CN112028980B - 丝胶蛋白、提取方法、作为细胞抗病毒免疫增强剂和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于天然蛋白成分的提取和病毒学技术领域，公开了一种丝胶蛋白、提取方法、作为细胞抗病毒免疫增强剂和应用，丝胶蛋白在制备用于预防和控制病毒感染药物中的用途；丝胶蛋白剂量浓度为10‑20mg/mL，有效终浓度为≥1mg/mL；丝胶蛋白的提取方法包括：选取可用的蚕茧和储存条件、蚕茧预处理和灭菌、丝胶溶解、透析和丝胶蛋白的复性、丝胶溶液浓缩、去除丝胶溶液中的内毒素、丝胶溶液过滤、丝胶溶液质量控制检测，符合检测标准的丝胶溶液作为细胞抗病毒免疫增强剂。本发明首次开发和利用蚕丝蛋白丝胶，作为预防和控制病毒感染的应用。本发明原材料来源广泛，相比其它抗病毒药物高昂的合成和生产费用，本发明成本低。

Description

丝胶蛋白、提取方法、作为细胞抗病毒免疫增强剂和应用
技术领域
本发明属于天然蛋白成分的提取和病毒学技术领域，尤其涉及一种丝胶蛋白、提取方法、作为细胞抗病毒免疫增强剂和应用。
背景技术
目前，丝胶是一种存在于蚕茧中的天然蛋白质，是包裹在蚕丝外层的活性成分。在纺织业中，蚕茧经过抽丝工艺提取用于制作纺织品的丝素，而丝胶以前通常作为工业废料抛弃。近年来，随着生物工程学和材料学的发展，研究者们开始逐渐发现使用价值，尤其是发现其具备多种生物学活性，更使这种物质成为研究热点，也让它变废为宝成为可能。诸多科学研究表明，丝胶具有低免疫原性、促细胞粘附和增值活性、促进代谢和促进细胞活力等活性，可作为高档化妆品中的活性成分，在食品和医疗领域的应用也开始有人开发和研究。
传统的丝胶提取工艺主要以水煮沸法为主，该方法通过加热，使蚕茧中的丝胶成分溶解，之后收集溶解在水溶液中的成分。优点是方法便捷，成本低廉。缺点是：1.提出的丝胶杂质较多，可能混有大量的丝素和蚕茧的其它成分；2.丝胶在加热的水溶液中十分不稳定，容易降解，得到的大部分是丝胶的降解产物；3.此外耗时较长，因为丝胶在热水中溶解比较费时。缩短时间可以减少丝胶降解，但得率就大打折扣，因此很难同时满足高得率和产物完整性。此种方法获得的丝胶，因品质和纯度都太低，只能用于饲料或者工业原料，比如作为生产氨基酸的原料等。
碱溶解法是对传统方法的改进后的一种技术。利用丝胶蛋白在弱碱性溶液中更易于溶解的特性，大大加快丝胶的溶解速度，再配合较低温度的加热，获得的丝胶比传统方法品质和得率都有一定程度的提高。尽管如此，该法获得的丝胶的品质和纯度任然无法满足生物医学研究和应用要求。
溴化锂法是比较有效的新型的丝胶提取方法，主要采用高浓度的溴化锂溶液在室温下溶解丝胶。该方法能获得完整的丝胶蛋白分子，且得率较高。溶解到丝胶溶液中的锂离子和溴离子很难完全去除干净，因此获得的丝胶很难应用于生物医学领域。
尿素法也是有效提取丝胶的新方法，它是通过利用高浓度的尿素溶液使蚕茧中的丝胶蛋白变性溶解，之后再通过复性获得高纯度完整的丝胶蛋白。该法的优点是得到的丝胶纯度和完整度都很高，且使用的溶解介质毒性低，且容易去除。缺点是尿素法中丝胶经过了变性和复性的过程，最后得到的蛋白的高级结构可能与天然结构不同。
丝胶是由蚕的丝腺细胞的三个基因Sericin-like 1，Ser2和Ser3编码合成和分泌的蛋白分子。丝胶蛋白的氨基酸序列包含了多个富含丝氨酸的重复序列，这样的重复序列中丝氨酸占比高达42.1％，在多肽链中每个丝氨酸残基上存在一个甲醇基团(-CH2OH)，甲醇基团由一个仲碳原子(-CH2-,一个C原子连接2个H原子)和一个醇羟基组成。丝胶的高丝氨酸特点决定了其蛋白序列中富含甲醇基团(-CH2OH)或醇羟基(-OH)。富含醇羟基的有机物化合物，具有很好吸水性，丝胶也具有良好的吸水性，因此有人开发丝胶作为护肤品，就是利用了其吸水保水滋润皮肤的活性。而甲醇基团(-CH2OH)容易被氧化成醛基(-CHO)，进一步氧化成羧基(-COOH)，具有还原性。因此富含甲醇基团(-CH2OH)的丝胶具有还原活性，是很好的生物抗氧化剂，利用其开发的护肤品具有抗氧化、抗衰老的功能和效果。
吸水性和抗氧化活性，是由丝胶的化学组成决定的，是丝胶重要的化学活性。丝胶的这两种化学活性已经得到很好的研究解析，并且得到了一定的应用。然而，除此之外，丝胶作为一种生物大分子蛋白，其生物学活性更值得研究，即丝胶是否可以调控细胞、组织、器官以及个体的分子信号传导和生命大分子反应过程？对细胞功能否具有什么调控作用？以及丝胶具有什么有价值的生物学活性或功能？一些研究者初步发现了丝胶的很多优良的生物学活性，丝胶可以促进某些细胞的增值，促进损伤组织的修复，抑制炎症反应，交联的丝胶水凝胶具有细胞粘附性。还有研究者发现，丝胶具有一定的抗肿瘤活性。这些研究工作为丝胶的开发和利用提供很好的启示。但丝胶作为一种天然的生物材料，针对特定的活性开发运用到细胞和人体，尤其需要考虑生物材料的生物安全性和生物学活性。
病毒一直是人类困扰不已挥之不去的恶魔，寻找有效的针对病毒的方法是病毒学研究者们一直以来孜孜以求的目标。其实，人类细胞具有天然的防控病毒的机制，就是细胞的天然免疫反应系统，这是人体抵抗病毒感染的第一道防线。病毒感染细胞时，细胞具有多种感受器捕获病毒的某些成分，捕获后这些感受器会激活下游的细胞信号，介导细胞启动表达干扰素，干扰素会诱导细胞多种抗病毒机制。例如细胞内RIG-I,Mda5以及TLR3/7等可识别病毒的特定成分，激活干扰素表达，从而启动下游的细胞抗病毒反应。目前的抗病毒药物大部分主要是针对病毒的吸附、入侵、表达、复制等过程而筛选或设计的。而现有的免疫增强剂发挥作用主要是通过提高机体的先天免疫和获得性免疫过程。本发明提供的丝胶蛋白，能特异性地提高细胞内的一种识别病毒RNA的模式受体及其下游信号的激活，从而使细胞对病毒的敏感性增强，更快地激活干扰素，产生更强的抗病毒免疫反应。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：(1)现有的丝胶提取方法，获得的丝胶产物在生物安全性、结构完整性、生物活性和较高的产物得率等方面存在问题，更是无法同时满足这些条件。
(2)现有技术对于活性丝胶蛋白应用于抗病毒没有提供有效技术支持。
(3)现有的免疫增强剂主要是增强机体的先天免疫和获得性免疫过程，对病毒感染的反应时间长，都不是通过增强细胞对病毒的识别和促进被感染细胞的抗病毒反应，针对性和特异性不强。
