JPH05502240A

JPH05502240A - ヘモグロビンオリゴマーに基づく組成物及びその製造方法

Info

Publication number: JPH05502240A
Application number: JP3514532A
Authority: JP
Inventors: ネルソン，デアンナ，ジェー; ハイ，トン，タット; スルナック，アナ
Original assignee: バクスター、インターナショナル、インコーポレイテッド
Priority date: 1990-08-17
Filing date: 1991-08-15
Publication date: 1993-04-22
Anticipated expiration: 2012-12-10
Also published as: EP0496866B1; WO1992003153A1; ES2091940T3; DK0496866T3; DE69120925D1; EP0496866A1; JP2689023B2; CA2067241A1; DE69120925T2; ATE140389T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヘモグロビンオリゴマーに基づく組成物及びその製造方法主豆勿宜景金１夏分ト本発明はヘモグロビンオリゴマーに基づく組成物及びその製造方法に関する。特に本発明は、少なくともヒト赤血球中ヘモグロビンの酸素親和性を保持しつつ、より長期間にわたって酸素を運搬する能力を有するヘモグロビンオリゴマーに基づく組成物を製造するためにヘモグロビンに基づ＜／８ｅ、を架橋する方法に関する。

五五垣歪夏記述現行の医療プラクティスにおいては、傷害を受けた者又は手術患者のような血液の損失のあった患者を酸素運搬性材料で潅流する必要がある場合には、全血又はバック赤血球が使用されているのみである。供血者と受血者の血液型を注意深く一致させる必要があり、その試験は血液潅流を遅らせ得る。結果として、実質的に血液損失の状態にある患者が傷害の原因となる酸素欠乏の期間にさらされることとなる。その上、事前の瀉血と貯蔵によって自家すなわち轡者に供血された赤血球が入手できる場合でさえも、これらの自家赤血球の酸素運搬能及び安全性は貯蔵の結果として低下している。その結果、輸血後２４時間までの間、患者は至適以下の酸素供給状態にされされ得る。最後に、全血及びこれから得た赤血球のあらゆる輸血において、ウィルス及び／又は細菌汚染という、患者にとって常に存在する危険がある。

従って、通常の環境条件下における酸素の運搬と放出に有用なそして以下の特徴を備えた物質が必要であることが認識されている。

理想的には、該物質は酸素を機器、器官及び組織に対して、正常の酸素分圧がこれらの環境中に維持されるように、運搬しそれを放出しなければならない。該物質は非抗原性でありそして無パイロ−ジエン（すなわち０．２５ＥＵ／ｍＬ）でなければならない。該物質は細菌及び／又はウィルスによる汚染のないものでなければならない。該物質は安全で無毒性でなければならない。該物質は血液及び血清と混和するものでなければならない。該物質は血液に匹敵する粘性、コロイド性及び浸透圧特性を有しなければならない。患者の脈管系内に長期間保持される物質を有することが望ましい。なぜなら、このことは、働者自身の赤血球造血と成熟とを許容するからである。さらに、該物質は赤血球造血に干渉しまたはこれを妨害することがあってはならない。

酸素の運搬及び放出のための自然の、哺乳類のタンパク質であるヘモグロビンは、血液型を決定する固有の抗原を含有する赤血球細胞膜又は間質からそして他の細胞及び細胞質成分から分離できることが認識されてきた。もしそのような分離及び単離が達成されれば、得られる間質不含ヘモグロビンは抗原性物質含有しない。従って、血液型の判定とその一致とはもはや必要がない。例えば、典型的な間質不含ヘモグロビンの製造は、残存血漿と細胞残滓を除くために赤血球を洗浄し、ヘモグロビンを遊離するために赤血球を溶解し、そしてヘモグロビンを濾過し限外濾過して夾雑物から分離することよりなる。Ｋ、　Ｂｏｎｈａｒｄ、　Ｂ、　Ｅｉｃｈｅｎｔｏｐｆ、　ａｎｄ　Ｎ、　Ｋｏｔｈｅ、　”Ｐｒｏｃｅｓｓ　ｆｏｒ　Ｏｂｔａｉｎｉｎｇ　）Ｉｅｐａｔｉｔｉｓ−５ａｆｅ、　５ｔｅｒｉｌｅ　Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　５ｏｌｕｔｉｏｎｓＦｒｅｅ　ｏｆ　Ｐｙｒｏｇｅｎｓ　ａｎｄ　５ｔｒｏｔｓａ、”　（米国特許第４４３９３５７号）及びＮ、　Ｎｏｔｈｅ　ａｎｄ　Ｂ、　Ｅｉｃｈｅｎｔｏｐｆ、　”Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ　）Ｉｉｇｈｌｙ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ、５ｔｒ６ａａ −Ｆｒｅｅ、Ｎｏｎ−Ｈｅｐａｔｉｔｉｃ　Ｈｕｍａｎ−Ａｎｉｇ＋ａｌ　）Ｉｅ＋＊ｏｇｌｏｂｉｎ　５ｏｌｕｔｉｏｎｓ　（米国特許第４５２６７４５号）。Ｔｈｅ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｆｏｒ　ｉｓｏｌａｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ　ｔｈｅ　５ｔｒｏａ＋ａ−ｆｒｅｅ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　１ｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｓ　ｐｒｏｃｅｓｓｓｔｅｐｓ　ｔｏ　ｅｌｉｍｉｎａｔｅ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｎｄ　ｖｉｒａｌ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ、　（米国特許第４５９８０４６号及び４６００５３１号）（ここに参照し導入する）。

しかしながら、間質不含ヘモグロビンは上記の物質適合性基準に合致しない。例えば、間質不含ヘモグロビンは酸素を運搬できることが知られてはいるが（Ｓ、Ｆ、　Ｒａｂｉｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　Ｖｏｌ、　１２６．、　ｐ、１１４２．　Ｌ９６７）、エフェクターとして知られる特有の追加の物質の不存在下では、間質不含ヘモグロビンが有用であるには酸素に対する親和性が余りに高過ぎる。結果として、間質不含ヘモグロビンは、器官及びＭｉ織において正常の酸素分圧を維持することができない。更に、その自然の形態においては、間質不含ヘモグロビンは、各々が１本のαタンパク鎖及び１本のβタンパク鎖より構成される一対の２量体凝集物（分子量３２２５０　）より作られる４量体凝集′！＃（分子量６４５００　）である。２量体凝集物同士は共有結合で相互に保持されているのではない。間質不含ヘモグロビンの注入に続いて、このタンパク質はこれらの２量体凝集物へと自然に解離し、これは酸素を放出しない。２量体は腎臓を通って濾過により除去され尿中に排泄されるに充分小さい。研究は、間質不含ヘモグロビン又はその解離２量体の循環中における保持半減期がおよそ２時間であることを示している。すなわちその濃度は２時間毎に１／２に減少する。この期間は骨髄中で赤血球が再生され成熟するに必要な時間よりはるかに短い。こうして、間質不含ヘモグロビンは時間の経過とともに益々効果がなくなる。更に、間質不含ヘモグロビンの解離は非常に速いため、２量体が腎臓や他の器官に蓄積し、これらの器官に傷害を引き起こす。この結果、間質不含ヘモグロビンは酸素運搬物質に要求される臨床的安全性を欠いているであろう（Ｓ、Ｌ、　Ｂａｋｅｒａｎｄ　Ｅ、Ｃ，Ｄｏｄｄｓ、　Ｂｒ１ｔ、　Ｊ、　Ｅｘ　、　Ｐａｔｈｏｌ、　６：　２４７．１９２５参照）。

これらの知見を総合すると、４量体ヘモグロビンは架橋なしでは組織への長期間の酸素供給のための担体としては適当でないことが示される。

間質不含ヘモグロビンの欠点のいくつかに向けられた非常に多くの修飾ヘモグロビンが知られている。既知の修飾方法には、間質不含ヘモグロビンの分子内架橋形成のための、低分子量試薬による間質不含ヘモグロビンの分子間架橋形成のための、低分子量試薬による間質不含ヘモグロビンの分子内及び分子間架橋のための、及び間質不含ヘモグロビンの他のポリマーへの結合のための種々の方法が含まれる。

