CN115317595A - 一种聚乙二醇化牛血红蛋白氧载体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种聚乙二醇化牛血红蛋白氧载体及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115317595A
CN115317595A CN202111134918.1A CN202111134918A CN115317595A CN 115317595 A CN115317595 A CN 115317595A CN 202111134918 A CN202111134918 A CN 202111134918A CN 115317595 A CN115317595 A CN 115317595A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bovine hemoglobin
bhb
pegylated
peg
hemoglobin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111134918.1A
Other languages
English (en)
Inventor
赵莲
王权
尤国兴
王瑛
李伟丹
周虹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Original Assignee
Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA filed Critical Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority to CN202111134918.1A priority Critical patent/CN115317595A/zh
Publication of CN115317595A publication Critical patent/CN115317595A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/41—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • A61K38/42—Haemoglobins; Myoglobins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0026—Blood substitute; Oxygen transporting formulations; Plasma extender
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种聚乙二醇化牛血红蛋白氧载体及其制备方法与应用，涉及血液代用品技术领域，所述牛血红蛋白表面修饰有甲氧基聚乙二醇乙烯砜。本发明使用甲氧基聚乙二醇乙烯砜作为修饰剂，有助于提高聚乙二醇和牛血红蛋白连接键之间的稳定性。本发明的聚乙二醇化牛血红蛋白氧载体具有较高的P50(氧饱和度为50％时的氧分压)，能够有效地携氧和释放氧气，作为血液代用品的前景广阔。

Description

一种聚乙二醇化牛血红蛋白氧载体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及血液代用品技术领域，尤其是涉及一种聚乙二醇化牛血红蛋白氧载体及其制备方法与应用。
背景技术
近年来，随着临床用血需求的快速增长，血液供需矛盾日趋突出。传统的输血方式在医疗救护中具有重要作用，同时也存在各种缺点，主要体现在：(1)由于窗口期的存在，输血存在病原体传播的风险，如血液中可能存在HIV、乙肝病毒等病原体；(2)血源短缺，临床血库储备不足，尤其是稀有血型患者可能因缺乏同型血而失去生命；(3)天然红细胞储存时间短，在4℃条件的血库中仅能保存5～6周，而且运输条件苛刻；(4)在输入人体前需进行交叉配血，不利于紧急情况下的抢救。这使得本就短缺的血源无法满足临床治疗及应急救援的需求，导致传统的输血治疗面临着重大的挑战，也限制了天然血液在大失血急救中的应用。
