CN102859364A - 通过减少反应物比例制备聚乙二醇-血红蛋白缀合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明主要涉及通过减少反应物比例制备聚乙二醇(“PEG”)缀合血红蛋白(“Hb”)的方法。更具体地说，本发明涉及制备增加产率和纯度的PEG缀合Hb(“PEG-Hb”)的方法。

Description

通过减少反应物比例制备聚乙二醇-血红蛋白缀合物的方法
技术领域
本发明主要涉及通过减少反应物比例制备聚乙二醇(“PEG”)缀合的血红蛋白(“Hb”)的方法。更具体地说，本发明涉及制备提高产率和纯度的聚乙二醇缀合的血红蛋白(“PEG-Hb”)的方法。
背景技术
能够用作氧治疗的氧载体(有时称作“携氧血浆扩容剂(expander)”)可以分为以下三类：i)基于全氟化碳的乳剂，ii)脂质体包封血红蛋白，iii)修饰的血红蛋白。如下所述，尽管认为包含修饰的无细胞血红蛋白的产品是最有希望的，但均未完全成功。基于全氟化合物的乳剂溶解氧气，而不与其结合为配基。为了用于生物系统，全氟化合物必须被脂质、一般为蛋黄磷脂乳化。尽管全氟化碳乳剂制备成本低廉，但它们不能在临床耐受剂量下携带足够有效的氧气。相反，已经表明脂质体包封血红蛋白是有效的，但其极为昂贵而无法广泛应用。(一般参见Winslow，R.M.，“Hemoglobin-based Red CellSubstitutes，”Johns Hopkins University Press，Baltimore(1992))。
最初的使用来自红血球溶血产物的游离血红蛋白作为红细胞替代物的尝试是不成功的。发现间质成分是有毒的，会引起凝血病和相关的肾衰竭。1967年，制备出了无基质血红蛋白(stroma-free Hb，“SFH”)溶液(Rabiner，S.F.等，1967，J.Exp.Med.126：1127-1142)。然而，发现它们的输液(输血，transfusion)半衰期仅有大约100分钟。
造成SFH短暂的循环半衰期的原因归咎于蛋白质从其四聚体解离成二聚体的能力，二聚体通过肾脏的循环被快速的过滤了。因此，已经设计出多种交联血红蛋白的方法和其它通过缀合大分子来增加血红蛋白流体尺寸的方法来限制或阻止Hb的外渗。交联SFH以形成聚-血红蛋白在美国专利4,001,200和4,001,401中被公开。可获得连接亚单元之间的氨基酸残基的内部交联的血红蛋白，其具有琥珀酰水杨酸(双-3，5-二溴水杨酸二酯)(参见美国专利4,529,719)或2-N-2-甲酰-吡哆醛-5’-磷酸酯和硼氢化物(Benesch，R.E.等，1975，Biochem.Biophys.Res.Commun.62：1123-1129)。分子内交联，其使得四聚体血红蛋白单元的亚基化学结合在一起以阻止二聚体的形成，参见美国专利5,296,465。另外，Simon，S.R.和Konigsberg，W.H.揭示了采用二-(N-甲基马来酸)醚(“BME”)产生分子内交联血红蛋白(1966，PNAS 56：749-56)，并报道了当其输入鼠或狗体内时半衰期提高到四倍(Bunn，H.F.等，1969，J.Exp.Med.129：909-24)。然而，通过BME交联血红蛋白会引起血红蛋白的氧亲和力的伴随提高，在当时它被认为会阻碍其用作潜在的基于血红蛋白的氧载体(“HBOC”)。
SFH也与其它大分子交联，如右旋糖苷(Chang，J.E.等，1977，Can.J.Biochem.55：398-403)，羟乙基淀粉(DE 2,161,086)，明胶(DE 2,449,885)，白蛋白(DE 2,449,885)和PEG(DE 3,026,398，美国专利4,670,417，4,412,989和4,301,144)。
这些携氧的溶液的某些生理效应尚未完全了解。其中，可能最有争议的是导致血管收缩的倾向，其可能表现为动物和人体中的高血压(Amberson，W.，1947，Science 106：117-117)(Keipert，P.等，1993，Transfusion33：701-708)。双二溴水杨基-延胡酸在α链间交联的人体血红蛋白(“ααHb”)被美军开发出来作为模型红细胞替代物，但在其显示出剧烈增加肺及全身血管阻力之后被放弃了(Hess，J.等，1991，Blood 78：356A)。该产品的商品化形式也在令人失望的III期临床试验后被放弃了(Winslow，R.M.，2000，Vox Sang79：1-20)。
