CN1782067A - 采用gs115酵母菌合成重组人肠三叶因子的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程的DNA或RNA、载体和质粒,或其分离、制备或纯化。是一种采用GS115酵母菌合成重组人肠三叶因子的工艺:包括目的基因的获取、酵母表达载体的构建、酶切及测序鉴定、转化入GS115酵母菌、诱导表达和纯化六步过程。按照本发明表达方法获得的重组人肠三叶因子,表达产量可达100mg/L,提纯纯度可达95%或更高,纯化的蛋白产物经检测结果表明:用本发明表达方法获得的重组人肠三叶因子为高纯度、无热源、无内毒素,有正确的分子量,与天然的肠三叶因子有相同的等电点、氨基酸序列和紫外光谱,及其完好的生物学活性的重组蛋白。它在治疗由各种致伤因子引起的胃肠粘膜损伤等方面具有显著效果。
Description
一、技术领域
本发明涉及基因工程的DNA或RNA、载体和质粒,或其分离、制备或纯化,具体涉及重组人肠三叶因子的表达和纯化。
二、背景技术
肠三叶因子(以下简称ITF)是分布于肠道的特异小分子蛋白,分子量约6~7kD。ITF由59个氨基酸残基构成,包含一个由38~39个氨基酸残基组成的特定序列,其中的6个半胱氨酸以1-5,2-4,3-6的顺序依次形成3个二硫键,从而产生特异而稳定的三叶结构。这种稳定的结构确保其在肠道中发挥活性,不受消化酶和pH变化的影响。正常情况下,ITF分布于整个小肠,特别是小肠绒毛环状细胞的基底部。ITF在体内以20%单体和80%二聚体的形式存在,但只有二聚体才具有生物活性。ITF不仅能促进肠上皮细胞增殖和移行,还能同粘蛋白中的寡聚糖或多糖的侧链相连,稳定肠粘液层。因此,ITF对肠道的保护作用非常强,。它在治疗由各种致伤因子引起的胃肠粘膜损伤等方面具有显著效果。
现有技术中,在《Biochemistry》,1995,34:4757-476,有一篇由Thim L,Woldike HF,Nielsen PF,et al.撰写的论文:“Characterization of human and rat intestinal trefoil factotproduced in yeast”,报道有肠三叶因子在酵母中的表达方法。该方法是利用第一代酿酒酵母发酵获得重组肠三叶因子。但它存在的缺陷是:它由实验室扩展到工业规模时,其产量迅速下降,原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失,质粒变得不稳定,拷贝数下降,导致了产量的降低,仅为48mg/L;它的纯化方法烦琐,操作复杂、步骤较多。2002年5月2日公开有一件主题名称为“肠三叶蛋白”的美国专利文献US20020052483A1,在关于肠三叶因子的来源上,该文献指出:应用真核表达载体(如pMAMneo),在COS细胞、CHO细胞等真核细胞中表达;直接从机体肠道粘膜中提取肠三叶因子。但按照它所介绍的方法具有以下不足:1.利用真核细胞表达获得肠三叶因子,虽然蛋白活性尚好,但成本较高、产量低,难以大规模生产;2.利用肠粘膜提取肠三叶因子,虽然可以得到天然的肠三叶因子,但其原料(肠粘膜)来源受限,产量更是极其有限。
三、发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷,提供一种不同于现有技术的采用GS115酵母菌合成重组人肠三叶因子的工艺,以便提高表达产量和纯度,有利于ITF的开发应用。
采用以下技术方案来实现本发明的目的。
