KR100676264B1 - 헤모글로빈-항산화제 콘쥬게이트 - Google Patents

헤모글로빈-항산화제 콘쥬게이트 Download PDF

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Abstract

산소 운반 능력을 가지며 항산화제에 화학적으로 결합하여 포유동물의 신체가 산화적 손상을 입지 않도록 보호할 수 있는 생물친화성 화학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물의 예는 트롤록스와 같은 6-히드록시 크로만 카르복실산에 공유 결합된 헤모글로빈이다.

Description

헤모글로빈-항산화제 콘쥬게이트{Hemoglobin-antioxidant conjugates}
본 발명은 헤모글로빈 조성물에 관한 것이며, 보다 상세하게는 산소-운반 및 항산화 치료를 목적으로 생명체에게 투여하는 헤모글로빈-항산화제 조성물에 관한 것이다.
심장 수술, 장기 보존 또는 이식과 같은 많은 외과적 시술시 실혈 (blood loss)을 막고 시술을 용이하게 하기 위해서는 반드시 조직으로의 혈액 흐름을 일시적으로 중단해야 한다. 심근경색, 혈전성 뇌졸증, 색전성 혈관 폐색, 협심증 및 말초혈관 부전증과 같은 질병이 있는 경우에는 혈관이 차단될 수도 있다. 이러한 상황 하에서 혈액 공급이 부족하면 허혈증이 발생하는데, 이러한 허혈증은 허혈 조직이 혈액이나 기타 산소-운반 용액으로 재관류되면서 반전된다. 이러한 산소의 재도입은 조직의 계속적인 작동에 있어 중요하지만, 새로이 유입된 산소가 조직 손상을 일으키는 산소-유도 유리 라디칼의 형성에 기여한다는 것이 일반적으로 수용되는 사실이다. 유입된 산소가 독성을 띄게 되는 하나의 메카니즘은 산틴 산화효소 (xanthine oxidase)에 의한 과산화물로의 전환에 의한 것이다. 이러한 효소의 농도는 허혈 기간중에 상승하게 될 것이다. 동시에 글루타치온과 같은 환원, 독성제거제 (reducing, detoxifying agent)의 농도는 결핍되어 있다. 전술한 바와 같은 현 상의 결과로서 발생하는 조직 손상이 재관류 손상으로서 알려져 있으며, 혈액으로 재관류되는 중에 발생하는 것으로 알려져 있고 혈액 대용제를 사용하는 일부 상황하에서 일어나는 것으로 예견된다.
혈액 대용제의 하나인 헤모글로빈-의존 산소 운반제 (hemoglobin-based oxygen carriers (HBOCs))는 화학적으로 변성된 무세포 헤모글로빈으로 이루어져 있다. 무세포 헤모글로빈은 반응성 산소종을 잠재적으로 손상시키는 또 다른 소스이다. 혈액 중의 헤모글로빈은 보통 혈액중의 적혈구에 들어 있는데, 체내를 순환하면서 산소를 운반하는 기능을 한다. 정상적인 대사 기능에 있어서, 혈액이 폐를 순환할 때 적혈구 중의 헤모글로빈은 산소와 결합한 다음 산소를 체내 조직으로 운반하여 방출한다. 혈액 중의 헤모글로빈은 헤모글로빈의 화학적 거동에 영향을 미치는 효소와 같은 다른 많은 성분들을 포함하는 적혈구에 존재하기 때문에 그의 화학적 거동이 구속된다. 헤모글로빈을 적혈구 세포로부터 추출한 다음 혈액 대체 용도중에서도 무세포 산소-운반체로서 즉시 사용할 수 있도록 정제하면 다른 적혈구 성분들이 헤모글로빈에 미치는 화학적 영향 및 그 반대로 헤모글로빈이 다른 적혈구 성분들에 미치는 화학적 영향은 상실된다.