解决以上问题及缺陷的难度为：(1)解决提取的丝胶的生物安全性的难度在于：丝胶是蚕茧的天然成分，原材料本身就会从环境中吸附各种微生物和杂质，普通的提取方法也很难避免提取过程中的微生物和有害物质的污染。建立一套科学合理的提取方法和检测方案，包括原材料的灭菌处理，所用试剂、器件、环境的无菌化，初产物的透析、纯化以及热源物质的检测等等技术方案的设计，保证丝胶结构完整性和产物得率的前提下，避免微生物和有害物质混入丝胶产物。
(2)现有的提取方法，都会改变丝胶蛋白的天然构象或破坏其结构完整性，这会严重损害丝胶产物的生物活性。要最大限度从蚕茧中溶解丝胶蛋白，就会采用改变蛋白构象的化合物比如尿素、LiBr、碱等，或者加热的方法，碱、加热会打断蛋白质的肽链，尿素、LiBr和加热等会改变蛋白肽链的空间构象。避免选用碱和高温，选择更温和的条件进行溶解和提取，可以避免丝胶蛋白分子不被破坏，但维持丝胶蛋白分子的天然构象却很难做到。此外，如何选取丝胶生物学活性最高的蚕茧作为原材料，也是关键一环。
(3)丝胶的溶解属性决定丝胶溶液产物满足既有足够高的浓度，又能保持天然结构完整，且不含有尿素、LiBr等作为促溶作用的变性剂，是极难解决的技术问题。丝胶在尿素、LiBr溶液中，肽链空间构象被改变，溶解度很高，如果利用透析等方法去掉尿素或LiBr这些小分子后，组成丝胶蛋白的多肽链会重新折叠。实践表明，尿素或LiBr浓度逐渐降低后，高浓度的丝胶蛋白就会发生不可逆的沉淀析出，说明丝胶蛋白的多肽链发生了错误折叠导致溶解度降低。而作为细胞和体内应用的丝胶溶液，尿素和LiBr等分子又是必须去除的成分。并且，足够高的丝胶蛋白浓度、天然结构完整都是发挥细胞抗病毒免疫增强剂作用所必须的。
(4)针对抵抗病毒感染的免疫增强剂，不仅要具备无毒无害、高生物安全性，而且必须对细胞抗病毒反应具有特异性的增强作用。细胞抗病毒的天然免疫反应涉及的细胞分子和信号通路复杂，但遵循严密的分子机制。在天然无公害物质中，找到且特异性增强细胞抗病毒天然免疫反应的物质，也是一件具有创造性的工作。
解决以上问题及缺陷的意义为：解决丝胶提取的生物安全性问题，是这种天然材料可以应用到细胞、动物模型和人体的前提条件，
维持丝胶结构完整性是丝胶发挥生物学活性所必须的。
足够高的浓度的有活性的丝胶溶液，才具有生物医学应用价值。
寻找和开发天然无害的物质，作为特异性的细胞抗病毒免疫增强剂，能保证增强免疫效果的高效性和实用性，也保证了安全性。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种丝胶蛋白、提取方法、作为细胞抗病毒免疫增强剂和应用。具体涉及从蚕丝中提取有活性的丝胶蛋白，以及针对多种病毒的抗病毒测试，尤其是病毒学技术与材料学技术的结合。本发明提取的天然丝胶蛋白，在一定的条件下可以通过增强细胞天然免疫反应能力，从而保护细胞免受病毒感染。
本发明的目的是从蚕茧中提取出高生物安全性、结构完整的活性丝胶蛋白，并首次提出将这种天然材料应用于抗病毒。本发明提供的丝胶纯度高，不含内毒素，结构完整，且具有生物学活性，可直接用于细胞病毒感染模型，动物感染模型和人体。本发明提供的丝胶蛋白，保存了天然丝胶的完整结构和活性，可以通过促进细胞天然免疫反应激活速度和效率，从而增强细胞抗病毒天然免疫反应。
本发明是这样实现的，一种丝胶蛋白在制备用于预防和控制病毒感染药物中的用途。
进一步，所述丝胶蛋白在制备用于预防和控制水泡性口炎病毒、肠道病毒-71感染药物中的应用。
进一步，提取所述丝胶蛋白浓度为10-20mg/mL，所述丝胶蛋白在细胞培养环境/体内组织液环境中细胞培养体系或组织液有效终浓度>1mg/mL。
提取的蛋白浓度必须比使用后(细胞生长环境)的终浓度高。例如：细胞培养体系中加入培养基体积1/10的本发明丝胶(10-20mg/mL)，细胞培养体系中丝胶终浓度即为1-2mg/mL。
此外，体外细胞培养，加入丝胶体积如果大于培养基体积的1/10，因为过多过多地稀释培养基，会导致细胞营养不良。
体内即使局部给予丝胶，要想达到局部组织终浓度1mg/mL，丝胶原液浓度也必须高于这个终浓度。
进一步，所述丝胶蛋白溶液内毒素含量低于0.25EU/mL,不会干扰细胞天然免疫反应信号转导，也避免了炎症反应。
本发明的另一目的在于提供一种丝胶蛋白的提取方法包括：
步骤一，选取可用的蚕茧和储存条件；选取结茧后24小时内破口除去蚕蛹的蚕茧；储存条件：选好的蚕茧在4℃或-20℃保存备用；
步骤二，蚕茧预处理和灭菌：在无菌环境中将蚕茧剪碎成碎片置于无菌容器中；将剪好的蚕茧碎片，单层分散平铺于无菌的玻璃板上，置于紫外线中照射；后翻动蚕茧碎片后，紫外线再照射；
步骤三，丝胶溶解，采用溴化锂法或尿素法；
步骤四，透析和丝胶蛋白的复性，对步骤三的溴化锂法产物透析、尿素法产物透析；
步骤五，丝胶溶液浓缩，最后一次透析完成后，在无菌环境下，将装有丝胶溶液的浓缩；
步骤六，去除丝胶溶液中的内毒素，采用蛋白质去内毒素试剂盒清除丝胶溶液中混有的少量内毒素，操作在无菌环境下进行；
步骤七，丝胶溶液过滤：在无菌环境下，吸取清除内毒素后的丝胶溶液，用滤器进行过滤；
步骤八，丝胶溶液质量控制检测和要求，包括：丝胶蛋白含量测定、蛋白质电泳、内毒素检测、在RNA病毒感染细胞实验模型中，用获得的丝胶溶液以不低于1mg/mL的终浓度预处理细胞12小时，之后用工具病毒感染丝胶处理和未用丝胶的对照细胞；
步骤九，完全符合步骤八中四项项检测标准的丝胶溶液作为细胞抗病毒免疫增强剂，用于抗病毒应用。
进一步，步骤二中，将蚕茧剪碎成小于2x2 mm2的碎片置于无菌容器中；将剪好的蚕茧碎片，置于光强度为1400Lux的紫外线中照射30分钟；后翻动蚕茧碎片后，相同条件紫外线再照射30分钟；
步骤三中，丝胶溶解具体包括：
a.溴化锂法：在无菌环境中，将每克蚕茧碎片投放入55mL浓度为521.1g/L的无菌溴化锂水溶液中，37℃恒温振荡6-12小时；取全部混合物置于无菌离心管中，12000rpm 4℃离心15分钟，取上清液置于新的离心管中，再次离心取上清，重复3-5次，直至完全去除未溶解物质；
b.尿素法：在无菌环境中，将每克蚕茧碎片投放入20mL浓度为480g/L的无菌尿素水溶液中，37℃恒温振荡6-12小时；取全部混合物置于无菌离心管中，12000rpm 4℃离心15分钟，取上清液置于新的离心管中，再次离心取上清，重复3-5次，直至完全去除未溶解物质。
