CN114303461B - 用于红细胞代用品的edc交联血红蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种采用EDC交联血红蛋白制备红细胞代用品的方法，本发明是按EDC与血红蛋白5～200∶1的比例，将EDC加入血红蛋白溶液，直接进行聚合反应；在反应中加有抗氧化剂，反应结束时加入终止剂；再用超滤/凝胶过滤方法截去100kDa以下的血红蛋白；用格林氏液作为抗衡液换液，得到聚合血红蛋白溶液。与现有技术相比，本发明聚合血红蛋白的P₅₀在10mmHg以下，氧亲和力高，聚合血红蛋白溶液粘度小，浓度在70～140mg/ml；所获得血红蛋白聚合物的分子量有90％以上分布在64～1500kDa，分子量64kDa的小于15％，分子量128～1500kDa的占75～85％，因此造成临床高血压的风险要小；解决了现有技术中制备复杂、聚合血红蛋白氧亲和力较低、粘度较大、血红蛋白浓度低的技术问题。

Description

用于红细胞代用品的EDC交联血红蛋白的制备方法

技术领域

本发明属于血液代用品制备方法的改进，具体涉及以血红蛋白为基质的红细胞代用品的化学修饰方法。

背景技术

血液对于临床手术、抗灾、恐怖袭击和战时救护都是非常重要的医疗手段。目前主要是靠人们献血来满足上述需求，由于人类血型复杂，输血时须进行配型，并且储存期短，运输不便，来源有限，另外人血还存在艾滋病、乙肝等病毒相互传染的危险。近些年来，血液的需求量不断增高，靠人类自身献血很难满足日益增长的需求，因此开发安全而有效的血液代用品对于缓解上述问题有着重要的意义。

无基质血红蛋白(stroma-free hemoglobin，SFH)具有携氧释氧的能力，一直以来被作为氧载体制剂进行研究代替红细胞的功能，具有潜在的临床应用价值，由血红蛋白开发的代替红细胞功能的制剂被称为血红蛋白类氧载体(Hemoglobin-based oxygen carriers，HBOCs)，其具有能够被消毒、容易储存、无需交叉配型等特点，特别适合于突发事件中的使用。

但是将无基质血红蛋白直接输入人体存在以下两个问题：一是会产生很强的毒性，主要表现为血尿、血压升高、腹痛、肾衰竭甚至死亡。其毒性主要是四聚体血红蛋白(64kDa)分子在溶液中易解离成为小分子量的二聚体(32kDa)，这些小分子易从血管内皮细胞间隙渗出，引起上述的毒副反应。二是无基质血红蛋白在体内的滞留时间非常短，其半衰期1-4h，不能达到临床的要求，原因在于血红蛋白是由四个亚基组成的蛋白，分子量为64kDa。四个亚基分别由两对αβ亚基组成，主要由离子键、疏水作用力和范德华力而不是共价键将其作用在一起。在低浓度溶液中容易解离成二聚体αβ亚基，甚至可以解离为α和β亚基。αβ亚基的分子量为32kDa，不能被肾小球截留，通过尿液排出体外，主要是分子量太小。

因此人们在设计HBOCs分子时，主要通过稳定血红蛋白四聚体并增加分子量或是分子半径的手段来克服天然血红蛋白的缺陷。

稳定血红蛋白四聚体的试剂中，常用的是多醛基分子，如戊二醛。血红蛋白约有40个氨基暴露在表面，多醛基分子可以与这些氨基反应，形成不均一聚合物分子，同时分子内也会被部分交联。如美国专利5,296,465描述了一种用戊二醛将血红蛋白进行分子内和分子间交联的方法，其平均分子量为250kDa，在体内有较长的滞留时间，其氧亲和力(用P₅₀表示)相对较低。

为了不被肾小球过滤掉，还可以给血红蛋白分子修饰上较大的聚合物分子，以增大分子半径。比如聚乙二醇、葡聚糖等。例如美国6,844,317 B2专利中描述用2-iminothiolane·HCl与血红蛋白的氨基进行反应从而给血红蛋白引入巯基，然后用活化的聚乙二醇与巯基反应，达到增大血红蛋白分子半径的目的。但是由于聚乙二醇的粘度较大，为了维持较低的粘度，需降低血红蛋白的浓度，导致其不能达到临床载氧的要求。