間質不含ヘモグロビンの分子内架橋形成のための方法は従来技術に知られている（米国特許第４５８４１３０号、４５９８０６４号及び４６００５３１号）。例えば、これらの修飾ヘモグロビンの１つであるジアスピリン架橋ヘモグロビンは、間質不含ヘモグロビンを、２．３−ジホスホグリセリート、イノシトールへキサホスフェート又はイノシトールヘキササルフェートの存在下に、ビス（３，５ −ジブロモサリチル）フマレートと反応させることによって製造される（米国特許第４５９８０６４号オリゴマー帯４６００５３１号）。この処理は、間質不含ヘモグロビンを、フマレート架橋によってタンパク質のα鎖の第９９番目のりジン残基を共有結合的に連結することによって修飾する。この分子内架橋の結果、ジアスピリン架橋ヘモグロビンは、血液に等しい酸素親和性を有する。更に、ジアスピリン架橋ヘモグロビン（分子量６４５００）はもはや２量体（分子量３２２５０）には解離することができない。タンパク質の分子量が増大するにともなって循環系中のヘモグロビンの保持時間は増大するから、ジアスピリンα−α架橋ヘモグロビンの保持時間は４乃至８時間であり、間質不含ヘモグロビンの２乃至４倍である。しかしながら、患者が相当量の血液を失った場合に数日間にわたって酸素をｉ！搬できる酸素運搬体が必要とされているから、これは急性の出血の処置において有用であるには充分な長さの時間ではない。

ヘモグロビン分子はまた、低分子量架橋剤によって分子間で相互に架橋形成もされている。特に、Ｋ、　Ｂｏｎｈａｒｄは、ジアルデヒドを使用し、好ましくは続いてピリドキサールフォスフェートを添加することによる、ヘモグロビン分子相互の及び／又は血清タンパク質及びゼラチン誘導体との結合を開示している（米国特許第４３３６２４８号）。・Ｂｏｎｓｏｎらは２官能性又は多官能性の低分子量の架橋剤による架橋を開示している（米国特許第４００１４０１号、４００１２００号、４０５３５９０を有している（全血のｐｓｏが２８であるのに対し、グルタルアルデヒドポリマー化ヘモグロビンのＰ、。は１８乃至２３である）。更に、グルタルアルデヒドによる既知の分子間架橋生成物は抗原性を有する（Ｄ、）１．　Ｍａｒｋｓ　ｅｔ、ａｌ、、　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ｍｅｄ、　Ｖｏｌ、　１５２．　ｐ、４７３．１９８７）。

同様に、Ｍｏｃｋ等（Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　Ｖｏｌ、　３４．　ＬＬ４５８．１９７５）及びＭａｚｕｒ（米国特許第３９２５３４４号）は、分子内及び分子間架橋ヘモグロビンの製造に、低分子量の２官能性架橋剤の使用を提示している。１９７５年に発見されたこの材料の有効性及び安全性に関する前臨床報告も臨床報告もないことは、それが上記の適合性基準に合致しないことを推測させる。

ヘモグロビンは、低分子量媒体を用いることによってポリマーにも結合されている。例えば、ヘモグロビンは、ヒドロキシエチル澱粉に（ドイツ特許出願公開第２６１６０８６号）、インスリンに（Ｋ、Ａｊ　１ｓａｋａ　ａｎｄ　Ｙ、　Ｉｗａｓｈｉｔａ、　”Ｏｘｙｇｅｎ　ｃａｒｒｉｅｒ　ｆｏｒ　ｂｌｏｏｄ　５ｕｂｓｔｉｔｕｔｅ”。

米国特許第４３７７５１２号）、及びデキストランに（Ｊ、Ｔ、Ｆ、　Ｗｏｎｇ、ヨーロッパ特許出願０１４０６４０号）結合されている。同様に、ヘモグロビンはそれ自身及び／又は他の血清タンパク質及びゼラチン誘導体とも、ジアルデヒド（３乃至８炭素原子）媒体の使用により、そして至適には続いてピリドキサールホスフェートの添加によって（Ｋ、　Ｂｏｎｈａｒｄ　ａｎｄ　Ｕ、　Ｂｏｙｓｅｎ、米国特許第４３３６２４８号）結合されている。

同様に、米国特許第４１７９３３７号においては、ペプチドとポリペプチドとが結合されて実質的に直線のエーテル性又は炭素−炭素中心骨格を含むポリマーが形成されている。ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールが好ましい。結合は、ペプチドに対してＩＯ乃至１００モル当量のポリマーを、より好ましくはポリペプチドに対して１５乃至５０モル当量のポリマーを使用して達成される。結合は媒体の助けを借りて達成されなければならない。米国特許第４３０１１４４号（Ｙｕｊｉ　Ｉｗａｓｈｉｔａ　ａｎｄ　Ｋａｔｓｕａ＋ｉ　Ａｊｉｓａｋａ、　”Ｂｌｏｏｄ　５ｕｂｓｔｉｔｕｔｅ　Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　）！ｅｍｏｇｌｏｂｉｎ”）において、ヘモグロビンは、媒体により活性化されたポリ（アルケン）グリコールの末端基及びヘモグロビンのアミノ基との間のアミド結合を介する結合によって修飾されている。この技術の一層最近の具体例（米国特許第４４１２９８９　号及び４６７０４１７号）は、修飾されたヘモグロビンの七ツマー１２量体及び３置体の製造を報告している。

これらの具体例はＰ、。が２１乃至２５であり循環中における半減期が４乃至８時間である。更に、該材料は非常に不安定であるため、貯蔵できるためには安定化剤の存在下に凍結乾燥をしなければならない。これらの全ての要素が、このタイプの誘導体が上記の基準に合致しないことを示している。

光！Ｒ目１斐驚くべきことに我々は、ポリマー化修飾されたヘモグロビンに基づくモノマーとヘモグロビンに基づく七ツマ−のオリゴマーとからなる、ヘモグロビンに基づく七ツマ−とオリゴマーとの混合物が上記の基準に合致することを見いだした。すなわち、該材料は、２置、器官及び組織に、これらの環境において正常な酸素分圧が維持されるように、酸素を運搬しそして放出する。該材料はまた、無パイロ −ジエンであることが示された。該材料は細菌及び／又はウィルスの汚染のないことが示された。該材料は安全で無毒であることが示さ机た。該材料は血液及び血清と混和性である。該材料は、血液に匹敵する粘性、コロイド性及び浸透圧特性を存する。最後に、Ｓ亥材料は、哺乳類の脈管系において少なくとも１３時間の半減期をもって保持され、そしてヒト赤血球中のヘモグロビンと少なくとも等価のＰ、。を有することが示された。咳産物がまた、限定された量の高分子量ポリマー化ヘモグロビン及び非修飾へモグロビンモノマ−を含有してよいことに注意すべきである。

特に、本発明は、ポリマー化修飾されたヘモグロビンに基づくモノマーとヘモグロビンに基づくモノマーのオリゴマーとからなる、ヘモグロビンに基づくモノマー及びポリマーの混合物に関する。好ましい具体例において、ポリマー化剤として水溶性ポリエーテルオキシランが使用される。加えて、好ましい具体例において、スルフヒドリル試薬が、重合を停止し混合物を最も有用な酸化状態にすることを保証するために使用される。

この発明はまた、ヘモグロビンに基づくモノマー及びオリゴマーの混合物を製造する方法を含む。該方法は、循環中における少なくとも１３時間の半減期を有し且つヒト赤血球のＰ５゜と等価なＰ５゜を有する混合物を製造するに充分な量の、３員環を含む水溶性物質の存在下にて前記モノマー重合することよりなる。

