CN110495579A - 一种提高河豚鱼皮营养价值的工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高河豚鱼皮营养价值的工艺，属于海洋生物技术领域。以河豚鱼皮为原料，集成现代生物分离技术、生物酶解技术、混菌微生物发酵技术，研制开发出高体外抗氧化能力的河豚鱼皮多肽生物制品，其中混菌好氧发酵菌种主要包括产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌。所得河豚鱼皮多肽具有较强的抗氧化能力，提取液可根据应用途径做浓缩、吸附干燥、醇析或树脂纯化等处理，满足在保健、食品、医药等领域的高效利用。该工艺技术简单高效、所得产品抗氧化能力和自由基清除能力强，产品稳定性强，生产成本低，易于工业化生产和规模化推广。

Description

一种提高河豚鱼皮营养价值的工艺
技术领域
本发明涉及一种提高河豚鱼皮营养价值的工艺，尤其是一种利用河豚鱼皮为原料通过微生物协同发酵制备高抗氧化能力和营养保健功效的河豚鱼皮多肽生物制品，属于海洋生物技术领域。
背景技术
河豚鱼（Fugu rubripes)中含有剧毒物质河豚鱼毒素,这种毒素具有极高的经济价值和医疗价值。人们对河豚鱼毒素的研究较深入%、细致，却忽略了河豚鱼其它方面的价值。随着无毒河豚鱼养殖及加工脱毒技术的发展，我国无毒河豚鱼的产量逐年上升，年出口率90%以上，现已成为国外河豚鱼供给的主要来源。河豚鱼的出口加工产生了大量的鱼皮等下脚料，造成了资源的极大浪费和环境污染。河豚鱼皮中含有大量的胶原蛋白，约88.5%，是提取制备明胶、胶原肽的优质原料，胶原肽具有许多重要的生理功能，如抑制ACE、促进皮肤胶原代谢、抗氧化、增加骨密度等，可广泛应用于医药、化妆品、保健品等领域。据研究报道，河豚鱼皮具有显著的健胃功效。
目前关于河豚鱼皮抗氧化多肽的研究相对较少，现有技术中专利200710158521.X公开了一种河豚鱼皮的活性胶原蛋白及其肽的制备方法，是将河豚鱼皮剪成小块冷冻干燥粉碎，放入氯化钠溶液中搅拌12h，然后离心，弃上清液除去非胶原蛋白，将沉淀放入醋酸溶液中，在0～10℃下，加入胃蛋白酶，酶解，离心，上清液通过的超滤膜，上面部分冷冻干燥得胶原蛋白。将制备活性胶原蛋白后离心所剩下的沉淀洗至pH2.0～7.0，向沉淀中加入木瓜蛋白酶酶解，灭酶后离心上清液分别通过超滤膜，得到不同分子量范围的河豚鱼皮胶原蛋白肽，经冷冻干燥后得到淡黄色或白色粉状的河豚鱼皮胶原蛋白活性肽；专利201610375282.2公开了一种河豚鱼鱼皮明胶的制备方法，具体步骤为：选择河豚鱼皮清洗除杂，切碎；加入氢氧化钠和过氧化氢的复合溶液浸泡5～10h，水洗至pH为7～9，得到碱处理鱼皮；加入浓度为0.1～2％的洗洁精水溶液浸泡5～10h；加入浓度为0.01～1.0mol/L的醋酸溶液浸提；离心收集上清液；加入浓度为2.0～3.0mol/L的氯化钠溶液进行盐析；离心收集沉淀；加入浓度为0.01～1.0mol/L的醋酸溶解，透析得到明胶溶液；冷冻干燥，得到河豚鱼鱼皮明胶。综上，目前关于河豚鱼皮多肽的研究相对较少，尤其是对于提高河豚鱼皮多肽·OH自由基清除能力是本领域的关键技术弊端。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，满足河豚鱼皮多肽高效提取及高值化利用，本申请提供一种提高河豚鱼皮营养价值的工艺，集成现代生物分离技术、生物酶解技术、混菌微生物发酵技术，研制开发出高体外抗氧化能力的河豚鱼皮多肽生物制品，满足保健、医疗、食品等领域对河豚鱼皮多肽的应用需求，该工艺技术发酵工艺简单高效、所得产品抗氧化能力和自由基清除能力强，生产成本低，易于工业化规模生产。
本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：
一种提高河豚鱼皮营养价值的工艺，其特征在于制备方法包括如下步骤：
（1）清洗：将加工的新鲜河豚鱼皮用自来水清洗干净，再用天然矿泉水或纯化水洗净沥干待用；
（2）匀浆：将步骤(1)所得河豚鱼皮加入高速匀浆机，加入天然矿泉水或纯化水，进行高速匀浆，直至全部能够通过2mm孔径圆筛；
（3）灭菌：将匀浆后的河豚鱼皮通过高压蒸锅灭菌，冷却后待用；
（4）复合酶解：向灭菌后的浆液中加入质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃条件下搅拌酶解30min；
（5）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵8h；
（6）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的干酪乳杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；
（7）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；
