CN115232850A - 海洋生物抗菌肽的制备方法 - Google Patents
海洋生物抗菌肽的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115232850A CN115232850A CN202211061303.5A CN202211061303A CN115232850A CN 115232850 A CN115232850 A CN 115232850A CN 202211061303 A CN202211061303 A CN 202211061303A CN 115232850 A CN115232850 A CN 115232850A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibacterial peptide
- solution
- enzymolysis
- neutral protease
- hours
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 title claims abstract description 76
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 54
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 claims abstract description 49
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 32
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical class O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 235000021190 leftovers Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 64
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims description 30
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 26
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 25
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 25
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 16
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 15
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 15
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 15
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 12
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 12
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 claims description 10
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- LIKFHECYJZWXFJ-UHFFFAOYSA-N dimethyldichlorosilane Chemical compound C[Si](C)(Cl)Cl LIKFHECYJZWXFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 10
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 10
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 7
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 claims description 7
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 claims description 7
- 239000001648 tannin Substances 0.000 claims description 7
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical group CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- LRWZZZWJMFNZIK-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-3-methyloxirane Chemical compound CC1OC1Cl LRWZZZWJMFNZIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000011837 N,N-methylenebisacrylamide Substances 0.000 claims description 5
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 5
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 claims description 5
- 238000002386 leaching Methods 0.000 claims description 5
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 5
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical group C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 5
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 5
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 claims description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 5
- FGKCGMMQJOWMFW-UHFFFAOYSA-M trimethyl-[2-(2-methylprop-2-enoyloxy)ethyl]azanium;bromide Chemical compound [Br-].CC(=C)C(=O)OCC[N+](C)(C)C FGKCGMMQJOWMFW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims description 4
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 4
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 claims description 3
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 claims description 3
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 claims description 2
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 abstract description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 8
- 238000010411 cooking Methods 0.000 abstract description 3
- 238000003825 pressing Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 12
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000011258 core-shell material Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000013094 purity test Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229910000859 α-Fe Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000143060 Americamysis bahia Species 0.000 description 1
- MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N N-[1-oxo-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propan-2-yl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(C(C)NC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000630524 Taractes rubescens Species 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000031729 antibacterial peptide production Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种海洋生物抗菌肽的制备方法，其包括：步骤一、取低等海洋生物下脚料，冷冻干燥并粉碎得原料粉末；步骤二、用Tris‑HCl缓冲溶液将磁性固定化中性蛋白酶配置成酶解溶液，将原料粉末加入至酶解溶液中酶解4h，将酶解液中的磁性固定化中性蛋白酶分离去除，得粗提液；步骤三、向粗提液中加入改性硅藻土，进行初步纯化得抗菌肽提取液；步骤四、将抗菌肽提取液用超滤膜过滤，收集分离液，冷冻干燥即得。本发明采用磁性固定化酶对低等海洋生物下脚料进行酶解，提取抗菌肽，避免高温蒸煮或机械压榨对蛋白的大幅破坏，同时可将酶解液中的磁性固定化酶分离去除，解决了抗菌肽分离难度大的问题。
Description
技术领域
本发明涉及抗菌肽生产技术领域。更具体地说，本发明涉及一种海洋生物抗菌肽的制备方法。
背景技术
海洋生物的下脚料中富含蛋白质，其中包括一系列生物抗菌肽，从海洋生物蛋白中提取抗菌肽应用于食品、化妆品和制药行业具有较大的潜力，现有技术中从海洋生物中提取的抗菌肽多采用高温蒸煮或机械压榨的方式，在此过程中蛋白质极易变性，导致抗菌肽纯度降低，活性较低，此外因蛋白质与脂肪等交合在一起，增加了蛋白质分解难度和抗菌肽分离难度。
为提高海洋生物中抗菌肽的分离提纯效率，公布号为CN111440835A的发明专利中通过发酵的方式从鲳鱼内脏中提取抗菌肽，其仍然存在发酵菌与抗菌肽分离难度大的问题。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种海洋生物抗菌肽的制备方法，其采用磁性固定化酶对低等海洋生物下脚料进行酶解，提取抗菌肽，避免高温蒸煮或机械压榨对蛋白的大幅破坏，同时可将酶解液中的磁性固定化酶分离去除，解决了抗菌肽分离难度大的问题，进一步通过改性硅藻土去除其余杂质，提高抗菌肽纯度和活性。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种海洋生物抗菌肽的制备方法，其包括以下步骤：
步骤一、取低等海洋生物下脚料，冷冻干燥并粉碎得原料粉末；
步骤二、用Tris-HCl缓冲溶液将磁性固定化中性蛋白酶配置成酶解溶液，将原料粉末加入至酶解溶液中酶解4h，将酶解液中的磁性固定化中性蛋白酶分离去除，得粗提液；酶解过程中，每隔1h将酶解液置于交变磁场下处理10～20min；
步骤三、向粗提液中加入改性硅藻土，重复搅拌至悬浮液，保持1～2h，然后离心，取沉淀物置于体积百分含量为60％的丙酮水溶液中于40℃下浸提1～2h，随后离心取上清液得抗菌肽提取液；
步骤四、将抗菌肽提取液用超滤膜过滤，收集分离液，冷冻干燥即得。
优选的是，所述的海洋生物抗菌肽的制备方法，步骤一中低等海洋生物下脚料为鱼皮或虾皮。
优选的是，所述的海洋生物抗菌肽的制备方法，步骤二中原料粉末与酶解溶液的固液比为1:10g/mL，酶活U与固体粉末重量比为3000U/g；于温度为50～55℃，pH为6.0～6.5的条件下进行酶解。
优选的是，所述的海洋生物抗菌肽的制备方法，改性硅藻土的制备方法为将硅藻土粉末加入至二甲基二氯硅烷与无水吡啶按体积比为1:18制得的混合液中，于30℃下搅拌反应2h，然后在搅拌下缓慢加入分子量为1500～1750的单宁，继续搅拌反应1h，静置30min后，5000r/min离心5min，去除上清液，收集沉淀物并用去离子水洗涤，40℃干燥后即得；其中，硅藻土粉末、单宁、二甲基二氯硅烷的质量比为5:2:2.5。