无细胞血红蛋白引起血管收缩的最常见的解释是，它易于结合内皮细胞来源的松弛因子(EDRF)一氧化氮(“NO”)。两种分子途径已经被发展尝试用于克服血红蛋白与NO之间的结合活性。第一种途径利用重组DNA，其通过诱使未梢血红素结合区(pocke t)的特定位点突变来降低NO与血红蛋白的结合(Eich，R.F.等，1996，Biochem.35：6976-83)。第二种途径采用化学修饰，其通过寡聚反应增大血红蛋白的尺寸，试图减少或可能完全抑制血红蛋白从血管空间向间质空间的渗出(Hess，J.R.等，1978，J.Appl.Physiol.74：1769-78；Muldoon，S.M.等，1996，J.Lab.Clin.Med.128：579-83；Macdonal，V.W.等，1994，Biotechnology 22：565-75；Furchgott，R.，1984，Ann.Rev.Pharmacol.24：175-97；和Kilbourne，R.等，1994，Biochem.Biophys.Res.Commun.199：155-62)。
实际上，已经制备了NO亲和力降低的重组血红蛋白，其在最高载量的大鼠实验中较少引起高血压(Doherty，D.H.等，1998，Nature Biotechnology16：672-676和Lemon，D.D.等，1996，Biotech 24：378)。但是，研究提示NO结合可能并非血红蛋白血管活性的唯一解释。已经发现，某些大的血红蛋白分子，例如由PEG修饰的血红蛋白分子，实际上没有高血压效应，即使其NO结合速率与严重高血压的ααHb相同(Rohlfs，R.J.等，1998，J Biol.Chem.273：12128-12134)。此外，发现在出血之前作为交换输液给予PEG-血红蛋白时，在防止出血后果方面格外有效(Winslow，R.M.等，1998，J.Appl.Physiol.85：993-1003)。
PEG与血红蛋白的缀合减少了其抗原性并且延长了它的循环半衰期。然而，已有报道称PEG的缀合反应会引起血红蛋白四聚体解离成αβ-二聚体亚单元，在交换输血的鼠类身上接受了低于40,000道尔顿(“Da”)的PEG缀合血红蛋白单体单元会导致显著的血红蛋白尿(Iwashita和Ajisaka Organ-DirectedToxicity：Chem.Indicies Mech.，Proc.Symp.，Brown等1981，Eds.Pergamon，Oxford，England 97-101页)。由Enzon，Inc.(美国专利5,650,388)制备了聚环氧烷(“PAO”)缀合的血红蛋白具有大于84,000Da的分子量，其可以携带10个PEG-5000链通过其α和ε-氨基连接血红蛋白的副本。该取代的程度被描述为可以避免临床上与哺乳动物血红蛋白尿有关的显著肾毒性。然而，缀合反应引起多样化的缀合群并且包含了其它不期望的反应物，它们必须通过柱状色谱去除。
PEG缀合通常通过活化的PEG与生物分子表面的官能团反应来进行。最普遍的官能团是赖氨酸和组氨酸残基的氨基基团，和蛋白质的N末端；半胱氨酸残基的巯基；和丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸残基的羟基；以及蛋白质的C末端。PEG的活化通常是将羟基末端转化成能够与这些官能团在温和的水环境中进行反应的反应性基团。最普遍的用于医学生物药物的缀合的单官能团PEG中的一个是甲氧基-PEG(“mPEG”)，它只有一个官能团(即羟基)，因而将与双官能团PEG有关的交联和聚合问题最小化。然而，由于其生产过程，mPEG经常被高分子量的双官能团PEG(即“PEG二醇”)污染，其范围可以达到10至15％(DustJ.M.等，1990，Macromolecule 23：3742-3746)。该双官能团PEG二醇的大小约为期望的单官能团PEG的两倍。随着PEG分子量的增加，污染问题进一步加重。mPEG的纯度在PEG化的生物治疗剂的生产中是特别关键的，因为FDA要求生产过程的高度重现性和最终药品产物的高质量。
在氧合和脱氧的状态下，均可使血红蛋白与PAOs缀合。美国专利6,844,317中描述了在氧合或“R”状态时缀合Hb，以增强生成的PEG-血红蛋白缀合物的氧亲和力。这是通过在缀合之前将血红蛋白与大气平衡来完成的。其它文献描述了关于在缀合前的脱氧步骤以减少氧亲和力和提高结构的稳定性使得血红蛋白能经受得住化学修饰中的物理应力，透析过滤和/或无菌过滤和灭菌过程(美国专利5,234,903)。对于Hb的分子内交联，建议在修饰过程之前对血红蛋白进行脱氧可能需要使α-链的赖氨酸99暴露于交联试剂中(美国专利5,234,903)。
