CN1782067A

CN1782067A - 采用gs115酵母菌合成重组人肠三叶因子的工艺

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Publication number: CN1782067A
Application number: CN 200510057295
Authority: CN
Inventors: 彭曦; 孙勇; 汪仕良; 黄跃生
Original assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2005-09-27
Filing date: 2005-09-27
Publication date: 2006-06-07
Anticipated expiration: 2025-09-27
Also published as: CN100381560C

Abstract

本发明涉及基因工程的DNA或RNA、载体和质粒，或其分离、制备或纯化。是一种采用GS115酵母菌合成重组人肠三叶因子的工艺：包括目的基因的获取、酵母表达载体的构建、酶切及测序鉴定、转化入GS115酵母菌、诱导表达和纯化六步过程。按照本发明表达方法获得的重组人肠三叶因子，表达产量可达100mg/L，提纯纯度可达95％或更高，纯化的蛋白产物经检测结果表明：用本发明表达方法获得的重组人肠三叶因子为高纯度、无热源、无内毒素，有正确的分子量，与天然的肠三叶因子有相同的等电点、氨基酸序列和紫外光谱，及其完好的生物学活性的重组蛋白。它在治疗由各种致伤因子引起的胃肠粘膜损伤等方面具有显著效果。

Description

采用GS115酵母菌合成重组人肠三叶因子的工艺

一、技术领域

本发明涉及基因工程的DNA或RNA、载体和质粒，或其分离、制备或纯化，具体涉及重组人肠三叶因子的表达和纯化。

二、背景技术

肠三叶因子(以下简称ITF)是分布于肠道的特异小分子蛋白，分子量约6～7kD。ITF由59个氨基酸残基构成，包含一个由38～39个氨基酸残基组成的特定序列，其中的6个半胱氨酸以1-5，2-4，3-6的顺序依次形成3个二硫键，从而产生特异而稳定的三叶结构。这种稳定的结构确保其在肠道中发挥活性，不受消化酶和pH变化的影响。正常情况下，ITF分布于整个小肠，特别是小肠绒毛环状细胞的基底部。ITF在体内以20％单体和80％二聚体的形式存在，但只有二聚体才具有生物活性。ITF不仅能促进肠上皮细胞增殖和移行，还能同粘蛋白中的寡聚糖或多糖的侧链相连，稳定肠粘液层。因此，ITF对肠道的保护作用非常强，。它在治疗由各种致伤因子引起的胃肠粘膜损伤等方面具有显著效果。

现有技术中，在《Biochemistry》，1995，34：4757-476，有一篇由Thim L，Woldike HF，Nielsen PF，et al.撰写的论文：“Characterization of human and rat intestinal trefoil factotproduced in yeast”，报道有肠三叶因子在酵母中的表达方法。该方法是利用第一代酿酒酵母发酵获得重组肠三叶因子。但它存在的缺陷是：它由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降，原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，导致了产量的降低，仅为48mg/L；它的纯化方法烦琐，操作复杂、步骤较多。2002年5月2日公开有一件主题名称为“肠三叶蛋白”的美国专利文献US20020052483A1，在关于肠三叶因子的来源上，该文献指出：应用真核表达载体(如pMAMneo)，在COS细胞、CHO细胞等真核细胞中表达；直接从机体肠道粘膜中提取肠三叶因子。但按照它所介绍的方法具有以下不足：1.利用真核细胞表达获得肠三叶因子，虽然蛋白活性尚好，但成本较高、产量低，难以大规模生产；2.利用肠粘膜提取肠三叶因子，虽然可以得到天然的肠三叶因子，但其原料(肠粘膜)来源受限，产量更是极其有限。

三、发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种不同于现有技术的采用GS115酵母菌合成重组人肠三叶因子的工艺，以便提高表达产量和纯度，有利于ITF的开发应用。

采用以下技术方案来实现本发明的目的。

一种采用GS115酵母菌合成重组人肠三叶因子的工艺，由目的基因的获取、酵母表达载体的构建、酶切及测序鉴定、转化入GS115酵母菌、诱导表达和纯化六步过程组成。

1.目的基因的获取

从正常人小肠绒毛中提取总RNA，通过RT-PCR获得编码59个氨基酸的肠三叶因子的基因序列：

GAGGAGTACGTGGGCCTGTCTGCAAACCAGTGTGCCGTGCCAGCCAAGGACAGGGTGGACTGCGGCTACCCCCATGTCACCCCCAAGGAGTGCAACAACCGGGGCTGCTGCTTTGACTCCAGGATCCCTGGAGTGCCTTGGTGTTTCAAGCCCCTGCAGGAAGCAGAATGCACCTTCTGA同时利用上游引物：5′-GAGA GAATTCCATCATCATCATCATCATGAGGAGTACGTGGGCCTGTC-3′(引物1)或5′-TTTA GCGGCCGCTCAGAAGGTGCATTCTGCTTC-3′(引物2)引入六个组氨酸标签：6×CAT。