特に、ポリエーテルオキシランは重合反応を完成させるために使用される。

本発明の−の目的は、約５０％未満のポリマー化修飾したヘモグロビンに基づく七ツマー１約５％未満のヘモグロビンに基づく組成物の高分子量ポリマー、及び少なくとも約２０％のオリゴマーを有するが、好ましくは約７０乃至８０％のヘモグロビンに基づく組成物のオリゴマーを有する混合物を提供することである。

オリゴマーは、２乃至１０個のヘモグロビンに基づくモノマーより構成される本発明の更なる目的は、ヒト赤血球中のヘモグロビンと等価なまたはそれより大きいＰ、。を有し、血液と粘度が等しく、抗原性がなく、毒性がなくそして酸素供給手段として充分に安定である、ヘモグロビンに基づくモノマー及びポリマーの混合物を提供することである。

図Ｉｆ」ＩＩＬ劇肌図１は、ここに開示する発明によって製造したヘモグロビン混合物のサイズ排除ＨＰＬＣプロフィールを示す。

図２は、グルタルアルデヒドでポリマー化したヘモグロビンのサイズ排除ＨＰＬＣプロフィールを示す。

図３は、注入されたアルブミンの対照溶液と比較して、尿流速に対するポリエーテルオキシランでポリマー化したヘモグロビンの注入の作用を示す。

図４は、注入されたアルブミンの対照溶液と比較して、ナトリウムの排泄率に対するポリエーテルオキシランでポリマー化したヘモグロビンの圧入の作用を示す。

図５は、注入されたアルブミンの対照溶液と比較して、糸球体濾過速度に対するポリエーテルオキシランでポリマー化したヘモグロビンの圧入の作用を示す。

図６は、ジアスピリン架橋ヘモグロビン及びグルタルアルデヒドによるポリマー化ヘモグロビンの注入と比較して、尿流速に対するポリエーテルオキシランでポリマー化したヘモグロビンの注入の効果を示す。

図７は、ジアスピリン架橋ヘモグロビン及びグルタルアルデヒドでポリマー化したヘモグロビンの注入と比較して、ナトリウムの排泄率に対するポリエーテルオキシランでポリマー化したヘモグロビンの注入の効果を示す。

の＝−゛　−のノ架橋形成は、間質不含ヘモグロビン、分子内架橋ヘモグロビン及びカプセル化ヘモグロビンを含みしかしこれらに限定されることのない、非常に多くのヘモグロビンに基づく組成物のいずれの１つに対しても行うことができる。好ましい具体例は、いずれもここに参照により導入する米国特許第４５９８０６４号及び４６００５３１号に記載されているような、ジアスピリン誘導体で分子内架橋形成されたヘモグロビンを使用する。好ましい具体例であるジアスピリン誘導体による分子内架橋形成については、ここでは簡単な記述で充分である。

記述は上記の特許においてなされている。赤血球は最初に洗浄され溶解されてヘモグロビンを遊離する。粗製の溶血物は外側細胞膜又は間質を除去するために濾過される。ヘモグロビンは次いで洗浄され濃縮されて、トリポリホスフェートナトリウム及びビス（３，５−ジブロモサリチル）フマレートと共に反応容器中におかれる。得られるジアスピリン架橋ヘモグロビンは６４５００ダルトンの分子量を有する。

本発明において使用されるポリマー化剤は、水溶性の３貴ベテロ環化合物であり、オキシラン、アジラン及びチイラン（Ｔｈｉｉｒａｎｅ）を包含する。選択するポリマー化試薬としては、水溶性ポリエーテルオキシラン化合物のうちいかなるものでもよく、好ましくは１５乃至７５原子を鎖中に有する長鎖ボリエーテルオキシランである。

ポリエーテルオキシランの１つはＤｅｎａｃｏｌ　（登録商標）　（Ｎａｇａｓｅ　Ｃｈｅ＋ａｉｃａｌ　Ｃｏ）である。Ｄｅｎａｃｏｌ　は、モノ−、ジー、トリグリンジルエーテル、エステル及びＮ−グリシジル化合物の混合物である数種のタイプのオキシラン化合物の商品名である。Ｄｅｎａｃｏｌ　（登録商標）　ＥＸ−８１０，ＥＸ−３１３，Ｅに−８３０，２Ｘ−８４１及びＥＸ−８６１を評価した。

グロビンに基づく組成物の高分子量ポリマーを有する。そして最後種々の工程変数が最終生成物の特性に影響を与える。これらのパラメーターには、緩衝剤、ヘモグロビンに基づく組成物に対するポリマー化試薬の比率及びポリマー化温度が含まれる。

ヘモグロビンに基づく溶液のポリマー化は、ＴＲｌ５．　ＨＥＰＥＳ及びリンｔｌｉＩＩ衝剤を含む緩衝剤の存在下において起こる。好ましい緩衝剤は炭酸ナトリウムである。

ポリマー化を実施する温度はある種の生成物特性を決定するために制御することができる。すなわち、もしポリマー化が約Ｏ′Ｃ乃至１０°Ｃにて行われたなら、ポリマー化生成物は血液に満たない、すなわち２１３＋ａｍ＋Ｈｇ未満のＰＳＯを有する。更に、もしポリマー化が１０°Ｃを超える温度で行われたなら、ポリマー化生成物は血液に一層近似のＰ、。を有する。代わりに、もしポリマー化が一層高い温度で完゛了すると、ポリマー化生成物は血液を超える又はこれと等価なＰ、。

を有する。

ヘモグロビンに基づく組成物に対するポリマー化剤のモル比は１０乃至１５が好ましいが、この比は１：１乃至１００　：　１の範囲にわたることができる。ヘモグロビンに基づく組成物に対するポリマー化試薬の比率が１５を超えると、ポリマー化生成物のＰ、。は、赤血球中のヘモグロビンから実質的に右方変位する。

ヘモグロビンに基づくモノマー及びポリマーの混合物は、この方法で形成される。上述のポリマー化方法により得られる混合物は約５０％未満のポリマー化修飾されたヘモグロビンに基づく七ツマ−を有するが、好ましくは、１０％未満のポリマー化修飾されたヘモグロビンに基づく七ツマ−を有する（「モノマー」とは４量体形態でのヘモグロビン単位をいう）。加えて、それは約５％未満のヘモ％のポリマー化試薬に修飾された七ツマ−を有する。

に、それは少なくとも約２０％のヘモグロビンに基づく組成物のオリゴマーを有するが、好ましくはおよそ７０と８０％の間のヘモグロビンに基づく組成物のオリゴマーを有する。オリゴマーは２乃至１０個のヘモグロビンに基づく七ツマ− よりなる。混合物がオリゴマーのみ含んでもよく、ポリマー化修飾ヘモグロビンに基づく七ツマ−又は高分子量ポリマー又は未修飾のへモグロビンモノマーを含有する必要はないことに江意しなければならない。

混合物中における七ツマ−とポリマーの分布は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって確認することができる。サイズ排除クロマトグラフィーは、クロマトグラフィー固定相のポアサイズによって決定される一定の限度内において、タンパク質はそれらの分子量に基づいて分離されるという観察にその基礎を置いている。カラムからの溶出の１頓序は最高分子量から最低分子量の順である。すなわち、固定相の保持の上限を超える分子量を有するタンパク質は、より速く溶出されそしてクロマトグラフィーカラムの空隙体積と同時に鋭いハンドとして検出されるのに対し、より低分子量のものはより遅くいくぶん広がったピークとして分子量の減少する順序にて溶出される。タンパク質の混合物の組成は、混合物中の全てのタンパク質成分のピーク面積の総和に対する各タンパク質成分のピーク応答の面積の比率によって決定される。従って、図１に示すように、ここに開示の方法によって製造されるヘモグロビンに基づく混合物のサイズ排除クロマトグラフィープロフィールは、バンド５として１％未満の高分子量ポリマー、バンド２．３及び４として７０乃至８０％のオリゴマー、そしてバンド１として２０乃至３０このプロフィールはグルタルアルデヒドポリマー化ヘモグロビンのそれとは対照的である。図２を参照のこと。グルタルアルデヒドポリマー化ヘモグロビンのサイズ排除クロマトグラフィーは、ノ＼ンドＥとして約ｌＯ％の高分子量ポリマーを、ハンドＣ及びＤとして約６０から７０％の間のオリゴマーを、ハンドＢとして約１０％の２量体を、そしてハンドＡとして約１０％の七ツマ− を示している更に、我々は、ポリマー化を停止させると同時に生成物がその最も有用な酸化状態にあることを保証する試薬を確認した。すなわち、我々は、停止剤であるし一システィン、Ｎ−アセチル−し−システィン又はこれらのアミノ酸とエタノールアミンとの組合せが、最終生成物の混合物中に存在し得る全てのメトヘモグロビン（鉄が＋３の酸化状態にある）を修飾されたヘモグロビン（鉄が＋２の酸化状態にある）へと変換することを見いだした。この変換は極めて重要である。なぜならば、メトヘモグロビンは酸素を運搬も放出もしないからである。上記の試薬のいかなる組合せも使用できるが、停止剤としてＮ−アセチル−し −システィンを使用したときには望ましからざる副反応がおこらないことは、このアミノ酸を最も使用に適したものとしている。