优选的是，所述的海洋生物抗菌肽的制备方法，磁性固定化中性蛋白酶的制备方法为：
步骤S1、按重量份数计，取1份的甲基丙烯酰氧乙基三甲基溴化铵、0.1份的交联剂、0.5份的表面活性剂和20份的去离子水置于烧瓶中搅拌至溶解，向烧瓶中加入200份的油相溶剂，搅拌均匀后将烧瓶内的气体置换为惰性气体，然后将烧瓶置于60℃的油浴下，恒温搅拌反应5h，反应结束后抽滤去除烧瓶中的溶剂，干燥后得水凝胶微球；
步骤S2、将1份的水凝胶微球分散于20份的去离子水中得水凝胶微球悬浮液，向水凝胶微球悬浮液中依次加入氯化铁、醋酸钠和乙二醇，搅拌均匀后置于190℃的反应釜内恒温反应12h，反应结束收集沉淀物，用去离子水洗涤沉淀物，于20℃下干燥24h，得磁性中空微球；氯化铁、醋酸钠和乙二醇在水凝胶微球悬浮液中的浓度分别为0.01mol/L、10g/L、1mL/mL；
步骤S3、在碱性条件下，将磁性中空微球依次用环氧氯丙烷水溶液、氨水和戊二醛水溶液处理，得改性磁性中空微球；
步骤S4、将中性蛋白酶溶于pH为7的缓冲溶液中制得浓度为0.06mg/mL的中性蛋白酶溶液，将改性磁性中空微球均匀分散至中性蛋白酶溶液中，于温度为30℃、转速为100r/min条件下的摇床中振荡2h，然后用磁铁分理处磁性固定化中性蛋白酶；中性蛋白酶溶液中改性磁性中空微球的浓度为2mg/mL；磁性固定化中性蛋白酶的酶活为1557U。
优选的是，所述的海洋生物抗菌肽的制备方法，所述交联剂为N，N-亚甲基双丙烯酰胺。
优选的是，所述的海洋生物抗菌肽的制备方法，所述表面活性剂为吐温-80。
优选的是，所述的海洋生物抗菌肽的制备方法，所述油相溶剂为正己烷或环己烷。
本发明至少包括以下有益效果：
1、本发明采用蛋白酶水解法提取海洋生物中的抗菌肽，提取条件温和，减少蛋白变性损失，提高抗菌的纯度和活性，此外反应时间短，易于控制，特异性强，不会残留有机溶剂等有害化学试剂；进一步的本发明采用磁性固定化酶，在酶解完成后简单利用磁铁即可将磁性固定化酶从酶解反应液中分离，提高抗菌肽的分离纯化效率；酶解过程中，每隔一定时间将酶解溶液置于交变磁场的环境下，酶解蓉液中的磁性固定化酶可在一定区域内运动，可避免原料粉末将磁性固定化酶包裹进而降低酶解效率，可提高磁性固定化酶的利用效率，同时磁场的作用可提高磁性固定化酶的酶活性，进一步提高酶的利用效率，能够将原料粉末快速、彻底的水解，最终提高抗菌肽的纯度和抗菌肽的抗菌活力；
2、本发明向粗提液中加入改性硅藻土，吸附抗菌肽与酶解底物残渣分离，进一步利用丙酮对抗菌肽溶解，将抗菌肽与改性硅藻土分离，实现对粗提液的初步提纯；利用改性硅藻土对粗提液进行初步提纯，配合超滤膜过滤的进一步提纯，大大提高了抗菌肽产物的纯度，且纯化方法简单易操作，不会引入新的有害的化学物质，成本低，环保性较好；
3、本发明提供了磁性固定化中性蛋白酶的具体制备方法，首先选用水凝胶微球作为模板，水凝胶微球在反应、后续的干燥过程中，脱水、收缩，形成具有中空结构的微球，随后在水凝胶微球表面包覆一层铁酸盐，即合成内层为水凝胶微球，外层为铁酸盐的核壳形磁性微球，水凝胶模板的核壳形磁性微球具有高比表面积、较大的内部空间、丰富的表面官能团以及良好的生物相容性等特点，对中空磁性微球进行环氧基、氨基改性，可进一步提高酶负载量、负载后酶的活性和稳定性，最终达到进一步提高抗菌肽的纯度和抗菌肽的抗菌活力；
4、本发明利用单宁对硅藻土进行改性制得改性硅藻土，基于单宁与蛋白质结合特性，利用改性硅藻土从粗提液中吸附抗菌肽，离心后共沉淀，随后用丙酮解离抗菌肽，离心去除改性硅藻土，获得初步提纯后的提取液。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实施例1>
本发明提供一种海洋生物抗菌肽的制备方法，其包括以下步骤：
步骤一、取鱼皮，冷冻干燥并粉碎得原料粉末；
步骤二、用Tris-HCl缓冲溶液将磁性固定化中性蛋白酶配置成酶解溶液，将原料粉末加入至酶解溶液中酶解4h，将酶解液中的磁性固定化中性蛋白酶分离去除，得粗提液；酶解过程中，每隔1h将酶解液置于交变磁场下处理10min；原料粉末与酶解溶液的固液比为1:10g/mL，酶活U与固体粉末重量比为3000U/g；于温度为50℃，pH为6.0的条件下进行酶解；
磁性固定化中性蛋白酶的制备方法为：
步骤S1、按重量份数计，取1份的甲基丙烯酰氧乙基三甲基溴化铵、0.1份的N，N-亚甲基双丙烯酰胺、0.5份的吐温-80和20份的去离子水置于烧瓶中搅拌至溶解，向烧瓶中加入200份的正己烷，搅拌均匀后将烧瓶内的气体置换为惰性气体，然后将烧瓶置于60℃的油浴下，恒温搅拌反应5h，反应结束后抽滤去除烧瓶中的溶剂，干燥后得水凝胶微球；