具有携/放氧功能的血液代用品应运而生，已成为国内外研究的热点。血液代用品通过模拟血液成分的结构和功能，以实现对血液的部分替代；能够长期保存，可避免经血传播疾病；同时具有来源充足、储运方便和无需交叉配型等优势，可以作为临床血液的必要补充。血液代用品主要包括氟碳化合物和血红蛋白氧载体(Hemoglobin based oxygencarriers，HBOCs)两大类。由于氟碳化合物难以克服的毒副作用和代谢问题，HBOCs成为血液代用品的主要类型。血红蛋白(Hemoglobin，Hb)是由四个亚基(ααββ)组成的四聚体蛋白，具有载氧和放氧功能。HBOCs以人或动物源性Hb为基础，通过化学改构去除其抗原性和毒性，从而能够安全、有效地替代红细胞发挥携/放氧功能，是一种理想的血液代用品。
游离的血红蛋白易透过血管内皮，结合血管舒张因子，引起血管收缩，产生血管活性，导致血压升高；血红蛋白的四聚体易解聚为二聚体，丧失携/放氧功能；二聚体经肾脏滤过后会积累在肾小管，导致肾小管坏死，不能直接输注使用。具有携/放氧功能的红细胞代用品主要是对无基质血红蛋白进行化学修饰、聚合、交联等化学改造，或包裹在高分子微囊中，使其能够模拟天然红细胞中血红蛋白的携-放氧能力，且能够安全有效地用于人体。
聚乙二醇(PEG)是一种中性、无毒，且具有良好生物相容性的高分子聚合物。PEG的末端羟基能衍化为各种反应官能团，可以对蛋白质的某些氨基酸残基进行共价修饰。自1977年Abuchowski等首次使用PEG修饰牛血清白蛋白以来，PEG已广泛用于蛋白质药物的修饰。PEG修饰血红蛋白后，增加了血红蛋白的分子量，同时在血红蛋白分子周围形成了保护层。因此，PEG修饰可以保持血红蛋白氧结合部位的结构完整性，降低网状内皮系统的吞噬，钝化血红蛋白的免疫原性和抗原性，提高血红蛋白在体内的循环半寿期，减少可能的过敏反应和免疫反应。除可用于急性失血或失血休克外，PEG修饰血红蛋白的潜在适应症还包括外科手术备血、贫血和镰刀型贫血、体外组织灌注、局部缺血、肿瘤治疗的佐剂(Biochimicaet Biophysica Acta 2008,1784:1395–1401)。
PEG修饰的血红蛋白除了可以有效地消除血管活性外，还可以有效地扩容和载氧。这表明PEG修饰血红蛋白可作为一种潜在的血液代用品。相关的PEG修饰的血红蛋白产品，如美国Sangart公司开发了一种PEG化人血红蛋白(商品名为Hemospan，又称MP4)，已经进入III期临床试验。MP4的制备过程为：首先以2-亚氨基硫烷为交联剂，与人血红蛋白表面的氨基反应生成巯基，然后巯基与分子量为5kDa的PEG马来酰亚胺反应得到MP4。然而得到的MP4存在以下的缺点：1)MP4的P50值很低，约为4～6mmHg，说明MP4无法有效地释放氧气；2)马来酰亚胺与巯基反应生成的C-S键不稳定。例如，在偏碱性(pH9.0)条件下，基于马来酰亚胺-巯基反应的PEG化蛋白质易出现PEG解离现象(Electrophoresis 2015,36:371-374)；在生理pH和常温条件下，带巯基的试剂可将基于马来酰亚胺-巯基反应的PEG化蛋白质的PEG解离(Bioconjugate Chemistry 2011,22(10):1946-1953)。
由于人血红蛋白来源于过期的人血液，而目前过期血液不足；此外，牛血红蛋白(bHb)与人血红蛋白的结构相似，且其P50值约为28mmHg，远高于人血红蛋白的P50值(14mmHg)。因此，也有部分血红蛋白氧载体以bHb制备血红蛋白氧载体。例如，美国Enzon公司研发的PEG化牛血红蛋白，使用分子量为5kDa的琥珀酰亚胺酯PEG直接与bHb的氨基反应得到PEG化牛血红蛋白。该产品的主要缺点是胶体渗透压太高，40mg/mL PEG化血红蛋白的胶体渗透压超过200mmHg；渗透压太高会导致细胞和组织脱水，不利于输血。因此，有必要提供一种新的PEG化血红蛋白载体及其制备方法。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种聚乙二醇化牛血红蛋白氧载体及其制备方法与应用，解决现有技术中聚乙二醇修饰的血红蛋白P50值很低，无法有效释放氧气或者胶体渗透压太高等问题。本发明的PEG-bHb具有较高的P50，能够有效地携氧和释放氧气。
本发明提供的技术方案如下：
在一个方面，本发明提供了一种聚乙二醇化牛血红蛋白氧载体，所述牛血红蛋白表面修饰有甲氧基聚乙二醇乙烯砜。具体地，所述牛血红蛋白表面共价连接有甲氧基聚乙二醇乙烯砜。本发明使用甲氧基PEG乙烯砜作为修饰剂，有助于提高PEG和牛血红蛋白连接键之间的稳定性。
在一个实施方案中，在所述甲氧基聚乙二醇乙烯砜修饰所述牛血红蛋白前，所述牛血红蛋白已经被巯基化。在一个具体的方案中，所述牛血红蛋白通过与2-亚氨基硫烷反应被巯基化。