进一步，步骤四中，溴化锂法产物透析的方法包括：无菌的4℃环境中，吸取丝胶溶液置于透析袋中密封好，置于10倍体积的含有2mM谷胱甘肽的无菌去离子水中透析，2mM谷胱甘肽包括1.6mM还原性谷胱甘肽GSH和0.4mM氧化型谷胱甘肽GSSG；每6小时更换一次含2mM谷胱甘肽的无菌去离子水，共透析3次；在不含谷胱甘肽无菌去离子水中再透析4次，每次6小时；
步骤四中，尿素法产物透析方法包括：无菌的4℃环境中，吸取丝胶溶液置于透析袋中密封好，置于10倍体积的浓度为含2mM谷胱甘肽的6M的无菌尿素溶液中透析6小时，后置于10倍体积的浓度为含2mM谷胱甘肽4M的无菌尿素溶液中透析6小时，后置于10倍体积的浓度为含2mM谷胱甘肽2M的无菌尿素溶液中透析6小时；置10倍体积的不含谷胱甘肽的无菌去了离子水中透析6小时，定时更换无菌去离子水，每次透析时间不低于6小时，透析4次；
步骤五中，取聚乙二醇PEG6000固体粉末完全覆盖透析袋，10分钟后用无菌去离子水将透析袋外的聚乙二醇冲洗干净；使每克蚕茧浓缩后的丝胶溶液体积在10-20mL。
进一步，步骤八中，包括：
1)丝胶蛋白含量测定：获得的丝胶溶液用标准的商业化蛋白浓度检测试剂盒进行浓度测定，提取的丝胶溶液丝胶蛋白含量合格范围在10-20mg/mL；
2)蛋白质电泳：取10微升获得的丝胶溶液按照标准的SDS-PAGE蛋白质电泳流程进行电泳，后对凝胶进行考马斯亮蓝染色，显示蛋白条带；结构完整丝胶蛋白在250kD以上和以下分别有1个和2个明显的条带；(如附图3所示)
3)内毒素检测:利用鲎试剂检测获得的丝胶溶液中内毒素的含量，符合生物安全性的丝胶溶液内毒素含量低于0.25EU/mL；
4)在RNA病毒感染细胞实验模型中，用获得的丝胶溶液以不低于1mg/mL的终浓度预处理细胞12小时，用工具病毒感染丝胶处理和未用丝胶的对照细胞。之后通过病毒学技术检测后，能看到丝胶预处理过的实验组与对照组相比。
本发明的另一目的在于提供一种所述用途中丝胶蛋白作为细胞天然免疫反应增强剂在制备RNA病毒的预防和治疗药物中的应用。丝胶蛋白剂量浓度为10-20mg/mL，细胞和组织终浓度不低于1mg/mL效果最佳。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述细胞天然免疫反应增强剂制备的用于皮肤、黏膜组织的免疫产品，制备的抗病毒护肤品、食品。
本发明的另一目的在于提供一种实施所述丝胶蛋白的提取方法的丝胶溶液的生物安全性控制体系，所述丝胶溶液的生物安全性控制体系包括：蚕茧的灭菌和消毒和无菌环境操作设备，无菌用品和试剂、无菌操作和透析清除小分子和内毒素清除和过滤清除大分子和大颗粒设备。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：
本发明基于尿素法提取丝胶的基本原理，对提取工艺进行改进，可以从蚕茧中提取高纯度，高完整性，无毒害的丝胶。尤其，本发明获得的丝胶制品可以达到无菌、无核酸酶和无热源的要求，不仅可以用于细胞、动物的科学研究，理论上也可以用于人体。本发明提出的丝胶可以直接用于针对多种病毒的抗病毒测试，包括细胞水平和动物水平测试。通过检测在不同浓度条件、不同给药方式的条件下多种病毒的感染和复制水平，本发明找到了丝胶用于防控病毒的必备条件，和最优的给予方式。通过不同类型病毒的抗病毒测试，发明人明确了丝胶可用防治的病毒感染性疾病的类型。
本发明与现有的丝胶提取技术相比，具有以下突出优势：
(1)本发明获得的丝胶产物具有更高的纯度，具有更高的生物安全性，产物应用范围更广。本发明对天然蚕茧的灭菌、无菌环境要求以及无菌操作标准保证丝胶在提取过程中的生物安全性，此外采用去内毒素技术，清除原材料可能从环境中混入的细菌细胞壁致热源成分，进一步保证本发明的生物安全性。抗病毒制剂中，如果混有致热源，会严重干扰细胞识别病毒特定成分(也是病毒的热源物质)，影响细胞启动天然免疫反应，并造成有害的炎症反应。本发明提供的丝胶产物，可用于细胞培养体系、动物模型以及人体。以医用氯化钠注射液(注射液是各种医用品中要求最严格的)为例，内毒素标准是<0.5EU/mL，本发明提供的丝胶溶液内毒素<0.5EU/mL。(如附图4、附图5所示)。
(2)本发明通过反复的试验明确了丝胶溶解、透析和浓缩的条件和液体体积范围等技术参数，降低丝胶不可逆析出的发生，提高可溶性丝胶蛋白的得率。本发明每1克蚕茧可获得体积为10-20mL浓度为10-20mg/mL的丝胶溶液产物(如附图2所示)，即理论上每1克蚕茧可获得0.1-0.4g(下限，最小体积X最小浓度；上限，最大体积X最大浓度)溶解状态的丝胶蛋白，实际实践中产物体积为最小值时浓度会更接近上限，实际操作中每1克蚕茧可获得0.2-0.3g溶解状态的丝胶蛋白。事实上，每1克天然蚕茧中丝胶的含量为0.3克左右，因此本发明丝胶的得率在60％-100％之间。严格控制实际操作过程中的丝胶溶解、透析和浓缩的条件和液体体积范围等技术参数，得率可以达到90％以上。现有的丝胶提取技术存在诸多的水解、不可逆析出等问题，可溶性丝胶得率极低。
(3)本发明通过结构完整性和生物学活性质量控制，最大限度地保护了丝胶蛋白的天然生物学活性。
本发明首次提供的无致热源、结构完整且具有生物学活性的丝胶可以作为细胞抗病毒免疫增强剂。
本发明提供的丝胶通过改善细胞代谢状态，降低细胞无氧呼吸(糖酵解)水平从而抑制胞内乳酸产生。细胞内乳酸水平的升高，可以降低病毒RNA感受器RIG-I蛋白的稳定性，使病毒RNA/RIG-1/MAVS的干扰素激活途径被抑制，从而导致细胞抗病毒天然免疫处于抑制状态。本发明丝胶处理的细胞，RIG-1/MAVS信号水平得到显著提升，对病毒RNA的灵敏度大幅度提高。(如附图6所示)
本发明提供的丝胶蛋白显著提高干扰素启动子活性，终浓度为1mg/mL的丝胶蛋白可以提高IFN-启动子活性8-10倍(如附图7所示)。
本发明提供的丝胶蛋白能显著提高细胞对不同感染剂量的水泡性口炎病毒感染的抵抗力，而且在低剂量的病毒感染时，丝胶蛋白处理的细胞完全可以完全阻断病毒的感染(如附图8所示)。本发明提供的丝胶处理的细胞，感染水泡性口炎病毒后，新产生的病毒的数量显著降低(如附图9所示)。