Acharya等(美国专利7,501,499)研究了在Hb与PEG缀合之前通过亚氨基四氢噻吩(iminothiolane)对血红蛋白进行硫醇化的反应动力学。观察到将亚氨基四氢噻吩的浓度从10倍(其引入了平均5个外来硫醇/四聚体)增加，增加到30倍几乎使相对血红蛋白的表在硫醇数量加倍。然而，甚至在双倍的硫醇数目时PEG缀合后观察到的尺寸增加也是微小的。这表明缀合反应在20倍摩尔过量的马来酰亚胺基(maleimidyl)PEG-5000存在时，活性较小的硫醇覆盖了血红蛋白的表面引起了空间干扰，阻挡了活性较大的硫醇对Hb的进一步修饰。因此，为了获得期望分子量的修饰血红蛋白(即6±1PEG/Hb分子)，Acharya等采用8-15倍摩尔过量的亚氨基四氢噻吩进行血红蛋白硫醇化，然后用16-30倍摩尔过量的马来酰亚胺基PEG-5000与硫醇化Hb反应。然而，这些高摩尔倍数过量的反应物浓度在大规模生产时显著增加了制备HBOC的成本。而且，这样高的摩尔倍数过量的马来酰亚胺基PEG-5000导致了大量不需要的反应物的产生，得到了多种不同的产物。
因此，需要一种低廉的、高效率的、更少杂质和更窄分子量范围的制备特定大小范围PEG缀合血红蛋白的方法。
发明内容
本发明主要涉及一种制备聚乙二醇缀合血红蛋白(PEG-Hb)的方法，包括如下步骤：将血红蛋白(Hb)与2-亚氨基四氢噻吩(2-iminothiolane)(2-IT)在水稀释液中混合，其中在稀释液中2-IT的浓度相对于血红蛋白浓度为7-8倍摩尔过量，以形成硫醇化Hb；然后在水性稀释液中，向硫醇化Hb加入聚乙二醇(PEG)-马来酰亚胺(Mal)，其中在稀释液中PEG-Mal的浓度相对于血红蛋白浓度为9-15倍摩尔过量以形成PEG-血红蛋白(PEG-Hb)缀合物，其中PEG-Mal具有4000-6000道尔顿(Da)的平均分子量；其中得到的PEG-Hb缀合物含有平均7.1-8.9PEG分子/Hb。
在一个实施方案中，在稀释液中2-IT的浓度相对血红蛋白浓度为7.5倍摩尔过量，PEG-Mal的浓度相对血红蛋白浓度为12倍摩尔过量，和/或PEG-Mal具有5000道尔顿的平均分子量。
根据本发明的示例性方法制备的PEG-Hb缀合物在血红蛋白50％饱和时的氧分压(p50)比在基本相同条件下测得的从同等来源得到的天然无基质血红蛋白的氧分压要低。在一个实施方案中，PEG-Hb缀合物的p50低于10毫米汞柱(mmHg)，例如在4-8mmHg之间。
本发明的其它方面如说明书全文所述。
附图说明
图1：βCys93残基和硫醇化的血红蛋白赖氨酸被PEG化。R1，R2和R3表示血红蛋白的主链；R4是烷基，“n”表示5000Da的PEG的氧乙烯单元的平均数目。
发明的详细说明
本发明主要涉及通过使用降低的反应物比例制备聚乙二醇(“PEG”)缀合的血红蛋白(“Hb”)的方法。更特别的，本发明涉及制备提高产率和纯度的聚乙二醇缀合的血红蛋白(“PEG-Hb”)的方法。
在下文的描述中，广泛使用了许多分子生物学，免疫学和医学领域的术语。为帮助清楚和一致的理解说明书和权利要求书，包括这些术语的范围，下文提供了非限定性的定义。
在公开内容中出现了术语“一个(one)”，“一(a)”，或“一(an)”时，除非另外说明，它们表示“至少一个”或“一个或更多”。
术语“活化的聚环氧烷”或“活化的PAO”在这里是指具有至少一个官能团的PAO分子。官能团是活性基团，它与分子上的自由氨基、巯基或羧基反应使得分子与PAO缀合。举例来说，与自由巯基反应的这样一种官能团是马来酰亚胺基团。相应的，与自由氨基反应的官能团是琥珀酰亚胺基团。
术语“大约”在这里是指实际值在所指数值的一个范围之内。一般而言，实际值在所指数值的10％上下(即加或者减)范围。
术语“血红蛋白”或“Hb”在这里一般是指红细胞内包含的输送氧的蛋白质。每个血红蛋白分子具有4个亚基，两条α链亚基和两条β链亚基，组成四聚体结构。每个亚基还包含一个血红素基团，它是结合氧的含铁中心。因而每个血红蛋白分子可结合4个氧分子。
术语“MalPEG-Hb”在这里是指已经缀合了马来酰亚胺基活化的PEG的血红蛋白。该缀合的实施是通过将MalPEG与血红蛋白的表面巯基(在较小粒度上与氨基)反应以形成MalPEG-Hb。巯基存在于Hb的氨基酸序列的半胱氨酸残基中，也可以通过修饰表面氨基引入巯基。
术语“高铁血红蛋白”或“metHb”在这里是指包含三价态铁的氧化形式的血红蛋白。MetHb不能起氧载体作用。术语“高铁血红蛋白％”在这里是指在全部血红蛋白中氧化的血红蛋白的百分比。