步骤S2、将1份的水凝胶微球分散于20份的去离子水中得水凝胶微球悬浮液，向水凝胶微球悬浮液中依次加入氯化铁、醋酸钠和乙二醇，搅拌均匀后置于190℃的反应釜内恒温反应12h，反应结束收集沉淀物，用去离子水洗涤沉淀物，于20℃下干燥24h，得磁性中空微球；氯化铁、醋酸钠和乙二醇在水凝胶微球悬浮液中的浓度分别为0.01mol/L、10g/L、1mL/mL；
步骤S3、在碱性条件下，将磁性中空微球依次用环氧氯丙烷水溶液(使得磁性中空微球表面带有环氧基)、氨水(使其表面带有氨基)和戊二醛水溶液处理，得改性磁性中空微球；
步骤S4、将中性蛋白酶溶于pH为7的缓冲溶液中制得浓度为0.06mg/mL的中性蛋白酶溶液，将改性磁性中空微球均匀分散至中性蛋白酶溶液中，于温度为30℃、转速为100r/min条件下的摇床中振荡2h，然后用磁铁分理处磁性固定化中性蛋白酶；中性蛋白酶溶液中改性磁性中空微球的浓度为2mg/mL；磁性固定化中性蛋白酶的酶活为1557U；
步骤三、向粗提液中加入改性硅藻土，重复搅拌至悬浮液，保持1h，然后离心，取沉淀物置于体积百分含量为60％的丙酮水溶液中于40℃下浸提1h，随后离心取上清液得抗菌肽提取液；改性硅藻土的制备方法为将硅藻土粉末加入至二甲基二氯硅烷与无水吡啶按体积比为1:18制得的混合液中，于30℃下搅拌反应2h，然后在搅拌下缓慢加入分子量为1500的单宁，继续搅拌反应1h，静置30min后，5000r/min离心5min，去除上清液，收集沉淀物并用去离子水洗涤，40℃干燥后即得；其中，硅藻土粉末、单宁、二甲基二氯硅烷的质量比为5:2:2.5；
步骤四、将抗菌肽提取液用超滤膜过滤，收集分离液，冷冻干燥即得。
<实施例2>
本发明提供一种海洋生物抗菌肽的制备方法，其包括以下步骤：
步骤一、取鱼皮，冷冻干燥并粉碎得原料粉末；
步骤二、用Tris-HCl缓冲溶液将磁性固定化中性蛋白酶配置成酶解溶液，将原料粉末加入至酶解溶液中酶解4h，将酶解液中的磁性固定化中性蛋白酶分离去除，得粗提液；酶解过程中，每隔1h将酶解液置于交变磁场下处理20min；原料粉末与酶解溶液的固液比为1:10g/mL，酶活U与固体粉末重量比为3000U/g；于温度为55℃，pH为6.5的条件下进行酶解；
磁性固定化中性蛋白酶的制备方法为：
步骤S1、按重量份数计，取1份的甲基丙烯酰氧乙基三甲基溴化铵、0.1份的N，N-亚甲基双丙烯酰胺、0.5份的吐温-80和20份的去离子水置于烧瓶中搅拌至溶解，向烧瓶中加入200份的正己烷，搅拌均匀后将烧瓶内的气体置换为惰性气体，然后将烧瓶置于60℃的油浴下，恒温搅拌反应5h，反应结束后抽滤去除烧瓶中的溶剂，干燥后得水凝胶微球；
步骤S2、将1份的水凝胶微球分散于20份的去离子水中得水凝胶微球悬浮液，向水凝胶微球悬浮液中依次加入氯化铁、醋酸钠和乙二醇，搅拌均匀后置于190℃的反应釜内恒温反应12h，反应结束收集沉淀物，用去离子水洗涤沉淀物，于20℃下干燥24h，得磁性中空微球；氯化铁、醋酸钠和乙二醇在水凝胶微球悬浮液中的浓度分别为0.01mol/L、10g/L、1mL/mL；
步骤S3、在碱性条件下，将磁性中空微球依次用环氧氯丙烷水溶液(使得磁性中空微球表面带有环氧基)、氨水(使其表面带有氨基)和戊二醛水溶液处理，得改性磁性中空微球；
步骤S4、将中性蛋白酶溶于pH为7的缓冲溶液中制得浓度为0.06mg/mL的中性蛋白酶溶液，将改性磁性中空微球均匀分散至中性蛋白酶溶液中，于温度为30℃、转速为100r/min条件下的摇床中振荡2h，然后用磁铁分理处磁性固定化中性蛋白酶；中性蛋白酶溶液中改性磁性中空微球的浓度为2mg/mL；磁性固定化中性蛋白酶的酶活为1557U；
步骤三、向粗提液中加入改性硅藻土，重复搅拌至悬浮液，保持2h，然后离心，取沉淀物置于体积百分含量为60％的丙酮水溶液中于40℃下浸提2h，随后离心取上清液得抗菌肽提取液；改性硅藻土的制备方法为将硅藻土粉末加入至二甲基二氯硅烷与无水吡啶按体积比为1:18制得的混合液中，于30℃下搅拌反应2h，然后在搅拌下缓慢加入分子量为1750的单宁，继续搅拌反应1h，静置30min后，5000r/min离心5min，去除上清液，收集沉淀物并用去离子水洗涤，40℃干燥后即得；其中，硅藻土粉末、单宁、二甲基二氯硅烷的质量比为5:2:2.5；
步骤四、将抗菌肽提取液用超滤膜过滤，收集分离液，冷冻干燥即得。
<实施例3>
本发明提供一种海洋生物抗菌肽的制备方法，其包括以下步骤：
步骤一、取虾皮，冷冻干燥并粉碎得原料粉末；
步骤二、用Tris-HCl缓冲溶液将磁性固定化中性蛋白酶配置成酶解溶液，将原料粉末加入至酶解溶液中酶解4h，将酶解液中的磁性固定化中性蛋白酶分离去除，得粗提液；酶解过程中，每隔1h将酶解液置于交变磁场下处理15min；原料粉末与酶解溶液的固液比为1:10g/mL，酶活U与固体粉末重量比为3000U/g；于温度为53℃，pH为6.3的条件下进行酶解；