本发明提供的丝胶蛋白，在肠道病毒-71(EV71)感染时，能使细胞在更短的时间内激活干扰素的表达，且大幅度提高干扰素表达水平(如附图11所示)。本发明提供的丝胶蛋白处理过的细胞，感染肠道病毒-71后新产生的病毒拷贝数显著降低(如附图11所示)。
本发明提供的丝胶，是用符合病毒学要求提取的天然蛋白分子，可以用于预防和控制水泡性口炎病毒、肠道病毒-71的感染。本发明发挥作用的途径是提高RIG-I/MAVS信号水平，RIG-I是细胞内双链RNA的识别元件，因此可以说明本发明能显著地提高细胞对RNA病毒感染的细胞天然免疫反应，是针对RNA病毒感染的细胞免疫增强剂。(如附图6，7，8，9，10，11所示)。
本发明首次开发和利用蚕丝蛋白丝胶，作为预防和控制病毒感染的应用。
本发明提供的丝胶与现有的抗病毒药物或技术手段相比，具有不可替代优势。第一，原材料来源广泛，应用成本低廉。蚕茧本是生产丝绸的原材料，是桑蚕养殖业主要的主要产品，利用蚕茧提取和生产抗病毒的丝胶产品，相比其它抗病毒药物高昂的合成和生产费用，本发明在转化和应用上，具有绝对的成本优势。第二，生物安全性更高，应用范围更加广泛。丝胶作为蚕茧天然成分，在护肤品和食品中也有小规模的实际应用，材料本身无毒无害的属性已得到有效的实践证实，因此本发明提供的技术可以开发成日常使用的防护病毒产品。
本发明提供的丝胶溶液提升细胞抗病毒天然免疫反应的有效浓度为不低于0.1mg/mL，最佳效果终浓度为不低于1mg/mL，可开发为用于皮肤、黏膜等组织的免疫增强剂，也能以护肤品、食品等形式开发为抗病毒产品。
本发明拓展了丝胶的应用，开发了丝胶的潜在应用价值。丝胶在丝绸纺织工业的蚕茧抽丝这一生产步骤中，通常作为不用废弃物或者作为廉价副产品处理，本发明提供的技术可与传统丝绸行业进行整合互补，变废为宝，将丝胶开发为细胞抗病毒免疫增强剂，为人类健康提供保障。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例。
图1是本发明实施例提供的丝胶蛋白提取技术方案。A.蚕茧、蚕丝模拟图和蚕丝横截面示意图。蚕丝横截面示意图显示，蚕丝由核心的丝素和包裹在外围的丝胶蛋白组成。B.本发明提供的丝胶蛋白提取的技术流程图。
图2是本发明实施例提供的丝胶提取过程浓度/含量控制数据。本发明提供的丝胶提取技术流程执行过程中，溶解、透析/复性、浓缩等步骤所得产物以及终产物的丝胶浓度检测和控制数据。两种溶解法所得丝胶溶液，通过精确地控制体积、浓度和丝胶蛋白溶解极限，避免丝胶蛋白发生不可逆析出保证得率，并获得丝胶蛋白合适的浓度的终产物(要求范围10-20mg/mL,实施例的两种方法都控制在15mg/mL左右)。
图3是本发明实施例提供的丝胶溶液SDS-PAGE电泳后，考马斯亮蓝染色结果。蛋白Ladder从上向下第一条带分子量大小为250kD,第二条为90kD.
图4是本发明实施例提供的丝胶溶液(LiBr法)用鲎试剂检测内毒素实验结果。(鲎试剂原理：内毒素含量越高浓度，越易形成凝胶)。
图5是本发明实施例提供的丝胶溶液(尿素法)用鲎试剂检测内毒素实验结果。
图6是本发明实施例提供的丝胶处理过的细胞和正常培养RD细胞(对照组)中RIG-I,MAVS,TLR4和MyD88的水平。
图7是本发明实施例提供的丝胶蛋白对干扰素启动子转录活性的促进作用。本发明提供的丝胶蛋白以终浓度0.1mg/mL，1mg/mL分别处理HEK293T细胞24小时后，经处理和未处理的正常培养的细胞，转染干扰素启动子质粒和Poly(I:C),转染24小时后测荧光素酶活性。
图8是本发明实施例提供的丝胶处理过的细胞抑制病毒感染。不同感染复数(MOI)的水泡性口炎病毒(VSV)感染人HepG2细胞12小时后，在显微镜下亮视野和荧光照片。丝胶处理的细胞病毒感染和病毒整合的绿色荧光蛋白(EGFP)明显低于对照细胞。
图9是本发明实施例提供的丝胶处理过的细胞中VSV病毒复制水平被抑制。利用终浓度为1mg/mL本发明的丝胶溶液孵育HepG2细胞24小时。感染复数(MOI)为1的水泡性口炎病毒(VSV)感染丝胶处理过的HepG2细胞和正常对照细胞24小时后，细胞培养上清液中的病毒拷贝数检测结果。
图10是本发明实施例提供的丝胶处理过的细胞，在病毒感染时干扰素更快被激活，表达水平也更高。利用终浓度为1mg/mL本发明的丝胶溶液孵育RD细胞24小时，收取处理过的细胞和正常培养的RD细胞，作为0小时样品。感染复数(MOI)为1的人肠道病毒71(EV71)感染丝胶处理过的RD细胞和正常对照细胞,感染时间3小时、6小时、10小时和14小时后分别收取细胞样，检测并计算干扰素-α(A)、干扰素-(B)、干扰素-λ1(C)信使RNA水平变化。
图11是本发明实施例提供的丝胶处理过的细胞中EV71病毒复制水平被抑制。利用终浓度为1mg/mL本发明的丝胶溶液孵育RD细胞24小时。感染复数(MOI)为1的人肠道病毒71(EV71)感染丝胶处理过的RD细胞和正常对照细胞24小时后，细胞培养上清液中的病毒拷贝数检测结果。
图12是本发明实施例提供的丝胶蛋白提取技术方案的设计与产物质量检测和控制要求紧密结合原理图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种丝胶蛋白、提取方法、作为细胞抗病毒免疫增强剂和应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明提供一种无致热源、高纯度、结构完整、具有生物学活性，能满足病毒学科研要求和应用需求的丝胶提取技术方法。
本发明提供的丝胶原材料灭菌、提取的无菌控制流程、致热源清除技术、保证丝胶完整蛋白结构的溶解、复性、浓缩和纯化等技术的联合应用方案。
本发明能满足病毒学科研和应用的丝胶的检测和质量控制技术和标准。即：蛋白浓度测定(丝胶浓度10-20mg/mL范围内)+SDS-PAGE电泳(可见三个条带)+致热源检测(内毒素含量低于0.25EU/mL)+生物学活性检测(抑制RNA病毒感染和复制水平)。
本发明丝胶的质量控制要求和提取流程紧密结合的操作和控制体系。
本发明提供一种生产对丝胶溶液的生物安全性控制系统:蚕茧的灭菌和消毒+无菌环境，无菌用品和试剂、无菌操作+透析清除小分子+内毒素清除+过滤清除大分子和大颗粒。
本发明提供的蚕茧的灭菌和消毒方法：无菌环境下剪碎成小于2x2 mm2的碎片，单层分散平铺于无菌的玻璃板上，置于光强度为1400Lux的紫外线中照射30分钟，后翻动蚕茧碎片后，相同条件紫外线再照射30分钟。