ポリマー化修飾されたヘモグロビンに基づく七ツマ−及びヘモグロビンに基づくオリゴマーよりなるヘモグロビンに基づくモノマー及びポリマーの混合物は、機器、器官及び組織に、正常な酸素分圧、すなわち３７°Ｃにおいて少なくとも２８Ｉ１ｍＨｇのＰ、。がこれらの環境に維持されるように、酸素を運搬し放出する。該混合物は無パイロージエンであり・且つ細菌及び／又はウィルス汚染がない。該混合物は安全で無毒である。それはまた、血液及び血清と混和する。該混合物は血液に匹敵する粘度、コロイド性及び浸透圧特性を有する。該混合物は、哺乳類の脈管系において少なくとも１３時間の半減期で保持され、少なくとも赤血球中のヘモグロビンと等価なＰｓｏを有することが知られている。更に、該混合物は赤血球造血を妨害しないことが見いだされている。

Ｉ　Ｄｅｎａｃｏｌ　ＥＸ−８６＞に　ＱｏにおＣるジアスビマン加　ヘモグロビンのボＴマー１０ｍＬのジアスピリン架橋ヘモグロビン（乳酸リンゲル溶液中２４．３　ｇ／ｄ　Ｌ）のＰＨを、０．３ｍＬの１Ｍ炭酸ナトリウムを加えることによって９．０　（５°Ｃ）に調整した。ｌｓ液は連続的吸引／窒素サイクルによって２５° Ｃにて１時間脱酸素化した。Ｄｅｎａｃｏｌ　（登録商標）　ＥＸ−８６１の水溶液を添加し、そして反応混合液を２５°Ｃにて窒素下に攪拌した。反応は、− 列に連結したＴＳＫＧｅｌ　（登録商標）Ｇ４０００Ｓ−及び丁５ＫＧｅｌ　（登録商標）　Ｇ３０００Ｓｗカラム及び、１ｍＬ／分で送り出される５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）／イソプロパツールの９　：　１　（Ｖ／Ｖ）の比率よりなる移動相を用いて、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってモニターした。実験データは次の表１に要約されている。

表１ポリマー化試薬によるジアスピリン架橋ヘモグロビンのポリマー化ポリマー化試薬：　ＳＥＣヘモグロビン　時間　プロフィール１％・、モル　Ｈｒ、　３４　５５５１　２５／１　２３．５　４６　１７　３７　０”　ＳＣＥ保持体積はバンドｌが１７−１８ｍＬ、ハンド２が１５−１６ｍＬ、ハンド３／４が１２−１４ｍＬ、そしてハンド５が１０ｍＬであった。このＨＰＬＣ条件下では、ジアスピリン架橋ヘモグロビンの保持体積は約２１ｍＬであった。ハンド１の減少した保持体積は、ジアスピリン架橋ヘモグロビンがポリマー化試薬によって広く修飾されていることを示している。

２　゛′ボ１マー　＝　′に　る　°Ｃ−“Ｃにゝ゛しるンアスピリン加　ヘモグロビンのボ１７− Ｄｅｎａｃｏｌ　（登録商標）　ＥＸ−８３０，６Ｘ−８４１及びＥＸ−８６１によるジアスピリン架橋ヘモグロビンのポリマー化は次の条件下にて達成した。

１０ｍＬのジアスピリン架橋ヘモグロビン（乳酸リンゲル溶液中２４゜３ｇ／ｄＬ）のｐＨを、０．３ｍＬの１Ｍ炭酸ナトリウムを加えることによって９．０　（５°Ｃ）に調整した。溶液は連続的吸引／窒素サイクルによって２５°Ｃにて１時間脱酸素化した。Ｄｅｎａｃｏｌ　（登録商標）の水溶液を添加し、そして反応混合液を２５°Ｃ又は５°Ｃにて窒素下に攪拌した。反応は、−列に連結したＴＳＫＧｅｌ　（登録商標）Ｇ４ｏｏｏｓｔｖ及びＴＳＫＧｅｌ　（登録商標）　Ｇ３０００５Ｗカラム及び、１ｍＬ／分で送り出される５０ｍＭリン酸緩衝！（ｐＨ６，５）／イソプロパツールの９　：　１　（Ｖ／Ｖ）の比率よりなる移動相を用いて、サイズ排除クロマトグラフィーによってモニターした。５°Ｃにおいては、ポリマー化試薬／ヘモグロビンのモル比ば４０：１乃至６０・１の範囲とし、反応は４又は５日後に停止させた。一方、２５°Ｃにおいては、対応するモル比は１５・１乃至２５：１の範囲とし、反応時間は１日又はそれ未満とした。実験データを表２に要約する。これらの誘導体の約Ｌｏｇ／ｄＬの溶液の粘度は１．９乃至２．５センチストークスであり、酸素結合曲線は全て自然のヘモグロビンに比して右方変位していた。

表２長鎖ポリマー化試薬による２５°Ｃにおけるジアスピリン架橋ヘモグロビンのポリマー化ポリマー化試薬：　ＳＥＣプロフィール°％ヘモグロビン　時間　ハンド１ＩＤｅｎａｃｏｌＴ″ｆ　モル　Ｈｒ。

５３８　２Ｘ−８３０１５／１　２２　３５　１７　４５　２５３９　ＥＸ−８３０２５／１　１９　３３　１６　４６　４５４２　ＥＸ−８４１１５／１　２１　４１　１８　４０　０５４３　ＥＸ−８４１２５／１　１９　４１　１８　４０　０５５０　ＥＸ−８６１１５／１　２４　５１　１７　３２　０Ｅχ−６／１　２３．　４６１７　３７　０”　ＳＣＥ保持体積はハンドｌが１７　１８ｍＬ、ハンド２が１５−１６ｍＬ、ハンド３／４が１２−１４ｍＬ、そしてバンド５が１０ｍＬであった。このＨＰＬＣ条件下では、ジアスピリン架橋ヘモグロビンの保持体積は約２１ｍＬであった。バンド１の減少した保持体積は、ジアスピリン架橋ヘモグロビンがＤｅｎａｃｏｌ　（登録商標）によって広く修飾されていることを示している。

３　″ポリマー　Ｗこよる　°Ｃ５こゝ゛しるジアスビ１ンヘモグロビンのポ１マーＤｅｎａｃｏｌ　（登録商標）（長鎖）によるジアスピリン架橋ヘモグロビンのポリマー化はまた５°Ｃ４二おいても検討された。予期したように、ポリマー化はより緩徐に進行し、２５°Ｃでの反応によって得られるものとは幾分具なったクロマトグラフィープロフィールを与えた。実験データ（表３）は、５　’Ｃでの反応が生成物混合物中における高分子量ポリマーのパーセントを最小にすることを示している。４乃至５日後、ハンドｌの保持体積はジアスピリン架橋ヘモグロビンに特徴的な通常の２０ｍＬから、通常２量体に対応する（ハンド２）１６５乃至１７．２ｍＬへと変位し、一方、ハンド２の保持体積は通常２量体で見られる１７．５ｍＬから３量体に特徴的な１５．４乃至１６．０ｍＬの範囲へと変位した。