在一个实施方案中，本发明所述聚乙二醇化牛血红蛋白的P50值不小于10mmHg；所述聚乙二醇化牛血红蛋白在蛋白浓度为40mg/mL的胶体溶液状态下，胶体渗透压不小于50mmHg。P50值是血红蛋白50％饱和时的氧分压或50％血氧饱和度时的氧分压。
在一个实施方案中，本发明所述聚乙二醇化牛血红蛋白氧载体的Hill系数是1.9。
在另一个方面，本发明提供了所述聚乙二醇化牛血红蛋白氧载体的制备方法，包括：将牛血红蛋白与甲氧基聚乙二醇乙烯砜混合反应，得到聚乙二醇化牛血红蛋白，优选地，所述牛血红蛋白经过巯基化处理。
在一个实施方案中，本发明以牛血红蛋白为原料，以2-亚氨基硫烷为连接桥，以甲氧基PEG乙烯砜为修饰剂，将PEG修饰在牛血红蛋白表面。
在一个实施方案中，所述巯基化的方法为将2-亚氨基硫烷与所述牛血红蛋白反应，使得所述牛血红蛋白的氨基变成巯基；
优选地，将所述牛血红蛋白溶于PBS缓冲液后，与溶解于PBS缓冲液中的2-亚氨基硫烷混合反应，得到巯基化的牛血红蛋白；
进一步地，所述牛血红蛋白与所述2-亚氨基硫烷混合的按摩尔比为1:(5-40)；优选的摩尔比为1:(15-25)混合；
进一步地，所述反应为4℃下反应过夜；
进一步地，加入甘氨酸终止所述混合反应。
在一个具体的优选实施方案中，所述牛血红蛋白的氨基变成巯基为：将牛血红蛋白溶于PBS缓冲液(pH 7.4)后，与溶解于PBS缓冲液(pH 7.4)的2-亚氨基硫烷按摩尔比1:20混合。4℃下反应过夜，加入过量的甘氨酸终止反应；透析除去未反应的2-亚氨基硫烷和甘氨酸，得到巯基化的牛血红蛋白。
在一个实施方案中，所述巯基化的牛血红蛋白与所述甲氧基聚乙二醇乙烯砜按摩尔比1:(5-40)，优选摩尔比为1:(35-50)的比例混合，得到聚乙二醇化牛血红蛋白粗品；
优选地，所述甲氧基聚乙二醇乙烯砜的分子量为2-40kDa；
进一步地，所述甲氧基聚乙二醇乙烯砜的分子量为3-10kDa；更优选的，所述甲氧基聚乙二醇乙烯砜的分子量为5kDa；
进一步地，所述反应为4℃下反应过夜。
在一个具体的优选实施方案中，所述对巯基化的牛血红蛋白进行PEG化为：将牛血红蛋白溶于PBS缓冲液(pH 7.4)后，与溶解于PBS缓冲液(pH 7.4)的甲氧基PEG乙烯砜按摩尔比1:40混合，4℃下反应过夜，得到PEG化牛血红蛋白氧载体。
在一个实施方案中，所述方法还包括对所述聚乙二醇化牛血红蛋白粗品进行纯化；优选地，选用尺寸排阻层析法对PEG化牛血红蛋白的粗品进行纯化。
在一个具体的实施方案中，所述纯化具体为：将PEG化牛血红蛋白的粗品上样至Superdex 200凝胶过滤柱(1.6cm×60cm)中进行洗脱，以PBS缓冲液(pH 7.4)作平衡液和洗脱液，于280nm下检测并收集PEG化牛血红蛋白对应的洗脱峰，即得到所述PEG化牛血红蛋白氧载体。
在另一个方面，本发明提供了所述聚乙二醇化牛血红蛋白氧载体在制备血液代用品和/或携氧剂中的应用。
在一个实施方案中，所述聚乙二醇化牛血红蛋白氧载体在输血过程中部分或全部替代红细胞发挥携氧或放氧功能。所述输血过程包括创伤、失血、贫血、手术等引起的输血。
有益效果：
(1)本发明提供了一种基于巯基-乙烯砜修饰的PEG化牛血红蛋白氧载体，本发明的聚乙二醇化牛血红蛋白(PEG-bHb)具有较高的P50(氧饱和度为50％时的氧分压)，能够有效地携氧和释放氧气；
(2)本发明使用甲氧基PEG乙烯砜作为修饰剂，有助于提高PEG和牛血红蛋白连接键之间的稳定性；
(3)本发明反应得到PEG化牛血红蛋白氧载体胶体渗透压低，有利于输血，作为血液代用品的前景广阔；
(4)本发明的制备方法简单、高效，便于操作和推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了制备本发明PEG-bHb的化学反应式；
图2示出了用SDS-PAGE电泳分析不同反应条件制备的PEG-bHb，第1泳道：标准蛋白，第2泳道：bHb,第3-11泳道为bHb:2-亚氨基硫烷:PEG的摩尔比分别为1:10:20、1:20:20、1:30:20、1:10:30、1:20:30、1:30:30、1:10:40、1:20:40和1:30:40时的PEG-bHb；
图3所示为用Superdex 200半制备型凝胶过滤柱纯化本发明PEG-bHb时的洗脱峰谱图；
图4所示为分析型Superdex 200凝胶过滤柱分析本发明PEG-bHb的洗脱峰谱图；
图5示出用SDS-PAGE电泳分析本发明PEG-bHb时的电泳图，第1泳道：标准蛋白，第2泳道：bHb，第3泳道：PEG-bHb；