本发明提供的丝胶溴化锂溶液透析复性方法：无菌的4℃环境中，吸取丝胶溶液置于透析袋(MW3500)中密封好，置于10倍体积的含有2mM谷胱甘肽(包括1.6mM还原性谷胱甘肽GSH和0.4mM氧化型谷胱甘肽GSSG)的无菌去离子水中透析，每6小时更换一次含2mM谷胱甘肽的无菌去离子水，共透析3次。之后在无菌去离子水(不含谷胱甘肽)中再透析4次，每次6小时。
本发明提供的丝胶尿素溶液透析复性方法：无菌的4℃环境中，吸取丝胶溶液置于透析袋(MW3500)中密封好，置于10倍体积的浓度为6M的无菌尿素溶液(含2mM谷胱甘肽)中透析6小时，后置于10倍体积的浓度为4M的无菌尿素溶液(含2mM谷胱甘肽)中透析6小时，后置于10倍体积的浓度为2M的无菌尿素溶液(含2mM谷胱甘肽)中透析6小时。之后置10倍体积的无菌去了离子水(不含谷胱甘肽)中透析6小时，定时更换无菌去离子水，每次透析时间不低于6小时，透析4次。
本发明提供的变性丝胶复性液配方：含有1.6mM还原性谷胱甘肽(GSH)和0.4mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)的无菌去离子水，在丝胶蛋白复性中的应用。
本发明提供的含有1.6mM还原性谷胱甘肽(GSH)和0.4mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)的6M的无菌尿素溶液，在丝胶蛋白复性中的应用。
本发明提供的含有1.6mM还原性谷胱甘肽(GSH)和0.4mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)的4M的无菌尿素溶液，在丝胶蛋白复性中的应用。
本发明提供的含有1.6mM还原性谷胱甘肽(GSH)和0.4mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)的2M的无菌尿素溶液，在丝胶蛋白复性中的应用。
本发明提供的丝胶溶解和浓缩的含量/浓度控制体系：每1g蚕茧55mL 6M溴化锂或20mL 8M尿素溶解，浓缩时1g蚕茧对应的丝胶溶液体积控制在10-20mL，产物可用于抗病毒应用的丝胶蛋白浓度为10-20mg/mL。
本发明提供的丝胶完整结构和生物学活性控制方法：选材和保存(选取结茧后24小时内破口除去蚕蛹的蚕茧4℃或-20℃保存)+变性溶解后的丝胶蛋白复性技术。
本发明提供的丝胶蛋白用于预防和控制水泡性口炎病毒感染。
本发明提供的丝胶蛋白用于预防和控制肠道病毒-71感染。
本发明提供的丝胶蛋白可以作为细胞天然免疫反应增强剂，在针对RNA病毒的预防和治疗中的应用。
本发明提供的丝胶蛋白可作为辅料或者添加剂用于制备预防和治疗病毒感染性疾病的药物和医疗用品。
本发明提供的丝胶蛋白用于制备食物、护肤品、消毒剂、清洁剂等日常用品，作为添加成分达到预防病毒感染的效果。
下面结合可用于抗病毒的丝胶蛋白提取技术方案对本发明作进一步描述。
如图1所示，本发明提供的可用于抗病毒的丝胶蛋白提取方法，包括：
(1)选取可用的蚕茧和储存条件。蚕茧选取方法：选取结茧后24小时内破口除去蚕蛹的蚕茧。结茧后未除去蚕蛹的蚕茧，蚕丝的丝胶成分会被逐渐破坏，用于本发明的应用效果会逐渐降低。储存条件：选好的蚕茧可在4℃或-20℃保存备用，至少一年。
(2)蚕茧预处理和灭菌：在无菌环境中(生物安全柜或超净工作台中)，用灭菌过的镊子和剪刀将蚕茧剪碎成小于2x2 mm2的碎片置于无菌容器中。将剪好的蚕茧碎片，单层分散平铺于无菌的玻璃板上，置于光强度为1400Lux的紫外线中照射30分钟。后翻动蚕茧碎片后，相同条件紫外线再照射30分钟。
(3)丝胶溶解：包括：
a.溴化锂法。在无菌环境中，将每克蚕茧碎片投放入55mL浓度为521.1g/L(6M)的无菌溴化锂(LiBr)水溶液中，37℃恒温振荡6-12小时。之后，取全部混合物置于无菌离心管中，12000rpm低温(4℃)离心15分钟，取上清液置于新的离心管中，再次离心取上清，重复3-5次，直至完全去除未溶解物质。
b.尿素法。在无菌环境中，将每克蚕茧碎片投放入20mL浓度为480g/L(8M)的无菌尿素水溶液中，37℃恒温振荡6-12小时。之后，取全部混合物置于无菌离心管中，12000rpm低温(4℃)离心15分钟，取上清液置于新的离心管中，再次离心取上清，重复3-5次，直至完全去除未溶解物质。
(4)透析和丝胶蛋白的复性：步骤(3)中步骤a溴化锂法产物透析：无菌的4℃环境中，吸取丝胶溶液置于透析袋(MW3500)中密封好，置于10倍体积的含有2mM谷胱甘肽(包括1.6mM还原性谷胱甘肽GSH和0.4mM氧化型谷胱甘肽GSSG)的无菌去离子水中透析，每6小时更换一次含2mM谷胱甘肽的无菌去离子水，共透析3次。之后在无菌去离子水(不含谷胱甘肽)中再透析4次，每次6小时。
步骤(3)中步骤b尿素法产物透析：无菌的4℃环境中，吸取丝胶溶液置于透析袋(MW3500)中密封好，置于10倍体积的浓度为6M的无菌尿素溶液(含2mM谷胱甘肽)中透析6小时，后置于10倍体积的浓度为4M的无菌尿素溶液(含2mM谷胱甘肽)中透析6小时，后置于10倍体积的浓度为2M的无菌尿素溶液(含2mM谷胱甘肽)中透析6小时。之后置10倍体积的无菌去了离子水(不含谷胱甘肽)中透析6小时，定时更换无菌去离子水，每次透析时间不低于6小时，透析4次。
(5)丝胶溶液浓缩：最后一次透析完成后，在无菌环境下，将装有丝胶溶液的透析袋平放于无菌的平皿中，取聚乙二醇(PEG6000)固体粉末完全覆盖透析袋，10分钟后用无菌去离子水将透析袋外的聚乙二醇冲洗干净。保证每克蚕茧浓缩后的丝胶溶液体积在10-20mL，如果大于此体积，可重复上述浓缩过程。
(6)去除丝胶溶液中的内毒素：蚕茧在在环境中不可避免会接触或沾染少量细菌，而导致少量细菌内毒素混入丝胶溶液中，本发明采用蛋白质去内毒素试剂盒彻底清除丝胶溶液中可能混有的少量内毒素，操作在无菌环境下进行。
(7)丝胶溶液过滤：在无菌环境下，用注射器吸取清除内毒素后的丝胶溶液，用孔径为0.22微米的滤器进行过滤一次。
(8)丝胶溶液质量控制检测和要求，包括：
1)丝胶蛋白含量测定：获得的丝胶溶液用标准的商业化BCA蛋白浓度检测试剂盒进行浓度测定，提取的丝胶溶液丝胶蛋白含量合格范围在10mg-20mg/mL。
