孔结构的固定，无需引入额外的交联剂。同时，由于所采用的光引发条件可与冷冻过程进行有效适配，过程可控，且可在数分钟内完成交联，具有交联速度快的特点。所获得的水凝胶具有贯通大孔，平均孔径可达到70～90μm。
本发明的技术方案如下：
一种大孔丝素蛋白水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：使用去离子水溶解再生丝素蛋白，离心取上清液，获得再生丝素蛋白溶液。
步骤2：在再生丝素蛋白溶液中加入光催化剂和引发剂，混合均匀。
步骤3：将步骤2混合后的再生丝素蛋白溶液降温冷冻，形成稳定的冰晶和丝素蛋白的混合物。
步骤4：使用光照射步骤3中获得的稳定混合物，进行交联，获得稳定的水凝胶；光照后，水凝胶在避光条件下升温融化，并用去离子水清洗水凝胶，得到大孔丝素蛋白水凝胶。
进一步的，步骤1中，去离子水溶解再生丝素蛋白的终浓度为50～200mg/ml。
进一步的，步骤1中，离心具体过程为：使用离心机以3000～7000r/min，离心2～10min，去除不溶沉淀，取上清液使用。
进一步的，步骤2中加入的光催化剂为氯化三(2,2’-联吡啶)钌(Ⅱ)六水合物(Ru(bpy)3Cl2·6H2O)。光催化剂浓度为1～4mM Ru(bpy)3 2+/100mg丝素蛋白。
进一步的，步骤2中所述的引发剂为过硫酸盐，包括过硫酸铵((NH4)2S2O8)、过硫酸钠(Na2S2O8)和过硫酸钾(K2S2O8)中的一种或两种以上混合。
进一步的，步骤2中，所述过硫酸盐浓度为10～80mM S2O8 2-/100mg丝素蛋白。
进一步的，步骤3中，冷冻温度为-10～-20℃，冷冻时间大于2h。
进一步的，步骤4中，使用的光源为含有452nm波长光的一切光源，包括但不限于：白炽灯、白光灯、蓝光LED灯珠等中的一种或两种以上组合；光源距离凝胶5～20cm，照射时间为3～20min。
进一步的，步骤4光照过程中冷冻溶液保存在与步骤3中相同温度的环境中，防止冰晶融化。
本发明的有益效果：
1.本发明提供一种新型大孔丝素蛋白水凝胶的制备方法，利用冷冻过程中产生的冰晶形成贯通大孔，具有较好的生物相容性。冷冻过程中丝素蛋白被浓缩，产生的凝胶壁更加致密，具有较强的抗压缩能力。
2.本发明使用光交联法制备水凝胶，光交联反应速度较快可以在数分钟内完成交联。
3.本发明利用丝素蛋白氨基酸侧链中的酚羟基互相交联，凝胶网络中不引入任何非丝素蛋白分子，提高材料的生物相容性，且本方法中使用的催化剂和引发剂在应用的浓度范围内均未表现出细胞毒性。
4.本方法制备简单，易于规模放大。
附图说明
图1为本发明实施例1的扫描电镜照片。
图2为本发明实施例2的扫描电镜照片。
图3为本发明实施例3的扫描电镜照片。
图4为本发明对比例3和对比例5的照片；其中，(a)为对比例3，(b)为对比例5。
图5为本发明实施例2、4与对比例1、2、4的扫描电镜照片；其中，(a)为实施例2，(b)为实施例4，(c)为对比例1，(d)为对比例2，(e)为对比例4。
图6为本发明实施例1、2与对比例4的应力-应变曲线图和压缩模量；其中，(a)为应力-应变曲线，(b)为压缩模量。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，所述实施例仅用于比较和解释的目的，本发明不限定于这些实施例中。需说明，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
将再生丝素蛋白溶解在去离子水中至终浓度为200mg/ml，以5000r/min的转速离心5min后取上清液使用；再加入Ru(bpy)3Cl2·6H2O至Ru(bpy)3 2+终浓度为4mM，加入(NH4)2S2O8至S2O8 2-终浓度为80mM。将混合后的再生丝素蛋白溶液置于-20℃下冷冻12h；然后使用100W白光灯照射冷冻溶液10min，光源距冷冻溶液10cm。光照后，凝胶在避光条件下升温溶解冰晶，使用去离子水清洗凝胶24h，得到大孔丝素蛋白水凝胶。
实施例2