图6示出了本发明PEG-bHb的粒径分布图；
图7示出了本发明PEG-bHb的圆二色光谱图；
图8示出了PEG-bHb的紫外-可见光光谱谱图；
图9示出了本发明PEG-bHb的氧结合与释放曲线图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：PEG-bHb的制备反应的优化
通过优化bHb、2-IT和PEG的摩尔比，可以提高PEG-bHb的产率。由SDS-PAGE检测在不同摩尔比条件下PEG-bHb的变化。如图2所示，当bHb:IT:PEG的摩尔比分别为1:10:20(第3泳道)、1:20:20(第4泳道)和1:30:20(第5泳道)时，PEG-bHb的产率逐渐增加。这表明在PEG：bHb的摩尔比不变的情况下，增加IT：bHb的摩尔比有助于提高PEG-bHb的产率。当bHb:IT:PEG的摩尔比分别为1:10:30(第6泳道)、1:20:30(第7泳道)和1:30:30(第8泳道)时，PEG-bHb的产率逐渐增加。这表明PEG：bHb摩尔比的增加有助于提高PEG-bHb的产率。当bHb:IT:PEG的摩尔比分别为1:10:40(第9泳道)、1:20:40(第10泳道)和1:30:40(第11泳道)时，PEG-bHb的产率逐渐增加。然而，1:20:40和1:30:40这两种摩尔比的PEG-bHb产率无显著变化。因此，本发明采用1:20:40的摩尔比用于制备PEG-bHb。
本发明通过化学修饰的方法，将分子量为5kDa的聚乙二醇(PEG)与牛血红蛋白(bHb)通过共价键连接起来，制备出一种基于牛血红蛋白的氧载体，即PEG化牛血红蛋白氧载体(PEG-bHb)，可用作红细胞代用品和携氧剂。
制备该PEG-bHb的方法，具体包括以下步骤：
(1)bHb的巯基化：将2mL bHb(60mg/mL)溶液用1L PBS缓冲液(pH 7.4)透析，每隔4小时用相同体积的缓冲液换一次液，共计换液两次。随后用PBS缓冲液(pH7.4)将bHb稀释，使其的浓度调整到64mg/mL。将溶解于PBS缓冲液(pH 7.4)的2-亚氨基硫烷与bHb按照摩尔比20：1的比例混合后，于4℃下反应8小时。如图1所示，2-亚氨基硫烷可与bHb的氨基基团反应生成巯基。
(2)PEG化bHb的制备：将步骤(1)得到的巯基化的bHb与分子量为5kDa的甲氧基PEG乙烯砜，按照摩尔比1:40的比例混合，于4℃下反应过夜。如图1所示，bHb的巯基基团与PEG的乙烯砜基团反应，得到PEG化bHb。
(3)PEG-bHb的分离纯化：选用分子排阻层析法对步骤(2)得到的PEG化bHb进行纯化，优选Superdex 200凝胶过滤柱(1.6cm×60cm)，用于平衡和洗脱层析柱的缓冲液为20mMPBS缓冲液(pH 7.4)。将步骤(2)的反应液上样至层析柱上，用2mL/min的流速进行洗脱，于280nm下检测洗脱峰。如图3所示，收集箭头所示洗脱峰对应的洗脱液，除去未反应的PEG，即为PEG-bHb，保存于-80℃冰箱备用。
实施例2：凝胶过滤法鉴定PEG-bHb
PEG-bHb和bHb由分析型Superdex 200半制备型凝胶过滤柱(1cm×30cm)进行分析。
如图4所示，PEG-bHb和bHb经洗脱后，均呈现出单一且对称的洗脱峰，而且洗脱峰的位置分别为12.7mL和17.9mL。这表明两种样品均具有较高的纯度。与bHb相比，PEG-bHb的出峰时间明显向左漂移。这表明PEG修饰显著增加了bHb的水化体积。
实施例3：SDS-PAGE电泳分析
向PEG-bHb溶液加入等体积的电泳缓冲液，在煮沸的水浴中放置5分钟，使用15％电泳胶(考马斯亮蓝染色)，由SDS-PAGE电泳分析PEG-bHb的纯度。
如图5所示，bHb(第2泳道)展示出1条单一的电泳条带，对应的分子量约为16kDa。这是由于bHb(64.0kDa)由四个亚基组成，在煮沸的水浴中四个亚基完全解聚为分子量为16.0kDa的单个亚基。与bHb相比，PEG-bHb(第3泳道)新增了4条电泳条带，而原有的电泳条带变浅。这表明bHb的4个亚基几乎全被PEG修饰，而且每个亚基结合了1～4个PEG分子，仅出现了少量未修饰的亚基条带。可见，血红蛋白与PEG发生了共价结合，得到了PEG化bHb。
实施例4：PEG-bHb的分子直径
PEG-bHb的分子直径由动态光散射进行测定。如图6所示，PEG-bHb和bHb的分子直径分别为10.9nm和5.4nm，而且两者的粒径大小呈现对称的单峰分布。其中，PEG-bHb的分子直径要大于bHb。这表明PEG修饰显著增加了bHb的分子直径。