2)蛋白质电泳：取微量(约10微升)获得的丝胶溶液按照标准的SDS-PAGE蛋白质电泳流程进行电泳，后对凝胶进行考马斯亮蓝染色，显示蛋白条带。结构完整丝胶蛋白在250kD以上和以下分别有1个和2个明显的条带。
3)内毒素检测:利用商业化的鲎试剂检测获得的丝胶溶液中内毒素的含量，符合生物安全性的丝胶溶液内毒素含量低于0.25EU/mL。
4)在RNA病毒感染细胞实验模型中，用获得的丝胶溶液以不低于1mg/mL的终浓度预处理细胞12小时，之后用工具病毒(例如VSV-EGFP)感染丝胶处理和未用丝胶的对照细胞。之后通过病毒学技术检测后，能看到丝胶预处理过的实验组与对照组相比，病毒感染和复制水平显著降低，因病毒感染导致的细胞凋亡明显减少。
(9)完全符合步骤(8)中四项项检测标准的丝胶溶液即可作为细胞抗病毒免疫增强剂，用于实验研究和抗病毒应用。本发明提供的丝胶蛋白提取技术方案，采用的技术方法、流程和参数，可以确保符合丝胶溶液质量控制检测的各项标准(步骤(8))。
步骤(8)中，本发明提供的丝胶蛋白提取技术方案的设计与产物质量检测和控制要求紧密结合，如图12所示，包括
本发明首次提供提取出高生物安全性、结构完整的、高纯度且具有生物学活性丝胶蛋白的技术方案，是根据病毒学的技术需求，提取可用于细胞病毒感染实验模型、动物病毒感染模型以及人体抗病毒感染应用的丝胶蛋白。
产物中丝胶蛋白含量/浓度控制。根据不同浓度丝胶蛋白在干扰素的诱导实验中的结果(附图7所示)，发明者明确了促进细胞抗病毒天然免疫反应的丝胶蛋白终浓度不应低于1mg/mL，因为提取的丝胶如果应用于抗病毒时，体外的细胞培养体系必须考虑培养基的体积，如果用于人体更需要考虑给药体积和浓度，因此提取的丝胶溶液浓度至少要求是有效终浓度的10倍，即10mg/mL。浓度低于10mg/mL的丝胶产物，如果开展抗病毒实验，需要加入细胞培养体系的丝胶液体积过大，会导致培养基稀释过度，从而影响细胞的营养和状态，从而无法实现抗病毒效果。因此，符合要求的丝胶蛋白溶液，丝胶含量必须高于10mg/mL。另外，本发明获知丝胶蛋白溶液，无法采用传统的蛋白质浓缩手段，冻干法进行浓缩而提高丝胶蛋白的浓度。丝胶溶液冻融过程，或者会导致丝胶蛋白沉淀析出，这个过程不可逆，也就是说丝胶蛋白一旦以沉淀形式析出很难再溶解，完全冻干的丝胶蛋白溶解率非常低，远远达不到10mg/mL。发明者在常温通过减少丝胶溶液的溶剂(水)的方法来浓缩时，发现室温中性PH值条件下当丝胶蛋白浓度高于20mg/mL时，也会发生不可逆沉淀析出。最终，基于此生物材料特殊溶解性和发明者大量的探索试验结果，本发明将可用于抗病毒的应用丝胶液浓度范围定义在10-20mg/mL这个范围，浓缩时丝胶溶液的体积控制在1克蚕茧对应10-20mL丝胶溶液范围。
本发明提供的技术方案设计中采用如下三个技术措施来保证丝胶蛋白浓度：(1).“蚕茧的选取和储存”步骤中，发明者选择新鲜蚕茧，并且低温储存，这很好的保证原材料中丝胶不会因在环境中降解，最大限度地保证原材料中丝胶的含量；(2).在溶解丝胶这一步骤中，发明者选用LiBr和尿素溶解法，与热溶解和碱溶解法相比，减少了丝胶蛋白在溶解过程中的降解；(3).丝胶浓缩步骤中，本发明直接将透析完成后，装有丝胶溶液的透析袋直接与聚乙二醇固体接触，使透析袋里的水析出，从而达到浓缩丝胶的目的，浓缩时同时要密切关透析袋内液体体积，剩余体积过大丝胶的浓度会不够，体积过小会导致丝胶蛋白不可逆析出。发明人通过反复多次测试，明确了每1克蚕茧对应丝胶溶液的浓缩完成时的体积范围在10-20mL。可通过称量透析袋总重量估算丝胶溶液的即时体积。本发明通过对这三个提取过程的技术控制，获得能满足抗病毒应用所需的含量的丝胶产物(如附图附图2，6，7，8，9，10，11所示)。
丝胶蛋白结构完整性的控制。蛋白分子的结构完整性决定了功能完整性，能得到完整的丝胶蛋白分子，是研究和利用其生物学活性的前提条件。本发明保证了提取的丝胶蛋白结构完整(如附图三所示)，采取如下技术手段：(1).选取和保存原材料过程中，最大限度地保护丝胶蛋白免受自然降解而破坏结构。自然状态下，蚕在结茧完成到完成变态发育，长成蛾子破茧过程中，蚕茧上的丝胶蛋白不仅总含量逐渐减少，而且丝胶蛋白分子完整性也逐渐降低。丝胶分子的破坏与暴露于自然环境有关，更与蚕发育过程中对丝胶蛋白的利用密切相关。本发明提供的技术方案中，在蚕茧形成的第一时间破口去掉蚕蛹，有效保护了丝胶蛋白结构完整。(2).采用的溶解方法，避免丝胶蛋白分子完整性被高温或碱所破坏。(3).在透析和复性步骤所需的时间是整个技术流程中最长的，为减少丝胶蛋白分子在长时间的透析过程中可能会发生水解或者被蛋白酶降解，透析过程选择在4℃温度条件下进行。
纯度和生物安全性控制。用于抗病毒应用的丝胶蛋白，无论在细胞水平做抗病毒测试，还是在个体水平进行抗病毒应用，对于纯度和生物安全性都必须有较高的要求。首先，提取的丝胶不能含有过多的杂质，虽然蚕茧主要由蚕丝构成，而蚕丝只由丝素和丝胶两种蛋白质构成，但是环境中可能混入的杂质，粗糙的提取方法每一个过程都有混入杂质和微生物的可能性，纯度低的丝胶无法满足本发明的应用生物安全性的要求。其次，如果提取的丝胶含有的某种杂质成分，能干扰或者抑制丝胶蛋白的生物学活性，即使其含量很低也是不允许含有的。因此，纯度和生物安全性的控制，是丝胶蛋白生物学活性及其相关功能的开发和应用的前提条件和基础。
本发明保证了提取丝胶产物的安全性(如附图4，5所示)，通过如下的技术方案设计：(1).整个提取过程在无菌环境下进行，使用的所有器具全部经过灭菌处理，使用的所有试剂都经过高压灭菌或过滤除菌，操作过程完全遵守后无菌操作实验要求。(2).剪好的蚕茧碎片在溶解前，必须进行无菌处理，因为溶解是在37℃进行，且时间长，蚕茧原材料混入的少量微生物也可能在溶解体系中大量繁殖。对蚕茧碎片的灭菌，不能采用高温高压(会破坏丝胶蛋白)，也不能采用化学药物(会混入杂质).发明人采用紫外灭菌灭菌法，将蚕茧碎片“单层分散平铺于无菌的玻璃板上，置于光强度为1400Lux的紫外线中照射30分钟。后翻动蚕茧碎片后，相同条件紫外线再照射30分钟。”这种紫外强度和辐照时间，既可以保证完全杀死蚕茧碎片上可能吸附的细菌或真菌孢子，也不会破坏丝胶蛋白的分子结构。(3).溶解完成后，溶解所使用的LiBr和尿素必须从丝胶溶液中去除，因为它们均是小分子化合物，所以采用透析方法。溶有丝胶的LiBr溶液(LiBr原浓度为6M)经过7次10倍体积的无菌去离子水充分透析后，因为小分子LiBr可以在透析袋内外侧自由扩散，因此完成7次透析后，理论上丝胶溶液中LiBr浓度<6x 10-7M,即每升丝胶溶液含有0.0000521.1g，这个浓度的LiBr完全在生物安全范围之内，且LiBr法提取的丝胶仅用于细胞实验和动物体内，不用于人体。溶有丝胶的尿素溶液，经尿素浓度降低到2M后，在10倍体积的无菌去离子水中透析充分透析4次，理论上最终丝胶溶液中尿素浓度<2x 10-4M,即每升丝胶溶液含有0.012g尿素，这个尿素浓度也在生物安全性范围之内。(4).采用蛋白质去内毒素试剂盒对丝胶进行去内毒素操作，对原材料可能吸附的少量内毒素进行彻底的清除，进一步保证产物的生物安全性。(5).利用0.22微米孔径的滤器对丝胶溶液进行纯化，去除可能混有的超大分子、大颗粒杂质或者微生物，进一步保证丝胶的纯度和生物安全性。