이러한 영향중 하나는 산소-헤모글로빈 반응, 및 독성 산소종의 발생에 관한 것이다. 헤모글로빈이 리간드 산소에 의해 산화되면 메트-헤모글로빈(met-hemoglobin)이 생성되는데, 이때 헴 철(heme iron)은 Fe (Ⅲ) 상태로 산화되고 산소 유리 라디칼인 "과산소", O2 -가 생성된다. 메트-헤모글로빈은 산소와 결합하여 운반할 수 없기 때문에 특별히 유용한 어떠한 기능도 가지고 있지는 않다. 그러나, 과산소는 내피 조직과 내피하 조직을 포함하는 혈관 성분에 산화적 손상을 입히는 등, 체내에서 일어나는 많은 유해한 효과와 관련이 있다. 적혈구에서 효소는 이들 독성 산소종이 무해한 부산물로 전환되지 못하도록 한다. 즉, 메트-헤모글로빈 환원 효소 시스템이 존재하여 메트-헤모글로빈을 헤모글로빈으로 환원시킨다. 과산소 디뮤타제와 과산소 카탈라제가 존재하는데, 이들은 각각 과산소를 과산화수소로 전환시키고 과산화수소를 물과 분자 산소로 전환시킨다.
적혈구 외부의 헤모글로빈은 이들 산화 부산물을 곧바로 처리하는 효소 시약을 가지고 있지 않다. 결론적으로, 산소-운반체와 같은 무세포 헤모글로빈을 사용하면 과산소와 같이 헤모글로빈 자체에 결합되었거나 결합하게될 산소로부터 유래하는 유해한 산화 생성물을 과다량 생산하게 될 것이다. 마찬가지로, HBOC 용액에 용해되었거나 허혈 조직에 재유입된 혼합 혈액에 용해된 산소는 전술한 메카니즘에 의해 재관류 손상을 일으키는 반응성 산소종이 될 것이다. 그러나, 산소 공급 재개에 대한 필요성은 절실하며, 재관류 손상 및 산소 라디칼 도입과 관련된 위험성보다 우선시된다.
본 발명의 목적은 전술한 문제점들을 극복하거나 적어도 최소화하면서 산소를 공급할 수 있는 신규한 헤모글로빈 조성물을 제공하는 것이다.
발명의 개요
HBOC와 같은 합성 또는 반합성 산소 운반 물질의 제조방법은 선택된 항산화제와 같은 개선 물질과 결합할 기회를 제공한다. 따라서, 본 발명은 산소 운반능력을 가지며, 예를 들면 하기 화학식으로 표시된 작용기를 하나 이상 포함하는 화합물과 같은 비효소적 페놀 화합물; 피라졸린; 카로테노이드 및 레티노이드 화합물; 퀴논; 폴리피롤; 인돌 및 아미노인돌; 푸린 유사체; 아스코르빈산; 및 스테로이드 항산화제 및 알칼로이드 항산화제로부터 선택된 하나 이상의 생물친화성 항산화제에 화학적으로 결합된 생물친화성 산소 운반 분자를 포함하는 화학적 조성물을 제공한다:
Figure 112001022563755-pct00001
식중, n은 1 내지 3의 정수이며, 방향족 고리는 추가로 치환되며 다른 카보고리 또는 헤테로고리 시스템에 임의로 융합되거나 결합된다.
본 발명의 콘쥬게이트는 산소 운반 분자 부근의 화학적 결합에서 항산화성 관능가를 제공한다. 따라서, 산소-함유 용액의 반응에 의해 발생되는 반응성 산소종은 매우 바람직한 특징인 항산화 작용효과를 즉시 나타내게 되는데, 그 이유는 산소종은 그 수명이 매우 짧고 손상되기 훨씬 전에는 이동하지 않기 때문이다. 이는 변성된 헤모글로빈에 의존하는 HBOC를 사용하는 경우에 특히 중요한데, 그 이유는 변성된 헤모글로빈은 혈관외 유출되는 것으로 알려져 있어서 HBOC가 이동하는 곳이면 어디든지 항산화 활성을 운반할 수 있기 때문이다. 또한, 산소 운반체에 콘쥬게이트된 산화된 항산화 부분은 생체내에서, 추가로 항산화 활성을 나타낼 수 있는 화학적 상태로, 그리고 생체 내에서 재순환되어 그러한 작용을 더 할 수 있는 콘쥬게이트로 환원될 수 있다.