磁性固定化中性蛋白酶的制备方法为：
步骤S1、按重量份数计，取1份的甲基丙烯酰氧乙基三甲基溴化铵、0.1份的N，N-亚甲基双丙烯酰胺、0.5份的吐温-80和20份的去离子水置于烧瓶中搅拌至溶解，向烧瓶中加入200份的环己烷，搅拌均匀后将烧瓶内的气体置换为惰性气体，然后将烧瓶置于60℃的油浴下，恒温搅拌反应5h，反应结束后抽滤去除烧瓶中的溶剂，干燥后得水凝胶微球；
步骤S2、将1份的水凝胶微球分散于20份的去离子水中得水凝胶微球悬浮液，向水凝胶微球悬浮液中依次加入氯化铁、醋酸钠和乙二醇，搅拌均匀后置于190℃的反应釜内恒温反应12h，反应结束收集沉淀物，用去离子水洗涤沉淀物，于20℃下干燥24h，得磁性中空微球；氯化铁、醋酸钠和乙二醇在水凝胶微球悬浮液中的浓度分别为0.01mol/L、10g/L、1mL/mL；
步骤S3、在碱性条件下，将磁性中空微球依次用环氧氯丙烷水溶液(使得磁性中空微球表面带有环氧基)、氨水(使其表面带有氨基)和戊二醛水溶液处理，得改性磁性中空微球；
步骤S4、将中性蛋白酶溶于pH为7的缓冲溶液中制得浓度为0.06mg/mL的中性蛋白酶溶液，将改性磁性中空微球均匀分散至中性蛋白酶溶液中，于温度为30℃、转速为100r/min条件下的摇床中振荡2h，然后用磁铁分理处磁性固定化中性蛋白酶；中性蛋白酶溶液中改性磁性中空微球的浓度为2mg/mL；磁性固定化中性蛋白酶的酶活为1557U；
步骤三、向粗提液中加入改性硅藻土，重复搅拌至悬浮液，保持1.5h，然后离心，取沉淀物置于体积百分含量为60％的丙酮水溶液中于40℃下浸提1.5h，随后离心取上清液得抗菌肽提取液；改性硅藻土的制备方法为将硅藻土粉末加入至二甲基二氯硅烷与无水吡啶按体积比为1:18制得的混合液中，于30℃下搅拌反应2h，然后在搅拌下缓慢加入分子量为1600的单宁，继续搅拌反应1h，静置30min后，5000r/min离心5min，去除上清液，收集沉淀物并用去离子水洗涤，40℃干燥后即得；其中，硅藻土粉末、单宁、二甲基二氯硅烷的质量比为5:2:2.5；
步骤四、将抗菌肽提取液用超滤膜过滤，收集分离液，冷冻干燥即得。
<对比例1>
本发明一种海洋生物抗菌肽的制备方法，与实施例3的不同在于，步骤二中将磁性固定化中性蛋白酶替换为等量的中性蛋白酶，其余条件和参数同实施例3。
<对比例2>
本发明一种海洋生物抗菌肽的制备方法，与实施例3的不同在于，步骤二中酶解过程中不在交变磁场下处理，其余条件和参数同实施例3。
<对比例3>
本发明一种海洋生物抗菌肽的制备方法，与实施例3的不同在于，不进行步骤三，直接进行步骤四，其余条件和参数同实施例3。
<对比例4>
本发明一种海洋生物抗菌肽的制备方法，与实施例3的不同在于，不进行步骤四，步骤三得到的抗菌肽提取液冷冻干燥即得抗菌肽，其余条件和参数同实施例3。
<试验例>
对本发明实施例1～3和对比例1～4的抗菌肽纯度和抗菌肽的抗菌活力进行测试，并统计至表1；
抗菌肽的纯度测试：选用反相高效液相色谱技术对提取产品抗菌肽进行纯度测试，结果显示，实施例1～3均为单一峰，对比例1～4均存在多个峰，(表现为单一峰说明产品纯度较高)，由此说明本发明实施例1～3具体抗菌肽提取纯度高的有益效果；以峰面积归一法，计算抗菌肽的纯度结果如表1所示。
抗菌肽活力测试方法：从固体斜面上取金黄色葡萄球菌分散于浓度为0.1mol/L、pH为6.4的磷酸钾缓冲溶液中，制得悬浮液，将悬浮液置于冰浴中，将本发明制备得到的抗菌肽产物溶解于无菌水中，并加入悬浮液，混匀后测其在570nm处的A0值，将悬浮液(加入有抗菌肽溶液的)置于30℃的水浴中恒温反应30min后取出，并立即置于冰浴下静置10min，测其在570nm处的A值，抗菌活力按U2＝(A0-A)/A式计算获得(U：活力单位)。
表1抗菌肽的纯度抗菌活力
| 纯度(％) | 抗菌活性(U) | |
| 实施例1 | 98.7 | 90.9 |
| 实施例2 | 99.1 | 91.7 |
| 实施例3 | 99.5 | 92.4 |
| 对比例1 | 54.9 | 69.4 |
| 对比例2 | 79.7 | 80.6 |
| 对比例3 | 69.5 | 72.1 |
| 对比例4 | 81.6 | 82.5 |
由表1可知，本发明实施例1～3制备得到的抗菌肽的纯度和抗菌活力均高于对比例1～4，说明本发明采用磁性固定化蛋白酶对低等海洋生物下脚料进行酶解，并在酶解过程中辅助交变磁场、用改性硅藻土进行初步纯化并配合超滤膜过滤的纯化，能够得到纯度较高和活力较高的抗菌肽。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (8)
