CN114470148B - 一种抗猪瘟病毒的天然复合生物制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗猪瘟病毒的天然复合生物制剂及其制备方法与应用，其包括原料：大蒜素8‑10份，白菜提取物5‑10份，大蒜抗菌肽0.5‑1份，蒲公英5‑8份，金银花10‑15份，鱼腥草3‑5份，黄芪8‑10份，姜黄1‑2份，桂皮3‑5份，灵芝3‑5份，绿豆肽10‑15份，甘草5‑10份，香菇多糖3‑5份。本发明通过各种天然植物组分进行科学配比，可用于兽药或饲料的制备，可以显著提高猪只的个体免疫能力以及体内的抗病毒抗体水平，使其能够辅助治愈或预防感染非洲猪瘟病毒。

Description

一种抗猪瘟病毒的天然复合生物制剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体为一种抗猪瘟病毒的天然复合生物制剂及其制备方法与应用。
背景技术
猪瘟是由猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起的一种高度传染性、高致病性和高致死性的烈性动物疫病，对养猪业危害巨大。
由于猪瘟病毒在组织和环境中的抵抗能力强，目前并没有有效的治疗措施以及对应的疫苗来控制该病，普遍做法只能是通过免疫的方式，用减毒活疫苗(如猪瘟兔化弱毒疫苗) 进行预防接种；以及通过“扑杀”杀死疫区及附近地区的部分甚至所有猪只以控制疫情，但对此带来的后果是给猪农带来灾难性的后果以及市场猪肉价格飞涨。
近年来，虽然已经研制出猪瘟弱毒疫苗(C株)，而且在此弱毒株的基础上开发出了乳兔苗、免脾淋苗、原代细胞苗及传代细胞苗等多种形式的弱毒疫苗。但组织苗的生产需要大量健康动物，生产过程中人工劳动强度大，成本高，同时存在接种副反应等这些不利因素，因此影响了此类疫苗的实际应用。而以培养细胞繁殖弱毒生产疫苗同样也存在诸多难题，如细胞培养用血清中BVDV及抗体会干扰病毒生长、病毒抗原滴度难以提高、弱毒疫苗需要全程冷链保藏等，其都会导致弱毒疫苗的使用效果。
所以急需一种生物制剂，使其能够在源头上提高猪只的个体免疫能力以及体内的抗病毒抗体水平，使其能够辅助治愈或预防非洲猪瘟，解决猪肉产业的重大难题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种抗猪瘟病毒的天然复合生物制剂及其制备方法与应用，其通过各种天然植物组分进行科学配比，可用于兽药或饲料的制备，可以显著提高猪只的个体免疫能力以及体内的抗病毒抗体水平，使其能够辅助治愈或预防感染非洲猪瘟病毒。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案如下：
提供了一种抗猪瘟病毒的天然复合生物制剂，其包括以下重量份的原料：大蒜素8-10 份，白菜提取物5-10份，大蒜抗菌肽0.5-1份，蒲公英5-8份，金银花10-15份，鱼腥草3-5份，黄芪8-10份，姜黄1-2份，桂皮3-5份，灵芝3-5份，绿豆肽10-15份，甘草5-10份，香菇多糖3-5份。
还提供一种上述抗猪瘟病毒的天然复合生物制剂的制备方法，其包括：
S100、制备大蒜素、白菜提取物、大蒜抗菌肽、绿豆肽以及香菇多糖；
S200、将蒲公英，金银花，鱼腥草，黄芪，姜黄，桂皮，灵芝，甘草磨碎过50目筛，按照权利要求1中的组分用量称取各组分，再将各种原料混合4-6min，得到混合料；
S300、将混合料送入造粒机内造粒，以获得粗成品，且造粒机内的蒸汽压力为0.5-0.8Mpa，造粒温度为70-80℃，造粒机的模孔直径为1.5-3mm；
S400、对所述粗成品进行8目过筛，最终获得所述抗猪瘟病毒的天然复合生物制剂。
优选的，所述大蒜素的制备方法包括：
S1、将大蒜、洋葱去皮、洗净，并粉碎成粒径为80-100目，得原料浆液；
S2、在所述原料浆液中刚加入其重量3-5倍的、质量分数为10％的白砂糖溶液，以及接种所述原料浆液重量3-5％的啤酒酵母，置于25±2℃的环境下恒温发酵48h，以得到发酵液；
S3、将发酵液的pH值调节至8.0-8.5，按所述发酵液重量的3-4％加入胰蛋白酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至55-60℃，保温30-35min后得到第一酶解液；
待第一酶解液降至20-22℃后，再调整其pH值至3.5-4.5，按第一酶解液重量的2-3％加入果胶酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至42-45℃，保温25-30min后得到第二酶解液；
待第二酶解液降至20-22℃后，再调整其pH值至4.5-5.0，按第二酶解液重量的1-2％加入纤维素酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至50-55℃，保温20-35min后得到第三酶解液；
S4、在所述第三酶解液中加入其重量5-6倍的无水乙醇进行超声提取，且超声功率为 100KW，超声提取温度为20-25℃，超声提取时间为20-30min；
S5、对完成超声提取的第三酶解液进行抽滤，分别得到滤液和滤渣，使用旋转蒸发仪对滤液进行干燥，以得到大蒜素成品。
优选的，所述步骤S1中，在粉碎前还包括：将去皮、洗净后的洋葱和大蒜浸入前处理液中浸泡12-24h；所述前处理液由质量分数3-5％的柠檬酸溶液和质量分数1-2％的乙酸溶液组成，且按体积比计，质量分数3-5％的柠檬酸溶液：质量分数1-2％的乙酸溶液＝(1-3)： 1。
优选的，所述大蒜抗菌肽的制备方法包括：
S1、将大蒜去皮、洗净，于80-100℃环境下干燥8-12h，在粉碎过20目筛，得大蒜粉；
S2、在所述大蒜粉中刚加入其重量3-5倍的、质量分数为10％的白砂糖溶液，以及接种所述原料浆液重量2-3％的啤酒酵母，置于25±2℃的环境下恒温发酵48h，以得到发酵液；
S3、将所述发酵液于5000-8000rpm条件下离心10-15min，收集上清液，上清液用0.1mol/L HCL和0.1mol/L NaOH调节pH值至4-5，以沉淀蛋白；再于5000-8000rpm条件下离心15-20min收集沉淀，将收集的沉淀用蒸馏水洗2-3遍后将pH调节为7，让沉淀的粗蛋白复溶，以得到大蒜抗菌肽粗品溶液；
S4、将所述大蒜抗菌肽粗品溶液加入半透膜中；再置于缓冲液中，于20-25℃下搅拌渗滤至缓冲液pH＝2.5-3.5；然后将含有大蒜抗菌肽粗品溶液的半透膜转移至纯化水中，于20-25℃下搅拌渗滤至半透膜内溶液pH＝3.0-4.0，以得到大蒜抗菌肽一次溶液；
S5、将所述大蒜抗菌肽一次溶液通过进行反相高效液相色谱分离，以获得大蒜抗菌肽二次溶液；所述反相高效液相色谱分离包括：将样品上样至反相C4硅胶柱上，并依次利用含有三氟乙酸的双蒸水和含有三氟乙酸的乙腈对C4硅胶柱进行洗脱处理，获得洗脱样品，其中，含有三氟乙酸的双蒸水中三氟乙酸的质量分数为0.2-0.3％，含有三氟乙酸的乙腈中三氟乙酸的质量分数为0.2-0.3％，乙腈质量分数为80-85％；洗脱处理时间为 40-45min；
以及S6、所述大蒜抗菌肽二次溶液通过醋酸铵和醋酸离子交换转盐，以获得大蒜抗菌肽精提液，对大蒜抗菌肽精提液进行减压浓缩、干燥后得到所述大蒜抗菌肽成品。