５°Ｃにおいては、メトヘモグロビンへの酸化が一層少ないことが認められた。

２５°Ｃでのポリマー化によって得られる生成物のように、これらの材料の約Ｌｏｇ／ｄＬの溶液は１．５乃至２．２センチストークスの範囲の粘度を有していた。２５°Ｃでの反応によって得られる生成物混合物とは対照的に、これらの材料の酸素結合曲線は左方へ変位し、自然のヘモグロビンの酸素結合曲線とは協調性が低かった。

表３長鎖ポリマー化試薬による５°Ｃにおけるジアスピリン架橋ヘモグロビンのポリマー化ポリマー化試薬／　ＳＥＣヘモグロビン　時間　プロフィール１％゛　モル　３／４５Ｄｅｎａｃｏｌ　７Ｍ５３６Ｅχ−８３０４０／１　４　４０　１９　４１．　０Ｄｅｎａｃｏｌ　” ５４０　ＥＸ−８４１４０／ｌ　４　４７　２３　３０　０Ｄｅｎａｃｏｌｌ　 ” ５５２　ＥＸ−８６１４０／１　５　４５　１９　３６　０の六ポリマー化ヘモグロビンの合成に間する１つの重大な問題は、ヘモグロビンのメトヘモグロビン（これは酸素を運搬も放出もしない）への酸化である。例えば、２５°Ｃでのポリマー化の間にメトヘモグロビンの比率は３．３％から１７％まで増大する。これに対処するため、我々は、ポリマー化を停止すると同時にメトヘモグロビンをヘモグロビンへと還元する試薬として、エタノールアミン及び／又はＮ−アセチル−Ｌ−システィンを評価した。実験は次の通りに実施した。ジアスピリン架橋ヘモグロビン（１９ｇ／ｄ　Ｌ）　ヲ脱ｍ素化し、Ｄｅｎａｃｏ　ｌ　（登録商標）　ＥＸ−８６１で２５°Ｃにて炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，０）中にてポリマー化した。Ｄｅｎａｃｏｌ（登録商標）とジアスピリン架橋ヘモグロビンのモル比は２０：１とした。２４時間後、脱酸素化した２Ｍの塩酸エタノールアミン溶液（ｐＨ９，０）又は２ＭのＮ−アセチル−Ｌ−システィン（ｐＨ９，０）を加えた。反応混合物を５°Ｃで有気又は無気条件下に終夜（１５時間）撹拌した。翌日、生成物のサイズ排除クロマトグラフィープロフィール及びメトヘモグロビンパーセントを測定した。

有気条件下ではポリマー化試薬に対しモル比３：１乃至６：１の範囲のエタノールアミンの添加は殆どポリマー化を停止させることが見いだされが、メトヘモグロビンの還元は起こらなかった。これとは対照的に、有気条件下でのＮ−アセチル−Ｌ−システィンの同しモル比範囲の添加は、ポリマー化を停止し更に生成物中のメトヘモグロビンのパーセントを減少もした。無気条件下でのＮ−アセチル −Ｌ−システィン（ＮＡＣ）の添加の効果は、表４に示すように一層著しい。ポリマー化試薬に対する停止剤のモル比としては、３：１乃至４：１が反応を停止させ且つメトヘモグロビンを２４％をこえる値から以上から１０％未満へと減少させるのに充分である。

表４停止剤の効果１モル比　メトヘモグロビン　ＳＥＣプロフィール、％ＮＡＣＤｅｎａｃｏｌ”　ｗ　’ ０／１　０　２５．１　４７　１４　３４　５０／１　１５　２３．６　２９　１１　２９　３１３／１　１５　７．５　３６　１４　４２　６４／１　１５　７．７　３４　１６　４３　６５／１　１５　１２．５　３５　１５　４３　６６１　１５　８．８　３４　１５　４４　６′″無気条件ゝＳＥＣ保持体積は、ジアスピリン架橋ヘモグロビン（２０−２１ｍＬ；全生成物混合物に存在せず）；バンドｌ（置換されたジアスピリン架橋へモグロビンモノマー）、約１８ｍＬ　；ハンド２　（ｉｌｆ換すれたジアスピリン架橋ヘモグロビン２量体）、約１６ｍＬＨハンド３／４（置換されたジアスピリン架橋ヘモグロビンオリゴマー）、ｈ１２−１６ｍＬ）；及びハンド５（置換されたジアスピリン架橋ヘモグロビンの高分子量ポリマー）、１０ｍＬ。

５　ヘモグロビンに　づ＜ン０゛　のポリマーポリマー化したジアスピリン架橋ヘモグロビンの生物学的スクリーニングを行うため、ポリマー化したヘモグロビンを少量の及び大量の実験室規模で製造した。方法は該方法パラメーターの適正を確証するため、大量規模の反応に先立ち少量規模にて実施した。少量規模において、０．０３６Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，０）中の１０ｍＬのデオキシジアスピリン架橋ヘモグロビン（６，４％のメトヘモグロビンを含存し、濃度２０．１ｇ／ｄＬ）をＤｅｎａｃ。

ｌ　（登録商ｌ）　ＥＸ−８６１の水溶液で処理した（ヘモグロビンに対するポリマー化剤のモル比は１５：１）。反応混合物は２５°Ｃで窒素下に２４時間攪拌した。この間にメトヘモグロビンのパーセントは１７．４％に増大した。反応混合液を５°Ｃまで冷却し、２ＭのＮＡＣ溶液（ｐＨ８１９５）を加えた（ポリマー化剤に対する停止剤の比は４：１）。得られた溶液を５°Ｃにて窒素下に終夜攪拌した。メトヘモグロビンの比率は９．７％に減少した。反応混合物を乳酸リンゲル溶液で１５０ｍＬに希釈し１００００ダルトンＭＷＣＯ中空繊維カートリッジを通して透析濾過して体積を１００ｍＬに減少させた。希釈／ＩＩ！縮プロセスを３Ｌの濾液が収集されるまで反復した。

溶液は４５ｍＬの体積まで濃縮された。得られた生成物を表５に示すように分析的に特徴づけた。

表５ポリマー化生成物の分析プロフィールグＨ３、ｇ／ｄ　Ｌ”　１０．６％メトヘモグロビン’　１０．０ＳＥＣプロフイールゝ　ハンド１　５０％バンド２　１６％ハンド３／４　３４％ハンド５　０％３７°Ｃでの粘度２．１センチスト一クスＰｓＯ７７ｓＩＩＨｇヒル　１．３１分光光度法による。

ｂＳＥＣバンドの説明については表４を参照。

Ｃ３酸素親和性は、酸素を使用し３７℃にてＨｅｍｏｘｌｌ衝液中でＨｅｍｏｘ分析器によって測定した。

６　ヘモグロビンに　づ　′六′のポリマー化剤は無菌的条件下にて大量の実験室規模で繰り返した。処理システムには、予め較正した酸素（Ｉｎｇｏｌｄポーラログラフイー酸素電極Ｌ　ｐＨ及び温度の各センサーを備えたＡｐｐｌｉｋｏｎ　（３−Ｌ用）ジャケット付醗酵器を導入した。１−Ｌ単位のジアスピリン架橋ヘモグロビンの９単位を解凍し、合わせそして約３Ｌに濃縮した。得られたジアスピリン架橋ヘモグロビンは３０．１ｇ／ｄＬの濃度であった。この溶液の１．ＩＬを醗酵耳中に移し、０．０５Ｍ炭酸ナトリウムの添加によってｐＨを９．０　（５°Ｃ）に調整した。体積を１．４Ｌとするために水を添加した。得られた溶液を２５°Ｃにて脱酸素化した。