术语“甲氧基-PEG”或“mPEG”在这里是指PEG羟基末端的氢被甲基(-CH3)所取代的PEG。
术语“混合物”或“混合”在这里指两种或更多的物质混合在一起，而不发生会导致它们丧失各自性质的反应。术语“溶液”是指液体混合物，术语“水溶液”是指包括一些水的溶液，可能还包括一种或更多种其它液体物质，与水形成多组分溶液。
术语“修饰血红蛋白”或“修饰Hb”在这里指，但不限于通过化学反应改造的血红蛋白，例如分子内或分子间交联、重组技术，从而这种Hb不再是它的“天然”状态。此处所用术语“血红蛋白”或“Hb”本身是指天然未修饰的血红蛋白以及修饰的血红蛋白。
术语“氧亲和力”在这里是指氧载体(例如血红蛋白)结合分子氧的亲和力。该特征由关于血红蛋白分子氧饱和度(Y轴)与氧分压(X轴)的氧平衡曲线定义。该曲线的位置由氧载体被氧半饱和时的氧分压p50值表示，它与氧亲和力逆相关。因此，p50越低，氧亲和力越高。可以利用本领域已知的多种方法测定全血(以及全血的组分诸如红细胞和血红蛋白)的氧亲和力。(参见例如Winslow，R.M.等，J.Biol.Chem.1977，252：2331-37)。也可使用市售的HEMOXTM分析仪(TCS Scientific Corporation，New Hope，PA)测定氧亲和力。(参见例如Vandegriff和Shrager的“Methods in Enzymology”(Everse等编著)232：460(1994))。
术语“全氟化碳”在这里是指包含氟原子的合成的惰性分子，以及完全由卤素(Br，F，Cl)和碳原子组成的惰性分子。其乳剂形式比等量的血浆或水能够多溶解很多倍的氧气，因而正开发为血液物质。
术语“聚乙二醇”或“PEG”在这里是指具有化学通式H(OCH2CH2)nOH(也称为α-氢-ω-羟基-聚(氧-1，2-亚乙基))的液体、固体或聚合物，其中“n”大于或等于4。该术语包括任何PEG试剂、取代或未取代的形式。市售PEG有多种形式(例如，CarbowaxTM(Dow Chemical，Midland，MI)，Poly-(ArchChemicals，Norwalk，CT)，和Solbase)。
术语“聚乙二醇缀合血红蛋白”或“PEG-Hb缀合物”在这里是指血红蛋白上面共价结合有PEG。
术语“无基质血红蛋白”或“SFH”在这里是指已经从中去除所有红细胞膜的血红蛋白。
术语“表面修饰血红蛋白”在这里指已经连接化学基团(通常为聚合物)的血红蛋白，诸如葡聚糖或聚环氧烷的血红蛋白。术语“表面修饰氧合血红蛋白”是指表面修饰时处于“R”状态的血红蛋白。
有机聚合物
在之前的研究中，发现了表面修饰血红蛋白的分子应足够大以避免被肾脏清除并达到理想的循环半衰期。Blumenstein，J.等人确定，分子量为84,000道尔顿(“Da”)或以上能够达到以上目的(“Blood Substitutes and PlasmaExpanders”，Alan R.Liss，editors，NewYork，N.Y.，205-212页(1978))。在该研究中，作者将血红蛋白与不同分子量的葡聚糖缀合。他们报道了，血红蛋白(分子量64,000Da)和葡聚糖(分子量20,000Da)的缀合物“被缓慢从循环中清除、由肾脏清除的几乎可忽略”。此外，还观察到提高分子量至84,000Da以上并未明显改变这些清除曲线。
本发明提供了缀合PAO到Hb的方法，其中可以得到至少84,000Da的分子量。适合的聚环氧烷聚合物包括，聚环氧乙烷(-(CH2CH2O)n-)、聚环氧丙烷(-(CH(CH3)CH2O)n-)和聚环氧乙烷/聚环氧丙烷共聚物(-(CH2CH2O)n-(CH(CH3)CH2O)n-)。适于实施本发明的其它直、支链以及任意取代的合成聚合物为医学领域所公知。
因为其药物可接受性以及商业可利用性，最常见的用于修饰血红蛋白表面的PAO是PEG。另外，PEG根据其分子中环氧乙烷(即-OCH2CH2-)亚单元的重复的数目可以得到多种分子量。PEG试剂通常后接一个对应其平均分子量的数字。例如，PEG-200的平均分子量为200Da，可能的分子量范围是190-210Da。
血红蛋白的修饰
在本发明方法中使用的血红蛋白不限来源并且可以从人或动物身上获得，或从基因重组技术中得到。它可以是天然(未修饰)的或修饰过的，或经过重组改造的。人α-和β-球蛋白基因均已克隆并测序(Liebhaber S.A.等，PNAS，1980，77：7054-7058；Marotta，C.A.等，J.Biol.Chem.1977，353：5040-5053(β-球蛋白cDNA))。此外，如今使用定位诱变已经制备了许多重组的修饰血红蛋白，尽管据报道这些“突变”血红蛋白变体具有并不理想的高氧亲和力(参见例如Nagai，K.等PNAS1985，82：7252-7255)。优选的，血红蛋白是无基质和无内毒素的。