一种采用GS115酵母菌合成重组人肠三叶因子的工艺,由目的基因的获取、酵母表达载体的构建、酶切及测序鉴定、转化入GS115酵母菌、诱导表达和纯化六步过程组成。
1.目的基因的获取
从正常人小肠绒毛中提取总RNA,通过RT-PCR获得编码59个氨基酸的肠三叶因子的基因序列:
GAGGAGTACGTGGGCCTGTCTGCAAACCAGTGTGCCGTGCCAGCCAAGGACAGGGTGGACTGCGGCTACCCCCATGTCACCCCCAAGGAGTGCAACAACCGGGGCTGCTGCTTTGACTCCAGGATCCCTGGAGTGCCTTGGTGTTTCAAGCCCCTGCAGGAAGCAGAATGCACCTTCTGA同时利用上游引物:5′-GAGA
GAATTCCATCATCATCATCATCATGAGGAGTACGTGGGCCTGTC-3′(引物1)或5′-TTTA
GCGGCCGCTCAGAAGGTGCATTCTGCTTC-3′(引物2)引入六个组氨酸标签:6×CAT。
2.酵母表达载体的构建
由RT-PCR扩增出的人肠三叶因子基因序列,经EcoRI和NotI双酶切,然后插入用同样的限制性内切酶处理过的酵母表达载体pPICZaA,转化入大肠杆菌Top10,以含25μg/ml Zeocin(一种特殊抗生素)的低盐LB平板筛选重组质粒,得到含有重组酵母表达质粒pPICZaA-hITF的重组大肠杆菌Top10。
3.酶切及测序鉴定
提取小量重组质粒pPICZaA-hITF,用EcoRI和NotI消化,切下预期大小片段,按设计编码pPICZaA-hITF序列,分别为210bp和3600bp,用重组质粒pPICZaA-hITF酶切电泳图和pPICZaA-hITF测序图谱测序鉴定,测序结果证明所克隆pPICZaA-hITF序列完全正确,而且是按照设计准确进入载体。
4.转化入GS115酵母菌
将重组质粒线性化,然后化学转化入GS115酵母菌,再进行抗性筛选,将筛选出的阳性克隆分别转接到MMH(含组氨酸的最小甲醇培养基)、MDH(含组氨酸的最小葡萄糖培养基)平板上,2天后获得克隆均为Mut+(甲醇利用型阳性)表型。提取酵母基因组DNA,作为模板进行PCR反应,做PCR反应电泳图显示,使扩增出的特异条带与预期结果大小一致,证明所获得克隆均有目的基因的成功整合。
5.诱导表达
选取阳性克隆Mut+表型进行甲醇诱导表达,诱导至96小时后,离心分离胞体和上清,上清蛋白以三氯醋酸沉淀,SDS-PAGE蛋白电泳,考马斯亮蓝染色,获得酵母菌GS115-hITF上清液;将其与阴性对照相比,在重组克隆的表达上清中出现与人肠三叶因子(hITF)非糖基化形式分子量一致的新生蛋白条带;做酵母菌GS115-hITF上清液Western blotting(免疫印迹)分析,显示重组克隆是以非糖基化形式分泌表达了hITF。
6.纯化
将酵母菌GS115-hITF上清液旋转蒸发(冷冻干燥)从1000ml浓缩至100ml,把浓缩上清移入超滤离心管(截留分子量30KD),离心约20~30分钟去除大部分大分子量杂蛋白,再将滤出液通过镍离子柱,10~50毫摩尔咪唑漂洗杂蛋白,100~800毫摩尔咪唑洗脱目的蛋白。然后把洗脱液移入超滤离心管(截留分子量3KD),离心约20~30分钟去除盐分、咪唑等小分子物质,最后将目的蛋白用孔径0.2微米的滤器过滤除菌,冷冻干燥成粉末状,-80℃长期保存。重组肠三叶因子N端具有伸展的6个组氨酸残基,能和Ni2+离子鳌合柱结合,进行快速亲和纯化;Ni2+离子是利用金属和蛋白质有亲和力的特点,将金属离子与凝胶载体相连,制成鳌合吸附剂用来蛋白质的亲和层析分离。Ni2+离子共有6个鳌合点,可以和6个组氨酸相结合,有利于目的蛋白的插入。纯化后的样品SDS-PAGE电泳后,考马斯亮兰R250染色,显示得到比较纯hITF。取所得纯化样品做重组人肠三叶因子纯化后Western blotting分析,结果显示所表达蛋白确实为hITF。