将再生丝素蛋白溶解在去离子水中至终浓度为100mg/ml，以5000r/min的转速离心5min后取上清液使用；再加入Ru(bpy)3Cl2·6H2O至Ru(bpy)3 2+终浓度为2mM，加入Na2S2O8至S2O8 2-终浓度为40mM。将混合后的再生丝素蛋白溶液置于-20℃下冷冻12h；然后使用100W白光灯照射冷冻溶液10min，光源距冷冻溶液10cm。光照后，凝胶在避光条件下升温溶解冰晶，使用去离子水清洗凝胶24h，得到大孔丝素蛋白水凝胶。
实施例3
将再生丝素蛋白溶解在去离子水中至终浓度为50mg/ml，以5000r/min的转速离心5min后取上清液使用；再加入Ru(bpy)3Cl2·6H2O至Ru(bpy)3 2+终浓度为1mM，加入(NH4)2S2O8至S2O8 2-终浓度为20mM。将混合后的再生丝素蛋白溶液置于-20℃下冷冻12h；然后使用100W白光灯照射冷冻溶液10min，光源距冷冻溶液10cm。光照后，凝胶在避光条件下升温溶解冰晶，使用去离子水清洗凝胶24h，得到大孔丝素蛋白水凝胶。
实施例4
将再生丝素蛋白溶解在去离子水中至终浓度为100mg/ml，以5000r/min的转速离心5min后取上清液使用；再加入Ru(bpy)3Cl2·6H2O至Ru(bpy)3 2+终浓度为2mM，加入(NH4)2S2O8至S2O8 2-终浓度为40mM。将混合后的再生丝素蛋白溶液置于-10℃下冷冻12h；然后使用100W白光灯照射冷冻溶液10min，光源距冷冻溶液10cm。光照后，凝胶在避光条件下升温溶解冰晶，使用去离子水清洗凝胶24h，得到大孔丝素蛋白水凝胶。
对比例1
将再生丝素蛋白溶解在去离子水中至终浓度为100mg/ml，以5000r/min的转速离心5min后取上清液使用；再加入Ru(bpy)3Cl2·6H2O至Ru(bpy)3 2+终浓度为2mM，加入(NH4)2S2O8至S2O8 2-终浓度为40mM。将混合后的再生丝素蛋白溶液置于-25℃下冷冻12h；然后使用100W白光灯照射冷冻溶液10min，光源距冷冻溶液10cm。光照后，凝胶在避光条件下升温溶解冰晶，使用去离子水清洗凝胶24h，得到大孔丝素蛋白水凝胶。
对比例2
将再生丝素蛋白溶解在去离子水中至终浓度为100mg/ml，以5000r/min的转速离心5min后取上清液使用；再加入Ru(bpy)3Cl2·6H2O至Ru(bpy)3 2+终浓度为2mM，加入(NH4)2S2O8至S2O8 2-终浓度为40mM。将混合后的再生丝素蛋白溶液置于-30℃下冷冻12h；然后使用100W白光灯照射冷冻溶液10min，光源距冷冻溶液10cm。光照后，凝胶在避光条件下升温溶解冰晶，使用去离子水清洗凝胶24h，得到大孔丝素蛋白水凝胶。
对比例3
将再生丝素蛋白溶解在去离子水中至终浓度为30mg/ml，以5000r/min的转速离心5min后取上清液使用；再加入Ru(bpy)3Cl2·6H2O至Ru(bpy)3 2+终浓度为0.6mM，加入(NH4)2S2O8至S2O8 2-终浓度为12mM。将混合后的再生丝素蛋白溶液置于-20℃下冷冻12h；然后使用100W白光灯照射溶液10min，光源距丝素蛋白溶液10cm。光照后，凝胶在避光条件下升温溶解冰晶，使用去离子水清洗凝胶24h，得到大孔丝素蛋白水凝胶。
对比例4
将再生丝素蛋白溶解在去离子水中至终浓度为100mg/ml，以5000r/min的转速离心5min后取上清液使用；再加入Ru(bpy)3Cl2·6H2O至Ru(bpy)3 2+终浓度为2mM，加入(NH4)2S2O8至S2O8 2-终浓度为40mM。使用100W白光灯照射混合后的再生丝素蛋白溶液10min，光源距丝素蛋白溶液10cm；光照后凝胶在避光条件下升温溶解冰晶，使用去离子水清洗凝胶24h，得到大孔丝素蛋白水凝胶。
对比例5
取一定量再生丝素蛋白，并按300mg再生丝素蛋白/1ml去离子水，加去离子水溶解，以5000r/min的转速离心5min。
根据图1-3显示，当丝素蛋白浓度为50-200mg/ml时均能形成具有清晰大孔结构的丝素蛋白水凝胶，但当溶解时投入的再生丝素蛋白量进一步增加，如图4(b)所示的对比例5，丝素蛋白无法完全溶解。当丝素蛋白浓度进一步降低，如图4(a)所示的对比例3，光照后无法形成有固定形状的凝胶。故丝素蛋白凝胶制备过程中，丝素蛋白浓度应为50-200mg/ml。