2.酵母表达载体的构建

由RT-PCR扩增出的人肠三叶因子基因序列，经EcoRI和NotI双酶切，然后插入用同样的限制性内切酶处理过的酵母表达载体pPICZaA，转化入大肠杆菌Top10，以含25μg/ml Zeocin(一种特殊抗生素)的低盐LB平板筛选重组质粒，得到含有重组酵母表达质粒pPICZaA-hITF的重组大肠杆菌Top10。

3.酶切及测序鉴定

提取小量重组质粒pPICZaA-hITF，用EcoRI和NotI消化，切下预期大小片段，按设计编码pPICZaA-hITF序列，分别为210bp和3600bp，用重组质粒pPICZaA-hITF酶切电泳图和pPICZaA-hITF测序图谱测序鉴定，测序结果证明所克隆pPICZaA-hITF序列完全正确，而且是按照设计准确进入载体。

4.转化入GS115酵母菌

将重组质粒线性化，然后化学转化入GS115酵母菌，再进行抗性筛选，将筛选出的阳性克隆分别转接到MMH(含组氨酸的最小甲醇培养基)、MDH(含组氨酸的最小葡萄糖培养基)平板上，2天后获得克隆均为Mut+(甲醇利用型阳性)表型。提取酵母基因组DNA，作为模板进行PCR反应，做PCR反应电泳图显示，使扩增出的特异条带与预期结果大小一致，证明所获得克隆均有目的基因的成功整合。

5.诱导表达

选取阳性克隆Mut+表型进行甲醇诱导表达，诱导至96小时后，离心分离胞体和上清，上清蛋白以三氯醋酸沉淀，SDS-PAGE蛋白电泳，考马斯亮蓝染色，获得酵母菌GS115-hITF上清液；将其与阴性对照相比，在重组克隆的表达上清中出现与人肠三叶因子(hITF)非糖基化形式分子量一致的新生蛋白条带；做酵母菌GS115-hITF上清液Western blotting(免疫印迹)分析，显示重组克隆是以非糖基化形式分泌表达了hITF。

6.纯化

将酵母菌GS115-hITF上清液旋转蒸发(冷冻干燥)从1000ml浓缩至100ml，把浓缩上清移入超滤离心管(截留分子量30KD)，离心约20～30分钟去除大部分大分子量杂蛋白，再将滤出液通过镍离子柱，10～50毫摩尔咪唑漂洗杂蛋白，100～800毫摩尔咪唑洗脱目的蛋白。然后把洗脱液移入超滤离心管(截留分子量3KD)，离心约20～30分钟去除盐分、咪唑等小分子物质，最后将目的蛋白用孔径0.2微米的滤器过滤除菌，冷冻干燥成粉末状，-80℃长期保存。重组肠三叶因子N端具有伸展的6个组氨酸残基，能和Ni²⁺离子鳌合柱结合，进行快速亲和纯化；Ni²⁺离子是利用金属和蛋白质有亲和力的特点，将金属离子与凝胶载体相连，制成鳌合吸附剂用来蛋白质的亲和层析分离。Ni²⁺离子共有6个鳌合点，可以和6个组氨酸相结合，有利于目的蛋白的插入。纯化后的样品SDS-PAGE电泳后，考马斯亮兰R250染色，显示得到比较纯hITF。取所得纯化样品做重组人肠三叶因子纯化后Western blotting分析，结果显示所表达蛋白确实为hITF。

按照本发明工艺获得的重组人肠三叶因子，表达产量可达100mg/L，提纯纯度可达95％或更高，纯化的蛋白产物经检测结果表明：用本发明工艺获得的重组人肠三叶因子为高纯度、无热源、无内毒素，有正确的分子量，与天然的肠三叶因子有相同的等电点、氨基酸序列和紫外光谱，及其完好的生物学活性的重组蛋白。将其应用于治疗由各种致伤因子引起的胃肠粘膜损伤疗效明显。