优选的，所述白菜提取物的制备方法包括：
S1、取新鲜白菜，加入白菜重量2-3倍的去离子水，并在25℃下浸泡3-5h，取出再用去离子水冲洗2-3遍；再将冲洗后的白菜打碎磨浆，得到白菜浆液；
S2、在所述白菜浆液中加入其重量2-3％的果胶酶，于30-40℃下处理12-24h，其中每30min搅拌一次，处理完成后保温30-35min后得到第一酶解液；
待第一酶解液降至20-22℃后，再调整其pH值至3.5-4.5，按第一酶解液重量的2-3％加入果胶酶，于30-40℃下处理8-10h，其中每30min搅拌一次，处理完成后保温2-3h，以得到第二酶解液；
S3、在所述第二酶解液中按照第二酶解液重量的3-5％加入活性干酵母以及按照第二酶解液重量的0.001-0.002％加入亚硒酸钠，发酵48-72h，获得初次发酵液；
S4、在所述初次发酵液中按照初次发酵液重量的1-2％加入冰醋酸以及按照初次发酵液重量的0.001-0.0015％加入亚硒酸钠，发酵36-48h，获得二次发酵液；
S5、将所述二次发酵依次经过分离孔径为50-100nm的陶瓷膜、截留分子量为2000-5000Da的超滤膜以及截留分子量为300-500Da的纳滤膜，最后得到白菜粗提物；
S6、按照白菜粗提物体积的1/10加入0.4M醋酸钡,搅拌均匀静置30min以沉降提取液中的部分蛋白质和悬浮杂质，然后4000r/min离心10min后,收集上清液,即得到含有吲哚-3-甲醇的白菜提取物。
优选的，所述香菇多糖的制备方法包括：
S1、香菇剪碎，于70℃烘箱中干燥至恒重，用超微粉碎机粉碎，过60目筛网，以获得香菇粉；所述超微粉碎条件为进料量300g，转速4000r/min，超微粉碎时间10min，粉碎两次；
S2、取香菇粉，加入香菇粉质量的20倍去离子水，调节温度至60℃后进行微波处理，随后将香菇水溶液加入亚临界水反应釜进行亚临界水提取，提取完成后，4000r/min离心 20min，上清液经旋转蒸发浓缩至1/3体积，以获得香菇多糖提取液；所述微波处理条件为：微波功率650W，微波6min；所述亚临界水提取条件为：提取压力5MPa，提取温度130℃，提取时间15min；
S3、在所述香菇多糖提取液中加入3倍体积的95％乙醇，200r/min搅拌30min后于4℃醇沉12h，随后减压抽滤取固形物，50℃烘干，即为香菇粗多糖；
S4、按质量比1:2加入去离子水对香菇粗多糖进行复融，将复融后的溶液置于-40℃冰箱4h后，取出于室温下融化，4000r/min低温离心10min，沉淀用去离子水洗涤后再次离心，重复3次弃去沉淀，合并上清液并将上清液反复冻融重复此步骤直至无沉淀产生，以获得初步脱蛋白的粗多糖溶液；
S5、在所述粗多糖溶液中按照体积比1∶1加入5％的三氯乙酸，涡旋震荡后于4℃过夜，8000r/min离心15min，上清液重复操作此步骤直至无沉淀产生，合并上清液，浓缩后冻干既得香菇多糖成品。
优选的，所述绿豆肽的制备方法包括：
S1、将绿豆用水浸泡过夜，去皮，40℃烘干后粉碎，过80目筛，以获得颗粒均匀的脱皮绿豆粉；
S2、向脱皮绿豆粉中加入其10倍重量的去离子水，用2mol/L的NaOH调节pH至8.0，同时调节温度至50℃后进行微波处理，对微波处理完成后的脱皮绿豆粉悬浮液进行减压抽滤，滤液用2mol/mL HCl调节pH至4.5，6000r/min离心15min，沉淀即为绿豆蛋白；所述微波处理条件为：微波功率400W，微波时间15min；
S3、在所述绿豆蛋白中加入其7倍重量的去离子水，调节pH至7.0，随后放入耐高压绝缘袋并置于处理腔进行高压脉冲电场处理，处理完毕后调节温度至55℃，加入3.5-4.5％绿豆蛋白重量的蛋白酶进行酶解，酶解后迅速将酶解液置于沸水中加热10min灭酶；随后再次调节酶解液pH至4.5以沉淀未反应的蛋白，3000r/min离心15min，上清液即为绿豆肽粗品溶液；所述高压脉冲电场处理条件为：场强16kV/cm，脉冲数18；所述蛋白酶为复合蛋白酶，酶解3.5h；
S4、将所述绿豆肽粗品溶液以1mL/min的流速流过大孔吸附树脂，透过液冷冻干燥即为绿豆肽成品。
还提供一种上述抗猪瘟病毒的天然复合生物制剂在制备饲料添加剂中的应用。
还提供一种上述抗猪瘟病毒的天然复合生物制剂在制备兽药中的应用。
与现有技术相比，本发明中含有丰富的天然植物抗病毒杀菌组分，如大蒜素、白菜提取物中的吲哚-3-甲醇(I3C)、大蒜抗菌肽、蒲公英、金银花、鱼腥草、黄芪、姜黄、绿豆肽等，同时，大蒜抗菌肽还可以作为抗生素的替代品运用于饲料和兽药制备中，以此减少抗生素的使用，同时搭配黄芪、甘草、桂皮、灵芝、香菇多糖，进一步祛除猪只体内积累毒素，以此提高猪只机体免疫力，有效防止非洲猪瘟病毒感染以及杀灭病毒、抑制病毒增长。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本实施例提供了一种抗猪瘟病毒的天然复合生物制剂，其包括以下重量份的原料：大蒜素8份，白菜提取物5份，大蒜抗菌肽0.5份，蒲公英8份，金银花11份，鱼腥草3 份，黄芪8份，姜黄1份，桂皮3份，灵芝3份，绿豆肽12份，甘草5份，香菇多糖3 份。
实施例2：
本实施例与实施例1的不同之处仅在于，本实施例中的抗猪瘟病毒的天然复合生物制剂有以下重量份的原料组成：大蒜素10份，白菜提取物10份，大蒜抗菌肽1份，蒲公英 8份，金银花13份，鱼腥草5份，黄芪9份，姜黄2份，桂皮5份，灵芝4份，绿豆肽 14份，甘草8份，香菇多糖5份。
实施例3：
本实施例与实施例1的不同之处仅在于，本实施例中的抗猪瘟病毒的天然复合生物制剂有以下重量份的原料组成：大蒜素9份，白菜提取物7份，大蒜抗菌肽0.8份，蒲公英 7份，金银花13份，鱼腥草4份，黄芪9份，姜黄1.5份，桂皮4份，灵芝4份，绿豆肽 13份，甘草8份，香菇多糖4份。
实施例4：
本实施例提供了一种如实施例1至3任一项所述抗猪瘟病毒的天然复合生物制剂的制备方法，其包括：
S100、制备大蒜素、白菜提取物、大蒜抗菌肽、绿豆肽以及香菇多糖；
S200、将蒲公英，金银花，鱼腥草，黄芪，姜黄，桂皮，灵芝，甘草磨碎过50目筛，按照实施例1至3任一项中的组分用量称取各组分，再将各原料混合4-6分钟min，得到混合料；
S300、将混合料送入造粒机内造粒，以获得粗成品，且造粒机内的蒸汽压力为0.5-0.8Mpa(优选为0.7Mpa)，造粒温度为70-80℃(优选为75℃)，造粒机的模孔直径为1.5-3mm(优选为2.0mm)；
S400、对所述粗成品进行8目过筛，最终获得所述抗猪瘟病毒的天然复合生物制剂。
其中，所述大蒜素的制备方法包括：
S1、将大蒜、洋葱去皮、洗净，且按重量计，大蒜：洋葱＝3：1；再将去皮、洗净后的洋葱和大蒜浸入前处理液中浸泡12h；所述前处理液由质量分数3％的柠檬酸溶液和质量分数1％的乙酸溶液组成，且按体积比计，质量分数3％的柠檬酸溶液：质量分数1％的乙酸溶液＝1：1；干燥后再粉碎成粒径为80-100目，得原料浆液；由此可通过前处理液消除大蒜、洋葱在处理过程中产生的臭味，避免对环境造成污染；
S2、在所述原料浆液中刚加入其重量3倍的、质量分数为10％的白砂糖溶液，以及接种所述原料浆液重量3％的啤酒酵母，置于25±2℃的环境下恒温发酵48h，以得到发酵液；