1.海洋生物抗菌肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、取低等海洋生物下脚料，冷冻干燥并粉碎得原料粉末；
步骤二、用Tris-HCl缓冲溶液将磁性固定化中性蛋白酶配置成酶解溶液，将原料粉末加入至酶解溶液中酶解4h，将酶解液中的磁性固定化中性蛋白酶分离去除，得粗提液；酶解过程中，每隔1h将酶解液置于交变磁场下处理10～20min；
步骤三、向粗提液中加入改性硅藻土，重复搅拌至悬浮液，保持1～2h，然后离心，取沉淀物置于体积百分含量为60％的丙酮水溶液中于40℃下浸提1～2h，随后离心取上清液得抗菌肽提取液；
步骤四、将抗菌肽提取液用超滤膜过滤，收集分离液，冷冻干燥即得。
2.如权利要求1所述的海洋生物抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤一中低等海洋生物下脚料为鱼皮或虾皮。
3.如权利要求1所述的海洋生物抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤二中原料粉末与酶解溶液的固液比为1:10g/mL，酶活U与固体粉末重量比为3000U/g；于温度为50～55℃，pH为6.0～6.5的条件下进行酶解。
4.如权利要求1所述的海洋生物抗菌肽的制备方法，其特征在于，改性硅藻土的制备方法为将硅藻土粉末加入至二甲基二氯硅烷与无水吡啶按体积比为1:18制得的混合液中，于30℃下搅拌反应2h，然后在搅拌下缓慢加入分子量为1500～1750的单宁，继续搅拌反应1h，静置30min后，5000r/min离心5min，去除上清液，收集沉淀物并用去离子水洗涤，40℃干燥后即得；其中，硅藻土粉末、单宁、二甲基二氯硅烷的质量比为5:2:2.5。
5.如权利要求1所述的海洋生物抗菌肽的制备方法，其特征在于，磁性固定化中性蛋白酶的制备方法为：
步骤S1、按重量份数计，取1份的甲基丙烯酰氧乙基三甲基溴化铵、0.1份的交联剂、0.5份的表面活性剂和20份的去离子水置于烧瓶中搅拌至溶解，向烧瓶中加入200份的油相溶剂，搅拌均匀后将烧瓶内的气体置换为惰性气体，然后将烧瓶置于60℃的油浴下，恒温搅拌反应5h，反应结束后抽滤去除烧瓶中的溶剂，干燥后得水凝胶微球；
步骤S2、将1份的水凝胶微球分散于20份的去离子水中得水凝胶微球悬浮液，向水凝胶微球悬浮液中依次加入氯化铁、醋酸钠和乙二醇，搅拌均匀后置于190℃的反应釜内恒温反应12h，反应结束收集沉淀物，用去离子水洗涤沉淀物，于20℃下干燥24h，得磁性中空微球；氯化铁、醋酸钠和乙二醇在水凝胶微球悬浮液中的浓度分别为0.01mol/L、10g/L、1mL/mL；
步骤S3、在碱性条件下，将磁性中空微球依次用环氧氯丙烷水溶液、氨水和戊二醛水溶液处理，得改性磁性中空微球；
步骤S4、将中性蛋白酶溶于pH为7的缓冲溶液中制得浓度为0.06mg/mL的中性蛋白酶溶液，将改性磁性中空微球均匀分散至中性蛋白酶溶液中，于温度为30℃、转速为100r/min条件下的摇床中振荡2h，然后用磁铁分理处磁性固定化中性蛋白酶；中性蛋白酶溶液中改性磁性中空微球的浓度为2mg/mL；磁性固定化中性蛋白酶的酶活为1557U。
6.如权利要求5所述的海洋生物抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述交联剂为N，N-亚甲基双丙烯酰胺。
7.如权利要求5所述的海洋生物抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂为吐温-80。
8.如权利要求5所述的海洋生物抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述油相溶剂为正己烷或环己烷。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211061303.5A CN115232850A (zh) | 2022-08-31 | 2022-08-31 | 海洋生物抗菌肽的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211061303.5A CN115232850A (zh) | 2022-08-31 | 2022-08-31 | 海洋生物抗菌肽的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115232850A true CN115232850A (zh) | 2022-10-25 |
Family