四.附图说明

图1是酵母表达载体构建技术路线示意图

图2是重组质粒PICZaA-hITF酶切电泳图

图3是重组质粒pPICZaA-hITF测序图谱

图4是酵母GS115-hITF基因PCR反应电泳图

图5是酵母GS115-hITF上清液Western blotting图

图6是重组人肠三叶因子纯化后Western blotting图

五.具体实施方式

下面用实施例进一步说明本发明采用GS115酵母菌合成重组人肠三叶因子的工艺的具体操作方法。

(一)目的基因的获取

从小肠粘膜中提取总RNA，通过RT-PCR获得编码59个氨基酸的肠三叶因子的基因序列：

(二)酵母表达载体的构建

1.酶切产物的纯化

1)割下含ITF DNA的琼脂糖块，放入1.5ml离心管。

2)加入400μl结合缓冲液，置于55-60℃水浴7分钟，使琼脂块完全熔化，每2分钟颠倒混匀一次。

3)将熔化的琼脂糖液移入吸附柱，10000转/分离心1分钟，倒掉收集管中液体，再将吸附柱放入同一收集管中。

4)在吸附柱中加入750μl洗脱缓冲液，静置2分钟后，离心1分钟倒掉收集管中液体，将吸附柱放入同一收集管中。

5)同(4)，离心1分钟。

6)将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附柱中央加入30-50ml去离子水，离心1分钟，将1.5ml离心管(DNA)贮存于-20℃冰箱。

2.连接

取2.5μl目的基因片断和5μl载体片断，建立20μl连接体系，4℃连接过夜。

3.转化

1)取10μl连接产物加入到100μl大肠杆菌TOP10感受态细菌轻轻混合，冰上放置30分钟。

2)42℃热休克90秒，冰上放置2分钟。

3)加人900μl LB培养基，37℃水平摇1小时。

4)取100μl分别涂于低盐LB琼脂平板(含Zeocin 25g/ml)，37℃过夜培养。

4.观察结果

第二天LB平板长出数十个阳性菌落.

(三)酶切及测序鉴定

从大肠杆菌TOP10中提取小量质粒pPICZaA-hITF，用EcoRI和NotI消化，切下预期大小片段，按设计编码pPICZaA-hITF序列，分别为210bp和3600bp，用重组质粒pPICZaA-hITF酶切电泳图和pPICZaA-hITF测序图谱测序鉴定，测序结果证明，所克隆pPICZaA-hITF序列完全正确，而且是按照设计准确进入载体。见图2和图3。

酶切体系：

质粒DNA 16μl

EcoRI 1μl

NotI 1μl

10X缓冲液 2μl

共计20μl

反应条件：

37℃4-6小时

(四)重组质粒转化入GS115酵母菌及PCR鉴定目的基因

1.GS115酵母菌感受态的制备

1)接种GS115酵母菌到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜(约24～28h)培养到OD值为0.8～1.0(约10⁸Cells/ml)。

2)收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10分钟。

3)重悬细胞于1ml 100mM氯化锂溶液中，将悬液转入1.5ml离心管。

4)离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400μl 100mM氯化锂溶液中。

5)按50μl/管分装，立即进行转化。

2.GS115酵母菌的化学转化

1)煮沸1ml鲑鱼精DNA 5分钟，迅速冰浴以制备单链担体DNA。

2)将处于感受态的GS115酵母菌离心，去除残余的氯化锂溶液。

3)对于每一个转化，按以下顺序加入：

50％PEG3350 240μl

1M LiCl 36μl

2mg/ml单链Salmon sperm DNA 25μl

5～10μg/50μl H₂0质粒DNA 50μl

4)剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀(约1min)。

5)30℃水浴孵育30分钟。

6)42℃水浴热休克20～25分钟。

7)6000～8000转/分离心收集酵母菌体(吸出液体)。

8)重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育。

9)1～4h后，取25～100μl菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定。

3.基因组PCR鉴定

提取GS115酵母菌DNA，以公用引物α-因子及AOX引物进行PCR鉴定，结果见图4

PCR反应体系(50μl)：

H2O： 35.5μl

10xbuffer： 5μl

dNTP： 2μl

上引(20μM)：1μl

下引(20μM)：1μl

模板： 1μl

Tag酶： 0.5μl

MgCl₂： 4μl

共计50μl

反应条件：

94℃预变性4分钟后进入循环；94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；循环完成后72℃继续延伸7分钟。

(五)基因型鉴定及诱导表达

1.主要溶液配制

1)YPD培养液：将10g酵母提取物，20g蛋白胨，20g葡萄糖溶至1000ml去离子水中，高压消毒。

2)MD平板：1L的组成含1.34％YNB，4×10^-3％生物素，2％葡萄糖，1.5％琼脂。

3)BMGY培养液：将10g酵母提取物，20g蛋白胨，13.4gYNB，4×10^-5g生物素，10g甘油溶至1000ml PH6.00.1M磷酸钾缓冲溶液中。

4)BMMY培养液：BMGY中10g甘油由5ml甲醇代替。

2.基因型鉴定

分别挑取含Zeocin的YPD平板上形成的阳性克隆接种于MDH、MMH培养板的相应位置上，并接种试剂盒中所提供的Mut+、Mut^-酵母细胞分别作为阳性阴性对照，置30℃恒温箱培养直至克隆形成，参照阳性阴性对照对比同一位置点隆大小，确定表型。