丝胶生物学活性控制。(1).蚕茧的选取和保鲜措施，是保证丝胶蛋白生物学活性的第一步，也是重中之重。(2).目前现有的所有丝胶溶解和提取方法都是通过使丝胶变性(热变性、碱变性、化合物构想变性)，热变性和碱变性会造成不可逆的蛋白水解，本发明采用LiBr和尿素对丝胶进行构象变性(使丝胶蛋白的三、四级结构破坏)进行溶解，之后将装有变性溶解的丝胶蛋白溶液透析袋，放入含有复性剂的无菌去离子水中低温透析复性，变性丝胶蛋白以多肽的形式溶解溶解于高浓度LiBr或尿素溶液中，本发明采用透析体系，逐步降低LiBr或尿素浓度，丝胶蛋白的多肽链会逐步折叠，在重新折叠过程中二硫键的结合不会自然的与天然丝胶蛋白质中对应的巯基(-SH)对应，会有错配发生，在体系中加入复性剂(2mM谷胱甘肽，包括1.6mM还原性谷胱甘肽GSH和0.4mM氧化型谷胱甘肽GSSG)持溶液的还原条件，允许“错配者”反悔，最后趋向于热力学上更稳定的配对，使原丝胶蛋白质的多肽链自发折叠成天然构象。在这一步骤是保证天然丝胶蛋白活性的关键一步。
本发明提供的方法业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施，图1的本发明提供的仅仅是一个具体实施例而已。
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例1：
如图1所示，结构完整、高生物安全性可以用于抗病毒应用的丝胶蛋白提取(LiBr法)
(1)选取1g结茧后24小时内破口除去蚕蛹的蚕茧，或者符合此条件的4℃保存的蚕茧。
(2)蚕茧预处理和灭菌。在生物安全柜(Thermo)中，用灭菌过的镊子和剪将蚕茧剪碎成小于2x2 mm2的碎片，单层分散平铺于无菌的玻璃板上，置于光强度为1400Lux的紫外线中照射30分钟。后翻动蚕茧碎片后，相同条件紫外线再照射30分钟。
(3)在生物安全二级实验室中，将每克蚕茧碎片投放入55mL浓度为521.1g/L(6M)的无菌溴化锂(LiBr，国药)水溶液中，37℃恒温振荡6小时。之后，取全部混合物置于无菌离心管中，12000rpm低温(4℃)离心15分钟，取上清液置于新的离心管中，再次离心取上清，重复3-5次，直至完全去除未溶解物质。
(4)在生物安全二级实验室中，吸取溴化锂溶解的丝胶溶液置于透析袋(MW3500)中密封好，置于10倍体积的含有2mM谷胱甘肽(包括1.6mM还原性谷胱甘肽GSH和0.4mM氧化型谷胱甘肽GSSG，Sigma公司)的无菌去离子水中，在4℃冰箱中透析，每6小时更换一次含2mM谷胱甘肽的无菌去离子水(出自PALL实验用水仪，并高压灭菌)，共透析3次。之后在无菌去离子水(不含谷胱甘肽)中再透析4次，每次6小时。
(5)最后一次透析完成后，在生物安全二级实验室中，将装有丝胶溶液的透析袋平放于无菌的平皿中，取聚乙二醇(PEG6000，国药)固体粉末完全覆盖透析袋，10分钟后用无菌去离子水将透析袋外的聚乙二醇冲洗干净。通过电子天平称重估算透析袋中丝胶溶液体积，保证每克蚕茧浓缩后的丝胶溶液体积在10-20mL，如果体积大于20mL，可重复上述浓缩过程。
(6)在生物安全二级实验中，采用蛋白质去内毒素试剂盒(Cloud-Clone,IS002，按照产品说明书操作)彻底清除丝胶溶液中可能混有的内毒素。
(7)在生物安全二级实验中，用注射器(BD公司生产)吸取清除内毒素后的丝胶溶液，用孔径为0.22微米(BD公司生产)的滤器进行过滤一次，受样品于无菌袋盖容器中备用。
实施例2：
结构完整、高生物安全性可以用于抗病毒应用的丝胶蛋白提取(尿素法)。
(1)选取1g结茧后24小时内破口除去蚕蛹的蚕茧，或者符合此条件的4℃保存的蚕茧。
(2)蚕茧预处理和灭菌。在生物安全柜(Thermo)中，用灭菌过的镊子和剪将蚕茧剪碎成小于2x2 mm2的碎片，单层分散平铺于无菌的玻璃板上，置于光强度为1400Lux的紫外线中照射30分钟。后翻动蚕茧碎片后，相同条件紫外线再照射30分钟。
(3)在生物安全二级实验室中，将5克蚕茧碎片投放入100mL浓度为480g/L(8M)的无菌尿素(国药)水溶液中，37℃恒温振荡6-12小时。之后，取全部混合物置于无菌离心管中，12000rpm低温(4℃)离心15分钟，取上清液置于新的离心管中，再次离心取上清，重复3-5次，直至完全去除未溶解物质。
(4)在生物在生物安全二级实验室中，取尿素溶解的丝胶溶液置于透析袋(MW3500)中密封好，置于10倍体积的浓度为6M的无菌尿素溶液(含2mM谷胱甘肽)中透析6小时，后置于10倍体积的浓度为4M的无菌尿素溶液(含2mM谷胱甘肽)中，4℃透析6小时，后置于10倍体积的浓度为2M的无菌尿素溶液(含2mM谷胱甘肽)中透析6小时。之后置10倍体积的无菌去了离子水(不含谷胱甘肽)中透析6小时，定时更换无菌去离子水，每次透析时间不低于6小时，透析4次。
(5)最后一次透析完成后，在生物安全二级实验室中，将装有丝胶溶液的透析袋平放于无菌的平皿中，取聚乙二醇(PEG6000，国药)固体粉末完全覆盖透析袋，10分钟后用无菌去离子水将透析袋外的聚乙二醇冲洗干净。通过电子天平称重估算透析袋中丝胶溶液体积，保证每克蚕茧浓缩后的丝胶溶液体积在10-20mL，如果体积大于20mL，可重复上述浓缩过程。
(6)在生物安全二级实验中，采用蛋白质去内毒素试剂盒(Cloud-Clone,IS002，按照产品说明书操作)彻底清除丝胶溶液中可能混有的内毒素。