（8）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；
（9）离心：以10000r/min速率离心分离，上清液即为河豚鱼皮多肽提取液。
优选的，在河豚鱼皮匀浆过程中加入河豚鱼皮质量比5%的茯苓寡糖。
进一步优选的，所述茯苓寡糖的分子量为3000-5000Da。
上述步骤（4）中所述复合蛋白酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的组合，其质量比为2:2:1。
上述步骤（5）中所述复合微生物菌剂为产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:3：1。
上述步骤（5）中好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.2～0.3m3/m3.min。
上述产朊假丝酵母种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mLPDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
上述枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
本发明提供一种提高河豚鱼皮营养价值的工艺，所得河豚鱼皮多肽具有较强的抗氧化能力，提取液可根据应用途径做浓缩、吸附干燥、醇析或树脂纯化等处理，满足在保健、食品、医药等领域的高效利用。
本发明提供一种提高河豚鱼皮营养价值的工艺，与现有技术相比，具有以下显著优势：
（1）本申请以河豚鱼皮蛋白为原料，集成现代生物分离技术、生物酶解技术、混菌微生物发酵技术，显著提升了河豚鱼皮蛋白抗氧化能力；尤为重要的是，本申请创造性的发现，在河豚鱼皮溶解液中加入一定比例的茯苓寡糖可以显著提高酶解发酵法制备的河豚鱼皮多肽的抗氧化能力；同时，试验结果表明茯苓寡糖的分子量对其功效提升影响显著，当分子量不在本申请所述范围内则不具备上述功效；
（2）本申请利用好氧菌（产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌）共同发酵河豚鱼皮蛋白提取河豚鱼皮多肽，充分利用微生物间的协同作用，提升河豚鱼皮多肽的提取率和体外抗氧化能力，其中：产朊假丝酵母在发酵过程中会产生各种降解细胞壁的酶类，使得更多的多肽等功能活性物质从细胞壁中释放出来，且酵母是产生能够释放结合态酚酸的酶类，有利于提升河豚鱼皮多肽的体外抗氧化能力；枯草芽孢杆菌在高温发酵过程中能够杀灭发酵液中的致病菌，并具有较强的产淀粉酶、蛋白酶等能力，可以将大分子淀粉、蛋白物质降解为微生物所利用，从而提高活性肽的抗氧化能力和营养保健功效；凝结芽孢杆菌的加入则可以显著提升河豚鱼皮多肽·OH自由基清除能力；
（3），本发明采用干酪乳杆菌进行厌氧发酵，提升了河豚鱼皮多肽的稳定性，试验结果表明，在20～80℃范围内，温度和时间对河豚鱼皮水解肽抗氧化性影响不大，当温度超过100℃时抗氧化性随着温度和时间的增加开始降低，稳定性高于目前报道的技术水平；当乳酸菌选择其余乳酸菌，如乳酸杆菌、保加利亚乳杆菌等则不具备上述功效；
（4）采用液体发酵，提高了菌体的生长速率，缩短了发酵时间，提升了生产效率；整个二步发酵工艺条件温和，生产成本低，且易于规模化生产，对提升行业经济效益及规模化推广应用具有重要作用。
具体实施方式
在本申请中，产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的活化方法如下：
（1）产朊假丝酵母种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mLPDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL；
（2）上述枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
实施例1
一种提高河豚鱼皮营养价值的工艺，具体工艺步骤包括：
（1）清洗：将加工的新鲜河豚鱼皮用自来水清洗干净，再用天然矿泉水或纯化水洗净沥干待用；
（2）匀浆：将步骤(1)所得河豚鱼皮加入高速匀浆机，加入天然矿泉水或纯化水，进行高速匀浆，直至全部能够通过2mm孔径圆筛；
（3）灭菌：将匀浆后的河豚鱼皮通过高压蒸锅灭菌，冷却后待用；
（4）复合酶解：向灭菌后的浆液中加入质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃条件下搅拌酶解30min；所述复合蛋白酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的组合，其质量比为2:2:1；