S3、将发酵液的pH值调节至8.0，按所述发酵液重量的3％加入胰蛋白酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至55℃，保温30min后得到第一酶解液；
待第一酶解液降至20-22℃后，再调整其pH值至3.5，按第一酶解液重量的2％加入果胶酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至42℃，保温25min后得到第二酶解液；
待第二酶解液降至20-22℃后，再调整其pH值至4.5，按第二酶解液重量的1％加入纤维素酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至50℃，保温20min后得到第三酶解液；
S4、在所述第三酶解液中加入其重量5倍的无水乙醇进行超声提取，且超声功率为100KW，超声提取温度为20℃，超声提取时间为20min；
S5、对完成超声提取的第三酶解液进行抽滤，分别得到滤液和滤渣，使用旋转蒸发仪对滤液进行干燥，以得到大蒜素成品。
进一步的，所述大蒜抗菌肽的制备方法包括：
S1、将大蒜去皮、洗净，于80℃环境下干燥8h，在粉碎过20目筛，得大蒜粉；
S2、在所述大蒜粉中刚加入其重量3倍的、质量分数为10％的白砂糖溶液，以及接种所述原料浆液重量2％的啤酒酵母，置于25±2℃的环境下恒温发酵48h，以得到发酵液；
S3、将所述发酵液于5000rpm条件下离心10min，收集上清液，上清液用0.1mol/LHCL 和0.1mol/L NaOH调节pH值至4，以沉淀蛋白；再于5000rpm条件下离心15min收集沉淀，将收集的沉淀用蒸馏水洗2-3遍后将pH调节为7，让沉淀的粗蛋白复溶，以得到大蒜抗菌肽粗品溶液；
S4、将所述大蒜抗菌肽粗品溶液加入半透膜中，本实施例中，所述半透膜为纤维素酯膜，截留分子量为500Da；再置于缓冲液(所述缓冲液为pH＝3.5的醋酸盐缓冲液)中，于20℃下搅拌渗滤至缓冲液pH＝2.5；然后将含有大蒜抗菌肽粗品溶液的半透膜转移至纯化水中，于20℃下搅拌渗滤至半透膜内溶液pH＝3.0，以得到大蒜抗菌肽一次溶液；
S5、将所述大蒜抗菌肽一次溶液通过进行反相高效液相色谱分离，以获得大蒜抗菌肽二次溶液；所述反相高效液相色谱分离包括：将样品上样至反相C4硅胶柱上，并依次利用含有三氟乙酸的双蒸水和含有三氟乙酸的乙腈对C4硅胶柱进行洗脱处理，获得洗脱样品，其中，含有三氟乙酸的双蒸水中三氟乙酸的质量分数为0.2％，含有三氟乙酸的乙腈中三氟乙酸的质量分数为0.2％，乙腈质量分数为80％；洗脱处理时间为40min；
以及S6、所述大蒜抗菌肽二次溶液通过醋酸铵和醋酸离子交换转盐，以获得大蒜抗菌肽精提液，对大蒜抗菌肽精提液进行减压浓缩、干燥后得到所述大蒜抗菌肽成品；其中，所述减压浓缩的温度为20℃，真空度为0.1。
进一步的，所述白菜提取物的制备方法包括：
S1、取新鲜白菜，加入白菜重量2倍的去离子水，并在25℃下浸泡3h，取出再用去离子水冲洗2-3遍；再将冲洗后的白菜打碎磨浆，得到白菜浆液；
S2、在所述白菜浆液中加入其重量2％的果胶酶，于30℃下处理12h，其中每30min搅拌一次，处理完成后保温30min后得到第一酶解液；
待第一酶解液降至20-22℃后，再调整其pH值至3.5，按第一酶解液重量的2％加入果胶酶，于30℃下处理8h，其中每30min搅拌一次，处理完成后保温2h，以得到第二酶解液；
S3、在所述第二酶解液中按照第二酶解液重量的3％加入活性干酵母以及按照第二酶解液重量的0.001％加入亚硒酸钠，发酵48h，获得初次发酵液；
S4、在所述初次发酵液中按照初次发酵液重量的1％加入冰醋酸以及按照初次发酵液重量的0.001％加入亚硒酸钠，发酵36h，获得二次发酵液；
S5、将所述二次发酵依次经过分离孔径为50-100nm的陶瓷膜、截留分子量为2000-5000Da的超滤膜以及截留分子量为300-500Da的纳滤膜，最后得到白菜粗提物；
S6、按照白菜粗提物体积的1/10加入0.4M醋酸钡,搅拌均匀静置30min以沉降提取液中的部分蛋白质和悬浮杂质。然后4000r/min离心10min后,收集上清液,即得到含有吲哚-3-甲醇的白菜提取物。
进一步的，所述香菇多糖的制备方法包括：
S1、香菇剪碎，于70℃烘箱中干燥至恒重，用超微粉碎机粉碎，过60目的筛网，以获得香菇粉；所述超微粉碎条件为进料量300g，转速4000r/min，超微粉碎时间10min，粉碎两次；
S2、取香菇粉，加入香菇粉质量的20倍去离子水，调节温度至60℃后进行微波处理，随后将香菇水溶液加入亚临界水反应釜进行亚临界水提取，提取完成后，4000r/min离心 20min，上清液经旋转蒸发浓缩至1/3体积，以获得香菇多糖提取液；所述微波处理条件为：微波功率650W，微波6min；所述亚临界水提取条件为：提取压力5MPa，提取温度130℃，提取时间15min；
S3、在所述香菇多糖提取液中加入3倍体积的95％乙醇，200r/min搅拌30min后于4℃醇沉12h，随后减压抽滤取固形物，50℃烘干，即为香菇粗多糖；
S4、按质量比1:2加入去离子水对香菇粗多糖进行复融，将复融后的溶液置于-40℃冰箱4h后，取出于室温下融化，4000r/min低温离心10min，沉淀用去离子水洗涤后再次离心，重复3次弃去沉淀，合并上清液并将上清液反复冻融重复此步骤直至无沉淀产生，以获得初步脱蛋白的粗多糖溶液；
S5、在所述粗多糖溶液中按照体积比1∶1加入5％的三氯乙酸，涡旋震荡后于4℃过夜，8000r/min离心15min，上清液重复操作此步骤直至无沉淀产生，合并上清液，浓缩后冻干既得香菇多糖成品。
更进一步的，所述绿豆肽的制备方法包括：
S1、将绿豆用水浸泡过夜，去皮，40℃烘干后粉碎，过80目筛，以获得颗粒均匀的脱皮绿豆粉；
S2、向脱皮绿豆粉中加入其10倍重量的去离子水，用2mol/L的NaOH调节pH至8.0，同时调节温度至50℃后进行微波处理，对微波处理完成后的脱皮绿豆粉悬浮液进行减压抽滤，滤液用2mol/mL HCl调节pH至4.5，6000r/min离心15min，沉淀即为绿豆蛋白；所述微波处理条件为：微波功率400W，微波时间15min；
S3、在所述绿豆蛋白中加入其7倍重量的去离子水，调节pH至7.0，随后放入耐高压绝缘袋并置于处理腔进行高压脉冲电场处理，处理完毕后调节温度至55℃，加入4.0％绿豆蛋白重量的蛋白酶进行酶解，酶解后迅速将酶解液置于沸水中加热10min灭酶；随后再次调节酶解液pH至4.5以沉淀未反应的蛋白，3000r/min离心15min，上清液即为绿豆肽粗品溶液；所述高压脉冲电场处理条件为：场强16kV/cm，脉冲数18；所述蛋白酶为复合蛋白酶(所述复合酶按照中性蛋白酶：风味蛋白酶＝1:1配制而成)，酶解3.5h；
S4、将所述绿豆肽粗品溶液以1mL/min的流速流过大孔吸附树脂，透过液冷冻干燥即为绿豆肽成品；所述大孔吸附树脂需经如下预处理：将一定量的大孔吸附树脂先用无水乙醇浸泡，使树脂充分溶胀，然后用无水乙醇洗至220nm处无吸收峰，最后再用去离子水清洗，去掉乙醇后装柱备用。
实施例5：
本实施例与实施例4的不同之处仅在于：所述大蒜素的制备方法包括：