实施例5：PEG-bHb的结构分析
用圆二色光谱仪分别检测PEG-bHb和bHb在近紫外区域(260-480nm)的圆二色光谱，用于表征PEG-bHb的二级结构和血红素区域结构。每次检测以缓冲液为背景，测三次取平均值；并在25℃下测定样品的CD值(mdeg)。
如图7所示，PEG-bHb在L带附近区域(260nm附近)的光谱略高于bHb。L带附近区域对血红素与其周边珠蛋白的相互作用很敏感，且受配基(如氧或一氧化碳)相互作用的影响。因此，PEG修饰对血红素与其周边珠蛋白的相互作用有轻微的影响。PEG-bHb在Soret峰(420nm附近)附近的最大吸光值略高于bHb。bHb的最大吸光值对应的波长为420nm，PEG-bHb的最大吸光值对应的波长为418nm。PEG-bHb在其它区域的吸光值也略高于bHb。这表明PEG修饰对bHb的血红素微环境结构产生了轻微的干扰。
实施例6：PEG-bHb的胶体渗透压
用Wescor 4420胶体渗透压仪(美国Wescor公司)对PEG-bHb和bHb溶液的胶体渗透压进行测定，测定温度为室温。PEG-bHb和bHb溶液，由PBS缓冲液(pH7.4)进行充分地透析，透析后将两种溶液中的蛋白浓度稀释为40mg/mL。经测定，PEG-bHb溶液在蛋白浓度为40mg/mL时，其胶体渗透压为49.6mmHg，远低于相同蛋白浓度下美国Enzon公司的PEG化牛血红蛋白的胶体渗透压(>200mmHg)，但高于相同浓度下bHb的胶体渗透压(16.0mmHg)。
实施例7：PEG-bHb的紫外-可见光光谱分析
如图8所示，PEG-bHb和bHb分别在415nm、540nm和575nm出现最大吸收峰，而且两者的光谱吸收曲线形状并无显著变化。这表明PEG-bHb和bHb均处于氧合状态下。在415nm处PEG-bHb和bHb的吸光值几乎重叠，而且两者在540nm和575nm的峰形非常相似。
实施例8：PEG-bHb的携放氧功能
由美国TCS科学公司Hemox血氧分析仪测定PEG-bHb的携放氧功能。分别加入6mgPEG-bHb和6mg bHb至4mL HEMOX缓冲液中，再加入20μL牛血清白蛋白和10μL消泡剂，于37℃水浴5分钟，将样品放入血氧分析仪的样品池中，待温度回升至37℃，开始测定。
如图9所示，在生理的氧分压条件下(90-100mmHg)，PEG-bHb和bHb的载氧曲线均处于饱和状态，这表明PEG-bHb能有效地携氧。与bHb相比，PEG-bHb的载氧曲线向左移动，说明PEG-bHb的氧释放能力受到了不利影响。P50(即达到50％氧饱和值时的氧分压)是衡量氧载体放氧能力的一个重要指标。P50越小，表明bHb的氧亲和性越高，氧释放能力越低。其中，bHb的P50值为25.6mmHg，而PEG-bHb的P50值为10.7mmHg，表明PEG的修饰在一定程度上扰乱了bHb从紧张态至松弛态的结构转换，降低了PEG-bHb的P50值。bHb的Hill系数是2.8，PEG-bHb的Hill系数是1.9，美国Sangart公司的PEG化人血红蛋白的Hill系数仅为1.5左右，表明PEG的修饰只对bHb的四个亚基之间的协同性产生了轻微的影响。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种聚乙二醇化牛血红蛋白氧载体，其特征在于，所述牛血红蛋白表面修饰有甲氧基聚乙二醇乙烯砜。
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇化牛血红蛋白氧载体，其特征在于，在所述甲氧基聚乙二醇乙烯砜修饰所述牛血红蛋白前，所述牛血红蛋白已经被巯基化。
3.根据权利要求1或2所述的聚乙二醇化牛血红蛋白氧载体，其特征在于，所述聚乙二醇化牛血红蛋白的P50值不小于10mmHg；所述聚乙二醇化牛血红蛋白在蛋白浓度为40mg/mL的胶体溶液状态下，胶体渗透压不小于50mmHg。
4.权利要求1～3中任一项所述的聚乙二醇化牛血红蛋白氧载体的制备方法，其特征在于，包括：将牛血红蛋白与甲氧基聚乙二醇乙烯砜混合反应，得到聚乙二醇化牛血红蛋白；优选地，所述牛血红蛋白经过巯基化处理。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述巯基化的方法为将2-亚氨基硫烷与所述牛血红蛋白反应，使得所述牛血红蛋白的氨基变成巯基；
优选地，将所述牛血红蛋白溶于PBS缓冲液后，与溶解于PBS缓冲液中的2-亚氨基硫烷混合反应，得到巯基化的牛血红蛋白；