（5）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵8h；所述复合微生物菌剂为产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:3：1；好氧发酵过程中通风量为0.2～0.3m3/m3.min；
（6）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的干酪乳杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；
（7）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；
（8）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；
（9）离心：以10000r/min速率离心分离，上清液即为河豚鱼皮多肽提取液。
测定实施例1中河豚鱼皮多肽提取液的抗氧化能力，其中·OH自由基清除率的测定参照邵秀芝等《食品化学试验》中所述方法；DPPH自由基清除率的测定参照林恋竹等《反应时间对DPPH法、ABTS法评价抗氧化性结果的影响》中所述方法；测定结果如下：
试验组别 ·OH清除率（%） DPPH自由基清除率（%）
实施例1试验组 53.31 74.28
对照1组 32.05 58.74
对照2组 48.89 70.37
对照3组 42.51 66.04
上述实验中对照1组为实施例1中步骤（2）酶解液灭酶离心后的河豚鱼皮多肽产品；对照2组为实施例1中不含厌氧发酵的河豚鱼皮多肽产品，其余同实施例1；对照3组为实施例1中不含厌氧发酵的河豚鱼皮多肽产品，其余同实施例1。
实施例2
一种提高河豚鱼皮营养价值的工艺，具体工艺步骤包括：
（1）清洗：将加工的新鲜河豚鱼皮用自来水清洗干净，再用天然矿泉水或纯化水洗净沥干待用；
（2）匀浆：将步骤(1)所得河豚鱼皮加入高速匀浆机，加入天然矿泉水或纯化水，进行高速匀浆，直至全部能够通过2mm孔径圆筛；加入河豚鱼皮质量比5%的茯苓寡糖，所述茯苓寡糖的分子量为3000D；
（3）灭菌：将匀浆后的河豚鱼皮通过高压蒸锅灭菌，冷却后待用；
（4）复合酶解：向灭菌后的浆液中加入质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃条件下搅拌酶解30min；所述复合蛋白酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的组合，其质量比为2:2:1；
（5）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵8h；所述复合微生物菌剂为产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:3：1；好氧发酵过程中通风量为0.2～0.3m3/m3.min；
（6）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的干酪乳杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；
（7）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；
（8）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；
（9）离心：以10000r/min速率离心分离，上清液即为河豚鱼皮多肽提取液。
测定实施例2中河豚鱼皮多肽提取液的抗氧化能力，测定方法同实施例1中所述的抗氧化性能测定方法。试验结果如下：
试验组别 ·OH清除率（%） DPPH自由基清除率（%）
实施例2试验组 62.67 88.35
对照1组 38.06 65.32
对照2组 53.76 80.15
对照3组 42.37 72.09
上述实验中对照1组为实施例2中步骤（2）酶解液灭酶离心后的河豚鱼皮多肽产品；对照2组为实施例2中不含厌氧发酵的河豚鱼皮多肽产品，其余同实施例2；对照3组为实施例2中不含厌氧发酵的河豚鱼皮多肽产品，其余同实施例2。
实施例3
一种提高河豚鱼皮营养价值的工艺，具体工艺步骤包括：
（1）清洗：将加工的新鲜河豚鱼皮用自来水清洗干净，再用天然矿泉水或纯化水洗净沥干待用；
（2）匀浆：将步骤(1)所得河豚鱼皮加入高速匀浆机，加入天然矿泉水或纯化水，进行高速匀浆，直至全部能够通过2mm孔径圆筛；加入河豚鱼皮质量比5%的茯苓寡糖，所述茯苓寡糖的分子量为6000Da。
（3）灭菌：将匀浆后的河豚鱼皮通过高压蒸锅灭菌，冷却后待用；
（4）复合酶解：向灭菌后的浆液中加入质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃条件下搅拌酶解30min；所述复合蛋白酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的组合，其质量比为2:2:1；