另一类试剂为双阿司匹林，是一种双脂结构，能将两个亚基进行分子内交联。例如美国专利4,600,531描述了一种用双阿司匹林特异性将血红蛋白分子内两个链进行交联，稳定了血红蛋白结构，其分子量为64kDa，氧亲和力与人红细胞相近；但在严重创伤性失血休克临床研究上死亡率较高。美国专利5，998，361使用bis(3，5-dibromosalicyl)sebacate(DecBDA)或者bis(3，5-dibromosalicyl)adipate(AdipBDA)先将血红蛋白进行分子内交联，再用离子交换色谱方法进行纯化，将分子内交联和未交联的血红蛋白分离，得到分子内交联的血红蛋白，再用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺[(1-ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl)carbodiimide，简称EDC]将分子间进行交联；此方法交联的聚合血红蛋白其P₅₀值在10mmHg以上；而且在将血红蛋白进行分子内交联的过程中需要加入纯化的步骤将分子内交联和未交联的血红蛋白进行分离，由于分子内交联和未交联的血红蛋白的性质比较相近，并且量非常大而难于纯化。

中国专利200310102023.5描述了一种用戊二醛聚合血红蛋白制备红细胞代用品的方法，其制备的聚合血红蛋白的氧亲和力P₅₀在15～40mmHg范围内，相对较低(高P₅₀)。虽然有理论认为，聚合血红蛋白的氧亲和力越低(高P₅₀)，越有利于聚合血红蛋白在体内的释氧，一般应高于26mmHg。但是，有部分高P₅₀的产品在临床实验中失败，因此Winslow等在已有数据的基础上认为，较高P₅₀的氧载体制剂由于在人小动脉处较早的释氧，引起小动脉收缩，从而造成高血压，理想的P₅₀应低于10mmHg；按照此理论，该产品在临床应用中存在着造成高血压的风险，尽管该理论未被完全证实，但是部分实验证实此理论有一定的合理性。

发明内容

本发明的目的是提供一种血红蛋白聚合的方法，具体是采用EDC交联血红蛋白制备红细胞代用品的方法，所获得产品不仅具有载氧释氧、维持渗透压及扩容的血液功能，而且使聚合血红蛋白的氧亲和力增高、P₅₀小于10mmHg、利于在组织内的释氧；并解决现有技术中制备复杂、聚合血红蛋白氧亲和力较低、粘度较大、血红蛋白浓度低的技术问题。

本发明技术方案中所述的EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺[(1-ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl)carbodiimide]，简称EDC；是采用EDC作为交联剂，将血红蛋白分子内和分子间进行交联，形成非均一性的聚合物。所述的Sulfo-NHS为N-羟基硫代琥珀酰亚胺，简称Sulfo-NHS。本发明技术方案的具体步骤包括：

取浓度为10mg/ml～150mg/ml，pH 6.0～8.0的血红蛋白溶液(所述血红蛋白可以是人、牛、猪血红蛋白的任一种)；按EDC与血红蛋白5～200∶1的摩尔比，将EDC加入血红蛋白溶液，进行聚合反应2～48小时；为加速聚合反应的进行，在反应液中可加有N-羟基硫代琥珀酰亚胺，加入量按EDC与N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比0.5～20∶1；在反应液中还可加有抗氧化剂，以减小亚铁血红蛋白被氧化成高铁血红蛋白的速度，所述的抗氧化剂包括氮-乙酰基半胱氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽的任一种；在聚合反应结束时，加入终止剂终止反应，得到聚合血红蛋白溶液；终止剂可以是各种氨基酸或是一些带-NH₂试剂的任一种(如甘氨酸溶液、赖氨酸溶液、乙二胺)；再用超滤/凝胶过滤方法截去100kDa以下的血红蛋白；用格林氏液作为抗衡溶液，用超滤方法进行换液，得到格林氏液为缓冲液的聚合血红蛋白溶液。

本发明技术方案中聚合反应时间的长短取决于EDC与血红蛋白的摩尔比，EDC用量多则反应时间短，用量少则反应时间长；同时，也取决于是否加有Sulfo-NHS，及其加入量的多少。在同样反应物浓度条件下，聚合反应的时间越长，形成聚合血红蛋白的分子量越大。所以，本发明对技术方案中反应时间和反应物用量给出的范围较宽，主要取决于对生成物的要求，由以下原理和实例可以得到验证，故无需更多的举例。

