CN111018867A - 从血红蛋白中的血红素的快速提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从血红蛋白中的血红素的快速提取方法。本发明使用了复合蛋白酶进行酶解，能够高效快速地酶解血红蛋白，缩短了酶解时间，从而能够快速地提取血红素，同时提高血红素的量。本发明的方法相对于传统有机溶剂法是一种绿色环保的方法，对得到的血红素粗品进行多次纯化处理，纯度可达97.2％以上。本发明的血红素提取方法成本低廉，使用的复合蛋白酶酶解效果好，制备效率高，安全环保，生产工艺简单可控，产品收率高，产品纯度高，具有较好的经济效益和社会效益，市场前景十分乐观。

Description

从血红蛋白中的血红素的快速提取方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地涉及血红蛋白中的血红素的快速提取方法。

背景技术

血红素是一种铁卟啉化合物，它是血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素、过氧化氢酶和过氧化物酶的辅基。主要存在于动物血液和肌肉中，是动物血液中的天然色素，在医药、食品、化工、保健品、建筑及化妆品行业中有广泛应用。在食品行业，血红素是一种天然色素，可替代熟肉制品中危及人体健康的发色剂亚硝酸盐及人工合成色素，减少亚硝酸盐的致癌作用，并能保持肌肉固有的天然色泽。血红素作为一种高效铁源物质，己在饲料生产中开始应用，成为一种新型绿色饲料添加剂。在分析化学上，血红素可用来鉴定铜。血红素除了可以用作食品中的色素添加剂外，还是目前治疗缺铁性贫血(IDA)疗效较好的一种补铁剂，具有生物利用度高、无体内铁蓄积中毒及胃肠剌激等不良反应等优点，同时还是抗贫血和抗肿瘤药物的重要原料，我国已批准以血红素为基本原料的血叶琳为抗肿瘤新药。

此外，我国每年猪血总量约有150万吨，除极少量用于制作血豆腐或饲料外，大部分被废弃，造成资源浪费和环境污染。可见，综合开发利用猪血资源提取血红素，既可以减少环境污染，又可以增加猪血的经济效益和社会效益，具有很高的应用价值和较好的市场前景。所以，研究血红素的提取技术意义重大。

目前，关于血红素的制备方法有很多，但是基本上都要用到大量的化学试剂，这样既造成了试剂的浪费和环境的污染同时也使生产成本很高。因此，本领域仍需要开发一种能够快速提取血红蛋白中的血红素的方法。

发明内容

鉴于上述问题，本发明的目的是提供一种非常快速、使用化学试剂少、成本较低、环境污染较低的利用动物血液制备血红素的方法。

本发明提供了一种提取血红素的方法，所述方法包括步骤：

(1)提供一动物血液，并从所述动物血液中分离得到血红蛋白溶液；

(2)将血红蛋白溶液中的血红蛋白变性后，并加入复合蛋白酶进行酶解，所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的混合物，其中所述木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的质量比为1:(0.5-2)，酶解完成后灭酶，得到酶解溶液；

(3)调节所述酶解溶液的pH至酸性，收集第一沉淀物；

(4)将所述第一沉淀物溶于碱性溶液，收集上清液；以及

(5)将所述上清液与沉淀剂混合，分离得到第二沉淀物血红素。

在另一优选例中，所述动物血液中添加有抗凝剂和/或抗氧化剂。

在另一优选例中，所述抗凝剂为柠檬酸钠。

在另一优选例中，所述步骤(1)包括：

(a)收集动物血液，并分离得到红细胞；和

(b)将所述红细胞与水混合后进行溶血，得到血红蛋白溶液。

在另一优选例中，所述溶血为搅拌溶血。较佳地，搅拌时间为20分钟-60分钟。

在另一优选例中，所述步骤(b)中，溶血后还包括超声波破碎和过滤。

在另一优选例中，所述复合蛋白酶的加入量为血红蛋白质量的0.2％-0.8％，优选地0.3％-0.5％。

在另一优选例中，所述酶解的温度为50-60℃，较佳地52-58℃。

在另一优选例中，所述酶解的pH为5-9，较佳地6-8。

在另一优选例中，所述酶解时间为2-6h，较佳地2-4h。

在另一优选例中，所述酸性指pH为2-4。

在另一优选例中，所述碱性溶液为氢氧化钠溶液。

在另一优选例中，所述沉淀剂为无水氯化钙。

在另一优选例中，所述氢氧化纳溶液与所述第一沉淀物的质量比为(3-8):1，所述无水氧化钙的加入量为第一沉淀物质量的O.2％-O.4％。

在另一优选例中，所述方法还包括对第二沉淀物血红素进行纯化、洗涤和/或干燥。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：用乙醚或乙二胺四乙酸二钠洗涤第二沉淀物。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：依次用水、乙酸和95％乙醇洗涤所述第二沉淀物。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：依次用乙二胺四乙酸二钠、硝酸和水洗涤所述第二沉淀物。

在另一优选例中，所述方法包括对第二沉淀物进行冷冻干燥。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量筛选，意外地获得一种快速提取血红素的方法。本发明使用了复合蛋白酶进行酶解，能够高效快速地酶解血红蛋白，缩短了酶解时间，从而能够快速地提取血红素，同时提高血红素的量。在此基础上完成了本发明。

除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

人体内的每一个血红蛋白由4个血红素(又称亚铁原卟啉)和中间的1个珠蛋白组成，每个血红素又由四个吡咯类亚基组成一个环，环中心为一个亚铁离子。每个珠蛋白则有四条多肽链，每条多肽链与一个血红素连接，构成血红蛋白的一个单体，或者说亚单位(即亚基)。在与人体内环境相似的电解质溶液中血红蛋白的四个亚基可以自动组装成α2β2的形态。组成珠蛋白的四条肽链各不相同，成年人可由2条α链和2条β链构成，称HbA。胎儿由2条α链2条γ链构成，称HbF。出生后不久由HbA取代。即血红蛋白由一个珠蛋白和四个血红素组成，而珠蛋白的一条肽链与一个血红素结合成为血红蛋白的一个亚单位，四个亚单位之间及亚单位内部以盐键相互结合。每个血红素基团中间的亚铁则可以与氧结合使之成为氧合血红蛋白。与氧结合或解离将影响盐键的形成或断裂，使Hb的四级结构发生改变，其与氧的亲和力亦随之改变，是氧解离曲线成S形和波尔效应的基础。

在本发明的血红素提取方法中，首先，将红细胞与适量水混合，同时配以适量的机械作用(如搅拌)，使红细胞溶血。红细胞充分破壁后，采用复合蛋白水解酶进行酶解，血红蛋白经酶解后肽链被断开，酶解液中有血红素。再者，根据血红素在酸性条件下溶解性很小的性质，调节酶解液的pH值可以使血红素沉淀出来，得到血红素粗品。接着，将血红素粗品溶于氢氧化钠溶液中进行纯化，并采用无水氯化钙重新沉淀血红素，收集血红素沉淀并洗涤至中性，烘干得血红素。

本发明在血红素提取过程中加水，主要目的在于溶血，破坏红细胞，从而使血红蛋白游离，以便血红素的提取。将红血球液与适量水混合后，降低了细胞外渗透压，使红细胞吸水导致细胞膜破裂，同时配以适量的机械作用(如搅拌)，可以提高破裂速度。

本发明采用复合蛋白水解酶酶解血红蛋白，复合蛋白水解酶包括木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶。木瓜蛋白酶为外切酶，在内切酶和外切酶的共同作用下，产生一定量的游离氨基酸和小肽，提高了水解度，同时枯草杆菌蛋白酶是芽孢杆菌属细菌所分泌的胞外碱性蛋白酶，属丝氨酸蛋白水解酶类，与木瓜蛋白酶具有协同作用，可以快速地酶解血红蛋白，同时能显著提高血红素的量。

本发明还对酶解的条件进行了优化，试验结果表明，在酶解过程中，适当的提高温度可增加酶的活力，促进水解，若温度过高，使血红蛋白和酶变性则对水解不利，因此选择50-60℃为复合蛋白水解酶适宜的酶解温度。pH作为变性因素的存在，使血红素上的丙酸基与珠蛋白结合的两个化学键及血红素中的铁与珠蛋白组氨酸咪唑环的氮形成的两个配位键断裂，从而使血红蛋白中的血红素与珠蛋白分离达到水解目的，不同的pH处理会对底物和酶的构象造成较大影响，pH应该控制在反应最适范围内有利于酶活力的充分发挥，因此pH在5-9是较优选择。酶解时间的长短会直接影响整个反应，水解时间过短导致反应不充分，不能完全水解血红蛋白释放出血红素，水解时间过程时作用底物被消耗水解度随之下降，由于水解产物被氧化以及在体系中达到溶解平衡，致使血红素浓度和水解度反而减小。根据本发明的复合蛋白酶高效水解的特性，选择酶解的时间为2-4h。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明采用复合蛋白酶解法从抗凝血中提取血红素，相对于传统有机溶剂法是一种绿色环保的方法，对得到的血红素粗品进行多次纯化处理，纯度可达97.2％以上。本发明的血红素提取方法成本低廉，使用的复合蛋白酶酶解效果好，制备效率高，安全环保，生产工艺简单可控，产品收率高，产品纯度高，具有较好的经济效益和社会效益，市场前景十分乐观。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1

1.血红蛋白溶液的制备

收集免疫合格的猪血，立即加入一定比例的抗凝剂，搅拌均匀，即得抗凝猪血。

将50kg抗凝猪血离心后，收集红血球液20kg，将20kg红血球液与2倍水(即40kg水)混合后，搅拌30分钟溶血，放入加热反应罐中。

2.酶解

将反应罐加热温度至54℃，再加入0.2％复合蛋白水解酶(复合蛋白水解酶的加入量为红血球液质量的0.2％)，恒温54℃，pH为6.0，酶解4小时，其中复合蛋白水解酶为木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的混合物，木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的质量比为1:1。

3.沉淀

调节酶解后的酶解液pH值至3-4，静置30min后，离心，收集第一沉淀物，即粗品血红素。

4.纯化

将第一沉淀物溶于5倍重量氢氧化钠溶液中并调节pH值至9，搅拌溶解，离心去沉淀取上清液，上清液中加入无水氯化钙15g，搅拌均匀，静置，血红素迅速沉淀，离心收集第二沉淀物血红素。

5.洗涤

将第二沉淀物血红素溶于5倍0.1％质量浓度的乙二胺四乙酸二钠溶液(即0.1％质量浓度的乙二胺四乙酸二钠溶液与第二沉淀物的质量比为5:1)洗涤，然后用pH 2的硝酸溶液洗涤，最后用水洗涤至中性，收集得到纯化后的血红素，并烘干至恒重，最终得到血红素产品24g。

将血红素对照品与提取的血红素产品分别在400cm^-1-4000cm^-l范围内扫描红外光谱。结果显示，血红素产品的红外光谱图与对照品的基本一致，波形相似，从二者吸收峰的位置和强度可知两种物质结构相同，为同一种物质，即血红素。经检测，本实施例得到的血红素纯度经检测为97.8％。

实施例2

1.血红蛋白溶液的制备

收集免疫合格的猪血，立即加入一定比例的抗凝剂，搅拌均匀，即得抗凝猪血。

将50kg抗凝猪血离心后，收集红血球液20kg，将20kg红血球液与2倍水(即40kg水)混合后，搅拌30分钟溶血，放入加热反应罐中。

2.酶解

将反应罐加热温度至52℃，再加入0.4％复合蛋白水解酶(复合蛋白水解酶的加入量为红血球液质量的0.4％)，恒温52℃，pH为6.5，酶解2小时，其中复合蛋白水解酶为木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的混合物，木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的质量比为1:0.5。

3.沉淀

调节酶解后的酶解液pH值至3-4，静置30min后，离心，收集第一沉淀物，即粗品血红素。

4.纯化

将第一沉淀物溶于5倍重量氢氧化钠溶液中并调节pH值至9，搅拌溶解，离心去沉淀取上清液，上清液中加入无水氯化钙15g，搅拌均匀，静置，血红素迅速沉淀，离心收集第二沉淀物血红素。

5.洗涤

将第二沉淀物血红素，依次用离子水、体积分数50％的乙酸液和体积分数95％乙醇溶液洗涤一次，收集得到纯化后的血红素，并烘干至恒重，最终得到血红素产品22g。

将血红素对照品与提取的血红素产品分别在400cm^-1-4000cm^-1范围内扫描红外光谱。结果显示，血红素产品的红外光谱图与对照品的基本一致，波形相似，从二者吸收峰的位置和强度可知两种物质结构相同，为同一种物质，即血红素。经检测，本实施例得到的血红素纯度经检测为97.2％。

实施例3

1.血红蛋白溶液的制备

收集免疫合格的猪血，立即加入一定比例的抗凝剂，搅拌均匀，即得抗凝猪血。

将50kg抗凝猪血离心后，收集红血球液20kg，将20kg红血球液与2倍水(即40kg水)混合后，搅拌30分钟溶血，放入加热反应罐中。

2.酶解

将反应罐加热温度至58℃，再加入0.3％复合蛋白水解酶(复合蛋白水解酶的加入量为红血球液质量的0.3％)，恒温58℃，pH为7，酶解3小时，其中复合蛋白水解酶为木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的混合物，木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的质量比为1:2。

3.沉淀

调节酶解后的酶解液pH值至2-4，静置30min后，离心，收集第一沉淀物，即粗品血红素。

4.纯化

将第一沉淀物溶于5倍重量氢氧化钠溶液中并调节pH值至9，搅拌溶解，离心去沉淀取上清液，上清液中加入无水氯化钙20g，搅拌均匀，静置，血红素迅速沉淀，离心收集第二沉淀物血红素。

5.洗涤

将第二沉淀物血红素，依次用离子水、体积分数50％的乙酸液和体积分数95％乙醇溶液洗涤一次，收集得到纯化后的血红素，并烘干至恒重，最终得到血红素产品25g。

将血红素对照品与提取的血红素产品分别在400cm^-1-4000cm^-1范围内扫描红外光谱。结果显示，血红素产品的红外光谱图与对照品的基本一致，波形相似，从二者吸收峰的位置和强度可知两种物质结构相同，为同一种物质，即血红素。经检测，本实施例得到的血红素纯度经检测为97.4％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种提取血红素的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)提供一动物血液，并从所述动物血液中分离得到血红蛋白溶液；

(2)将血红蛋白溶液中的血红蛋白变性后，并加入复合蛋白酶进行酶解，所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的混合物，其中所述木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的质量比为1:(0.5-2)，酶解完成后灭酶，得到酶解溶液；

(3)调节所述酶解溶液的pH至酸性，收集第一沉淀物；

(4)将所述第一沉淀物溶于碱性溶液，收集上清液；以及

(5)将所述上清液与沉淀剂混合，分离得到第二沉淀物血红素。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：

(a)收集动物血液，并分离得到红细胞；和

(b)将所述红细胞与水混合后进行溶血，得到血红蛋白溶液。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，溶血后还包括超声波破碎和过滤。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复合蛋白酶的加入量为血红蛋白溶液质量的0.2％-0.8％，优选地0.3％-0.5％。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解的温度为50-60℃，酶解的pH为5-9。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解时间为2-6h，较佳地2-4h。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱性溶液为氢氧化钠溶液。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述沉淀剂为无水氯化钙。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述氢氧化纳溶液与所述第一沉淀物的质量比为(3-8):1，所述无水氧化钙的加入量为第一沉淀物质量的O.2％-O.4％。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对第二沉淀物血红素进行纯化、洗涤和/或干燥。