用于增加血红蛋白上可缀合位点的数目的方法是通过引入巯基(“-SH”)，巯基比自由氨基更易于与PEG-Mal反应。本领域已知有多种方法可以对蛋白质硫醇化。它们包括，例如，通过与琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯反应以硫醇化蛋白质中含自由氨基的残基，然后用二硫苏糖醇(“DTT”)或三(2-羧乙基)磷酸(“TCEP”)还原3-(2-吡啶基二硫代)丙酰基缀合物。氨基也可以直接通过与琥珀酰亚胺乙酰硫代乙酸酯反应进行硫醇化，接着用50mM羟胺或联胺在近中性pH下去除乙酰基。此外，2-亚氨基四氢噻吩(2-IT)可以用于将自由氨基转换为巯基。
天然人体血红蛋白具有固定数量的氨基酸残基侧链，可以硫醇化后与马来酰亚胺活化的PAO分子进行缀合。这些在下表中列出：
  α球蛋白
  赖氨酸   7，16和40
  β球蛋白
  赖氨酸   8，17，59，66，95
  半胱氨酸   93，132
已有建议在缀合后保持血红蛋白中的氨基基团(α-或ε-)的原始正价是有益的。为了达到此目的，进行了科学研究将PEG连接于Hb表面的赖氨酸残基的ε-氨基，其中Hb的氨基仍然保持了原始正价(美国专利5,585,484)。这里包括通过2-亚氨基四氢噻吩对Hb的ε-氨基进行脒基化作用以在蛋白质上引入巯基，其随后在与马来酰亚胺-PEG的缀合反应中目标作为与PEG连接的位点。
该方法相比之前的使用琥珀酰亚胺的化学方法具有至少两个额外的特别优点：(1)马来酰亚胺基团对巯基的非常高的反应活性和选择性有利于近乎定量的修饰硫醇，反应试剂限制性的过量，(2)2-亚氨基四氢噻吩的巯基是隐藏的并且它作为试剂与蛋白质氨基反应的结果仅仅在原位产生。因此，血红蛋白可以与硫醇化和PEG化反应试剂同时存在时温育以用PEG进行表面修饰。
在一个实施方案中，硫醇化反应在pH7-9时进行，此pH值低于2-IT在反应完成之前显著水解的pH值，并且低于赖氨酸的pKa值以最优化反应的程度。
缀合反应
如本文中其它部分讨论的，之前假设增加缀合反应中反应物的摩尔比例会导致与Hb缀合的PEG分子数量的增加。这包括Hb的硫醇化过程(即增加硫醇化试剂对Hb的摩尔比例)和表面修饰过程(即增加活化的PEG对硫醇化Hb的摩尔比例)。这些研究证实了大于10倍摩尔过量的亚氨基四氢噻吩实质性增加了血红蛋白的硫醇化位点，从反应最初2小时的4个新的活性-SH基/四聚体到11小时后的7个新的活性-SH基/四聚体。摩尔比例从10倍增加到30倍使相对于Hb的硫醇数目大约加倍。相应地，提高硫醇活化的PEG相对于硫醇化血红蛋白的摩尔比例(即20倍)也增加了马来酰亚氨活化的PEG分子的数量，它可以与硫醇化血红蛋白结合(参见美国专利7,501,499)。这些超量的摩尔比例导致血红蛋白有6±1个PEG分子共价键合在其表面。然而，反应物比例的提高减缓了反应动力学，增加了不希望的副产品的水平并增加了PEG-Hb缀合物的分子量分布。
本发明基于预料不到的发现，通过特定分子量的PEG和对反应物比例的精确控制，能制备优异的PEG-Hb缀合物。本发明的方法既在Hb硫醇化反应也在PEG缀合反应中采用了减少的反应物摩尔比例。传统常识是更高浓度的反应物会增加产率和缀合效率，与其相反的不可预料的结论是，采用较低的反应物摩尔比例时会有大量的PEG分子与修饰血红蛋白缀合。而且另一益处是，发得到的缀合产物相比采用高比例的产物具有更紧凑的分子量分布。更具体地说，在硫醇化反应中，小于8倍摩尔过量的2-IT，优选介于7至8倍摩尔过量，更优选7.5倍摩尔过量；以及在缀合反应中，小于15倍摩尔过量的PEG-Mal，优选的是介于9至15倍摩尔过量，更优选的是12倍摩尔过量；导致了PEG分子平均数/Hb在7.1到8.9之间，特别是约为8。如所讨论的，采用较低的反应物摩尔比例有几个益处。它减少了最终产物中的杂质，这有利于提高纯化过程的效率和通过提高分子分散增加了反应效率。增加的效率也减少了完成水解和马来酰亚胺环钝化的反应时间。此外，通过降低反应物的数量，也减少了其各反应的副产物。特别地，2-IT的水解副产品，包括4-丁酰硫内酯(4-butrythiolactone)和4-硫代丁酸，以及开环的、无反应活性的PEG副产品均显著减少。