（5）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵8h；所述复合微生物菌剂为产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:3：1；好氧发酵过程中通风量为0.2～0.3m3/m3.min；
（6）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的干酪乳杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；
（7）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；
（8）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；
（9）离心：以10000r/min速率离心分离，上清液即为河豚鱼皮多肽提取液。
测定实施例3中河豚鱼皮多肽提取液的抗氧化能力，测定方法同实施例1中所述的抗氧化性能测定方法。试验结果如下：
试验组别 ·OH清除率（%） DPPH自由基清除率（%）
实施例3试验组 60.59 84.76
对照1组 39.92 64.31
对照2组 56.23 79.61
对照3组 47.22 69.93
上述实验中对照1组为实施例3中步骤（2）酶解液灭酶离心后的河豚鱼皮多肽产品；对照2组为实施例3中不含厌氧发酵的河豚鱼皮多肽产品，其余同实施例3；对照3组为实施例3中不含厌氧发酵的河豚鱼皮多肽产品，其余同实施例3。
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种提高河豚鱼皮营养价值的工艺，其特征在于制备方法包括如下步骤：
（1）清洗：将加工的新鲜河豚鱼皮用自来水清洗干净，再用天然矿泉水或纯化水洗净沥干待用；
（2）匀浆：将步骤(1)所得河豚鱼皮加入高速匀浆机，加入天然矿泉水或纯化水，进行高速匀浆，直至全部能够通过2mm孔径圆筛；
（3）灭菌：将匀浆后的河豚鱼皮通过高压蒸锅灭菌，冷却后待用；
（4）复合酶解：向灭菌后的浆液中加入质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃条件下搅拌酶解30min；
（5）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵8h；
（6）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的干酪乳杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；
（7）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；
（8）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；
（9）离心：以10000r/min速率离心分离，上清液即为河豚鱼皮多肽提取液。
2.根据权利要求1所述的一种提高河豚鱼皮营养价值的工艺，其特征在于所述步骤（2）匀浆过程中加入河豚鱼皮质量比5%的茯苓寡糖。
3.根据权利要求2所述的一种提高河豚鱼皮营养价值的工艺，其特征在于所述茯苓寡糖的分子量为3000-5000Da。
4.根据权利要求1所述的一种提高河豚鱼皮营养价值的工艺，其特征在于所述步骤（4）中所述复合蛋白酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的组合，其质量比为2:2:1。
5.根据权利要求1所述的一种提高河豚鱼皮营养价值的工艺，其特征在于所述步骤（5）中所述复合微生物菌剂为产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:3：1。
6.根据权利要求1所述的一种提高河豚鱼皮营养价值的工艺，其特征在于所述步骤（5）中好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.2～0.3m3/m3.min。
7.根据权利要求1所述的一种提高河豚鱼皮营养价值的工艺，其特征在于所述产朊假丝酵母种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mLPDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
8.根据权利要求1所述的一种提高河豚鱼皮营养价值的工艺，其特征在于所述枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
9.按权利要求1-8所述工艺制备的河豚鱼皮多肽。
10.权利要求9所述河豚鱼皮多肽在在保健、食品、医药中的应用。
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