S1、将大蒜、洋葱去皮、洗净，且按重量计，大蒜：洋葱＝4：1；再将去皮、洗净后的洋葱和大蒜浸入前处理液中浸泡18h；所述前处理液由质量分数4％的柠檬酸溶液和质量分数1.5％的乙酸溶液组成，且按体积比计，质量分数4％的柠檬酸溶液：质量分数1.5％的乙酸溶液＝2：1；再粉碎成粒径为80-100目，得原料浆液；
S2、在所述原料浆液中刚加入其重量4倍的、质量分数为10％的白砂糖溶液，以及接种所述原料浆液重量4％的啤酒酵母，置于25±2℃的环境下恒温发酵48h，以得到发酵液；
S3、将发酵液的pH值调节至8.2，按所述发酵液重量的3.5％加入胰蛋白酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至57℃，保温32min后得到第一酶解液；
待第一酶解液降至20-22℃后，再调整其pH值至4.0，按第一酶解液重量的2.5％加入果胶酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至43℃，保温30min后得到第二酶解液；
待第二酶解液降至20-22℃后，再调整其pH值至4.7，按第二酶解液重量的1.5％加入纤维素酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至52℃，保温30min后得到第三酶解液；
S4、在所述第三酶解液中加入其重量6倍的无水乙醇进行超声提取，且超声功率为100KW，超声提取温度为22℃，超声提取时间为25min；
S5、对完成超声提取的第三酶解液进行抽滤，分别得到滤液和滤渣，使用旋转蒸发仪对滤液进行干燥，以得到大蒜素成品。
进一步的，所述大蒜抗菌肽的制备方法包括：
S1、将大蒜去皮、洗净，于90℃环境下干燥10h，在粉碎过20目筛，得大蒜粉；
S2、在所述大蒜粉中刚加入其重量4倍的、质量分数为10％的白砂糖溶液，以及接种所述原料浆液重量2.5％的啤酒酵母，置于25±2℃的环境下恒温发酵48h，以得到发酵液；
S3、将所述发酵液于7000rpm条件下离心12min，收集上清液，上清液用0.1mol/LHCL 和0.1mol/L NaOH调节pH值至4.5，以沉淀蛋白；再于7000rpm条件下离心17min收集沉淀，将收集的沉淀用蒸馏水洗2-3遍后将pH调节为7，让沉淀的粗蛋白复溶，以得到大蒜抗菌肽粗品溶液；
S4、将所述大蒜抗菌肽粗品溶液加入半透膜中，本实施例中，所述半透膜为纤维素酯膜，截留分子量为500Da；再置于缓冲液(所述缓冲液为pH＝3.5的醋酸盐缓冲液)中，于22℃下搅拌渗滤至缓冲液pH＝3.0；然后将含有大蒜抗菌肽粗品溶液的半透膜转移至纯化水中，于20℃下搅拌渗滤至半透膜内溶液pH＝3.5，以得到大蒜抗菌肽一次溶液；
S5、将所述大蒜抗菌肽一次溶液通过进行反相高效液相色谱分离，以获得大蒜抗菌肽二次溶液；所述反相高效液相色谱分离包括：将样品上样至反相C4硅胶柱上，并依次利用含有三氟乙酸的双蒸水和含有三氟乙酸的乙腈对C4硅胶柱进行洗脱处理，获得洗脱样品，其中，含有三氟乙酸的双蒸水中三氟乙酸的质量分数为0.25％，含有三氟乙酸的乙腈中三氟乙酸的质量分数为0.25％，乙腈质量分数为82％；洗脱处理时间为42min；
以及S6、所述大蒜抗菌肽二次溶液通过醋酸铵和醋酸离子交换转盐，以获得大蒜抗菌肽精提液，对大蒜抗菌肽精提液进行减压浓缩、干燥后得到所述大蒜抗菌肽成品；其中，所述减压浓缩的温度为22℃，真空度为0.12。
更进一步的，所述白菜提取物的制备方法包括：
S1、取新鲜白菜，加入白菜重量2倍的去离子水，并在25℃下浸泡4h，取出再用去离子水冲洗2-3遍；再将冲洗后的白菜打碎磨浆，得到白菜浆液；
S2、在所述白菜浆液中加入其重量2.5％的果胶酶，于35℃下处理18h，其中每30min 搅拌一次，处理完成后保温32min后得到第一酶解液；
待第一酶解液降至20-22℃后，再调整其pH值至4.0，按第一酶解液重量的2.5％加入果胶酶，于35℃下处理9h，其中每30min搅拌一次，处理完成后保温2.5h，以得到第二酶解液；
S3、在所述第二酶解液中按照第二酶解液重量的4％加入活性干酵母以及按照第二酶解液重量的0.0015％加入亚硒酸钠，发酵60h，获得初次发酵液；
S4、在所述初次发酵液中按照初次发酵液重量的1.5％加入冰醋酸以及按照初次发酵液重量的0.0012％加入亚硒酸钠，发酵40h，获得二次发酵液；
S5、将所述二次发酵依次经过分离孔径为50-100nm的陶瓷膜、截留分子量为2000-5000Da的超滤膜以及截留分子量为300-500Da的纳滤膜，最后得到白菜粗提物；
S6、按照白菜粗提物体积的1/9加入0.4M醋酸钡,搅拌均匀静置25min以沉降提取液中的部分蛋白质和悬浮杂质。然后5000r/min离心8min后,收集上清液,即得到含有吲哚-3-甲醇的白菜提取物。
所述香菇多糖的制备方法包括：
S1、香菇剪碎，于70℃烘箱中干燥至恒重，用超微粉碎机粉碎，过60目的筛网，以获得香菇粉；所述超微粉碎条件为进料量300g，转速6000r/min，超微粉碎时间7min；
S2、取香菇粉，加入香菇粉质量的15倍去离子水，调节温度至60℃后进行微波处理，随后将香菇水溶液加入亚临界水反应釜进行亚临界水提取，提取完成后，4000r/min离心 20min，上清液经旋转蒸发浓缩至1/3体积，以获得香菇多糖提取液；所述微波处理条件为：微波功率600W，微波8min；所述亚临界水提取条件为：提取压力10MPa，提取温度 110℃，提取时间10min；
S3、在所述香菇多糖提取液中加入4倍体积的95％乙醇，200r/min搅拌30min后于4℃醇沉18h，随后减压抽滤取固形物，50℃烘干，即为香菇粗多糖；
S4、按质量比1:3加入去离子水对香菇粗多糖进行复融，将复融后的溶液置于-40℃冰箱4h后，取出于室温下融化，4000r/min低温离心10min，沉淀用去离子水洗涤后再次离心，重复3次弃去沉淀，合并上清液并将上清液反复冻融重复此步骤直至无沉淀产生，以获得初步脱蛋白的粗多糖溶液；
S5、在所述粗多糖溶液中按照体积比1∶1加入7％的三氯乙酸，涡旋震荡后于4℃过夜，8000r/min离心15min，上清液重复操作此步骤直至无沉淀产生，合并上清液，浓缩后冻干既得香菇多糖成品。
更进一步的，所述绿豆肽的制备方法包括：
S1、将绿豆用水浸泡过夜，去皮，40℃烘干后粉碎，过80目筛，以获得颗粒均匀的脱皮绿豆粉；
S2、向脱皮绿豆粉中加入其15倍重量的去离子水，用2mol/L的NaOH调节pH至8.5，同时调节温度至50℃后进行微波处理，对微波处理完成后的脱皮绿豆粉悬浮液进行减压抽滤，滤液用2mol/mL HCl调节pH至4.2，6000r/min离心15min，沉淀即为绿豆蛋白；所述微波处理条件为：微波功率450W，微波时间12min；
S3、在所述绿豆蛋白中加入其8倍重量的去离子水，调节pH至7.5，随后放入耐高压绝缘袋并置于处理腔进行高压脉冲电场处理，处理完毕后调节温度至55℃，加入3.5％绿豆蛋白重量的蛋白酶进行酶解，酶解后迅速将酶解液置于沸水中加热10min灭酶；随后再次调节酶解液pH至4.2以沉淀未反应的蛋白，3000r/min离心15min，上清液即为绿豆肽粗品溶液；所述高压脉冲电场处理条件为：场强15kV/cm，脉冲数20；所述蛋白酶为复合蛋白酶(所述复合酶按照中性蛋白酶：风味蛋白酶＝1:1配制而成)，酶解3.0h；
S4、将所述绿豆肽粗品溶液以1mL/min的流速流过大孔吸附树脂，透过液冷冻干燥即为绿豆肽成品；所述大孔吸附树脂需经如下预处理：将一定量的大孔吸附树脂先用无水乙醇浸泡，使树脂充分溶胀，然后用无水乙醇洗至220nm处无吸收峰，最后再用去离子水清洗，去掉乙醇后装柱备用。
实施例6：
本实施例与实施例4的不同之处仅在于：所述大蒜素的制备方法包括：
S1、将大蒜、洋葱去皮、洗净，且按重量计，大蒜：洋葱＝5：1；再将去皮、洗净后的洋葱和大蒜浸入前处理液中浸泡24h；所述前处理液由质量分数5％的柠檬酸溶液和质量分数2％的乙酸溶液组成，且按体积比计，质量分数5％的柠檬酸溶液：质量分数2％的乙酸溶液＝3：1；再粉碎成粒径为80-100目，得原料浆液；
S2、在所述原料浆液中刚加入其重量5倍的、质量分数为10％的白砂糖溶液，以及接种所述原料浆液重量5％的啤酒酵母，置于25±2℃的环境下恒温发酵48h，以得到发酵液；
S3、将发酵液的pH值调节至8.5，按所述发酵液重量的4％加入胰蛋白酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至60℃，保温35min后得到第一酶解液；
待第一酶解液降至20-22℃后，再调整其pH值至4.5，按第一酶解液重量的3％加入果胶酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至45℃，保温30min后得到第二酶解液；
待第二酶解液降至20-22℃后，再调整其pH值至5.0，按第二酶解液重量的2％加入纤维素酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至55℃，保温35min后得到第三酶解液；
S4、在所述第三酶解液中加入其重量6倍的无水乙醇进行超声提取，且超声功率为100KW，超声提取温度为25℃，超声提取时间为30min；
S5、对完成超声提取的第三酶解液进行抽滤，分别得到滤液和滤渣，使用旋转蒸发仪对滤液进行干燥，以得到大蒜素成品。
进一步的，所述大蒜抗菌肽的制备方法包括：
S1、将大蒜去皮、洗净，于100℃环境下干燥12h，在粉碎过20目筛，得大蒜粉；
S2、在所述大蒜粉中刚加入其重量5倍的、质量分数为10％的白砂糖溶液，以及接种所述原料浆液重量3％的啤酒酵母，置于25±2℃的环境下恒温发酵48h，以得到发酵液；
S3、将所述发酵液于8000rpm条件下离心15min，收集上清液，上清液用0.1mol/LHCL 和0.1mol/L NaOH调节pH值至5.0，以沉淀蛋白；再于8000rpm条件下离心20min收集沉淀，将收集的沉淀用蒸馏水洗2-3遍后将pH调节为7，让沉淀的粗蛋白复溶，以得到大蒜抗菌肽粗品溶液；
S4、将所述大蒜抗菌肽粗品溶液加入半透膜中，本实施例中，所述半透膜为纤维素酯膜，截留分子量为500Da；再置于缓冲液(所述缓冲液为pH＝3.5的醋酸盐缓冲液)中，于25℃下搅拌渗滤至缓冲液pH＝3.5；然后将含有大蒜抗菌肽粗品溶液的半透膜转移至纯化水中，于25℃下搅拌渗滤至半透膜内溶液pH＝3.5，以得到大蒜抗菌肽一次溶液；
S5、将所述大蒜抗菌肽一次溶液通过进行反相高效液相色谱分离，以获得大蒜抗菌肽二次溶液；所述反相高效液相色谱分离包括：将样品上样至反相C4硅胶柱上，并依次利用含有三氟乙酸的双蒸水和含有三氟乙酸的乙腈对C4硅胶柱进行洗脱处理，获得洗脱样品，其中，含有三氟乙酸的双蒸水中三氟乙酸的质量分数为0.3％，含有三氟乙酸的乙腈中三氟乙酸的质量分数为0.3％，乙腈质量分数为85％；洗脱处理时间为45min；
以及S6、所述大蒜抗菌肽二次溶液通过醋酸铵和醋酸离子交换转盐，以获得大蒜抗菌肽精提液，对大蒜抗菌肽精提液进行减压浓缩、干燥后得到所述大蒜抗菌肽成品；其中，所述减压浓缩的温度为25℃，真空度为0.12。
更进一步的，所述白菜提取物的制备方法包括：
S1、取新鲜白菜，加入白菜重量3倍的去离子水，并在25℃下浸泡5h，取出再用去离子水冲洗2-3遍；再将冲洗后的白菜打碎磨浆，得到白菜浆液；
S2、在所述白菜浆液中加入其重量3％的果胶酶，于40℃下处理24h，其中每30min搅拌一次，处理完成后保温35min后得到第一酶解液；
待第一酶解液降至20-22℃后，再调整其pH值至4.5，按第一酶解液重量的3％加入果胶酶，于40℃下处理10h，其中每30min搅拌一次，处理完成后保温3h，以得到第二酶解液；
S3、在所述第二酶解液中按照第二酶解液重量的5％加入活性干酵母以及按照第二酶解液重量的0.002％加入亚硒酸钠，发酵72h，获得初次发酵液；
S4、在所述初次发酵液中按照初次发酵液重量的2％加入冰醋酸以及按照初次发酵液重量的0.0015％加入亚硒酸钠，发酵48h，获得二次发酵液；
S5、将所述二次发酵依次经过分离孔径为50-100nm的陶瓷膜、截留分子量为2000-5000Da的超滤膜以及截留分子量为300-500Da的纳滤膜，最后得到白菜粗提物；
S6、按照白菜粗提物体积的1/8加入0.4M醋酸钡,搅拌均匀静置30min以沉降提取液中的部分蛋白质和悬浮杂质。然后4000r/min离心10min后,收集上清液,即得到含有吲哚-3-甲醇的白菜提取物。
进一步的，所述香菇多糖的制备方法包括：
S1、香菇剪碎，于70℃烘箱中干燥至恒重，用超微粉碎机粉碎，过60目的筛网，以获得香菇粉；所述超微粉碎条件为进料量300g，转速6000r/min，超微粉碎时间6min；
S2、取香菇粉，加入香菇粉质量的17倍去离子水，调节温度至60℃后进行微波处理，随后将香菇水溶液加入亚临界水反应釜进行亚临界水提取，提取完成后，4000r/min离心 20min，上清液经旋转蒸发浓缩至1/3体积，以获得香菇多糖提取液；所述微波处理条件为：微波功率650W，微波6min；所述亚临界水提取条件为：提取压力7.5MPa，提取温度 115℃，提取时间13min；
S3、在所述香菇多糖提取液中加入5倍体积的95％乙醇，200r/min搅拌30min后于4℃醇沉6h，随后减压抽滤取固形物，50℃烘干，即为香菇粗多糖；
S4、按质量比1:4加入去离子水对香菇粗多糖进行复融，将复融后的溶液置于-40℃冰箱4h后，取出于室温下融化，4000r/min低温离心10min，沉淀用去离子水洗涤后再次离心，重复3次弃去沉淀，合并上清液并将上清液反复冻融重复此步骤直至无沉淀产生，以获得初步脱蛋白的粗多糖溶液；
S5、在所述粗多糖溶液中按照体积比1∶1加入9％的三氯乙酸，涡旋震荡后于4℃过夜，8000r/min离心15min，上清液重复操作此步骤直至无沉淀产生，合并上清液，浓缩后冻干既得香菇多糖成品。
更进一步的，所述绿豆肽的制备方法包括：
S1、将绿豆用水浸泡过夜，去皮，40℃烘干后粉碎，过80目筛，以获得颗粒均匀的脱皮绿豆粉；
S2、向脱皮绿豆粉中加入其13倍重量的去离子水，用2mol/L的NaOH调节pH至9.0，同时调节温度至50℃后进行微波处理，对微波处理完成后的脱皮绿豆粉悬浮液进行减压抽滤，滤液用2mol/mL HCl调节pH至4.0，6000r/min离心15min，沉淀即为绿豆蛋白；所述微波处理条件为：微波功率350W，微波时间20min；
S3、在所述绿豆蛋白中加入其10倍重量的去离子水，调节pH至8.0，随后放入耐高压绝缘袋并置于处理腔进行高压脉冲电场处理，处理完毕后调节温度至55℃，加入4.5％绿豆蛋白重量的蛋白酶进行酶解，酶解后迅速将酶解液置于沸水中加热10min灭酶；随后再次调节酶解液pH至4.0以沉淀未反应的蛋白，3000r/min离心15min，上清液即为绿豆肽粗品溶液；所述高压脉冲电场处理条件为：场强17kV/cm，脉冲数16；所述蛋白酶为复合蛋白酶(复合酶按照中性蛋白酶：风味蛋白酶＝1:1配制而成)，酶解3.0h；
S4、将所述绿豆肽粗品溶液以1mL/min的流速流过大孔吸附树脂，透过液冷冻干燥即为绿豆肽成品；所述大孔吸附树脂需经如下预处理：将一定量的大孔吸附树脂先用无水乙醇浸泡，使树脂充分溶胀，然后用无水乙醇洗至220nm处无吸收峰，最后再用去离子水清洗，去掉乙醇后装柱备用。
实施例7：
本实施例提供了一种如实施例1-3任一项所述抗猪瘟病毒的天然复合生物制剂在制备饲料添加剂中的应用。
实施例8：
本实施例提供了一种如实施例1-3任一项所述抗猪瘟病毒的天然复合生物制剂在制备兽药中的应用。
<大蒜素检测结果>
对比例1：取新鲜大蒜，去皮洗净后用组织捣碎机捣成蒜泥，加去离子水搅拌均匀后得到大蒜浆液；调节大蒜浆液pH值为4-5后置于30-40℃水浴锅中酶解1-2h后冷冻干燥6h，得到处理液；往处理液中加入体积分数为90％的乙醇于30-40℃下萃取1h，离心取上清液过滤，其中处理液的质量与乙醇体积之比为1g：5mL；过滤后的上清液在温度为40℃，压力0.01MPa条件下，用旋转蒸发仪进行减压浓缩，得到提取的大蒜素。
实验组：通过本发明实施例4-6制备获得的大蒜素。
在对照组进行酶解和萃取过程中，以及在实验组进行酶解和超声提取的过程中，分别抽取三次样品检测蒜氨酸含量，以及检测最后获取的大蒜素含量，检测方法均为现有技术，在此不再赘述，检测结果如表1所示。
表1蒜氨酸、大蒜素含量
Figure BDA0003511944800000191
大蒜素是大蒜、洋葱等百合科植物破碎后，蒜氨酸在蒜氨酸酶催化作用下产生的一种具有生物活性的有机硫化物，其具有抗菌消炎、降血脂、降胆固醇、增强血管弹性及降低血压、调节血糖、防癌、增强免疫功能以及解毒保健等功能。本发明中采用充分发酵，多重酶解的方案来增加大蒜素前提物质--蒜氨酸的含量，具体的，如表1所示，本发明中蒜氨酸的含量相对对比例1提高约42％，进一步的，因为蒜氨酸的含量提高，结合超声和无水乙醇提取可极大提高最终大蒜素的含量，如本发明中大蒜素提取率、含量分别相对对比例1提高31.7％、42.4％，且用过抽滤、旋转蒸发等方式提高纯度，使得纯度相对对比例1 提高26.4％。
<大蒜抗菌肽检测结果>
对比例2：取新鲜大蒜，去皮洗净后用组织捣碎机捣成蒜泥，加去离子水搅拌均匀后得到大蒜浆液；加入大蒜浆液重量1.0％-2.0％的复合蛋白酶，在温度45-55℃下调节PH值 6-7，酶解时间为3-5小时；酶解后沸水加热以分解复合蛋白酶，加热时间为10-15min，冷冻干燥得到抗菌肽。
实验组：通过本发明实施例4-6制备获得的大蒜抗菌肽。
检测最后获取的大蒜抗菌肽抑菌效价、含量，检测方法均为现有技术，在此不再赘述，检测结果如表2所示；且同时利用对比例2与本发明的大蒜抗菌肽进行抑菌试验，实验结果如表3所示。
表2大蒜抗菌肽抑菌效价、含量
Figure BDA0003511944800000201
表3抑菌试验(CFU/ml)
Figure BDA0003511944800000202
Figure BDA0003511944800000211
如表2-3所示，本发明中大蒜抗菌肽的抑菌效价以及含量均显著大于对比例2，其分别提高21.2％和35.3％，且相对对比例2而言，其对于多种细菌均具有显著的抑菌效果。说明通过本发明中的方法可高效、高产的获得大蒜抗菌肽，以此可作为常规抗生素的替代品运用于兽药或动物饲料，以增强动物，例如猪只的机体免疫力，以有效抵抗包括非洲猪瘟病毒在内病毒、病菌的侵袭。
<白菜提取物检测结果>
对比例3：取白菜清洗后破碎，获得破碎液，按照破碎液重量的1.5-2.0％加入果胶酶和按照破碎液重量的1.0-1.5％加入纤维素酶，40-42℃保温4-5小时，每30min搅拌一次；用0.2μm滤膜过滤后获得白菜提取物。
实验组：通过本发明实施例4-6制备获得的白菜提取物。
检测最后获取的白菜提取物中吲哚-3-甲醇(I3C)的含量和有机硒含量，检测方法均为现有技术，在此不再赘述，检测结果如表4所示。
表4吲哚-3-甲醇(I3C)的含量和有机硒含量
I3C(μmol/100mL) 有机硒(μg/100mL)
对比例3 1.41±0.52 --
实施例4 3.59±0.74 25.64±2.21
实施例5 3.42±0.12 24.15±1.57
实施例6 3.71±0.57 26.33±2.69
本发明通过多种酶+活性干酵母对白菜充分酶解，并且添加冰醋酸促进芥子油苷水解，并通过加入醋酸钡以沉淀部分蛋白质和悬浮杂质，以形成丰富的I3C，由此可通过I3C实现增强猪只体质，抗癌解毒的功能，同时，本发明在发酵过程中还添加有亚硒酸钠，亚硒酸钠既能促进发酵效率提高，又能促进醋酸发酵时芥子油苷转化效率，同时上述有机硒也不会导致猪只中毒，并且也能提高猪只的抵抗力，预防癌症以及促进排出体内的重金属与毒素。
<香菇多糖检测结果>
对比例4：香菇经干燥后粉碎，过20目筛，取10g香菇粉末并按1:15加纯水，40℃超声提取20min，经纱布或脱脂棉滤过后浓缩至20mL，加入3倍体积无水乙醇静置数小时，置冰箱中过夜沉淀，然后于离心机离心最后干燥，得到香菇多糖。
实验组：通过本发明实施例4-6制备获得的香菇多糖。
采用苯酚硫酸法检测最后获取的香菇多糖含量并计算提取率，检测结果如表5所示。
表5香菇多糖的含量和提取率
含量(％) 提取率(％)
对比例4 19.43±2.07 8.61±0.83
实施例4 40.48±3.65 12.33±1.19
实施例5 39.73±2.51 11.85±1.64
实施例6 40.86±2.93 12.17±1.34
一直以来，香菇多糖作为免疫促进剂被广泛地关注，在机体免疫调节方面有明显的效果。本发明通过超微粉碎+微波+亚临界水提取，使得细胞壁充分破裂，香菇多糖溶出增多，同时采用反复冻融+三氯乙酸对提取物进行脱蛋白纯化，进一步提高香菇多糖的含量，使其充分发挥增强免疫力功效。
<绿豆肽检测结果>
对比例5：绿豆种子洗净去杂，加水浸泡12h，去皮后子叶匀浆，调节pH至9.0，搅拌30min进行减压抽滤，滤液调节pH至4.0，离心取沉淀，沉淀加水复融调节pH至9.0，调节温度至55℃，加入3.0％绿豆蛋白重量的碱性蛋白酶进行酶解，酶解4h后迅速将酶解液置于沸水中加热10min灭酶，冷冻干燥得到绿豆肽。
实验组：通过本发明实施例4-6制备获得的绿豆肽。
采用pH-stat法测定水解度，福林酚法绿豆肽得率，检测结果如表6所示。
表6绿豆肽的水解度和肽得率
水解度(％) 肽得率(％)
对比例5 24.96±0.27 12.10±1.26
实施例4 39.52±1.35 16.54±0.58
实施例5 38.69±1.73 18.20±1.04
实施例6 39.84±0.91 17.38±0.69