脱酸素化の程度は、脱酸素化の過程で無気的に採取したサンプルのＣｏ−ｏｘｉｍｅｔｅｒ分析によってモニターした。オキシジアスピリン架橋ヘモグロビン濃度４．８％という値が達成され、これはＰ。２のＯ，１０３ｐｐｒｎ酸素の読みに相当した。次いでＤｅｎａｃｏｌ（登録商標）Ｅχ−８６１（ポリマー化試薬のヘモグロビンに対する比率は１５：１）の水溶液を加え、反応を終夜撹拌した。サイズ排除クロマトグラフィーでのモニターが適当な程度のポリマー化が達成されたことを示したときに、反応混合物を１３゛Ｃにまで冷却し、ｐＨ９，０の２ＭのＮ−アセチル−し−システィン溶液（停止剤のポリマー化剤に対する比率は４：］）を添加した。反応を５°Ｃにて終夜撹拌した。濾過及び乳酸リンゲルに対して透析濾過して、生成物を得た。生成物の分析プロフィールを表６に示す。

表６ボ１７−　のゝ　プロフィールＧＰＣプロフィール５　ハンド１　５２％ハンド２　１１％ハンド３／４　３３％ハンド５　３％３７°Ｃでのｐ　Ｈ７，２３Ｐ、。ζ　６ｉ８．５　ｍｒｇＨｇ浸透圧　４６．２　＋ｕ＋Ｈｇ無菌性　無菌パイロ−ジエン　＜０．１２５　Ｅｌｆ／ｍＬ・１　５゛・当た　１６　ｍＬ１分光光度法による。

ｈＳＥＣハンドの説明については表４を参照。

Ｃ０酸素親和性は、酸素を使用し３７°ＣにてＨｅｍｏｘ緩衝液中でＨｅｍｏｘ分析器によって測定しだ。

ポリエーテルオキシランポリマー化生成物は補体活性化や白血球凝集を起こさないことが確認された。特に、マウスにこの化生下−化生成物を投与しても補体活性化の増大は何ら観察されなかった。

同様に、白血球カウントは、このポリマー化生成物の投与しても実質的に変化しなかった。好気的及び嫌気的培養によって微生物の存在しないことが確認された。同様に、ポリエーテルオキシランポリマー化生成物は血液と同様の挙動を示した。このポリマー化生成物の投与を受けても被検動物の血圧が低下しなかったことから、コロイド及び浸透圧特性が確立された。実施例８を参照。ポリマー化生成物はまた、もし血液サンプルを吸引しても２つの異なる層が観察されないことから、血液と混和性であることも観察された。更に、このポリマー化生成物が赤血球造血を妨害しないことが観察されたことに注意すべきである。

７　′　′　菫のもポリエーテルオキシランポリマー化ヘモグロビンを雄性のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｉ＋Ｉｅｙう、トで評価した。動物の血液量の２０％に相当する混合物をＱｕＪｃｋＣａｔｈ　（登録商標）によって尾静脈にポーラス（ｂｏｌｕｓ）？Ｉ射投与した。０．２５乃至９２時間にわたるサンプリング時に、血液を内在の頚動脈カテーテル又は尾静脈より採取した。４１４ｎｍにおける血漿サンプルの吸収から半減期を測定した。平均半減期は１３．２時間であった。

血漿サンプル中の混合物のモノマー、２回体、及びポリマー体はサイズ排除クロマトグラフィーによって分離した。４１４　ｎｍＱこおける血漿の全唆収に対する各々の成分の寄与は、クロマトグラムのピークの面積％から算出し、これらのデータより半減期を決定した。２回体及びより大きい成分の半減期は１５時間であり、モノマーは存意に短い半′ｆｔ期（８時間）を存した。

８　２のポリエーテルオキシランポリマー化ジアスピリン架橋ヘモグロビン溶液のトップロード（ｔｏｐｌｏａｄ）注入が腎機能に及ぼす効果を、ポリエーテルオキシランポリマー化ジアスピリン架橋ヘモグロビン溶液と同様になるよう調整した浸透圧を有するアルブミンの乳酸リンゲル溶液である対照溶液の効果と比較した。腎機能は雄性Ｓｐｒａｇｕｅｐａｗｌｅｙう、トにて腎血流量、糸球体濾過速度及び主な溶質の排泄速度の測定によって評価した。試験品は、実施例６によりポリマー化しそして乳酸リンゲル溶液で希釈したヘモグロビンの約１０　ｇ／ｄＬを含有する溶液とした。対照品はヒト血清アルブミンを、１０ｇ／ｄＬのポリマー化ヘモグロビン溶液と同様のコロイド浸透圧となる濃度に含有する乳酸リンゲル溶液とした。要約すると、実験データは、ポリマー化ヘモグロビンに基づく溶液の注入後に腎機能が維持されていることを示している。

これらの実験において各ラットは腹腔注射により麻酔し、カテーテルを、注入のために両頭静脈に、血液サンプルを採取し且つ平均動脈血圧（■ＡＰ）をモニターするために頚動脈に、そして尿サンプルを集めるために膀胱にそれぞれ埋め込んだ。呼吸を容易にするために気管婁孔形成を実施した。体温は実験中をモニターし続けそして約３７乃至３８゛Ｃに維持した。カテーテルを置いた後、腎機能を安定化させ且つ体液の外科的損失分に置き換えるため、各動物は最初の１時間食塩水の注入を受けた。各０．５μＣｉの１２５ｉ−イオタラメート（ｉｏ　ｔｈａ　ｌａｍａ　ｔｅ）及び＋１１７−ヒノブラン（ｈｌｐｐｕｒａｎ＞を含有する食塩水のポーラス（ｂｏｌｕｓ）を最初に注入し、続いて約０．５μＣｉ／ｍＬの１２５Ｉ−イオタラメート及び＋３１　■−ヒップランを含有する正常の食塩ｊ容液を徐々に注入した。３０分間隔で６回の連続的尿サンプルを集めた。

第１．３及び５回目の尿サンプルの中間点及び実験の終了後に血液サンプルを得た（表７）。ラットには、第２回目の尿採取の最初の部分の間に、３０　ｍ　Ｌ　／　ｋ　ｇのポリマー化ヘモグロビン溶液又はアルブミン溶液を注入した。表７を参照。

表７−サンプル採取期間の時間列時間（分）　Ｏ１５３０４５６０７５９０１０５１，２０１３５１５０１６５１８０１９５尿サンプル採取　１２３４５６血液サンプル採取　１　２３　３　４被検品注入　１尿流速は、各期間の間に排泄された尿の体積を測定し、分で表した収集の時間で割ることによって決定した。動脈血サンプルは無気的に採取してｐＯ□、ｐＣＯ □、ｐＨ，ＨＣＯ，−及びヘマトクリットを分析した。尿及び血漿サンプルはまた、放射性アイソトープカウントについても分析した（＋！ＳＩ−イオタラメート及び１３１１−ヒップラン）。　″′■−イオタラメートのカウントは＋３１１−ヒップランのカウントによって較正した。

糸球体濾過速度は、濾過されるが再吸収、分泌又は腎臓での代謝を受けない溶質である　１２５Ｉ−イオタラメートのクリアランスを測定することにより決定した。有効腎血電流量、すなわち腎小管に直接接触している全腎血漿流量の一部は、濾過され且つ分泌されるが腎によって再吸収又は代謝されることのない１３１１−ヒップランのクリアランスを測定することにより決定した。