按照本发明工艺获得的重组人肠三叶因子,表达产量可达100mg/L,提纯纯度可达95%或更高,纯化的蛋白产物经检测结果表明:用本发明工艺获得的重组人肠三叶因子为高纯度、无热源、无内毒素,有正确的分子量,与天然的肠三叶因子有相同的等电点、氨基酸序列和紫外光谱,及其完好的生物学活性的重组蛋白。将其应用于治疗由各种致伤因子引起的胃肠粘膜损伤疗效明显。
四.附图说明
图1是酵母表达载体构建技术路线示意图
图2是重组质粒PICZaA-hITF酶切电泳图
图3是重组质粒pPICZaA-hITF测序图谱
图4是酵母GS115-hITF基因PCR反应电泳图
图5是酵母GS115-hITF上清液Western blotting图
图6是重组人肠三叶因子纯化后Western blotting图
五.具体实施方式
下面用实施例进一步说明本发明采用GS115酵母菌合成重组人肠三叶因子的工艺的具体操作方法。
(一)目的基因的获取
从小肠粘膜中提取总RNA,通过RT-PCR获得编码59个氨基酸的肠三叶因子的基因序列:
GAGGAGTACGTGGGCCTGTCTGCAAACCAGTGTGCCGTGCCAGCCAAGGACAGGGTGGACTGCGGCTACCCCCATGTCACCCCCAAGGAGTGCAACAACCGGGGCTGCTGCTTTGACTCCAGGATCCCTGGAGTGCCTTGGTGTTTCAAGCCCCTGCAGGAAGCAGAATGCACCTTCTGA同时利用上游引物:5′-GAGA
GAATTCCATCATCATCATCATCATGAGGAGTACGTGGGCCTGTC-3′(引物1)或5′-TTTA
GCGGCCGCTCAGAAGGTGCATTCTGCTTC-3′(引物2)引入六个组氨酸标签:6×CAT。
(二)酵母表达载体的构建
1.酶切产物的纯化
1)割下含ITF DNA的琼脂糖块,放入1.5ml离心管。
2)加入400μl结合缓冲液,置于55-60℃水浴7分钟,使琼脂块完全熔化,每2分钟颠倒混匀一次。
3)将熔化的琼脂糖液移入吸附柱,10000转/分离心1分钟,倒掉收集管中液体,再将吸附柱放入同一收集管中。
4)在吸附柱中加入750μl洗脱缓冲液,静置2分钟后,离心1分钟倒掉收集管中液体,将吸附柱放入同一收集管中。
5)同(4),离心1分钟。
6)将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中,在吸附柱中央加入30-50ml去离子水,离心1分钟,将1.5ml离心管(DNA)贮存于-20℃冰箱。
2.连接
取2.5μl目的基因片断和5μl载体片断,建立20μl连接体系,4℃连接过夜。
3.转化
1)取10μl连接产物加入到100μl大肠杆菌TOP10感受态细菌轻轻混合,冰上放置30分钟。
2)42℃热休克90秒,冰上放置2分钟。
3)加人900μl LB培养基,37℃水平摇1小时。
4)取100μl分别涂于低盐LB琼脂平板(含Zeocin 25g/ml),37℃过夜培养。
4.观察结果
第二天LB平板长出数十个阳性菌落.
