CN116262777A

CN116262777A - 一种多肽、制备方法及黄嘌呤氧化酶抑制剂、降尿酸制剂

Info

Publication number: CN116262777A
Application number: CN202211184594.7A
Authority: CN
Inventors: 严小军; 黄芳芳; 杨伟; 姜维; 代清菲; 刘宇; 余中节; 周小敏
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU; Zhejiang Industrial Group Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU; Zhejiang Industrial Group Co Ltd
Priority date: 2022-09-27
Filing date: 2022-09-27
Publication date: 2023-06-16

Abstract

本发明涉及活性多肽技术领域，公开一种具有XOD抑制活性的多肽，选自短肽KR5、FL7、RK8或者其组合物，氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3，具有良好的XOD抑制性，可以作为XOD抑制剂、降尿酸制剂开发。同时本发明提供的多肽可以从金枪鱼红肉中水提得到，实现了金枪鱼暗色肉的高值化开发。

Description

一种多肽、制备方法及黄嘌呤氧化酶抑制剂、降尿酸制剂

技术领域

本发明涉及活性多肽技术领域，具体涉及一种多肽、制备方法及黄嘌呤氧化酶抑制剂、降尿酸制剂。

背景技术

黄嘌呤氧化酶XOD在体内可以催化次黄嘌呤生成黄嘌呤，并氧化成尿酸，黄嘌呤氧化酶活性异常增大时将导致尿酸生成过多，引发高尿酸。高尿酸症状HUA，可导致痛风、肾结石等病症，还和心血管疾病等代谢性疾病存在密切联系，具有诸多危害。黄嘌呤氧化酶抑制剂即以黄嘌呤氧化酶为靶点抑制黄嘌呤氧化酶的活性，减少黄嘌呤向尿酸的转化，降低尿酸生成水平。目前临床常用的黄嘌呤氧化酶抑制剂主要是别嘌呤醇、非布索坦，但均有严重的副作用，如别嘌呤醇可引发致命的别嘌呤醇超敏综合征，非布索坦容易引发心血管事件。因此需要开发更加安全、高效的黄嘌呤氧化酶抑制剂。

从天然植物中获取具有黄嘌呤氧化酶活性抑制作用的多酚类化合物已经成为一个重要的研究方向，比如白杨素、芹菜素等黄酮类化合物，高良姜素等黄酮醇类化合物。但是这些多酚类化合物多存在稳定性弱、溶解性差以及低毒性等问题限制了其应用。因此随着多肽的生物活性、安全性被广泛认可，从动物或植物中开发获取具有黄嘌呤氧化酶抑制效果的多肽也逐渐引起研究人员的重视。如侯梦凡等(卵形鲳鲹黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备及其工艺优化[J]，食品与发酵工业，2021年，47(23):185-192)利用酶解法，从卵形鲳鲹中提取了具有黄嘌呤氧化酶活性抑制作用的多肽，多肽的XOD抑制率在50％～60％。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多肽，具有黄嘌呤氧化酶体外抑制活性，而且抑制率较高。

本发明提供如下的技术方案：

一种多肽，包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的短肽中的一种或多种。

本发明提供的多肽选自三条短肽KR5、FL7、RK8或者其中的两种或三种的组合物。其中KR5的氨基酸序列SEQ ID NO.1为：Lys-Leu-Ala-His-Arg(KLAHR)，FL7的氨基酸序列SEQ ID NO.2为：Phe-Val-Gly-Gly-Leu-Arg-Leu(FVGGLRL)，RK8的氨基酸序列SEQ ID NO.3为：Arg-Met-Pro-Met-Phe-Phe-Leu-Lys(RMPMFFLK)。

经过测试，KR5、FL7、RK8均具有XOD抑制活性，其中1mg/mL低浓度下，RK8的XOD抑制率可以达到69.80％，FL7可以达到68.22％；当浓度增大至30mg/mL时，RK8的抑制率可以达到87.6％，FL7则能够达到100％，XOD抑制效果明显。

一种上述多肽的制备方法，包括以下步骤：

水煮金枪鱼鱼肉，分离上清液，从上清液中截取分子量<3KD的产物，冷冻干燥，然后纯化。与现有报道的具有XOD抑制活性的多肽通过酶解法获得不同，本发明的多肽可以通过金枪鱼鱼肉水提得到。优选为金枪鱼红肉，金枪鱼红肉即金枪鱼加工中的暗色肉，往往因腥味重、肉质粗糙而被丢弃，因此本发明的技术方案对于实现暗色肉高值化开发，提高产品附加值水平具有重要意义。