(7)在生物安全二级实验中，用注射器(BD公司生产)吸取清除内毒素后的丝胶溶液，用孔径为0.22微米(BD公司生产)的滤器进行过滤一次，受样品于无菌袋盖容器中备用。
实施例3：
丝胶提取过程质量控制和产物丝胶溶液质量检测。
(1)提取过程中的LiBr和尿素溶解的丝胶溶解液、透析/复性产物、浓缩产物和最终得到的丝胶溶液，在每个步骤中吸取10uL,置于-20℃保存。提取完成后，购买商业化的BCA蛋白浓度检测试剂盒(Milipore),按照试剂盒使用说明书的操作，对收集的溶液进行蛋白浓度测定。
浓度测定结果如附图2所示，通过浓度/体积控制，避免了提取过程中丝胶蛋白不可逆析出，既保证了得率，又保证了获得产物丝胶溶液的浓度满足预防和控制病毒的应用要求(如附图2所示)。1g蚕茧LiBr法提取获得的16.4mL终产物丝胶溶液，浓度为15.6mg/mL，计算得率为85.3％。1g蚕茧尿素法提取获得的18.7mL终产物丝胶溶液，浓度为14.3mg/mL，计算得率为89.1％。
表：丝胶提取产物体积、浓度和得率
Figure BDA0002680802950000141
(2)取终产物丝胶溶液10uL,按照标准SDS-PAGE电泳制样方法进行制样，后和蛋白质ladder一起上样，开始110伏恒压电泳至溴酚蓝指示带跑至凝胶底部。取下凝胶，进行考马斯亮蓝染色、脱色，后观察凝胶中丝胶样品泳道的蛋白质条带，并对凝胶进行拍照。
如附图3所示，两种方法提取的丝胶溶液，经SDS电泳后均呈现出三个主要条带，说明本发明提取的产物比较完整天然丝胶结构。
(3)购买商业化内毒素提取试剂盒(鲎试剂)，取100uL提取获得的丝胶溶液，进行内毒素检测，丝胶溶液结果与阴性对照和阳性对照进行对比。如附图4、图5所示，两种方法获得的丝胶溶液的内毒素含量均低于0.25EU/mL，说明本发明生物安全性较高。
(4)生物学活性测试，主要测试获得的丝胶蛋白对细胞抗病毒天然免疫反应的促进作用，具体方法参考实施例4、实施例5。
实施例4：
本发明处理过的细胞抵抗水泡性口炎病毒测试
(1)根据本发明的丝胶溶液浓度值，用含有双抗(Gibico)和胎牛血清(Gibico)的DMEM(Gibico)培养基(一下简称基础培养基)将丝胶溶液浓度稀释到10mg/mL备用。
(2)培养的HepG2细胞铺24孔板，培养至密度为50％(细胞覆盖培养板底面积比例)，一半的孔培养基换为每孔0.45mL新鲜基础培养基和0.05mL 10mg/mL的丝胶本发明溶液(丝胶蛋白终浓度为1mg/mL)，另一半的孔换为0.5mL新鲜基础培养基作为对照，继续培养。
(3)收样和检测病毒RNA感受器信号基因。培养24小时后收取细胞。荧光定量PCR技术检测细胞样品中RIG-I,MAVS,TLR4,MyD88等基因的表达水平。
如附图6所示，经丝胶培养的HepG2细胞RIG-I,MAVS的表达表达水平显著高于对照细胞，说明本发明提供的丝胶蛋白可以提高细胞内病毒RNA感受器RIG-I和信号转导分子MAVS的水平，而对TLR4,MyD88有明显的促进作用。
(4)继续培养24小时后，所有板孔换成0.5mL新鲜基础培养基，加入I MOI的VSV-EGFP病毒(按每孔2.5x104细胞计算)，并轻轻晃动培养基，2小时后吸弃含病毒的培养基，换入等体积的新鲜基础培养基，继续培养。
(5)采用步骤(2)相同的方法，分别在24孔板中对HEK293T细胞采用终浓度为0.1mg/mL，1mg/mL的丝胶蛋白培养24小时，后对两种丝胶处理的细胞和正常培养的细胞转染Poly(I:C)和IFN-启动子质粒(两者比例2：1)，转染完成6小时后，换新鲜培养基，培养18小时，之后检测荧光素酶活性。
如附图7所示，0.1mg/mL和1mg/mL的丝胶蛋白均能提高IFN-启动子的活性，1mg/mL的丝胶蛋白的作用更为显著，提高IFN-启动子活性8-10倍。
(6)采用步骤(2)相同的方法，分别在24孔板中对HepG2细胞采用终浓度为1mg/mL的丝胶蛋白培养24小时，后分别加入感染复数为10MOI,1MOI,0.1MOI和0.01MOI的VSV-EGFP病毒感染，12小时后，通过荧光显微镜观察绿色荧光评估病毒感染情况。
如附图8所示，丝胶蛋白处理过的细胞，对不同感染复数的病毒感染均有显著的抑制作用，而且，在最低感染复数0.01MOI的病毒感染情况下，丝胶蛋白处理过的细胞完全抑制了病毒感染。
(7)终浓度为1mg/mL的丝胶培养24小时的细胞和正常细胞，经感染复数为1MOI的VSV-EGFP感染的24小时后，收取细胞培养上清液，提取RNA，荧光定量PCR技术检测病毒RNA拷贝数。
如附图9所示，正常细胞感染病毒后上清液中病毒拷贝数约为1.5x107每毫升，而丝胶培养过的细胞上清液病毒拷贝数约为4x105每毫升。
实施例5：
本发明处理过的细胞抵抗人肠道病毒71测试
(1)经终浓度为1mg/mL的丝胶培养24小时的RD细胞，和正常培养的RD细胞，采用感染复数为5MOI的EV71感染，感染前和病毒感染后第3、6、10、14小时收取丝胶处理和未处理的RD细胞样品，提取RNA后用荧光定量PCR技术检测干扰素-α，干扰素-，干扰素-λ1的表达水平。
如附图10所示，丝胶培养的细胞在病毒感染后3小时，干扰素-α，干扰素-和干扰素-λ1均被激活，且RNA表达量达到最大值，激活速度和表达量显著高于未经丝胶培养的细胞。
(2)经终浓度为1mg/mL的丝胶培养24小时的RD细胞，和正常培养的RD细胞，采用感染复数为5MOI的EV71感染，病毒感染后第24小时收取丝胶处理和未处理的RD细胞上清液，提取RNA，荧光定量PCR技术检测病毒RNA拷贝数。
如附图11所示，正常培养的RD细胞经EV71感染24小时后，上清中病毒拷贝数约为1.75x107，经丝胶培养的细胞上清液中病毒拷贝数为5x105。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种丝胶蛋白在制备用于预防和控制病毒感染药物中的用途；
所述丝胶蛋白在制备用于预防和控制水泡性口炎病毒、肠道病毒-71感染药物中的应用；
提取所述丝胶蛋白浓度为10-20mg/mL，所述丝胶蛋白在细胞培养环境/体内组织液环境中细胞培养体系或组织液有效终浓度>1 mg/mL。
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