본 발명에서 항산화제로서 사용되는 바람직한 페놀 화합물은 프로부콜 및 그의 에스테르, 비스(1,1-메틸에틸)-4-[(1-에틸아미노)]메틸] 페놀 및 그의 부가염, 및 5-(3,5-디-3급부틸-4-히드록시벤질)티아졸리딘-4-온과 같은 폴리페놀 및 치환된 페놀 항산화제; (3,5-디-3급부틸-4-히드록시페닐티오)알카놀과 같은 페놀 에스테르; 디-3급부틸히드록시페닐티오-치환 히드록사민산; 크로마놀 및 디히드로벤조푸라놀과 같은 크로만계 화합물; 플라바논 및 디히드로플라바놀과 같은 플라바노이드 및 이소플라바노이드; 갈레이트; 카테콜 및 카테콜 유도체; 및 p-히드록시벤조산, 디히드록시벤조산, 및 2-(2,3-디히드로-5-아세톡시-4,6,7-트리메틸)벤조푸라닐 아세트산과 같은 페놀산이다. 특히 바람직한 것은 토콜과 같은 크로마놀 및 토코페놀이고, 보다 바람직한 것은 6-히드록시 크로만 카르복실산 및 6-히드록시크로만-2-카보니트릴과 같은 6-히드록시 크로만이다. 다른 바람직한 페놀 화합물은 3,4-디히드로-6-히드록시-2H-1-나프토피란이다.
적당한 피라졸리논의 예로는 노르페나존 및 3-메틸-1-페닐-피라졸린-5-온을 들 수 있다.
바람직한 카로테노이드 및 레티노이드 화합물은 비타민 A, 카로텐, 리코펜 및 류테인이다.
적당한 퀴논 항산화제 화합물중에서 바람직한 것은 코엔자임 Q 및 플라스티퀴논과 같이 여러가지 식물에서 유도된 퀴논이다.
바람직한 테트라피롤 화합물의 예는 빌리루빈이다.
멜라코닌은 본 발명에서 사용되는 바람직한 적당한 인돌 화합물의 예이다.
본 발명에서 유용한 푸린 유사체로는 요산, 알로푸리놀 및 옥시푸리놀이 있다.
적당한 스테로이드 항산화제 중에서 바람직한 것은 메틸프레드니솔론 숙신네이트, 및 티릴라자드와 같은 라자로이드 (21-아미노스테로이드)이다.
선택된 항산화제 상에서와 선택된 산소 운반체 상에서 이용가능한 화학기들을 고려할때, 생물친화성 항산화제를 산소 운반 물질에 콘쥬게이트시키는 화학은 본 발명의 범위 내에 있다. 산소 운반 작용이나 항산화 능력이 선택된 콘쥬게이트 형태에 의하여 크게 손상되지 않도록 보장하는데 주의해야 한다.
산소 운반 화합물은 산소를 헴 부분에 역결합시켜서 산소를 운반하는 헤모글로빈이나 헴-알부민, 또는 기체상 산소를 용해시켜서 용액으로서 운반하는 퍼플루오로카본과 같은 헴-단백질 고분자일 수 있다. 이용가능한 산소 운반 화합물중에서 바람직한 것은 헤모글로빈이다.