ID=83681107
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211061303.5A Withdrawn CN115232850A (zh) | 2022-08-31 | 2022-08-31 | 海洋生物抗菌肽的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115232850A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117695370A (zh) * | 2023-12-19 | 2024-03-15 | 青岛市畜牧工作站(青岛市畜牧兽医研究所) | 一种寡肽在制备猪流行性腹泻病毒抑制药物中的应用 |
-
2022
- 2022-08-31 CN CN202211061303.5A patent/CN115232850A/zh not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117695370A (zh) * | 2023-12-19 | 2024-03-15 | 青岛市畜牧工作站(青岛市畜牧兽医研究所) | 一种寡肽在制备猪流行性腹泻病毒抑制药物中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Skeggs Jr et al. | The purification of hypertensin II | |
| CN104130319B (zh) | 一种藻红蛋白的提取方法 | |
| CN115232850A (zh) | 海洋生物抗菌肽的制备方法 | |
| CN107868805B (zh) | 一种通过乳酸菌发酵降解的龙眼多糖及其制备方法 | |
| CN111073941B (zh) | 檀香多肽的制备工艺 | |
| CN103243127B (zh) | 一种超微粉碎酶解一体化制备复合氨基酸的方法 | |
| CN104371000A (zh) | 啤酒废酵母中谷胱甘肽和核糖核酸的高效提取 | |
| CN109527196B (zh) | 一种提高大豆蛋白酶解效率和产率的方法 | |
| WO2022060235A1 (en) | Method of obtaining hyaluronidase from bovine testes | |
| CN111533781B (zh) | 非特异受体结合型真菌靶向抗菌肽及其制备方法和应用 | |
| CN113584108A (zh) | 一种脾氨肽的制备方法 | |
| CN108404114B (zh) | 一种金黄色葡萄球菌抗菌剂及其制备方法和应用 | |
| CN108191991B (zh) | 一种杏鲍菇多糖的提纯方法 | |
| CN108101980B (zh) | 一种高纯度藻蓝色素的制备方法 | |
| CN109480082A (zh) | 一种贝类投喂饵料及其降低贝类体内重金属的方法 | |
| CN116262777A (zh) | 一种多肽、制备方法及黄嘌呤氧化酶抑制剂、降尿酸制剂 | |
| CN108041402A (zh) | 一种复合型生物防腐剂的制备方法 | |
| CN113999881A (zh) | 微生物发酵制备l-2-氨基己二酸的方法及抑制蓝藻的应用 | |
| CN110724175B (zh) | 一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法 | |
| CN111018867A (zh) | 从血红蛋白中的血红素的快速提取方法 | |
| CN115651093B (zh) | 青稞β-葡聚糖的提取方法 | |
| Wen et al. | Synergistic removal of dyes by Myrothecium verrucaria immobilization on a chitosan–Fe membrane | |
| JP2758475B2 (ja) | キトサンオリゴマー及びその製造法 | |
| CN114306115A (zh) | 用于除皱的生物细胞肽组合物及其制备方法 | |
| CN114081098B (zh) | 一种由Subtilosin A与蒲公英根多糖制备复合免疫增强剂的方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20221025 |
|
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |