CN117695370A - 一种寡肽在制备猪流行性腹泻病毒抑制药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种寡肽在制备猪流行性腹泻病毒抑制药物中的应用，属于生物学技术领域。该寡肽提取自海洋生物掌状红皮藻和四角蛤蜊，通过碾磨、酶解、离心、超滤等步骤制备。实验结果表明，不同比例提取的寡肽抑制PEDV的效果不同，其中以3:2的比例提取的寡肽2效果最佳。同时，结果表明寡肽2能够抑制PEDV感染Vero细胞，降低病毒对宿主细胞的损害。而且，在本发明检测的浓度范围内，其对于细胞无明显毒性，因此，可以将本发明所制备的寡肽2开发成安全有效的抗PEDV药物。
Description
技术领域
本发明属于生物学技术领域，尤其涉及一种寡肽在制备猪流行性腹泻病毒抑制药物中的应用。
背景技术
猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea， PED）是一种由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）引发的急性、高度传染性的肠道传染病。该疾病可以对各年龄段猪的健康造成极为严重的威胁，特别是对仔猪，可能引发腹泻、脱水，甚至导致死亡。自2010年以来，由PEDV变异株引起的PED病例在全球范围内急剧增加，其高发病率和高死亡率的特征导致大量仔猪患病并死亡，对养猪业带来了巨大的经济损失。
尽管近年来在PED的分子流行病学、诊断、预防和治疗方面取得了一些进展，但这种疾病的流行仍在不断蔓延，给养猪业和国际贸易带来了严峻的挑战。PED的变异株不断出现，对当前的预防和治疗措施构成了挑战。因此，开发有效的抗病毒药物对于PEDV的防治具有重要意义。
海洋生物是地球上最丰富和多样的生物资源之一，拥有庞大的遗传多样性和生物活性化合物。海洋环境中独特的生态系统和极端的生存条件使得海洋生物适应了各种激烈的竞争和逆境，从而导致其产生了许多具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤等生物活性的天然产物。因此，通过深入挖掘和研究海洋生物中的天然产物，有望发现新型、高效的PEDV抑制剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种寡肽在制备猪流行性腹泻病毒抑制药物中的应用，从而开发一种新的安全有效的抗猪流行性腹泻病毒的药物。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
首先，本发明提供了一种寡肽在制备猪流行性腹泻病毒抑制药物中的应用，所述寡肽的制备方法包括如下步骤：
（1）将掌状红皮藻和四角蛤蜊肉清洗干净并干燥后，按照比例加入到研磨器中，研磨为粉末；
（2）将所述粉末按照1g:5mL的比例加入蒸馏水，搅拌均匀后，得到匀浆液；
（3）调节匀浆液的温度为37℃，pH为7.5后，加入胰蛋白酶酶解5h，得到酶解液1；
（4）加热所述酶解液1使酶灭活后，静置冷却至室温，得到酶解液2；
（5）将所述酶解液2加入到离心管中，置于离心机中离心，收集上清至新的容器中，得到酶解液3；
（6）将所述酶解液3使用1kDa的超滤膜进行过滤，收集滤过液，冷冻干燥得到寡肽。
优选地，所述步骤（1）中，所述比例为1:1，3:2或2:3。
优选地，所述步骤（1）中，所述比例为3:2。
优选地，所述药物通过抑制猪流行性腹泻病毒的感染来有效的抑制猪流行腹泻病毒。
优选地，所述药物为液体药物，所述液体药物中所述寡肽的浓度为8-128μg/mL，所述药物的给药方式为肌肉注射。
其次，本发明提供了一种寡肽在制备猪流行性腹泻病毒感染抑制药物中的应用，所述寡肽的制备方法包括如下步骤：
（1）将掌状红皮藻和四角蛤蜊肉清洗干净并干燥后，按照3:2比例加入到研磨器中，研磨为粉末；
（2）将所述粉末按照1g:5mL的比例加入蒸馏水，搅拌均匀后，得到匀浆液；
（3）调节所述匀浆液的温度为37℃，pH为7.5后，加入胰蛋白酶酶解5h，得到酶解液1；
（4）加热所述酶解液使酶灭活后，静置冷却至室温，得到酶解液2；
（5）将所述酶解液2加入到离心管中，置于离心机中离心，收集上清至新的容器中，得到酶解液3；
（6）将所述酶解液3使用1kDa的超滤膜进行过滤，收集滤过液，冷冻干燥得到寡肽。
优选地，所述药物为液体药物，所述液体药物中所述寡肽的浓度为8-128μg/mL，所述药物的给药方式为肌肉注射。
其次，本发明提供了一种寡肽在制备用于治疗猪流行性腹泻病毒引起的疾病的药物中的应用，所述寡肽由上述的制备方法制备得到。
优选地，所述药物为液体药物，所述液体药物中所述寡肽的浓度为8-128μg/mL，所述药物的给药方式为肌肉注射。
其次，本发明提供了一种用于抑制猪流行性腹泻病毒的药物，所述药物由如下的制备方法制备得到：
（1）将寡肽使用0.9% 氯化钠注射液配置成8-128μg/mL的寡肽溶液；
（2）使用0.22μm的过滤膜进行过滤除菌后，分装至无菌药瓶中，得到抑制猪流行性腹泻病毒的药物；
所述寡肽由上述的制备方法制备得到。
1.本发明提供了一种新的寡肽，该寡肽是从海洋生物掌状红皮藻和四角蛤蜊按照不同比例提取的寡肽，其中，按照3:2的比例提取的寡肽2抑制PEDV的效果最好;
2.本发明所制备的寡肽2在浓度为8μg/mL时就可以显著的抑制PEDV-N的表达，128μg/mL时基本可以完全抑制PEDV-N的表达；
3. 本发明所制备的寡肽2在一定浓度范围内对正常细胞没有明显的毒性作用，表明其可以开发成安全的抗PEDV感染的药物。
4.当使用本发明制备的寡肽2预处理时，可以有效的抑制PEDV对于细胞的感染，从而减少病毒对宿主细胞的伤害。
总的来说，本发明具有抑制PEDV感染的明确药效，并有望开发成安全有效的抗PEDV感染的药物，对防治猪流行性腹泻病毒引起疾病具有一定的应用前景。
附图说明
图1为不同浓度的寡肽2处理对于Vero细胞中PEDV-N蛋白影响的检测结果图；
图2为寡肽2不同作用方式对于Vero细胞中PEDV感染影响的检测结果图。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
实施例1
（1）将掌状红皮藻和四角蛤蜊肉清洗干净并干燥后，按照1:1的比例加入到研磨器中，研磨为粉末；
（2）将20g粉末加入100mL蒸馏水，搅拌均匀后，得到匀浆液；
（3）调节匀浆液的温度为37℃，pH为7.5后，加入400mg胰蛋白酶酶（10万U/g）解5h，得到酶解液1；
（4）加热酶解液1至90℃，加热30min后，静置冷却至室温，得到酶解液2；
（5）将酶解液2加入到离心管中，置于离心机中离心，收集上清至新的烧杯中，得到酶解液3；
（6）将酶解液3使用1kDa的超滤膜进行过滤，收集滤过液，冷冻干燥得到寡肽1。
实施例2
（1）将掌状红皮藻和四角蛤蜊肉清洗干净并干燥后，按照3:2的比例加入到研磨器中，研磨为粉末；
（2）将20g粉末加入100mL蒸馏水，搅拌均匀后，得到匀浆液；
（3）调节匀浆液的温度为37℃，pH为7.5后，加入400mg胰蛋白酶酶（10万U/g）解5h，得到酶解液1；
（4）加热酶解液1至90℃，加热30min后，静置冷却至室温，得到酶解液2；
（5）将酶解液2加入到离心管中，置于离心机中离心，收集上清至新的烧杯中，得到酶解液3；
（6）将酶解液3使用1kDa的超滤膜进行过滤，收集滤过液，冷冻干燥得到寡肽2。
实施例3
（1）将掌状红皮藻和四角蛤蜊肉清洗干净并干燥后，按照2:3的比例加入到研磨器中，研磨为粉末；
（2）将20g粉末加入100mL蒸馏水，搅拌均匀后，得到匀浆液；
（3）调节匀浆液的温度为37℃，pH为7.5后，加入400mg胰蛋白酶酶（10万U/g）解5h，得到酶解液1；
（4）加热酶解液1至90℃，加热30min后，静置冷却至室温，得到酶解液2；
（5）将酶解液2加入到离心管中，置于离心机中离心，收集上清至新的烧杯中，得到酶解液3；
（6）将酶解液3使用1kDa的超滤膜进行过滤，收集滤过液，冷冻干燥得到寡肽3。
实施例4
（1）将掌状红皮藻和四角蛤蜊肉清洗干净并干燥后，按照1:1的比例加入到研磨器中，研磨为粉末；
（2）将20g粉末加入100mL蒸馏水，搅拌均匀后，得到匀浆液；
（3）调节匀浆液的温度为37℃，pH为7.5后，加入400mg胰蛋白酶酶（10万U/g）解5h，得到酶解液1；
（4）加热酶解液1至90℃，加热30min后，静置冷却至室温，得到酶解液2；
（5）将酶解液2加入到离心管中，置于离心机中离心，收集上清至新的烧杯中，得到酶解液3；
（6）将酶解液3使用1kDa的超滤膜进行过滤，收集截留液，将收集的截留液使用5kDa的超滤膜进行过滤，收集滤过液，冷冻干燥得到多肽1。
实施例5
（1）将掌状红皮藻和四角蛤蜊肉清洗干净并干燥后，按照1:1的比例加入到研磨器中，研磨为粉末；
（2）将20g粉末加入100mL蒸馏水，搅拌均匀后，得到匀浆液；
（3）调节匀浆液的温度为37℃，pH为7.5后，加入400mg胰蛋白酶酶（10万U/g）解5h，得到酶解液1；
（4）加热酶解液1至90℃，加热30min后，静置冷却至室温，得到酶解液2；
（5）将酶解液2加入到离心管中，置于离心机中离心，收集上清至新的烧杯中，得到酶解液3；
（6）将酶解液3使用5kDa的超滤膜进行过滤，收集截留液，将收集的截留液使用10kDa的超滤膜进行过滤，收集滤过液，冷冻干燥得到多肽2。
实施例6
（1）将Vero细胞接种到96孔培养板中，放入37℃，5% CO2的细胞培养箱中待细胞长为单层；
（2）将实施例1-5制备得到的寡肽1，2和3以及多肽1和2分别使用MEM培养基配置成32μg/mL的溶液a，b，c，d和e并进行过滤除菌；
（3）细胞长为单层后，去除培养基，使用PBS清洗后，分别加入步骤（2）中得到的溶液a，b，c，d和e，每种溶液添加3个重复孔，放入37℃，5% CO2的细胞培养箱孵育2h；
（4）弃去培养基，使用0.1 MOI PEDV感染细胞2h后，弃去PEDV感染液，使用PBS清洗后，加入新的无血清MEM培养基，同时设置不进行PEDV感染的阴性对照组，以及只进行PEDV感染的阳性对照组；
（5）继续培养24h后，弃去培养基，加入CCK-8检测各孔450nm的吸光值并计算细胞活性。
表1 溶液a，b，c，d和e对于PEDV导致的Vero细胞活性下降的影响
从表1可以看出，阳性对照组相对于阴性对照组显示了显著的细胞活性下降（P＜0.001）；说明PEDV感染会显著的降低Vero细胞的细胞活性；
溶液a、溶液b、溶液c组相对于阳性对照组显示了显著的细胞活性增加（P＜0.05）；说明使用溶液a、溶液b、溶液c处理可以有效的减少PEDV对于Vero细胞的细胞活性的抑制作用；
同时，可以看出，按照不同比例的掌状红皮藻和四角蛤蜊原料所制备寡肽效果各不相同，其中寡肽2的效果最为显著；说明不同的掌状红皮藻和四角蛤蜊原料的比例，会显著影响所制备出的寡肽的效果，其原因可能是掌状红皮藻和四角蛤蜊中所含的寡肽成分种类及比例不同，所作用的细胞机制不同，从而使寡肽2的效果最为显著；
其次，可以看出，溶液d组和溶液e组与阳性对照组相比，细胞活性没有显著的差异（P＞0.05），说明1kDa-5kDa的多肽1和5kDa-10kDa的多肽2均不能有效减少PEDV对于Vero细胞的细胞活性的抑制作用。
实施例 7
（1）将Vero细胞接种到6孔培养板中，放入37℃，5% CO2的细胞培养箱中待细胞长为单层；
（2）将寡肽2使用MEM培养基配置成0，8，16，32，64，128 μg/mL的溶液并进行过滤除菌；
（3）细胞长为单层后，去除培养基，使用PBS清洗后，加入步骤（2）中配置的不同浓度的寡肽2溶液，每种溶液添加3个重复孔，放入37℃，5% CO2的细胞培养箱；
（4）培养24h后，去除培养基，加入CCK-8检测450nm吸光度并计算细胞活性。
表2 不同浓度的寡肽2对于Vero细胞的细胞活性的影响
从表2可以看出，随着浓度的增高，Vero细胞的细胞活性并没有出现显著的下降，说明在测试的浓度范围内，本发明所制备的寡肽2对于Vero细胞不存在明显的抑制作用，可以将其开发为功能性的药物。
实施例8
（1）将Vero细胞接种到6孔培养板中，放入37℃，5% CO2的细胞培养箱中待细胞长为单层；
（2）将寡肽2使用MEM培养基配置成0，8，16，32，64，128 μg/mL的溶液并进行过滤除菌；
（3）细胞长为单层后，去除培养基，使用PBS清洗后，加入步骤（2）中配置的不同浓度的寡肽2溶液，每种溶液添加3个重复孔，放入37℃，5% CO2的细胞培养箱孵育2h；
（4）弃去培养基，使用0.1 MOI PEDV感染细胞2h后，弃去PEDV感染液，使用PBS清洗后，加入新的无血清MEM培养基；
（5）继续培养24h后，弃去培养基，使用PBS清洗后，加入蛋白裂解液，提取各处理组的蛋白样品；
（6）利用BCA法测定蛋白样品浓度后，加入上样缓冲液，100℃煮5min后，得到蛋白样品；
（7）配置SDS凝胶，安装电泳架，上样后，进行电泳；
（8）待溴酚蓝到达底部后，停止电泳，安装电转夹，进行电转；
（9）电转结束后，将膜取出置于脱脂奶粉中，封闭1h；
（10）孵育PEDV-N和β-actin抗体，置于4℃孵育过夜；
（11）第二天回收一抗，洗膜后，孵育二抗，置于室温下孵育1h；
（12）去除二抗，洗膜后，进行显影，得到的结果如图1。
从图1中可以看出，随着寡肽浓度的增加，PEDV-N的蛋白灰度逐渐的降低；说明本发明所制备的寡肽2能够有效的抑制PEDV-N在Vero细胞中的复制合成，即可以有效的抑制PEDV病毒在Vero细胞中的复制，因此可以将本发明所制备的寡肽制备成抑制PEDV病毒的药物。
实施例9
（1）将Vero细胞接种到12孔培养板中，放入37℃，5% CO2的细胞培养箱中待细胞长为单层；
（2）将寡肽2使用MEM培养基配置成128 μg/mL的寡肽2溶液并进行过滤除菌；
（3）细胞长为单层后，去除培养基，使用PBS清洗后，进行如下的分组：
阴性对照组：更换为无血清的MEM培养基继续培养；
阳性对照组：0.1 MOI PEDV感染细胞2h后，弃去PEDV感染液，使用PBS清洗后，加入新的无血清MEM培养基；
预处理组：在培养孔中加入128 μg/mL的寡肽2溶液，置于培养箱中放置2h，之后弃去溶液；使用0.1 MOI PEDV感染细胞2h后，弃去PEDV感染液，使用PBS清洗后，加入新的无血清MEM培养基；
共培养组：将128 μg/mL的寡肽2溶液与0.1 MOI PEDV等量混合后，置于培养箱中放置2h，之后将混合后的溶液加入到培养孔中，感染细胞2h后弃去，使用PBS清洗后，加入新的无血清MEM培养基；
（4）继续培养24h后，弃去培养基，加入4%的多聚甲醛固定细胞30min；
（5）加入0.2% Triton-100透膜20min，之后使用5%脱脂奶粉封闭1h；
（6）加入PEDV-N一抗孵育1h后，去除一抗，PBS清洗后，加入二抗避光孵育1h；
（7）去除二抗，PBS清洗后，置于荧光显微镜下，×100观察和拍照，得到的结果如图2所示。
从图2可以看出，相较于未感染的阴性对照组，阳性对照组的出现显著的荧光，说明细胞被成功感染；
相较于阳性对照组，预处理的荧光强度明显降低，而共混组的荧光强度有所下降，但是效果并不显著；说明本发明所制备的寡肽主要是通过抑制PEDV对于细胞的感染来发挥抑制PEDV的作用，因此可以将本发明制备的寡肽用于抑制PEDV病毒感染的药物。
实施例10
（1）将实施例2制备的寡肽2使用0.9% 氯化钠注射液配置成8μg/mL的寡肽溶液；
（2）使用0.22μm的过滤膜进行过滤除菌后，分装至无菌药瓶中，得到抑制PEDV病毒的药物1。
实施例11
（1）将实施例2制备的寡肽2使用0.9% 氯化钠注射液配置成128μg/mL的寡肽溶液；
（2）使用0.22μm的过滤膜进行过滤除菌后，分装至无菌药瓶中，得到抑制PEDV病毒的药物2。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。
Claims (10)
1.一种寡肽在制备猪流行性腹泻病毒抑制药物中的应用，其特征在于，所述寡肽的制备方法包括如下步骤：
（1）将掌状红皮藻和四角蛤蜊肉清洗干净并干燥后，按照比例加入到研磨器中，研磨为粉末；
（2）将所述粉末按照1g:5mL的比例加入蒸馏水，搅拌均匀后，得到匀浆液；
（3）调节所述匀浆液的温度为37℃，pH为7.5后，加入胰蛋白酶酶解5h，得到酶解液1；
（4）加热所述酶解液1使酶灭活后，静置冷却至室温，得到酶解液2；
（5）将所述酶解液2加入到离心管中，置于离心机中离心，收集上清至容器中，得到酶解液3；
（6）将所述酶解液3使用1kDa的超滤膜进行过滤，收集滤过液，冷冻干燥得到寡肽。
2.根据权利要求1所述的一种寡肽在制备猪流行性腹泻病毒抑制药物中的应用，其特征在于，所述步骤（1）中，所述比例为1:1，3:2或2:3。
3.根据权利要求2所述的一种寡肽在制备猪流行性腹泻病毒抑制药物中的应用，其特征在于，所述步骤（1）中，所述比例为3:2。
4.根据权利要求3所述的一种寡肽在制备猪流行性腹泻病毒抑制药物中的应用，其特征在于，所述药物通过抑制猪流行性腹泻病毒的感染来有效的抑制猪流行腹泻病毒。
5.根据权利要求4所述的一种寡肽在制备猪流行性腹泻病毒抑制药物中的应用，其特征在于，所述药物为液体药物，所述液体药物中所述寡肽的浓度为8-128μg/mL，所述药物的给药方式为肌肉注射。
6.一种寡肽在制备猪流行性腹泻病毒感染抑制药物中的应用，其特征在于，所述寡肽的制备方法包括如下步骤：
（1）将掌状红皮藻和四角蛤蜊肉清洗干净并干燥后，按照3:2比例加入到研磨器中，研磨为粉末；
（2）将所述粉末按照1g:5mL的比例加入蒸馏水，搅拌均匀后，得到匀浆液；
（3）调节所述匀浆液的温度为37℃，pH为7.5后，加入胰蛋白酶酶解5h，得到酶解液1；
（4）加热所述酶解液1使酶灭活后，静置冷却至室温，得到酶解液2；
（5）将所述酶解液2加入到离心管中，置于离心机中离心，收集上清至容器中，得到酶解液3；
（6）将所述酶解液3使用1kDa的超滤膜进行过滤，收集滤过液，冷冻干燥得到寡肽。
7.根据权利要求6所述的一种寡肽在制备猪流行性腹泻病毒感染抑制药物中的应用，其特征在于，所述药物为液体药物，所述液体药物中所述寡肽的浓度为8-128μg/mL，所述药物的给药方式为肌肉注射。
8.一种寡肽在制备用于治疗猪流行性腹泻病毒引起的疾病的药物中的应用，其特征在于，所述寡肽由权利要求5所述的制备方法制备得到。
9.根据权利要求8所述的一种寡肽在制备用于治疗猪流行性腹泻病毒引起的疾病的药物中的应用，其特征在于，所述药物为液体药物，所述液体药物中所述寡肽的浓度为8-128μg/mL，所述药物的给药方式为肌肉注射。
10.一种用于抑制猪流行性腹泻病毒的药物，其特征在于，所述药物由如下的制备方法制备得到：
（1）将寡肽使用0.9% 氯化钠注射液配置成8-128μg/mL的寡肽溶液；
（2）使用0.22μm的过滤膜进行过滤除菌后，分装至无菌药瓶中，得到抑制猪流行性腹泻病毒的药物；
所述寡肽由权利要求5所述的制备方法制备得到。
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