根据图5(a)、图5(b)显示，当反应溶液冷冻温度为-10～-20℃时反应可以进行，如实施例2、4，生成有清晰孔结构的大孔水凝胶，孔径可达数十微米。但冷冻温度低于-20℃时，如5(c)、5(d)所示的对比例1、2，交联反应无法进行，产物无明显结构。若不对反应溶液加以冷冻，直接进行光照，如5(e)所示的对比例4，凝胶无大孔，只有数十纳米的小孔结构。
根据图6(b)显示，对比例4相比实施例1与实施例2具有更高的压缩模量，约48kpa，但抗压缩能力较差，如图6(a)显示对比例4受压缩形变接近60％时材料破碎。实施例1与实施例2压缩模量均小于10kpa，远小于对比例4，表明本发明中制备的冷冻凝胶较为柔软，随着丝素蛋白浓度增加材料的压缩模量也同步增加。该冷冻凝胶具有较强的抗压缩能力，如图6(a)所示实施例1与实施例2在受压缩超过80％时依然能够保持结构完整。
Figure BDA0003582093270000111

Claims (10)

1.一种大孔丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将再生丝素蛋白溶解在去离子水中至终浓度为50～200mg/ml；离心取上清液，获得再生丝素蛋白溶液；
步骤2：在再生丝素蛋白溶液中加入光催化剂和引发剂，混合均匀；所述的光催化剂为Ru(bpy)3Cl2·6H2O；所述的引发剂为过硫酸盐；
步骤3：将步骤2混合后的再生丝素蛋白溶液降温冷冻，形成稳定的冰晶和丝素蛋白的混合物；
步骤4：使用光照射步骤3中获得的混合物，进行交联，获得稳定的水凝胶；光照后，水凝胶在避光条件下升温融化，并用去离子水清洗水凝胶，得到大孔丝素蛋白水凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种大孔丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，光催化剂浓度为1～4mM Ru(bpy)3 2+/100mg丝素蛋白；过硫酸盐浓度为10～80mMS2O8 2-/100mg丝素蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的一种大孔丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述的过硫酸盐包括过硫酸铵、过硫酸钠和过硫酸钾中的一种或两种以上混合。
4.根据权利要求1或2所述的一种大孔丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，冷冻温度为-10～-20℃，冷冻时间大于2h。
5.根据权利要求3所述的一种大孔丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，冷冻温度为-10～-20℃，冷冻时间大于2h。
6.根据权利要求1、2或5所述的一种大孔丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤4中，使用的光源为含有452nm波长光的一切光源；光源距离凝胶5～20cm，照射时间为3～20min。
7.根据权利要求3所述的一种大孔丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤4中，使用的光源为含有452nm波长光的一切光源；光源距离凝胶5～20cm，照射时间为3～20min。
8.根据权利要求4所述的一种大孔丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤4中，使用的光源为含有452nm波长光的一切光源；光源距离凝胶5～20cm，照射时间为3～20min。
9.根据权利要求1、2、5、7或8所述的一种大孔丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤4中的照射光源包括白炽灯、白光灯和蓝光LED灯珠中的一种或两种以上组合。
10.根据权利要求1、2、5、7或8所述的一种大孔丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤4光照过程中冷冻溶液保存在与步骤3中相同温度的环境中，防止冰晶融化。
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