以下结合附图说明本发明技术方案的原理和效果。

本发明用EDC做为交联剂可以将氨基与羧基进行缩肽反应，形成酰胺键，如附图1所示，在聚合反应中，EDC首先与蛋白羧基反应，形成一种不稳定的脂键，可直接将另一蛋白的氨基缩合或是解离下来，但是加入Sulfo-NHS可以将这种中间产物中的EDC置换与羧基连接，进一步活化羧基，更容易与另一蛋白的氨基进行缩合。这种反应是将蛋白表面的氨基与羧基直接相连，形成肽键。

本发明将这种反应体系直接应用于蛋白连接。由附图2～4可看出，峰1为64kDa血红蛋白，随着聚合时间的延长，聚合血红蛋白逐渐增大，分子量聚合变大，出现峰2(128kDa)和峰3(大于1300kDa)，此色谱柱的排阻极限Mr＝1300kDa，并且64kDa血红蛋白的含量在逐渐降低。

EDC可将分子间进行交联，还可以将分子内进行交联，在高浓度MgCl₂溶液中，分子内未交联的血红蛋白可以被解离成为αβ亚基，如附图5所示，峰1为被解离为32kDa的αβ亚基，峰2为分子内交联的血红蛋白，其余为分子内和分子间都被交联的血红蛋白。

从附图6中可以看出，聚合血红蛋白氧平衡曲线明显左移，氧亲和力被明显升高。血红蛋白有两种状态，即结合氧的松弛态(R态)和脱去氧的紧张态(T态)，在两种不同状态下聚合出来的聚合血红蛋白的氧亲和力有明显的差异，在T态下聚合的氧亲和力较低，在R态下聚合的氧亲和力较高。血红蛋白从红细胞中释放出来并被纯化之后，失去2，3-二磷酸甘油酸(2，3-DPG)的调节，氧的亲和力被提高，成为完全的R态。

虽然目前的聚合血红蛋白都是基于降低氧亲和力的目的开发产品，但是基于前面的讨论，较高的氧亲和力可能有利于在组织毛细血管释氧；而本发明制剂的P₅₀低于正常的红细胞，最低可达到5mmHg左右。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、聚合血红蛋白的氧亲和力高。现有聚合血红蛋白的主要产品除美国专利6,844,317 B2外，其余产品的P₅₀都高于10torr(1torr＝1mmHg＝133.3Pa)；而本发明聚合血红蛋白的P₅₀在10mmHg以下，氧亲和力高。

2、聚合血红蛋白溶液粘度小。美国专利6,844,317 B2是由聚乙二醇修饰的血红蛋白产品，其粘度较高；本发明采用EDC交联，其溶液粘度小。

3、聚合血红蛋白的浓度分布合理。美国专利6,844,317 B2是由聚乙二醇修饰的，其血红蛋白产品的浓度较低(约42mg/ml)；而本发明血红蛋白的浓度在70～140mg/ml之间，分布合理。

4、聚合血红蛋白分子量的大小分布适中。中国专利94190130.0是由棉子糖聚合的，其聚合血红蛋白分子量小，32kDa的聚合血红蛋白占5％，64kDa的聚合血红蛋白占40％，其分子量主要分布在64～500kDa，同时不含600kDa的血红蛋白，64kDa的血红蛋白较多，在临床使用时造成高血压的风险较高。而太大的聚合物可能容易沉积并阻塞血管，微循环不畅。本发明所获得的血红蛋白聚合物分子量在64～2000kDa，其中有90％以上分布在64～1500kDa范围，分子量64kDa的四聚体小于15％，分子量128～1500kDa的占75～85％。通过截留的方式还可进一步减少64kDa的含量；一种理论认为64kDa的血红蛋白分子可以渗透血管内皮细胞进入血管平滑肌，与血管舒张因子NO结合从而清除了NO，由此可以引起高血压，因此本发明对临床高血压的风险要小。

5、工艺简单。美国专利6,844,317 B2用PEG修饰的血红蛋白需要对PEG进行活化，步骤较多、工艺复杂。美国专利5,998,361描述的用bis(3，5-dibromosalicyl)sebacate(DecBDA)或者bis(3，5-dibromosalicyl)adipate(AdipBDA)先将血红蛋白进行分子内交联，然后进行纯化，再将交联和未交联的血红蛋白分离，由于交联和未交联的血红蛋白性质相近，很难纯化，工艺复杂而且容易带来高铁血红蛋白升高的缺点。本发明直接用EDC对血红蛋白进行交联，其分子内交联效率高，32kDa的含量少(见图5)，并且工艺简单。