3.Mut⁺表型重组酵母的诱导表达实验

1)挑选一单菌落，置于装有25ml MGY、BMG或BMGY培养基的250ml摇瓶中，于28-30℃，250-300转/分，培养至0D＝2～6(λ＝600，16-18小时)。

2)室温下1500-3000g离心5分钟，收集菌体，用MM、BMM或BMMY重悬菌体，使OD600＝1.0左右(约100-200ml)。

3)将步骤2所得的菌液置于1L的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30℃、250-300转/分的摇床上继续生长。

4)每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5～1.0％。

5)按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5ml EP管中，最大转速离心2-3分钟，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一般取：0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h。

5)分离样品的上清液，于-80℃保存备用。

(六)表达产物的纯化

1、取上清1000毫升，冷冻干燥浓缩至100毫升。

2、将浓缩上清移入超滤离心管(截留分子量30KD)，离心约20～30分钟去除大部分大分子量杂蛋白。

3、将滤出液通过镍离子柱，10～50毫摩尔咪唑漂洗杂蛋白。

4、100～800毫摩尔咪唑洗脱目的蛋白。

5、将洗脱液移入超滤离心管(截留分子量3KD)，离心约20～30分钟去除盐分、咪唑等小分子物质。

6、将目的蛋白用孔径0.2微米的滤器过滤除菌。

7、冷冻干燥成粉末状，-80℃长期保存。

Claims

1、一种采用GS115酵母菌合成重组人肠三叶因子的工艺，包括目的基因的获取、酵母表达载体的构建、酶切及测序鉴定、诱导表达和纯化过程，其特征是在酶切及测序鉴定之后还有一个转化入GS115酵母菌的过程：将重组质粒线性化，然后化学转化入GS115酵母菌，再进行抗性筛选，将筛选出的阳性克隆分别转接到MMH、MDH平板上获得阳性克隆Mut+表型。

2、按照权利要求1所述的采用GS115酵母菌合成重组人肠三叶因子的工艺，其特征在于所说的目的基因的获取是从小肠粘膜中提取总RNA，通过RT-PCR获得编码59个氨基酸的肠三叶因子的基因序列：

GAGGAGTACGTGGGCCTGTCTGCAAACCAGTGTGCCGTGCCAGCCAAGGACAGGGTGGACTGCGGCTACCCCCATGTCACCCCCAAGGAGTGCAACAACCGGGGCTGCTGCTTTGACTCCAGGATCCCTGGAGTGCCTTGGTGTTTCAAGCCCCTGCAGGAAGCAGAATGCACCTTCTGA同时利用上游引物：5′-GAGA GAATTCCATCATCATCATCATCATGAGGAGTACGTGGGCCTGTC-3′或5′-TTTA GCGGCCGCTCAGAAGGTGCATTCTGCTTC-3′引入六个组氨酸标签：6×CAT。

3、按照权利要求1所述的采用GS115酵母菌合成重组人肠三叶因子的工艺，其特征在于所说的酵母表达载体的构建是由RT-PCR扩增出的人肠三叶因子基因序列，经EcoRI和NotI双酶切，然后插入用同样的限制性内切酶处理过的酵母表达载体pPICZaA，转化入大肠杆菌Top10，以浓度20～30μg/ml Zeocin的低盐LB平板筛选重组质粒，得到含有重组酵母表达质粒pPICZaA-hITF的重组大肠杆菌Top10。

4、按照权利要求1所述的采用GS115酵母菌合成重组人肠三叶因子的工艺，其特征在于所说的酶切及测序鉴定是从大肠杆菌Top10中提取小量质粒pPICZaA-hITF，用EcoRI和NotI消化，切下预期大小片段，按设计编码pPICZaA-hITF序列，分别为210bp和3600bp；再用重组质粒pPICZaA-hITF酶切电泳图和pPICZaA-hITF测序图谱测序鉴定。

5、按照权利要求1所述的采用GS115酵母菌合成重组人肠三叶因子的工艺，其特征在于所说的诱导表达是选取阳性克隆Mut+进行甲醇诱导表达，诱导至96小时后，离心分离胞体和上清，获得酵母GS115-hITF上清液。

6、按照权利要求1所述的采用GS115酵母菌合成重组人肠三叶因子的工艺，其特征在于所说的纯化是将酵母菌GS115-hITF上清液冷冻干燥，从1000ml浓缩至100ml，把浓缩上清移入超滤离心管，离心20～30分钟去除大部分大分子量杂蛋白，再将滤出液通过镍离子柱，10～50毫摩尔咪唑漂洗杂蛋白，100～g00毫摩尔咪唑洗脱目的蛋白，然后把洗脱液移入超滤离心管，离心20～30分钟去除盐分、咪唑等小分子物质，最后将目的蛋白用孔径0.2微米的滤器过滤除菌，冷冻干燥成粉末状，-80℃长期保存。