クリアランス実験の完了後、麻酔状態のままの動物を放血し、完全なネクロプシーを実施した。心臓、肺、肝臓及び両方の腎臓のサンプルを採取して組織病理学的に評価した。

表８は、ポリマー化ヘモグロビン溶液とアルブミンｙｔ’Ｂｉとの腎機能に対する影響を比較したものである。表中の全ての結果は、５又は６匹のラットの平均値：　ＳＥｌ’ｌとして示しである。ポリマー化ヘモグロビンｆ４液は、アルブミン対照７容液との比較において、中等度の利尿すなわち尿流速の増大と（図３及び表８）そしてナトｉＪウム（図４及び表８）及びリン（表８〕の排泄率の小さい増大を誘導した。この利尿作用はおそろく注入？８ｅの体積シこ関係するものであろう８　に・　るボ１マー　ヘモグロビンイ穴　び１ンールノ９　の≦“ を日　ｌ尿流速（μＬ）分）乳酸１１ンゲル　１９±６　６３±２６　１３７±４３ＤＰＤＣＬＨｂ　２８土１２　２６９±５６　２５１±４８、”’　ｍＬ乳酸リンク＋Ｌ　２．１８±０．２２　’　２．１７±０．３８　２．３１±０．１７ＤＰＤＣＬＨｂ　１．７±０．１６　２．５４±０．２４　２．１５±０．４７′″　將　（ｌｌｌＬ）乳酸１ルケル　６，２２±０．５３　５．６３±０．６０　５．３１±０．７０表」１℃続き）・菫Ｂ４尿流速（μＬ／分）乳酸１ルケル　１８３±２６　１２８土２５６９±３ＤＰＤＣＬＩ（ｂ　１４５ ±２３９２±１９４６±１３、゛　パｆｆ１Ｌ／）乳酸リンゲル　２．２５二０．０９　１．６６±０．２３　２．４７±０．１０ＤＰＤＣＬ）ｌｂ　１．８７±０．３４　１．６４±０．３２　２．０１±０．８３六　將　（ｍＬ　ゝ乳酸リンク；シ　５．０４±０．１６　３．５０±０．４８　５．５２±０．４６ＤＰＤＣＬＨｂ　４．６６±０．８３　４．０５＝０．７６　５．５１土１．１２ＤＰＤＣＬＨｂ：　Ｄｅｎａｃｏｌポリマー化ジアスピリン架橋ヘモグロビン表中の結果は、ポリエーテルオキシランポリマー化ヘモグロビン群の第６番目の期間（ｎ＝５である）を除いて６匹のラットの平均＝ＳＥ−で示されている。

ポリマー化ヘモグロビン溶液群の糸球体ａ過速度（図５及び表８）及びを効腎血漿流量（表８）は、アルブミングループに対して増大したが、その変化は腎機能を損なわないような機能的なものである。クレアチニンクリアランスは両群ともに変動した。

図６及び７は、ジアスピリン架橋ヘモグロビン及びグルタルアルデヒドポリマー化ノアスピリン架橋ヘモグロビンとに対するポリエーテルオキシランポリマー化ヘモグロビン溶液のトノブロード（ｔｏｐｌｏａｄ）注入の作用を比較巳たものである。尿流速に対するポリエーテルオキシランポリマー化ヘモグロビン？８液の作用は、ジアスピリン架橋ヘモグロビンによって誘導された大きな利尿とグルタルアルデヒドポリマー化ジアスピリン化架橋ヘモグロビンによって誘導される最小限の利尿との中間にあった（図６）が、一方、ポリマー化ヘモグロビン溶液によって誘導されたナトリウム利尿は他の２群に比して僅かに増加していた。

表９は溶質に対するポリマー化ヘモグロビン溶液の作用を示す。

血漿クレアチニンの増加はグルタルアルデヒドポリマー化ジアスピリン架橋ヘモグロビンの圧入後に観察されるのと同様であった。ナトリウム、カリウム及びリンのレベルは、ポリマー化ヘモグロビン溶液群において基準の期間の間に増加したが、アルブミン／８液対照群において観察されるように正常レベルへと減少した。

表９−溶質の血漿濃度に対するポリエーテルオキシランポリマー化ヘモグロビン溶液の作用罵　ｌ１ｄＬ）乳酸１ルケル　１４±１　１３±１　１１±１　１１１ＤＰＤＣＬＨｂ　１６± １　１３±１　１３±１　１３±ｌ將クレアチニン（ｍｄＬ）乳酸１ルケル　０．４＝０．ＯＯ，５±０．０　０．５±０．０　０．５±００ＤＰＤＣＬＨｂ　Ｏ，５＝０．０　０．７土０．０　０．７±０．０　０．６± ０．１皿Ｉ］ユ（ｂ几１μ 乳酸リンクＩ＆　７．９＝０．６　７．７二０．４　７．７±０．２　８．１± ０．２０ＰＤＣＬＩ（ｂ　８．２＝０．２　７．３±０．２　８．６±１．３　７．３±０．２將　鳶　（ｍｄＬ乳酸サンプル　４．７±０．２　５．’５±０．３　５．９±０．３　５．６± ０．３ＤＰＤＣＬＨｂ　４．８±０．１　７．６±０．４　７．４ｔ０．４　７．２±０．２將　ト１ウム（ＩＩＩＥ／Ｌ）乳酸リンケル　１４ＥＩ：Ｉ　１４９±１　１５０±１　１４８±ＩＤＰＤＣＬ）ｌｂ　１５０二１１４５±１１４３±１１４３±２將力Ｔウム（ＩＩＥＬ）乳酸リンケル　４．０±０．１　３．８±０．１　３．６＝０．１　３．８±０．２ＤＰＤＣＬＨｂ　４．５±０．１　３．６±０．１　４．１土０．４　３．７±０．２表中の結果はＤＰＤＣＬＨｂ群の第６番目の期間（ｎ；５である）を除いて６匹のラットの平均±ＳＥＭで示す。

ポリエーテルオキシランポリマー化ヘモグロビン溶液における血漿総タンパク質の増加は、ヘモグロビン生成物の注入及び保持を反映している（明るい赤色の尿の色がないことより判断した）。

表ＩＯは血液ガス、ＭＡＰ及びヘマトクリットを示す。

表１０−血液ガス値、ＭＡＰ及びヘマトクリットに対するポリマー化ヘモグロビン溶液の作用血ＪｂＬ比乳酸リンケル　７．３１±０．０６　７．４６±０．０３　７．４６±０．０３　７．４５±０．０４ＤＰＤＣＬ）ｌｂ　７．３１±０．０４　７．４４±０．０２　７．４５±０．０２　７．４６±００３血ｊｊユＬ墾。

乳酸１ルゲル　５３．０±７．１　４５．８±４．６　４３．５土４．２　４１．４：！：３．８ＤＰＤＣＬＨｂ　５５．９＋６．８　５１．３±５．１　５２．３±６．５　５０．０±６．３血濃」ゴ不す一道牡乳酸リンケル　２６，１±０．７　２６．１±０．５　２５．６±］、、１　２４．７±１．２ＤＰＤＣＬＨｂ　２７．５±１．１　２８．６：２．２　２３．４±５．５　２９．０−２．２ヘマ　りｉ・　０乳酸リンクル　４０，２±１．０　２７．９±１．０　３１．７±０．８　３２．２：：０．７ＤＰＤＣＬｌｌｂ　３８．８±１．０　３２．３±０．９　２８．０±３．２　３２．６±０．７ｙ３ユニｂ！ｕ）乳酸リンク（１９９±１０　８２±５　９６±８　９２土６ＤＰＤＣＬ）Ｉｂ　１０９土９１１９±１３　１１１±１１　１−：１．１表中の結果はＤＰＤＣＬＨｂ群の第６番目の期間（ｎ−５である）を除いて６匹のラットの平均±ＳＥＭで示す。

被検及び対照品の注入の間、ヘマトクリットは減少し、次いで圧入の終了に続いて　準しヘルヘ向かって増大する傾向があった。両群のラットは基１！期間の間は最初僅かにアシド−シスを呈したが、その後のＭｒＢＩには血液ｐＨは正常値に戻った。腎臓、肝臓、肺及び心臓の［織は組織病理学的に評価した。腎組織における＆［ｌ織柄理学所見は何ら検出可能な機能障害に結びつくものでなかった。

本発明は一定の特有な具体例との関連で示されたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、要求に適するように各段階の形態及び配列に種々の変更を加えることができることは、当業者に自明であろう。