(三)酶切及测序鉴定
从大肠杆菌TOP10中提取小量质粒pPICZaA-hITF,用EcoRI和NotI消化,切下预期大小片段,按设计编码pPICZaA-hITF序列,分别为210bp和3600bp,用重组质粒pPICZaA-hITF酶切电泳图和pPICZaA-hITF测序图谱测序鉴定,测序结果证明,所克隆pPICZaA-hITF序列完全正确,而且是按照设计准确进入载体。见图2和图3。
酶切体系:
质粒DNA 16μl
EcoRI 1μl
NotI 1μl
10X缓冲液 2μl
共计20μl
反应条件:
37℃4-6小时
(四)重组质粒转化入GS115酵母菌及PCR鉴定目的基因
1.GS115酵母菌感受态的制备
1)接种GS115酵母菌到50ml YPD培养基中,30℃摇菌过夜(约24~28h)培养到OD值为0.8~1.0(约108Cells/ml)。
2)收获细胞,用25ml无菌水洗涤一次,室温下1500g离心10分钟。
3)重悬细胞于1ml 100mM氯化锂溶液中,将悬液转入1.5ml离心管。
4)离心机最大速度离心15秒沉淀菌体,重悬菌体于400μl 100mM氯化锂溶液中。
5)按50μl/管分装,立即进行转化。
2.GS115酵母菌的化学转化
1)煮沸1ml鲑鱼精DNA 5分钟,迅速冰浴以制备单链担体DNA。
2)将处于感受态的GS115酵母菌离心,去除残余的氯化锂溶液。
3)对于每一个转化,按以下顺序加入:
50%PEG3350 240μl
1M LiCl 36μl
2mg/ml单链Salmon sperm DNA 25μl
5~10μg/50μl H20质粒DNA 50μl
4)剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀(约1min)。
5)30℃水浴孵育30分钟。
6)42℃水浴热休克20~25分钟。
7)6000~8000转/分离心收集酵母菌体(吸出液体)。
8)重悬酵母于1ml YPD培养基,30℃摇床孵育。
9)1~4h后,取25~100μl菌液铺选择性培养基平板,于30℃培养2~3天鉴定。
3.基因组PCR鉴定
提取GS115酵母菌DNA,以公用引物α-因子及AOX引物进行PCR鉴定,结果见图4
PCR反应体系(50μl):
H2O: 35.5μl
10xbuffer: 5μl
dNTP: 2μl
上引(20μM):1μl
下引(20μM):1μl
模板: 1μl
Tag酶: 0.5μl
MgCl2: 4μl
共计50μl
反应条件:
94℃预变性4分钟后进入循环;94℃变性45秒,55℃退火45秒,72℃延伸1分钟,共30个循环;循环完成后72℃继续延伸7分钟。
(五)基因型鉴定及诱导表达
1.主要溶液配制
1)YPD培养液:将10g酵母提取物,20g蛋白胨,20g葡萄糖溶至1000ml去离子水中,高压消毒。
2)MD平板:1L的组成含1.34%YNB,4×10-3%生物素,2%葡萄糖,1.5%琼脂。
3)BMGY培养液:将10g酵母提取物,20g蛋白胨,13.4gYNB,4×10-5g生物素,10g甘油溶至1000ml PH6.00.1M磷酸钾缓冲溶液中。
4)BMMY培养液:BMGY中10g甘油由5ml甲醇代替。
2.基因型鉴定
分别挑取含Zeocin的YPD平板上形成的阳性克隆接种于MDH、MMH培养板的相应位置上,并接种试剂盒中所提供的Mut+、Mut-酵母细胞分别作为阳性阴性对照,置30℃恒温箱培养直至克隆形成,参照阳性阴性对照对比同一位置点隆大小,确定表型。
3.Mut+表型重组酵母的诱导表达实验
1)挑选一单菌落,置于装有25ml MGY、BMG或BMGY培养基的250ml摇瓶中,于28-30℃,250-300转/分,培养至0D=2~6(λ=600,16-18小时)。
2)室温下1500-3000g离心5分钟,收集菌体,用MM、BMM或BMMY重悬菌体,使OD600=1.0左右(约100-200ml)。
3)将步骤2所得的菌液置于1L的摇瓶中,用双层纱布或粗棉布封口,放置于28-30℃、250-300转/分的摇床上继续生长。
4)每24h向培养基中添加100%甲醇至终浓度为0.5~1.0%。
5)按时间点分别取菌液样品,取样量为1ml,置于1.5ml EP管中,最大转速离心2-3分钟,分别收集上清和菌体,分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一般取:0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h。
5)分离样品的上清液,于-80℃保存备用。
(六)表达产物的纯化
1、取上清1000毫升,冷冻干燥浓缩至100毫升。
2、将浓缩上清移入超滤离心管(截留分子量30KD),离心约20~30分钟去除大部分大分子量杂蛋白。
3、将滤出液通过镍离子柱,10~50毫摩尔咪唑漂洗杂蛋白。
4、100~800毫摩尔咪唑洗脱目的蛋白。
5、将洗脱液移入超滤离心管(截留分子量3KD),离心约20~30分钟去除盐分、咪唑等小分子物质。
6、将目的蛋白用孔径0.2微米的滤器过滤除菌。
7、冷冻干燥成粉末状,-80℃长期保存。
Claims (6)
1、一种采用GS115酵母菌合成重组人肠三叶因子的工艺,包括目的基因的获取、酵母表达载体的构建、酶切及测序鉴定、诱导表达和纯化过程,其特征是在酶切及测序鉴定之后还有一个转化入GS115酵母菌的过程:将重组质粒线性化,然后化学转化入GS115酵母菌,再进行抗性筛选,将筛选出的阳性克隆分别转接到MMH、MDH平板上获得阳性克隆Mut+表型。
2、按照权利要求1所述的采用GS115酵母菌合成重组人肠三叶因子的工艺,其特征在于所说的目的基因的获取是从小肠粘膜中提取总RNA,通过RT-PCR获得编码59个氨基酸的肠三叶因子的基因序列:
GAGGAGTACGTGGGCCTGTCTGCAAACCAGTGTGCCGTGCCAGCCAAGGACAGGGTGGACTGCGGCTACCCCCATGTCACCCCCAAGGAGTGCAACAACCGGGGCTGCTGCTTTGACTCCAGGATCCCTGGAGTGCCTTGGTGTTTCAAGCCCCTGCAGGAAGCAGAATGCACCTTCTGA同时利用上游引物:5′-GAGA
GAATTCCATCATCATCATCATCATGAGGAGTACGTGGGCCTGTC-3′或5′-TTTA
GCGGCCGCTCAGAAGGTGCATTCTGCTTC-3′引入六个组氨酸标签:6×CAT。
3、按照权利要求1所述的采用GS115酵母菌合成重组人肠三叶因子的工艺,其特征在于所说的酵母表达载体的构建是由RT-PCR扩增出的人肠三叶因子基因序列,经EcoRI和NotI双酶切,然后插入用同样的限制性内切酶处理过的酵母表达载体pPICZaA,转化入大肠杆菌Top10,以浓度20~30μg/ml Zeocin的低盐LB平板筛选重组质粒,得到含有重组酵母表达质粒pPICZaA-hITF的重组大肠杆菌Top10。
4、按照权利要求1所述的采用GS115酵母菌合成重组人肠三叶因子的工艺,其特征在于所说的酶切及测序鉴定是从大肠杆菌Top10中提取小量质粒pPICZaA-hITF,用EcoRI和NotI消化,切下预期大小片段,按设计编码pPICZaA-hITF序列,分别为210bp和3600bp;再用重组质粒pPICZaA-hITF酶切电泳图和pPICZaA-hITF测序图谱测序鉴定。
5、按照权利要求1所述的采用GS115酵母菌合成重组人肠三叶因子的工艺,其特征在于所说的诱导表达是选取阳性克隆Mut+进行甲醇诱导表达,诱导至96小时后,离心分离胞体和上清,获得酵母GS115-hITF上清液。
6、按照权利要求1所述的采用GS115酵母菌合成重组人肠三叶因子的工艺,其特征在于所说的纯化是将酵母菌GS115-hITF上清液冷冻干燥,从1000ml浓缩至100ml,把浓缩上清移入超滤离心管,离心20~30分钟去除大部分大分子量杂蛋白,再将滤出液通过镍离子柱,10~50毫摩尔咪唑漂洗杂蛋白,100~g00毫摩尔咪唑洗脱目的蛋白,然后把洗脱液移入超滤离心管,离心20~30分钟去除盐分、咪唑等小分子物质,最后将目的蛋白用孔径0.2微米的滤器过滤除菌,冷冻干燥成粉末状,-80℃长期保存。
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