本发明技术方案已列入科技部保密项目。

附图及其说明

附图1是本发明制备方法用EDC交联血红蛋白反应过程的示意图。

附图2是血红蛋白纯度分析色谱图，峰1为64kDa血红蛋白。附图3是本发明血红蛋白聚合1.5小时用凝胶过滤对分子量分布分析的色谱图，可以看出部分血红蛋白被聚合，峰1为血红蛋白64kDa，峰2为二聚体血红蛋白128kDa。附图4是本发明血红蛋白聚合16小时用凝胶过滤对分子量分布分析的色谱图，可以看出大部分血红蛋白被聚合，峰1为血红蛋白64kDa，峰2为二聚体血红蛋白128kDa，峰3为分子量大于1300kDa聚合血红蛋白。

附图5是本发明血红蛋白聚合11小时后在解离条件下用凝胶过滤对分子量分布分析的色谱图，可以看出仅有少量的分子内未交联的血红蛋白，峰1为解离血红蛋白32kDa，峰2为分子内交联血红蛋白64kDa，峰3为分子量大于128kDa的聚合血红蛋白。

附图6是血红蛋白(a)与本发明聚合血红蛋白(b)的氧合曲线，由图中可以看出，聚合血红蛋白的氧合曲线明显左移，说明聚合血红蛋白的氧亲和力显著增强(P₅₀降低)。

具体实施方式

取100mg的EDC和10mg的Sulfo-NHS溶解于0.5M的HEPES缓冲液(pH 6.9)中，缓冲液的量为最低溶解量；取7.5ml的50mg/ml猪血红蛋白溶液(pH 6.9)，加入溶有交联剂的缓冲液(终浓度EDC为10.0mg/ml，Sulfo-NHS为1.0mg/ml)，再加入氮-乙酰基半胱氨酸(终浓度0.1mmol/l)，温度20℃反应16小时后，用乙二胺(终浓度0.1mol/l)终止反应。再用100kDa的中空纤维超滤方法截去100kDa以下的血红蛋白，至100kDa以下的血红蛋白小于15％；用格林氏液作为抗衡溶液进行换液，得到格林氏液为缓冲液的聚合血红蛋白溶液。

反应的进程用HPLC-SEC进行监测，结果见附图1～3。色谱条件：用Superdex 200凝胶过滤柱分析聚合时分子量的分布；流动相为150mmol/lNaCl+50mmol/l P.B.，pH7.2，流速0.5ml/min，检测波长为415nm。

解离色谱条件：用Superdex 200凝胶过滤柱分析聚合血红蛋白在解离条件下的分子量分布；流动相为50mmol/l bis-Tris+750mmol/l MgCl₂，pH7.5，流速0.5ml/min，检测波长为415nm。

氧平衡曲线测定：使用血氧分析仪测定氧平衡曲线(OECs)，同时测定氧亲和力(P₅₀)和Hill系数；血红蛋白浓度为85μmol/l，高铁血红蛋白不超过5％，温度37℃，在4.0ml最终的缓冲液中含有150mmol/l NaCl，50mmol/l HEPES，pH7.36，加有抗发泡剂。按照仪器说明书进行操作测定。

Claims (5)

1.一种采用EDC交联血红蛋白制备红细胞代用品的方法，其特征在于，具体步骤包括：取浓度为10mg/ml～150mg/ml，pH 6.0～8.0的血红蛋白溶液，按EDC与血红蛋白5～200∶1的摩尔比，将EDC加入血红蛋白溶液，进行聚合反应2～48小时；在聚合反应结束时，加入终止剂终止反应，得到聚合血红蛋白溶液；再用超滤/凝胶过滤方法截去100kDa以下的血红蛋白；用格林氏液作为抗衡溶液进行换液，得到格林氏液为缓冲液的聚合血红蛋白溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述的聚合反应中加有N-羟基硫代琥珀酰亚胺，加入量按EDC与N-羟基硫代琥珀酰亚胺摩尔比的0.5～20∶1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在反应液中加有抗氧化剂；所述的抗氧化剂为氮-乙酰基半胱氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽的任一种；所述的终止剂是各种氨基酸或是一些带-NH₂试剂的任一种。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述聚合反应中加入的EDC或/和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，先用缓冲液溶解。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所获得的血红蛋白聚合物分子量在64～2000kDa，其中有90％以上分布在64～1500kDa范围，分子量64kDa的四聚体小于15％，分子量128～1500kDa的占75～85％；所获得聚合血红蛋白的P50在10mmHg以下。

Images