进一步地，所述牛血红蛋白与所述2-亚氨基硫烷混合的摩尔比为1:(5-40)；优选的摩尔比为1:(15-25)；
进一步地，加入甘氨酸终止所述混合反应。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述巯基化的牛血红蛋白与所述甲氧基聚乙二醇乙烯砜按摩尔比1:(5-40)，优选摩尔比为1:(35-50)的比例混合，得到聚乙二醇化牛血红蛋白粗品；
优选地，所述甲氧基聚乙二醇乙烯砜的分子量为2-40kDa；
进一步地，所述甲氧基聚乙二醇乙烯砜的分子量为3-10kDa；更优选的，所述甲氧基聚乙二醇乙烯砜的分子量为5kDa。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括对所述聚乙二醇化牛血红蛋白粗品进行纯化。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述纯化的方法为尺寸排阻层析法。
9.权利要求1～3中任一项所述的聚乙二醇化牛血红蛋白氧载体在制备血液代用品和/或携氧剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述聚乙二醇化牛血红蛋白氧载体在输血过程中部分或全部替代红细胞发挥携氧或放氧功能。
CN202111134918.1A 2021-09-27 2021-09-27 一种聚乙二醇化牛血红蛋白氧载体及其制备方法与应用 Pending CN115317595A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111134918.1A CN115317595A (zh) 2021-09-27 2021-09-27 一种聚乙二醇化牛血红蛋白氧载体及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111134918.1A CN115317595A (zh) 2021-09-27 2021-09-27 一种聚乙二醇化牛血红蛋白氧载体及其制备方法与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115317595A true CN115317595A (zh) 2022-11-11

Family

ID=83912211

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111134918.1A Pending CN115317595A (zh) 2021-09-27 2021-09-27 一种聚乙二醇化牛血红蛋白氧载体及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115317595A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116042763A (zh) * 2023-03-07 2023-05-02 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种放大血管活性的方法、产品及其应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116042763A (zh) * 2023-03-07 2023-05-02 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种放大血管活性的方法、产品及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2907300B2 (ja) 効果的で、安定した、非免疫原性の赤血球代替物としての化学的修飾ヘモグロビン
US7005414B2 (en) Synthetic oxygen transport made from cross-linked modified human or porcine haemoglobin with improved properties, method for a preparation thereof from purified material and use thereof
CA2233725A1 (en) Hemoglobin-hydroxyethyl starch complexes