如前所述，缀合反应中PEG-Mal对Hb的摩尔比例小于15倍。该摩尔比例基于活性PEG-Mal的浓度，不是基于PEG-Mal对Hb的绝对比例。具有封闭环状结构的活性马来酰亚胺在PEG-Mal中的百分比是指它的“末端活性”。因此，如果所有的马来酰亚胺都是活性的，PEG-Mal具有100％的末端活性。在这里描述的PEG-Mal对Hb的摩尔比例是基于末端活性PEG-Mal对Hb的摩尔比例。因此，如果PEG-Mal试剂的末端活性为90％，需要向Hb再加入10％以获得同样的摩尔比例。
还原残余的未反应PEG带来的额外益处是增加了生产效率和最终产品的质量。在PEG缀合反应之后，残余的反应物通过10体积最终产物稀释液膜渗滤去除，例如林格氏乳酸盐(Ringer’s lactate)或醋酸盐溶液。这一步需要的时间通过膜渗滤过程的膜流量来确定。对于给定的过滤器尺寸，采用本发明的反应物比例，渗滤过程会加快完成。反应物的洗出遵循指数衰减，结果，减少杂质的最初浓度(残余反应物和反应物中的杂质)将减少产品中它们的最终浓度。因此，将试剂的量最小化可以减少产品中杂质的总量。
PEG-Hb缀合物
本发明中的PEG-Hb缀合物通常具有比全血更好的氧亲和力，更特别的是，是全血的两倍甚至三倍。不同的是，在同样的条件下测量，PEG-Hb通常具有比无基质血红蛋白(SFH)更好的氧亲和力。这表明PEG-Hb缀合物通常具有小于10毫米汞柱(mmHg)、但是大于3mmHg的p50。SFH的p50在37℃，pH7.4时约15mmHg，同样条件下的全血的p50约28mmHg。这表明增加血红蛋白基氧载体(HBOC)的氧亲和力，从而降低p50，会增加对组织的氧的输送，但是低于SFH的氧亲和力不能被接受。参见Winslow，R.M.等，在“Advances in BloodSubstitutes”，(1997)，
Figure BPA00001624709900111
，eds.Boston，Mass.，167页，和美国专利6,054,427。这观点与广泛持有的观点相悖，即，HBOCs应该具有较低的氧亲和力，且特别是其p50接近全血p50的。因此，许多研究者使用磷酸吡哆醛(pyridoxyl phosphate)使SFH的p50，由10mmHg增加到约20-22mmHg，因为吡哆醛化的Hb相比SFH更容易释放氧。
有许多关于生产高氧亲和力(即其p50低于SFH)的HBOCs的科学研究。例如，有研究证明氨基酸残基在氧亲和力中起到重要作用，如β93半胱氨酸。因为这些发现，现在可以很容易的实施定位诱变以构造理想水平的氧亲和力(参见例如，美国专利5,661,124)。β93半胱氨酸残基被直接定位相邻于最接近的β92组氨酸残基，其为β-亚基中的唯一直接残基，使其等位于血红素铁。刚性、庞大的马来酰亚氨基团与β93半胱氨酸的连接置换了盐桥，所述盐桥正常地稳定了低亲和力T态血红蛋白构造(Perutz M.F.等，Biochemistry 1974，13：2163-2173)。这促使四元构造朝着R态的转变，从而得到了更高的氧亲和力(Imai，K.等，Biochemistry 1973，12：798-807)。许多其它的方式在美国专利6,054,427中有所讨论。
体内给药的制剂
本发明的PEG-Hb缀合物采用适用于体内给药的水稀释液配配制。尽管根据应用，稀释液中氧载体的浓度可能改变，但由于PEG-Hb缀合物提供了增强的氧气输送及治疗效果，其通常不高于10g/dl的血红蛋白浓度。更具体地，浓度通常为0.1-8g/dlHb。
合适的水稀释液(即，供静脉注射的药物可接受的稀释液)包括，尤其是蛋白质、糖蛋白、多糖及其它胶体。这并非意味着这些实施方案被限制到任何特定稀释剂。因此，稀释剂可涵盖白蛋白、其它胶体或其它非携氧成分的无细胞水溶液。
PEG-Hb缀合物的这种溶液性质归因于PEG链与溶剂水分子之间的强烈的相互作用。由于以下两个原因这被认为是HBOC的重要属性：1)更高的粘度降低了PEG-Hb分子的分散常数，和2)更高的粘度增加了溶液流向血管内皮壁时的剪切应力，诱发了血管扩张剂的释放从而阻碍血管收缩。因此，在水稀释液中的PEG-Hb制剂的粘度通常为至少2厘泊(cP)。更优选的，介于2-4cP之间，特别优选在2.5cP左右。在另一实施方案中，水溶液的粘度也为6cP或更高，但是通常不超过8cP。
PEG-Hb缀合物适合用作血红蛋白基氧载体及其它任何类似产品。例如，它可以用作血液代用品、用于器官维护、在外科手术时促进血液动力学稳定性等。
具体实施方式
实施例1
血红蛋白的硫醇化
1、制备无基质血红蛋白(SFH)
从商业来源获得压积红细胞(“RBC”)，例如从本地血库，纽约血液中心(theNew York Blood Center)，或美国红十字会(the American Red Cross)。获得材料从采集之日起不超过45天。在使用前筛查所有单元的病毒感染并进行核酸检测。未去除白细胞的收集单元(pooled unit)使用膜过滤进行白细胞去除。压积RBC倒入消毒无菌容器中并储存在2-15℃直到进一步处理。记录体积，使用市售获得的联合血氧定量计或其它技术认可的方法测定血红蛋白浓度。
采用6倍体积0.9％氯化钠洗涤压积红细胞，通过0.45-μm切向流过滤，接着通过减少盐的浓度来溶解细胞。采用同样的膜进行血红蛋白的提取。利用白蛋白的分光光度计测定分析细胞洗涤，验证去除血浆成分。细胞胞溶产物通过0.16-μm膜在冷处处理以纯化血红蛋白。将纯化的血红蛋白收集到无菌去热源容器中然后通过超滤进行病毒去除。可以进行另外的去除病毒步骤，包括溶剂/洗涤剂处理，纳米过滤，阴离子Q膜纯化。该过程中的所有步骤都在2-15℃下进行。
从胞溶产物中得到的血红蛋白使用30-kD膜交换到林格氏乳酸盐(Ringer’s lactate，RL)或磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.4)中。血红蛋白被浓缩到浓度1.1-1.5mM(按四聚体)。10-12体积的RL或PBS用于溶剂交换。该过程在2-15℃下进行。在硫醇化之前将用RL或PBS制备的溶液的pH调整到8.0。血红蛋白通过0.45-或0.2-μm一次性滤器瓶帽无菌过滤，在化学修饰反应前于4±2℃保存。
2、无基质血红蛋白(SFH)的硫醇化
使用如前所述制备的SFH，硫醇化采用相对血红蛋白小于8倍摩尔过量的2-IT进行。比例和反应时间被最优化以得到最多的巯基数目用于PEG的缀合并使产物的异质性最小化。位于RL(pH7.0-8.5)、PBS或其它类似的缓冲液中的大约1mM血红蛋白(四聚体)，与位于同样缓冲溶液中的小于8mM的2-IT结合。混合物在10±5℃连续搅拌小于6小时。
使用二硫吡啶(dithiopyridine)比色测定方法(Ampulski，R.S.等，Biochem.Biophys.Acta 1969，32：163-169)测定硫醇化前后以及Hb-PEG缀合后的Hb四聚体表面上可利用的巯基数。二硫吡啶反应证实，人血红蛋白包含两个固有的反应性巯基，位于β93半胱氨酸残基处。SFH按1∶＜8(SFH∶2-IT)比例硫醇化后，反应活性巯基的数目从2增加到超过7个巯基。
实施例2
血红蛋白与PEG-Mal的缀合
根据起始四聚体血红蛋白浓度，采用小于15倍摩尔过量的基于100％末端活性的PEG-Mal将PEG-Mal与实施例1中得到的硫醇化的Hb结合。血红蛋白首先与大气平衡以氧化血红蛋白。近似的，于RL(pH7.0-8.5)、PBS或任何相似的缓冲液中的1mM硫醇化血红蛋白，与于同样的缓冲液中的小于15mM的PEG-Mal结合。混合物在10±5℃下连续搅拌小于6小时。
PEG-Hb缀合物通过70-kD膜处理(即＜0-体积过滤)，去除未反应试剂。通过体积排阻液相色谱(“LC”)在540nm和280nm处进行反应监控。将血红蛋白浓度调整到4g/dl，pH调整到6.0±7.8。
最终的PEG-Hb缀合产物在4±2℃使用0.2-μm无菌一次性滤帽进行无菌过滤，并收集到无菌去热源的容器中。PEG-Hb缀合物稀释到4g/dlRL，pH调整到pH7.4±0.2，然后无菌过滤(0.2μm)并等份分装到无内毒素的消毒容器中。
实施例3
PEG-Hb缀合物的表征
1、生理化学分析方法
PEG-Hb缀合物的均一性和分子大小由液相色谱(LC)表征以评价未反应PEG-Mal的去除程度。洗出液中的Hb量通过在540nm吸光度处监测来确定。通过峰位置基于分子量的差异分辨PEG-Hb缀合物和未反应血红蛋白。使用280nm吸光度监测来确定洗出液中未反应的PEG-Mal的量。分辨PEG-Hb缀合物与游离的PEG-Mal，其由于PEG-Mal中的马来酰亚胺环结构而在光谱的紫外(“UV”)区有吸收。
使用快速扫描二极管阵列分光光度计收集Soret和可见区光谱，利用多成分分析进行血红蛋白浓度和高铁血红蛋白(metHb)百分比分析。
使用联合血氧定量计(Instrumentation Laboratory，Bedford，MA)测定PEG-Hb缀合物浓度和高铁血红蛋白百分比，粘度采用流变仪(BrookfieldEngineering Lboratories，Inc.Middleboro，MA)测定。使用胶体渗透压计Osmomat 050(Gonotec GmbH，Germany)测定胶体渗透压。根据由Hemox分析仪(TCS Scientific Corporation，New Hope，PA)测定的氧平衡曲线来确定氧结合参数。