有研究表明，绿豆肽具有提高免疫力的功能，在小鼠体内体现在吞噬巨噬细胞的能力、半数溶血值、脾脏生成抗体的细胞数以及淋巴细胞的增殖能力显著提高等方面。本发明通过微波+高压脉冲电场+酶解提取绿豆多肽，并经大孔吸附树脂脱盐，结果如表6所示，本发明水解度、肽得率均有大幅提高，说明通过本发明中的方法可高效、高产的获得绿豆肽，以充分发挥其增强免疫力功效。
<抗体水平检测结果>
选取2月龄幼猪，对其进行点眼法接种稀释后的猪瘟病毒液，感染12h，选择500只进行试验，其中100只作为空白组隔离饲养，喂食普通饲料，100只作为对照组(喂养添加量为50mg/Kg的土霉素和20mg/Kg的黄霉素的普通饲料)，300只作为实验组，且实验组中100只为低剂量组，饲喂含0.6％wt本发明的天然复合生物制剂的普通饲料，100只为中剂量组，喂养饲喂含1.0％wt本发明的天然复合生物制剂的普通饲料，100只为高剂量组，饲喂含1.4％wt本发明的天然复合生物制剂的普通饲料。自由采食、自由饮水，分别喂养 15d、30d后利用ELESA试剂盒，分别对其血清中抗体OD值进行检测，检测结果如表7 所示。
表7抗体OD值水平
Figure BDA0003511944800000241
从表7中可以看出，经过15d、30d的饲喂后，对照组、高剂量组、中剂量组以及低剂量组的抗体水平均显著高于空白组，说明通过添加抗生素以及本发明的天然复合生物制剂均有助于提高猪只体内的抗体水平，且剂量组的抗体水平显著高于对照组，相对于对照组而言，剂量组的OD值水平最多可提高30％，而本发明中的天然复合生物制剂的组分多为纯天然植物提取物制成，其包括大蒜素、富含I3C的白菜提取物、大蒜抗菌肽、蒲公英、金银花、鱼腥草、姜黄、绿豆肽等天然杀菌解毒成分，因此其可以在提高猪只抗体水平，增强体质以及有效杀灭猪瘟病毒的前提下，同时不会像抗生素一样产生耐药性，其使用更加安全。
<临床表现观察>
上述<抗体水平检测结果>中的仔猪在饲养45d后，空腹称重，计算平均日增重，同时在试验期间每天观察各组的临床表现并记录腹泻率、发病率和死亡率三项指标，其具体检测结果参见表8。
表8仔猪生长情况
Figure BDA0003511944800000251
从表8中可以看出，实验组仔猪的平均日采食量、平均日增重均明显高度阳性对照组和空白组，同时腹泻率、发病率以及死亡率均明显低于阳性对照组和空白组，说明本发明的天然复合生物制剂可显著增强仔猪的体质，进一步有助于其对于猪瘟病毒的抵抗力，其原因在于除了具有杀菌解毒作用的组分外，本发明的天然复合生物制剂中的灵芝、黄芪、桂皮、甘草等具有养肝护肾，调理肝肾阴阳气化平衡，祛除动物体内积累毒素，清除自由基，快速修复肝脏，肾脏等功能，以及具有解除药物残留毒素、霉菌毒素及缓解病毒、细菌感染所致毒血症、菌血症、败血症等症状，有助于体质恢复；进一步的，中剂量组和高剂量组差异不明显，说明当饲料中添加0.6％wt的天然复合生物制剂即可收到显著效果，由此也可降低饲养成本。
<抗菌水平>
采用纸片扩散法检测本发明中天然复合生物制剂的抑菌作用。
药敏片的制备：选用新华滤纸1号，用打孔器制成6.00mm的小圆纸片，高压灭菌后分别放入含有不同浓度(质量百分比分别为5％、10％、15％和20％)的本发明中天然复合生物制剂的溶液中浸泡1～2h，真空干燥后形成不同的药敏片，装入灭菌青霉素瓶中，4℃冰箱备用。菌液的制备：取菌株接种至肉汤浸液琼脂平板，37℃孵育过夜。取单个菌落接种于肉汤浸液琼脂平板，37℃过夜培养。比浊法将菌液溶度先调整为0.5麦氏管悬液(1.5 ×108cfu/mL)，然后用培养基稀释到溶度约5×105cfu/mL。取1.5×105cfu/mL菌液100μL 接种到琼脂平板上，用涂布棒均匀涂开。将含有不同药敏片贴于平板上。于37℃培养48h 后，取出观察，测量抑菌圈直径，其结果如表9所示，且抑菌圈直径平均值如表10所示。
表9抑菌圈直径(mm)
Figure BDA0003511944800000261
表10抑菌圈直径平均值(mm)
5％ 10％ 15％ 20％
猪链球菌 6.28 6.39 7.61 6.84
猪巴氏杆菌 10.84 13.68 14.61 12.77
猪丹毒杆菌 9.61 10.87 12.06 11.81
从表9-10中可以看出，本发明中的天然复合生物制剂对几种常见的猪只感染细菌：猪链球菌、猪巴氏杆菌以及猪丹毒杆菌猪均有不同程度的抑菌作用，其中抑菌效果依次为猪巴氏杆菌＞猪丹毒杆菌＞猪链球菌。且当天然复合生物制剂的浓度为15％时，对猪巴氏杆菌菌株和猪丹毒杆菌菌株具相对最好的抑制作用，而这种杀菌作用正是因为本发明中的天然复合生物制剂中含有大蒜抗菌肽、大蒜素等天然抗菌成分所致。
综上所示，本发明中含有丰富的天然植物抗病毒杀菌组分，如大蒜素、白菜提取物中的吲哚-3-甲醇(I3C)、大蒜抗菌肽、蒲公英、金银花、鱼腥草、黄芪、姜黄、绿豆肽等，其可以有效杀灭、抑制猪瘟病毒的繁殖、扩散；同时，大蒜抗菌肽还可以作为抗生素的替代品运用于饲料和兽药制备中，以此减少抗生素的使用，同时搭配黄芪、甘草、桂皮、灵芝、香菇多糖等组分，使其具有养肝护肾，调理肝肾阴阳气化平衡，祛除动物体内积累毒素，清除自由基，快速修复肝脏，肾脏等功能，以及具有解除药物残留毒素、霉菌毒素及缓解病毒、细菌感染所致毒血症、菌血症、败血症等症状，有助于提高机体的抗体水平以及体质恢复能力。
需要说明的是，上述实施例1至6中的技术特征可进行任意组合，且组合而成的技术方案均属于本发明的保护范围。术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种抗猪瘟病毒的天然复合生物制剂，其特征在于，所述抗猪瘟病毒的天然复合生物制剂由以下重量份的原料制成：大蒜素8-10份，白菜提取物5-10份，大蒜抗菌肽0.5-1份，蒲公英5-8份，金银花10-15份，鱼腥草3-5份，黄芪8-10份，姜黄1-2份，桂皮3-5份，灵芝3-5份，绿豆肽10-15份，甘草5-10份，香菇多糖3-5份；
所述大蒜素的制备方法包括：
S1、将大蒜、洋葱去皮、洗净，并粉碎成粒径为80-100目，得原料浆液，且按重量计，大蒜：洋葱＝3：1或4:1或5：1；
S2、在所述原料浆液中刚加入其重量3-5倍的、质量分数为10％的白砂糖溶液，以及接种所述原料浆液重量3-5％的啤酒酵母，置于25±2℃的环境下恒温发酵48h，以得到发酵液；
S3、将发酵液的pH值调节至8.0-8.5，按所述发酵液重量的3-4％加入胰蛋白酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至55-60℃，保温30-35min后得到第一酶解液；
待第一酶解液降至20-22℃后，再调整其pH值至3.5-4.5，按第一酶解液重量的2-3％加入果胶酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至42-45℃，保温25-30min后得到第二酶解液；
待第二酶解液降至20-22℃后，再调整其pH值至4.5-5.0，按第二酶解液重量的1-2％加入纤维素酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至50-55℃，保温20-35min后得到第三酶解液；
S4、在所述第三酶解液中加入其重量5-6倍的无水乙醇进行超声提取，且超声功率为100KW，超声提取温度为20-25℃，超声提取时间为20-30min；
S5、对完成超声提取的第三酶解液进行抽滤，分别得到滤液和滤渣，使用旋转蒸发仪对滤液进行干燥，以得到大蒜素成品；
所述大蒜抗菌肽的制备方法包括：
S1、将大蒜去皮、洗净，于80-100℃环境下干燥8-12h，在粉碎过20目筛，得大蒜粉；
S2、在所述大蒜粉中刚加入其重量3-5倍的、质量分数为10％的白砂糖溶液，以及接种所述原料浆液重量2-3％的啤酒酵母，置于25±2℃的环境下恒温发酵48h，以得到发酵液；
S3、将所述发酵液于5000-8000rpm条件下离心10-15min，收集上清液，上清液用0.1mol/LHCL和0.1mol/LNaOH调节pH值至4-5，以沉淀蛋白；再于5000-8000rpm条件下离心15-20min收集沉淀，将收集的沉淀用蒸馏水洗2-3遍后将pH调节为7，让沉淀的粗蛋白复溶，以得到大蒜抗菌肽粗品溶液；
S4、将所述大蒜抗菌肽粗品溶液加入半透膜中；再置于缓冲液中，于20-25℃下搅拌渗滤至缓冲液pH＝2.5-3.5；然后将含有大蒜抗菌肽粗品溶液的半透膜转移至纯化水中，于20-25℃下搅拌渗滤至半透膜内溶液pH＝3.0-4.0，以得到大蒜抗菌肽一次溶液；
S5、将所述大蒜抗菌肽一次溶液通过进行反相高效液相色谱分离，以获得大蒜抗菌肽二次溶液；所述反相高效液相色谱分离包括：将样品上样至反相C4硅胶柱上，并依次利用含有三氟乙酸的双蒸水和含有三氟乙酸的乙腈对C4硅胶柱进行洗脱处理，获得洗脱样品，其中，含有三氟乙酸的双蒸水中三氟乙酸的质量分数为0.2-0.3％，含有三氟乙酸的乙腈中三氟乙酸的质量分数为0.2-0.3％，乙腈质量分数为80-85％；洗脱处理时间为40-45min；
以及S6、所述大蒜抗菌肽二次溶液通过醋酸铵和醋酸离子交换转盐，以获得大蒜抗菌肽精提液，对大蒜抗菌肽精提液进行减压浓缩、干燥后得到所述大蒜抗菌肽成品；
所述白菜提取物的制备方法包括：
S1、取新鲜白菜，加入白菜重量2-3倍的去离子水，并在25℃下浸泡3-5h，取出再用去离子水冲洗2-3遍；再将冲洗后的白菜打碎磨浆，得到白菜浆液；
S2、在所述白菜浆液中加入其重量2-3％的果胶酶，于30-40℃下处理12-24h，其中每30min搅拌一次，处理完成后保温30-35min后得到第一酶解液；
待第一酶解液降至20-22℃后，再调整其pH值至3.5-4.5，按第一酶解液重量的2-3％加入果胶酶，于30-40℃下处理8-10h，其中每30min搅拌一次，处理完成后保温2-3h，以得到第二酶解液；
S3、在所述第二酶解液中按照第二酶解液重量的3-5％加入活性干酵母以及按照第二酶解液重量的0.001-0.002％加入亚硒酸钠，发酵48-72h，获得初次发酵液；
S4、在所述初次发酵液中按照初次发酵液重量的1-2％加入冰醋酸以及按照初次发酵液重量的0.001-0.0015％加入亚硒酸钠，发酵36-48h，获得二次发酵液；
S5、将所述二次发酵依次经过分离孔径为50-100nm的陶瓷膜、截留分子量为2000-5000Da的超滤膜以及截留分子量为300-500Da的纳滤膜，最后得到白菜粗提物；
S6、按照白菜粗提物体积的1/10加入0.4M醋酸钡,搅拌均匀静置30min以沉降提取液中的部分蛋白质和悬浮杂质，然后4000r/min离心10min后,收集上清液,即得到含有吲哚-3-甲醇的白菜提取物；
所述香菇多糖的制备方法包括：
S1、香菇剪碎，于70℃烘箱中干燥至恒重，用超微粉碎机粉碎，过60目筛网，以获得香菇粉；所述超微粉碎条件为进料量300g，转速4000r/min，超微粉碎时间10min，粉碎两次；
S2、取香菇粉，加入香菇粉质量的20倍去离子水，调节温度至60℃后进行微波处理，随后将香菇水溶液加入亚临界水反应釜进行亚临界水提取，提取完成后，
4000r/min离心20min，上清液经旋转蒸发浓缩至1/3体积，以获得香菇多糖提取液；所述微波处理条件为：微波功率650W，微波6min；所述亚临界水提取条件为：提取压力5MPa，提取温度130℃，提取时间15min；
S3、在所述香菇多糖提取液中加入3倍体积的95％乙醇，200r/min搅拌30min后于4℃醇沉12h，随后减压抽滤取固形物，50℃烘干，即为香菇粗多糖；
S4、按质量比1:2加入去离子水对香菇粗多糖进行复融，将复融后的溶液置于-40℃冰箱4h后，取出于室温下融化，4000r/min低温离心10min，沉淀用去离子水洗涤后再次离心，重复3次弃去沉淀，合并上清液并将上清液反复冻融重复此步骤直至无沉淀产生，以获得初步脱蛋白的粗多糖溶液；
S5、在所述粗多糖溶液中按照体积比1∶1加入5％的三氯乙酸，涡旋震荡后于4℃过夜，8000r/min离心15min，上清液重复操作此步骤直至无沉淀产生，合并上清液，浓缩后冻干既得香菇多糖成品；
所述绿豆肽的制备方法包括：
S1、将绿豆用水浸泡过夜，去皮，40℃烘干后粉碎，过80目筛，以获得颗粒均匀的脱皮绿豆粉；
S2、向脱皮绿豆粉中加入其10倍重量的去离子水，用2mol/L的NaOH调节pH至8.0，同时调节温度至50℃后进行微波处理，对微波处理完成后的脱皮绿豆粉悬浮液进行减压抽滤，滤液用2mol/mLHCl调节pH至4.5，6000r/min离心15min，沉淀即为绿豆蛋白；所述微波处理条件为：微波功率400W，微波时间15min；
S3、在所述绿豆蛋白中加入其7倍重量的去离子水，调节pH至7.0，随后放入耐高压绝缘袋并置于处理腔进行高压脉冲电场处理，处理完毕后调节温度至55℃，加入3.5-4.5％绿豆蛋白重量的蛋白酶进行酶解，酶解后迅速将酶解液置于沸水中加热10min灭酶；随后再次调节酶解液pH至4.5以沉淀未反应的蛋白，3000r/min离心15min，上清液即为绿豆肽粗品溶液；所述高压脉冲电场处理条件为：场强16kV/cm，脉冲数18；所述蛋白酶为复合蛋白酶，酶解3.5h；
S4、将所述绿豆肽粗品溶液以1mL/min的流速流过大孔吸附树脂，透过液冷冻干燥即为绿豆肽成品。
2.一种如权利要求1所述抗猪瘟病毒的天然复合生物制剂的制备方法，其特征在于，包括：
S100、制备大蒜素、白菜提取物、大蒜抗菌肽、绿豆肽以及香菇多糖；
S200、将蒲公英，金银花，鱼腥草，黄芪，姜黄，桂皮，灵芝，甘草磨碎过50目筛，按照权利要求1中的组分用量称取各组分，再将各种原料混合4-6min，得到混合料；
S300、将混合料送入造粒机内造粒，以获得粗成品，且造粒机内的蒸汽压力为0.5-0.8Mpa，造粒温度为70-80℃，造粒机的模孔直径为1.5-3mm；
S400、对所述粗成品进行8目过筛，最终获得所述抗猪瘟病毒的天然复合生物制剂。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述大蒜素的制备方法的步骤S1中，在粉碎前还包括：将去皮、洗净后的洋葱和大蒜浸入前处理液中浸泡12-24h；所述前处理液由质量分数3-5％的柠檬酸溶液和质量分数1-2％的乙酸溶液组成，且按体积比计，质量分数3-5％的柠檬酸溶液：质量分数1-2％的乙酸溶液＝1：1-3：1。
4.如权利要求1所述的抗猪瘟病毒的天然复合生物制剂在制备饲料添加剂中的应用。
5.如权利要求1所述的抗猪瘟病毒的天然复合生物制剂在制备兽药中的应用。
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