Iwasaki et al. Preparation and evaluation of hemoglobin‐polyethylene glycol conjugate (pyridoxalated polyethylene glycol hemoglobin) as an oxygen‐carrying resuscitation fluid
KR20040081451A (ko) 산소 친화도가 높은 헤모글로빈 변형류를 포함하는 산소전달용 조성물 및 방법
CA2258947A1 (en) Haemoglobin-hydroxyethyl starch conjugates as oxygen carriers
KR102238718B1 (ko) 폴리알킬렌 산화물 발레르산염 헤모글로빈 접합체
AU2013240141B2 (en) Diaspirin crosslinked PEGgylated hemoglobin
CN115317595A (zh) 一种聚乙二醇化牛血红蛋白氧载体及其制备方法与应用
Wang et al. Structural, functional and physiochemical properties of dextran-bovine hemoglobin conjugate as a hemoglobin-based oxygen carrier
Portörő et al. Towards a novel haemoglobin-based oxygen carrier: Euro-PEG-Hb, physico-chemical properties, vasoactivity and renal filtration
Hu et al. Propylbenzmethylation at Val-1 (α) markedly increases the tetramer stability of the PEGylated hemoglobin: a comparison with propylation at Val-1 (α)
KR20070069154A (ko) 산소 운반 조성물을 사용하여 혈역학적 안정성을향상시키는 방법
CN102859364A (zh) 通过减少反应物比例制备聚乙二醇-血红蛋白缀合物的方法
US5998361A (en) Polymerized hemoglobin
CN111499732B (zh) 一种基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体及其制备方法和应用
AU2018390489B2 (en) Modified globin proteins
US20100075379A1 (en) Method for making polyalkylene oxide modified hemoglobin
Manning [14] Preparation of hemoglobin carbamylated at specific NH2-terminal residues
US5334705A (en) Benzenetricarboxylate derivative-crosslinked low oxygen affinity hemoglobin
Hui et al. Solid-Phase Polymerization Using Anion-Exchange Resin Can Almost Completely Crosslink Hemoglobin to Prepare Hemoglobin-Based Oxygen Carriers
CA2778010C (en) A novel blood substitute with complete red blood cell functions
Razynska et al. Zero-link polymerization: a new class of polymeric hemoglobins
Webster Development of" inside-out" PEGylated crosslinked hemoglobin polymers: Novel hemoglobin-based oxygen carriers (HBOC)
JP2004509168A (ja) 血液代用品としてのデキストラン−ヘモグロビン複合体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination