CN114668792A

CN114668792A - 一种构树提取物的提取方法和应用

Info

Publication number: CN114668792A
Application number: CN202210490649.0A
Authority: CN
Inventors: 张帆帆; 季华员; 刘晨龙; 邹志恒; 周泉勇; 熊立根; 方绍培; 饶煜玲
Original assignee: Institute Of Animal Husbandry Veterinary Jiangxi Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute Of Animal Husbandry Veterinary Jiangxi Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-05-07
Filing date: 2022-05-07
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2042-05-07
Also published as: CN114668792B

Abstract

本发明提供了一种构树提取物的提取方法和应用。该方法通过将构树枝叶烘干后粉碎，然后于乙醇溶液中浸泡，过滤后浓缩干燥即得构树提取物；本申请的构树提取物为天然的植物成分，不会产生耐药性、无残留等优点，在疾病治疗具有广泛的应用前景；本发明的构树提取物能够有效抑制PEDV、SADS‑CoV在Vero E6细胞中的复制，当构树提取物浓度大于2.5mg/ml可完全抑制PEDV和SADS‑CoV的增殖，可广泛用于猪流行性腹泻的预防和治疗，本发明首次发现构树提取物具有高效抑制猪腹泻病毒复制的活性，具有较好的应用价值和市场前景。

Description

一种构树提取物的提取方法和应用

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其涉及一种构树提取物的提取方法和应用。

背景技术

病毒性腹泻一直是困扰生猪养殖的重要疾病之一，疾病主要引起一周龄以内的仔猪呕吐、水样腹泻和脱水死亡。猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea, PED)由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种接触性肠道传染病，是致仔猪死亡的头号杀手，感染率高达60％，死亡率可达100％。PEDV属于套式病毒目冠状病毒科冠状病毒亚科α冠状病毒属的成员，有囊膜的、多形态，电镜下为具有典型“皇冠”状结构的冠状病毒。

猪流行性腹泻暴发呈现所有日龄猪只均可感染、腹泻，又以7日内新生仔猪高发病率和高死亡率为主要特征，在不少规模化养猪场是影响哺乳仔猪存活的头号杀手，是严重危害我国生猪生产的核心传染病。PED在2013年4月首次进入美国，高毒力PEDV 毒株迅速蔓延到美国36个州，超过800万头仔猪死于PED暴发。此后，PEDV 迅速扩散至北美和南美洲其他国家，包括加拿大、墨西哥、多米尼加共和国、哥伦比亚和秘鲁等国家。目前，PEDV已成为全球性猪只腹泻致病原，给世界养猪业带来巨大危害和经济损失。

猪流行性腹泻病毒感染仔猪后，首先激发粘膜局部体液免疫反应，而后再刺激全身免疫；粘膜局部体液免疫以IgA为主，全身体液免疫反应以IgG为主，且粘膜局部免疫反应要早于全身体液免疫反应3–6天；粘膜局部免疫反应周期约30天左右，全身免疫周期约60天左右。为此，预防猪流行性腹泻病毒主要依赖于注射腹泻疫苗免疫母猪产生高水平的sIgA和IgG，通过乳汁为初生仔猪提供免疫保护。然而，一方面，目前的生产的疫苗不能够产生高水平的sIgA水平为仔猪提供免疫保护；另一方面，PEDV的不断变异造成疫苗免疫对各场猪群的保护力参差不齐。除免疫疫苗外，也有使用化学合成的药物(Remdesivir、 Paxlovid、金刚烷胺等)、抗生素、激素也常用于治疗腹泻脱水引起的仔猪死亡，但是其大多具有较大的副作用，并且药物残留对人体具有极大的危害。猪急性腹泻综合征冠状病毒(swineacute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)是 2017年初新发现的一种新型致病性肠道冠状病毒，临床发病时间比PEDV稍晚 2-3天，临床症状也相较于PEDV要轻，发病机制也与PEDV相似，目前尚无疫苗和特效药。

为了解决当前猪流行性腹泻病毒疫苗免疫效力参差不齐，合成药物或抗生素残留、耐药性等问题，有必要研发一种环保防治猪流行性腹泻的药物。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种构树提取物的制备方法和应用、以解决上述问题或者至少部分地解决上述问题。