2、PEG-Hb缀合物的规范
本发明中典型的血液替代组合物规范列于下面的表1中：
  测试   规范
  血红蛋白浓度(g/dl)   4.0-4.6
  高铁血红蛋白(％)   ＜10
  pH   6.4-7.9
  摩尔渗透压浓度(mOsm/L)   240-300
  内毒素(EU/mL)   ＜0.5
  纯度(经GPC)   ＞95％
  粘度(cPs)   2-4
  胶体渗透压(mmHg)   60-70
  p50(mmHg)   5±2
  峰数目(于p50)   1.2±0.5
  PEG缀合程度   平均介于7.1-8.9PEGs/Hb四聚体
  波尔效应(ΔLog)   -0.24
  分子量(kDa)   ＞100
  无菌度   通过
****
为给予本领域一般技术人员有关如何制备和使用该组合物优选实施方案的完整公开内容和说明而提供上述实施例，并非意在限制本发明人视作其发明的范围。以上描述的方式的改进(实施本发明的对本领域技术人员而言显而易见的方式)落入以下权利要求书的范围之内。本说明书引用的所有出版物、专利以及专利申请通过参考引入此处，如同特定逐一明确指明其中每一出版物、专利以及专利申请，在此引入以供参考。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种制备聚乙二醇缀合血红蛋白(PEG-Hb)的方法，包括如下步骤：
a)将血红蛋白(Hb)与2-亚氨基四氢噻吩(2-IT)在水稀释液中混合，其中在稀释液中2-IT的浓度相对血红蛋白浓度为7-8倍摩尔过量，以形成硫醇化血红蛋白；以及
b)在硫醇化血红蛋白的水稀释液中加入聚乙二醇(PEG)-马来酰亚胺(Mal)，其中在释释液中PEG-Ma l的浓度相对血红蛋白浓度为9-15倍摩尔过量以形成PEG-Hb缀合物，其中PEG-Mal具有4000-6000道尔顿(Da)的平均分子量；
其中PEG-Hb缀合物含有平均7.1-8.9PEG分子/Hb；
其中的PEG-Hb缀合物具有比使用更高的2-IT或PEG-Mal摩尔比例制备得到的PEG-Hb缀合物更紧凑的分子量分布。
2.根据权利要求1的方法，其中稀释液中2-IT的浓度相对血红蛋白浓度为7.5倍摩尔过量。
3.根据权利要求1的方法，其中稀释液中PEG-Mal的浓度相对血红蛋白浓度为12倍摩尔过量。
4.根据权利要求1的方法，其中PEG-Mal具有5000道尔顿的平均分子量。
5.根据权利要求1的方法，其中PEG-Hb缀合物在血红蛋白50％饱和时的氧分压(p50)低于基本相同条件下测得的从同等来源得到的天然无基质血红蛋白的氧分压。
6.相据权利要求5的方法，其中PEG-Hb缀合物的p50低于10毫米汞柱(mmHg)。
7.根据权利要求5的方法，其中PEG-Hb缀合物的p50在4和8mmHg之间。
8.根据权利要求5的方法，其中步骤a)在pH7-9进行。

Claims (8)

1.一种制备聚乙二醇缀合血红蛋白(PEG-Hb)的方法，包括如下步骤：
a)将血红蛋白(Hb)与2-亚氨基四氢噻吩(2-IT)在水稀释液中混合，其中在稀释液中2-IT的浓度相对血红蛋白浓度为7-8倍摩尔过量，以形成硫醇化血红蛋白；以及
b)在硫醇化血红蛋白的水稀释液中加入聚乙二醇(PEG)-马来酰亚胺(Mal)，其中在释释液中PEG-Mal的浓度相对血红蛋白浓度为9-15倍摩尔过量以形成PEG-Hb缀合物，其中PEG-Mal具有4000-6000道尔顿(Da)的平均分子量；
其中PEG-Hb缀合物含有平均7.1-8.9PEG分子/Hb。
2.根据权利要求1的方法，其中稀释液中2-IT的浓度相对血红蛋白浓度为7.5倍摩尔过量。
3.根据权利要求1的方法，其中稀释液中PEG-Mal的浓度相对血红蛋白浓度为12倍摩尔过量。
4.根据权利要求1的方法，其中PEG-Ma l具有5000道尔顿的平均分子量。
5.根据权利要求1的方法，其中PEG-Hb缀合物在血红蛋白50％饱和时的氧分压(p50)低于基本相同条件下测得的从同等来源得到的天然无基质血红蛋白的氧分压。
6.根据权利要求5的方法，其中PEG-Hb缀合物的p50低于10毫米汞柱(mmHg)。
7.根据权利要求5的方法，其中PEG-Hb缀合物的p50在4和8mmHg之间。
8.根据权利要求5的方法，其中步骤a)在pH7-9进行。
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