作为本发明方法的优选，金枪鱼鱼肉和水的质量比为1:3～6。

作为本发明方法的优选，水煮温度为80～100℃，水煮时间为20～30min。

上述多肽在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂上的应用。

一种黄嘌呤氧化酶抑制剂，所述抑制剂含有上述多肽。

作为本发明的优选，所述抑制剂含有氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的短肽，抑制剂为液态形式，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的短肽在抑制剂中的浓度≥20mg/mL。

作为本发明的优选，所述抑制剂含有氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的短肽，抑制剂为液态形式，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的短肽在抑制剂中的浓度≥30mg/mL。当浓度达到30mg/mL时，FL7的XOD抑制效果可以达到100％。

一种降尿酸制剂，所述降尿酸制剂含有上述黄嘌呤氧化酶活性抑制剂。

本发明的有益效果如下：

本发明提供了一种具有XOD抑制活性的多肽，选自短肽KR5、FL7、RK8或者其组合物，氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3，具有XOD抑制活性，可以作为XOD抑制剂、降尿酸制剂开发。同时本发明提供的多肽可以从金枪鱼红肉中水提得到，实现了金枪鱼暗色肉的高值化开发。

附图说明

图1是短肽KR5的质谱图。

图2是短肽FL7的质谱图。

图3是短肽RK8的质谱图。

具体实施方式

下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。

如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。

本发明提供了一种多肽，具有XOD活性抑制作用，该多肽选自短肽KR5、FL7和RK8中的一种或者多种，其中，

KR5的氨基酸序列SEQ ID NO.1为：Lys-Leu-Ala-His-Arg；

FL7的氨基酸序列SEQ ID NO.2：Phe-Val-Gly-Gly-Leu-Arg-Leu；

RK8的氨基酸序列SEQ ID NO.3：Arg-Met-Pro-Met-Phe-Phe-Leu-Lys。

本发明还提供了一种黄嘌呤氧化酶抑制剂，在一些实施方案中，该黄嘌呤氧化酶抑制剂为短肽KR5或者FL7或者短肽RK8或者其中的两种或三种的组合物。

在本发明提供的另外一些黄嘌呤氧化酶抑制剂的实施方案中，该黄嘌呤氧化酶抑制剂为短肽KR5或者FL7或者短肽RK8或者其中的两种或三种的组合物，与其他成分，比如常规的药物载体、赋形剂、成形剂等的复合物。

在本发明提供的一些黄嘌呤氧化酶抑制剂的实施方案中，黄嘌呤氧化酶抑制剂为液态形式，且含有短肽FL7；优选的，短肽FL7的浓度≥20mg/mL，进一步的，短肽FL7的浓度≥30mg/mL，更优选的为30mg/mL。

本发明还提供了一种降尿酸制剂，在一些实施方案中，该降尿酸制剂为短肽KR5或者FL7或者短肽RK8或者其中的两种或三种的组合物。在一些实施方案中，该降尿酸制剂为上述黄嘌呤氧化酶抑制剂，或者上述黄嘌呤氧化酶抑制剂与其他成分，如载体、赋形剂、成形剂等的复合物。

本发明还提供了多肽的制备方法的实施方案，包括水煮金枪鱼鱼肉，如金枪鱼红肉，过滤后分离上清液，截取分子量<3KD的产物，冷冻干燥，然后纯化。

在本发明提供的一些实施方案中，金枪鱼鱼肉和水的质量比为1:3～6。

在本发明提供的一些实施方案中，水煮温度为80～100℃，水煮时间为20～30min。

下面通过具体的实施例对本发明的多肽的获取、多肽的XOD抑制率效果进一步说明。

实施例1多肽的获取

(1)取蓝鳍金枪鱼红肉400g，加入1600mL ddH₂O水煮20min，离心过滤。将离心获得上清液进行超滤，分别截取>10KD,5-10KD,5-3KD和<3KD的分子段产物，并进行冷冻干燥，放置于-20℃备用，其中>10KD，5-10KD，5-3KD和<3KD的分子段产物得率分别为：1.42％、0.24％、0.17％和0.18％，1mg/mL时，各分子段产物的黄嘌呤氧化酶抑制率(％)分别为：28.81±0.03、35.18±0.12、17.55±0.22、20.88±0.02；

(2)将小于<3KD分子样品进行多肽序列分析，鉴定到458条肽段以及对应到金枪鱼蛋白，从中获得4条未比对到已知的物种蛋白的短肽，其中包括KR5、FL7、RK8，如下表1所示。KR5、FL7、RK8的质谱图分别如图1、2、3所示。

表1四种短肽

短肽	氨基酸序列	ALC(％)	质量	local confidence(％)
					KR5	KLAHR	92	623.3867	100 99 94 81 89
FL7	FVGGLRL	92	760.4595	99 96 95 88 85 91 92
					RK8	RMPMFFLK	91	1068.5613	90 85 83 95 98 96 90 90

上述短肽为首次发现，在获取氨基酸序列的情况下，可通过常规合成方法批量获取。

实施例2多肽的XOD抑制率对比

KR5、FL7和RK8的黄嘌呤氧化酶抑制性测试如下：

反应体系体积为200μL，依次向96孔板中加入样品40μL、8U的XOD溶液80μL，在恒温培养箱内40℃孵育30min，之后加入底物黄嘌呤溶液80μL，放入恒温培养箱中孵育15min，然后在292nm处记录吸光度值。实验分别设置有样品组(含样品、酶及底物)、空白组(含底物和样品，不含酶)、阳性对照组(含别嘌醇、酶及底物)、酶组(含酶和底物，不加样品)，各个组均含3个复孔，实验重复三次，各样品终浓度为100μg/mL，XOD抑制率计算公式如下：

抑制率(％)＝[(A1-A0)/(B1-B0)]/×100％；

A1：含阳性药、XOD、XO、缓冲液孔的OD值；

A0：不含XOD的空白对照；

B1：含XOD、XO、缓冲液孔的OD值；

B0：含XO、缓冲液孔的阴性对照。

结果见表2所示。

表2蓝鳍金枪鱼水提物对XOD影响(

n＝3)

从上表中可以看出，不同短肽的XOD抑制活性不同，FR7、RK8在同等浓度下表现出较好的XOD抑制活性，而458条肽段中的一些肽存在无XOD抑制活性的情况。

实施例3FL7的XOD抑制活性测试

FL7不同浓度下的XOD抑制活性见表3所示。

表3FL7不同浓度下的XOD抑制率(`x±s,n＝3)

C mg/mL(mmol/L)	1(1.32)	5(6.58)	10(13.16)	20(26.32)	30(39.47)
						XOD抑制率(％)	68.22±0.12	64.22±0.32	75.13±0.02	78.33±0.20	100±0.29

通过上表可以看出，在测试范围内，随FL7浓度的增大，XOD抑制率逐渐升高，其中20～30mg/mL范围内出现明显的上升，当FL7浓度达到30mg/mL时，XOD抑制率达到100％，计算FL7的半抑制浓度为IC50＝1.69mg/mL。

实施例4RK8的XOD抑制活性

RK 8不同浓度下的XOD抑制活性见表4所示。

表4RK8不同浓度下的XOD抑制率(`x±s,n＝3)

C mg/mL(mmol/L)	1(1.87)	5(6.58)	10(13.16)	20(26.32)	30(56.07)
						XOD抑制率(％)	69.80±0.32	65.73±0.24	69.44±0.25	76.50±0.42	87.62±0.22

通过上表可以看出，在测试范围内，随RK8浓度的增大，XOD抑制率逐渐升高，当RK8浓度达到30mg/mL时，XOD抑制率达到87.62％，计算RK8的半抑制浓度为IC50＝1.82mg/mL。

Claims

1.一种多肽，其特征在于，包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示的短肽中的一种或多种。

2.一种如权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

水煮金枪鱼鱼肉，分离上清液，从上清液中截取分子量<3KD的产物，冷冻干燥，然后纯化。

3.根据权利要求2所述的多肽的制备方法，其特征在于，金枪鱼鱼肉和水的质量比为1:3～6。

4.根据权利要求2或3所述的多肽的制备方法，其特征在于，水煮温度为80～100℃，水煮时间为20～30min。

5.如权利要求1所述的多肽在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂上的应用。

6.一种黄嘌呤氧化酶抑制剂，其特征在于，所述抑制剂含有如权利要求1所述的多肽。

7.根据权利要求6所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂含有氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的短肽，抑制剂为液态形式，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的短肽在抑制剂中的浓度≥20mg/mL。

8.根据权利要求6所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂含有氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的短肽，抑制剂为液态形式，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的短肽在抑制剂中的浓度≥30mg/mL。

9.一种降尿酸制剂，其特征在于，所述降尿酸制剂含有如权利要求6至8任一所述的黄嘌呤氧化酶活性抑制剂。