Ｆｉｇ、　３ Δポリエーテルオキ／ラン＝乳酸゛Ｊ　ンケ゛Ｊ′　、、、−イヒヘえ、つｌｌ−７Ｆｉ、　４＝乳酸リンゲル　Δポリマー化ヘモク゛ロヒ゛ンＦｉｇ、　５：乳酸リンゲル　Δポリマー化ヘモク゛ロヒ゛ンＦｉｇ、　６：ノアスピリン架橋　Δポリマー化　Ｏグルタルアルデヒド。

ヘモグロビン　へモグロビン　ポリマー化へモグロビンＦｉｇ、　７期間要約書３員へテロ環、すなわちポリエーテルオキソランの存在下にヘモグロビンに基づく組成物のポリマー化によって製造されるヘモグロビンに基づく修飾された七ツマ−及びオリゴマーの非免疫原性の混合物。該修飾されたヘモグロビン組成物は、ヒト赤血球中のヘモグロビンのＰ、。に少なくとも等しいＰ、。を有する。

国際調査報告１７１．〜＋、＋＋＋＋ｌ　Ａ＋□ｋｉ１１゜□。ＰＣＴ／ＵＳ　９１１０５７９９国際調査報告Ｔ’：：−；：＝；；−ニジ〒；＝、’：二：；コに；ｔ’ｓ’　ニー＝”−’ ｓ””ｏ”＝；””：　ｍ　ｄｌｍ　ｌ”−−°コ［１：；■窒盾V！シ１ｒ” −“ｌ　ｍ−ｒｅ＋ｗａｉ−ｅ＠−ｎ−−嗜１Ｐｓ−書−ｅｍｅ＊ＩＩＩｓｗＭＹＩｌｅｕｍｋｒｔ＊ｔｌ）ｌ＠＋’ｌｌｅｗｌ＠ｒｓｗｈｌｄＭｆｆ＋＋ｗ＋ ’＋|マ―ｈ喝嗜−「惟・−−１−〇零・−ｍａｒ＋ｍｌ−曝

Claims

【特許請求の範囲】

１．ヘモグロビンオリゴマーよりなり、少なくともヒト赤血球中のヘモグロビンのＰ５０に等しいＰ５０を有し、且つ実質的に非免疫原性であることを特徴とする、ヘモグロビンに基づく組成物。
２．前記オリゴマーが水溶性であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
３．前記オリゴマーが２乃至１０個のヘモグロビンに基づくモノマーよりなることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
４．前記ヘモグロビンがα−αジアスピリン架橋ヘモグロビンであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
５．前記オリゴマーが、ポリマー化試薬によって修飾されそして更に前記オリゴマーを形成するよう該ポリマー化試薬によってポリマー化されたものであるヘモグロビンに基づくモノマーのオリゴマーであり、ここに該モノマーの各々が４個のグロビン鎖よりなることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
６．ヘモグロビンに基づく組成物であって、（ａ）ポリマー化試薬によって修飾されているがいまだポリマー化していないヘモグロビンに基づくモノマーと、（ｂ）前記モノマーのオリゴマーとからなり、（ｃ）前記組成物が少なくともヒト赤血球中のヘモグロビンのＰ５０に等しいＰ５０を有し、そして（ｄ）前記モノマーの各々が４個のグロビン鎖よりなることを特徴とする組成物。
７．前記オリゴマーが水溶性であることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
８．実質的に非免疫原性であることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
９．前記ポリマー化試薬がオキシラン化合物であることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
１０．ポリマー化試薬によって修飾された前記モノマー及び前記オリゴマーが、前記ポリマー化試薬を介して該モノマー及びオリゴマーに共有結合で結合したスルフヒドリル基を含み、前記ポリマー化試薬がオキシラン化合物であることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
１１．前記スルフヒドリル基がＮ−アセチル−Ｌ−システインであることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
１２．前記オリゴマーが、ポリマー化試薬によって修飾されそして更に前記オリゴマーを形成するよう該ポリマー化試薬によってポリマー化されたヘモグロビンに基づくモノマーの２乃至１０個より形成されるものである、請求項６に記載の組成物。
１３．前記モノマーがα−αジアスピリン架橋ヘモグロビンであることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
１４．ポリマー化試薬によって修飾されているがまだポリマー化していない前記ヘモグロビンに基づくモノマーが前記組成物の５０％未満を構成し、そして前記オリゴマーが前記組成物の少なくとも２０％を構成することを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
１５．前記ポリマー化試薬が水溶性であり且つ２個又はより多くの３員ヘテロ環を有する活性部分を有することを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
１６．ヘモグロビンに基づく組成物であって、（ａ）ポリマー化試薬によって修飾されているがまだポリマー化していないヘモグロビンに基づくモノマーと、（ｂ）前記ヘモグロビンに基づくモノマーのオリゴマーと、（ｃ）修飾されていないヘモグロビンに基づくモノマーと、そして（ｄ）前記修飾されたヘモグロビンに基づくモノマーの高分子量ポリマーとからなり、（ｅ）前記組成物が少なくともヒト赤血球中のヘモグロビンのＰ５０に等しいＰ５０を有し、そして（ｆ）前記モノマーの各々が４個のグロビン鎖よりなることを特徴とする組成物。
１７．前記オリゴマーが水溶性である、請求項１６に記載の組成物。
１８．前記オリゴマーが、ポリマー化試薬によって修飾されそして更に前記オリゴマーを形成するよう該ポリマー化試薬によってポリマー化されたヘモグロビンに基づくモノマーの２乃至１０個よりなるものであることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
１９．ポリマー化試薬によって修飾されているがまだポリマー化していない前記ヘモグロビンに基づくモノマーか前記組成物の５０％未満を構成し、前記オリゴマーか前記組成物の少なくとも２０％を構成し、そして前記高分子量ポリマーが前記組成物の約５％未満を構成することを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
２０．停止剤がＮ−アセチル−Ｌ−システインであることを特徴とする、請求項１８に記載の組成物。
２１．前記修飾されていないモノマー及び前記修飾されたモノマーがα−αジアスピリン架橋ヘモグロビンであることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
２２．実質的に非免疫原性である請求項１６に記載の組成物。
２３．請求項１に記載の修飾されたヘモグロビンに基づく組成物を製造する方法であって、（ａ）十分量の水溶性３員ヘテロ環の存在下にヘモグロビンに基づモノマーをポリマー化し、そして（ｂ）前記ポリマー化を停止させるために十分量の停止剤を加えることよりなる工程よりなる方法。
２４．該停止剤がＮ−アセチル−Ｌ−システインであることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
２５．請求項６に記載の修飾されたヘモグロビンに基づく組成物を製造する方法であって、（ａ）十分量の水溶性３員ヘテロ環の存在下にヘモグロビンに基づモノマーをポリマー化し、そして（ｂ）前記ポリマー化を停止させるために十分量の停止剤を加えることよりなる工程よりなる方法。
２６．前記ポリマー化修飾ヘモグロビンに基づくモノマーが前記混合物の約５０％未満を構成し、前記オリゴマーが少なくとも前記混合物の２０％を構成することを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
２７．該停止剤がＮ−アセチル−Ｌ−システインであることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
２８．請求項１６に記載の修飾されたヘモグロビンに基づく組成物を製造する方法であって、（ａ）十分量の水溶性３員ヘテロ環の存在下にヘモグロビンに基づモノマーをポリマー化し、そして（ｂ）前記ポリマー化を停止させるために十分量の停止剤を加える工程よりなる方法。
２９．前記ポリマー化修飾ヘモグロビンに基づくモノマーが前記混合物の約５０％未満を構成し、前記オリゴマーが前記混合物の少なくとも２０％を構成し、前記高分子量ポリマーが前記混合物の約５％未満を構成することを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
３０．該停止剤がＮ−アセチル−Ｌ−システインであることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
３１．ポリマー化試薬によって修飾されているがまだポリマー化しておらずそして各モノマーが４個の架橋された鎖よりなるものであるヘモグロビンに基づくモノマーよりなるヘモグロビンに基づく組成物。
３２．該モノマーがα−αジアスピリン架橋ヘモグロビンであることを特徴とする、請求項３１に記載の組成物。