第一方面，本发明提供了一种构树提取物的制备方法，包括以下步骤：

将构树枝叶烘干后粉碎，加入至乙醇溶液中浸泡后，过滤，得到滤液；

将滤液浓缩后，干燥，即得构树提取物。

优选的是，所述的构树提取物的制备方法，将构树枝叶烘干后粉碎，加入至质量浓度为70～80％的乙醇溶液中浸泡3～5h，过滤，得到滤液。

优选的是，所述的构树提取物的制备方法，构树枝叶与乙醇的质量体积比为1g:(5～10)mL。

优选的是，所述的构树提取物的制备方法，将滤液经52～55℃下减压浓缩后，冷冻干燥，即得构树提取物。

第二方面，本发明还提供了一种所述的制备方法制备得到的构树提取物在制备防治猪流行性腹泻的药物中的应用。

优选的是，所述的应用，所述药物用于抑制猪腹泻病毒的复制。

优选的是，所述的应用，所述猪腹泻病毒为PEDV或SADS-CoV。

优选的是，所述的应用，所述药物的剂型包括溶液剂、粉末剂、片剂中的任一种。

本发明的一种构树提取物的制备方法和应用，相对于现有技术具有以下有益效果：

1、本发明的构树提取物的制备方法，通过将构树枝叶烘干后粉碎，然后于乙醇溶液中浸泡，过滤后浓缩干燥即得构树提取物；本申请的构树提取物为天然的植物成分，不会产生耐药性、无残留等优点，在疾病治疗具有广泛的应用前景；本发明的构树提取物可有效抑制猪流行性腹泻病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒在宿主细胞中的复制；本发明丰富了中草药在治疗疾病的作用，有效的减少了了仔猪死亡和阻止了腹泻病毒的传播，为仔猪的健康生长提供了强有力的保障。本申请的构树提取物相对于复方制剂，成分单一，提取方法成熟，原材料可广泛获得，获得的构树提取物安全性高，稳定性好，适口性好，易于仔猪吸收，天然的植物成分无残留，可调节猪群的抗病毒的免疫功能，是非常绿色环保的抗病毒产品，对我国无抗养殖的发展提供有力保障，具有非常高的开发价值；

2、本发明制备得到的构树提取物，能够有效抑制PEDV、SADS-CoV在Vero E6细胞中的复制，当构树提取物浓度大于2.5mg/ml可完全抑制PEDV和 SADS-CoV的增殖，可广泛用于猪流行性腹泻的预防和治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例2中不同浓度的构树提取物对PEDV滴度的影响结果；

图2为本发明实施例2中不同浓度的构树提取物对PEDV在Vero E6细胞复制的免疫荧光结果；

图3为本发明实施例3中不同浓度的构树提取物对SADS-CoV滴度的影响结果；

图4为本发明实施例3中不同浓度的构树提取物对SADS-CoV在Vero E6 细胞复制的免疫荧光结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

本申请实施例提供了一种构树提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1、将构树枝叶烘干后粉碎，加入至乙醇溶液中浸泡后，过滤，得到滤液；

S2、将滤液浓缩后，干燥，即得构树提取物。

在一些实施例中，将构树枝叶烘干后粉碎，加入至质量浓度为70～80％的乙醇溶液中浸泡3～5h，过滤，得到滤液。

在一些实施例中，构树枝叶与乙醇的质量体积比为1g:(5～10)mL。

在一些实施例中，将构树枝叶烘干后粉碎至100～200目。

在一些实施例中，除了可以采用常规装置对构树枝叶进行烘干，也可以采用公开号为CN113983779A公开的一种便于使用操作的中成药晾晒系统对构树枝叶进行晾晒干燥。

具体的，在一些实施例中，将构树枝叶烘干后粉碎，加入至乙醇溶液常温下浸泡，过滤，得到滤液；

在一些实施例中，将滤液经52～55℃下减压浓缩后，冷冻干燥，即得构树提取物。

第二方面，本发明还提供了一种上述的制备方法制备得到的构树提取物在制备防治猪流行性腹泻的药物中的应用。

在一些实施例中，药物用于抑制猪腹泻病毒的复制。

在一些实施例中，猪腹泻病毒为PEDV或SADS-CoV。

在一些实施例中，药物的剂型包括溶液剂、粉末剂、片剂中的任一种。

本申请的构树提取物的制备方法，通过将构树枝叶烘干后粉碎，然后于乙醇溶液中浸泡，过滤后浓缩干燥即得构树提取物；本申请的构树提取物为天然的植物成分，不会产生耐药性、无残留等优点，在疾病治疗具有广泛的应用前景；构树是桑科、构树属的一种落叶乔木，具有消肿利尿、清热利湿、补肾明目等功效；构树含有多种生物活性物质，具有抗细菌、抗真菌、抗氧化、抗炎和抗肿瘤业活性；本申请的构树提取物可有效抑制猪流行性腹泻病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒在宿主细胞中的复制；本申请丰富了中草药在治疗疾病的作用，有效的减少了了仔猪死亡和阻止了腹泻病毒的传播，为仔猪的健康生长提供了强有力的保障。本申请的构树提取物相对于复方制剂，成分单一，提取方法成熟，原材料可广泛获得。获得的构树提取物安全性高，稳定性好，适口性好，易于仔猪吸收，天然的植物成分无残留，可调节猪群的抗病毒的免疫功能，是非常绿色环保的抗病毒产品，对我国无抗养殖的发展提供有力保障，具有非常高的开发价值。

以下进一步以具体实施例说明本申请的构树提取物的制备方法及其应用。

实施例1

S1、将构树枝叶使用水清洗，然后烘干，粉碎至100～200目，按1g:8mL的比例加入至质量浓度为75％的乙醇溶液中浸泡4h，过滤，得到滤液；

S2、将滤液经52℃减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥获得构树提取物粉末，于常温下保存备用。

实施例2构树提取物对Vero E6细胞生物活性的影响及在Vero E6细胞中抑制PEDV复制的试验

1.构树提取物对Vero E6细胞的毒性作用试验

在96孔板加入等体积浓度为1×10⁵个/ml的Vero E6细胞悬液100μl，将培养板放在培养箱预培养24小时(37℃，5％CO₂)。将实施例1中制备得到的构树提取物用DMEM培养基2倍倍比浓解稀释，加入96孔细胞培养板，终浓度依次为10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml和0.625mg/ml。将培养板在培养箱培养24小时，向每孔加入10μl CCK溶液，在培养箱内孵育4小时。用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算Vero E6细胞存活率，比较构树叶提取物的毒性作用。公式如下：细胞活力*(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100

A(加药)：具有细胞、CCK溶液和药物(药物即指构树提取物)溶液的孔的吸光度

A(空白)：具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度

A(0加药)：具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

结果如下表1所示，当培养物添加终浓度为10mg/ml的构树提取物时，细胞出现少量死亡；当添加浓度为5mg/ml时，为安全浓度。

表1-构树叶提取物对Vero E6细胞存活率的影响

2.不同浓度的构树提取物对PEDV滴度的影响

2.1、取六块12孔板按每孔加入1×10⁵个Vero E6细胞，“十字摇匀”法摇匀后置于培养箱预培养(37℃，5％CO₂)至完全汇合；

2.2、弃去含有10％FBS的DMEM培养基，用1×PBS(pH 7.2～7.4)洗涤细胞表面3次，弃去PBS，用DMEM培养基溶解稀释实施例1中制备的构树提取物，分别向12孔板中加入0mg/ml(阴性对照)、0mg/ml(阳性对照)、5mg/ml、 2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/mlDMEM培养基稀释的构树提取物处理1h 后，弃去孔内液体，除阴性对照孔外，其余孔分别加入MOI＝0.1的PEDV病毒液，置于培养箱孵育1h后，弃去孔内液体，同时添加含有10μg/ml胰酶和对应浓度构树提取物的DMEM培养基置于培养箱预培养(37℃，5％CO₂)培养12h、 24h、36h。收集的样品置于-80℃冰箱保存备用。

2.3、取96孔板按每孔加入1×10⁴Vero E6个细胞，置于培养箱预培养 (37℃，5％CO₂)至完全汇合。将步骤2.2收集的细胞液进行10倍梯度稀释至 10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，再加入至96孔板中，每个稀释度8个重复，放置在37℃、5％CO₂培养箱中孵育1h，然后向96孔板中加入含有10 μg/ml胰酶的DMEM培养液，每孔100μL，放置在37℃、5％CO2细胞培养箱中，培养5-7d，并每天观察记录细胞状态。病毒TCID₅₀的计算按照 Reed-Muench氏法。

根据图1结果显示，当构树提取物的浓度达到2.5mg/ml以上时，构树提取物可以完全抑制PEDV在Vero E6细胞的增殖。

3.使用免疫荧光对不同浓度的构树提取物对PEDV复制的影响

3.1、取六块12孔板按每孔加入1×10⁵个细胞，“十字摇匀”法摇匀后置于培养箱预培养(37℃，5％CO₂)至完全汇合；

3.2、弃去添加10％FBS的DMEM培养基，用1×PBS(pH 7.2～7.4)洗涤细胞表面3次，弃去PBS，用DMEM培养基溶解稀释实施例1中制备得到的构树提取物，分别向12孔板中加入0mg/ml(阴性对照)、0mg/ml(阳性对照)、 5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/mlDMEM培养基稀释后的构树提取物处理1h后，弃去孔内液体，除阴性对照孔外，其余孔分别加入MOI＝0.1的 PEDV病毒液，置于培养箱孵育1h后，弃去孔内液体，同时添加含有10μg/ml 胰酶和对应浓度构树提取物的DMEM培养基置于培养箱预培养(37℃，5％ CO₂)培养12h、24h、36h后PBS清洗3次，加入4℃预冷4％多聚甲醛溶液 1ml，室温固定15min。

3.3、步骤3.2固定的细胞，使用预冷的PBS洗涤细胞3次，每次5min；每孔加入300μL的预冷的无水甲醇将细胞透化15min后，用预冷的PBS洗涤细胞 3次，每次5min；每孔加入300μL的0.5％山羊血清，置于37℃将细胞封闭 30min，之后用预冷的PBS洗涤细胞3次，每次5min；每孔加入200μL稀释好的PEDV N蛋白单克隆抗体，置于4℃孵育过夜；用预冷的PBS洗涤细胞，洗涤3次，每次5min，每孔加入200μL的1:500稀释的FITC荧光二抗，37℃避光孵育30min；用预冷的PBS洗涤细胞，洗涤3次，每孔加入200μL的1:2500稀释的DAPI染色液(PBS稀释)，室温避光作用15min；用预冷的PBS洗涤细胞，洗涤3次，每次5min，洗涤后在荧光显微镜观察并拍照，结果如图2所示。

从图2结果可知，构树提取物具有抑制PEDV复制的生物活性，随着药物浓度的升高，PEDV N蛋白的荧光强毒逐渐减弱。当构树提取物达到2.5mg/ml 时，可完全抑制PEDV病毒的复制。

实施例3

构树提取物对其他种类的冠状病毒的抗病毒活性研究

猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)与猪流行性腹泻病毒(PEDV) 均属于套式病毒目冠状病毒科冠状病毒亚科α冠状病毒属的成员，均可引起7 日龄内仔猪发生急性腹泻、呕吐，死亡率高达100％。本发明人随后采用实施例2中完全相同的试验条件，探究构树提取物对猪急性腹泻综合征冠状病毒的抗病毒活性，即使用SADS-CoV病毒代替实施例2中的PEDV病毒，其余条件均与实施例2相同。

由图3和图4结果表明，构树提取物对SADS-CoV具有较强的抑制作用，并且当构树提取物浓度高于2.5mg/ml时，可完全抑制SADS-CoV的增殖。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种构树提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将滤液浓缩后，干燥，即得构树提取物。

2.如权利要求1所述的构树提取物的制备方法，其特征在于，将构树枝叶烘干后粉碎，加入至质量浓度为70～80％的乙醇溶液中浸泡3～5h，过滤，得到滤液。

3.如权利要求1所述的构树提取物的制备方法，其特征在于，构树枝叶与乙醇的质量体积比为1g:(5～10)mL。

4.如权利要求1所述的构树提取物的制备方法，其特征在于，将滤液经52～55℃下减压浓缩后，冷冻干燥，即得构树提取物。

5.一种如权利要求1～4任一所述的制备方法制备得到的构树提取物在制备防治猪流行性腹泻的药物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物用于抑制猪腹泻病毒的复制。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述猪腹泻病毒为PEDV或SADS-CoV。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括溶液剂、粉末剂、片剂中的任一种。