본 발명의 바람직한 콘쥬게이트에서 사용되는 헤모글로빈종은 산소를 운반할 수 있는 실질적으로 임의의 생물 친화적 헤모글로빈인데, 인간 또는 동물로부터 유래될 수 있으며, 본 발명의 분야에 공지된 방법에 의하여 적혈구를 용혈시켜서 얻어진 헤모글로빈을 분리 및 정제함으로써 포유동물 적혈구, 예를 들면 사람 혈액 (outdated human blood)으로부터 얻을 수 있다. 최적의 생물친화성을 위해서는 결과물인 헤모글로빈이 스트로마와 내독성을 가지고 있지 않아야 한다. 다른 방법으로서, 본 발명의 분야에서 이미 알려져 있는 재조합 기법 및 세포 배양 기법에 의 해 헤모글로빈을 자연형 또는 돌연변이형으로 제조할 수 있다. 자연형 헤모글로빈을 이용하거나 자연형이 아닌 돌연변이형 헤모글로빈종을 이용하는 것도 본 발명의 범주에 포함된다.
특히 바람직한 본 발명의 산소 운반-항산화제 콘쥬게이트는 산소 운반 화합물과, 항산화 특성을 가지며 하기 하학식으로 표시되는 6-히드록시 크로만 화합물의 화학적 콘쥬게이트이다:
Figure 112001022563755-pct00002
식중, R1, R2 및 R3는 H, C1-C8 알킬 및 (CH2 )nX (n은 0 내지 20의 정수임)로부터 독립적으로 선택되고; R3, R4, R5 및 R6는 H, C1 -C20 알킬, X 및 -(CH2)mX (식중, m은 0 내지 20의 정수임)으로부터 독립적으로 선택되며; X는 선택된 산소 운반 화합물과 반응하여 그 화학적 결합이 크로만 화합물에 영향을 미치도록, 상기 산소 운반 화합물을 고려하여 선택된 반응성 관능기이다 (단, 크로만 화합물은 1개 이상의 관능기 X를 포함한다).
이러한 콘쥬게이트에서 산소 운반 화합물은 헤모글로빈종과 같은 헴-단백질 고분자인 것이 바람직하고, 크로만 상의 관능기 X는 그의 단백질 사슬의 아미노산 잔기와 반응할 수 있는 기이다. X기의 적당한 예는 할로, 카르복시, 아미노, 히드 록시, 티올, 아지드, 아조, 알데하이드, 구아니딘 및 포스페이트이다.
특히 바람직한 본 발명의 콘쥬게이트는, 예를 들면 X가 그 자체의 카르복실 작용에 의해 헤모글로빈에 화학적으로 공유 결합된 COOH인 헤모글로빈-크로만-카르복실산 콘쥬게이트이다. 헤모글로빈의 글로빈 사슬 상의 1차 아민기에 직접 결합될 수 있다. 이와는 달리, 적절한 화학적 링커를 사용할 수 있다. 본 발명의 구현예에서 사용된 크로만-카르복실산은 많은 경우에 생체 내에서 형성된 과산소 및 기타 반응성 산소종들을 제거할 수 있는 생물학적으로 허용가능한 항산화제로서 알려져 있다. 본 발명에 따르면, 크로만-카르복실산의 항산화 작용은 후속하는 헤모글로빈종으로의 콘쥬게이션을 적어도 실질적으로 손상시키지 않으며, 콘쥬게이션에 의해 헤모글로빈과 크로만 카르복실산의 물리적 혼합물의 항산화 효과보다 더 개선되었음을 발견하였다. 본 발명의 헤모글로빈 콘쥬게이트는 산소-운반 능력을 가지고 있다.
본 발명에서 사용되는 바람직한 형태의 헤모글로빈종은, 헤모글로빈 이량체로 해리되지 않도록 사량체 헤모글로빈 단위 (tetrameric hemoglobin unit)가 화학적으로 분자내 가교된 가교결합 헤모글로빈이다. 잘 알려진 것처럼, 천연 헤모글로빈 사량체가 이량체로 해리되는 경향은 헤모글로빈을 혈액중의 적혈구로부터 추출한 다른 결과이다. 그러한 해리에 의하여 형성된 분자량 약 32,000 달톤의 헤모글로빈 이량체는 신장을 통해 분비됨으로써 생체로부터 조기에 유실되므로 해리를 최소화시켜야 한다. 글루타르알데하이드, 당과 폴리사카라이드를 산화 개환 (oxidative ring opening)으로부터 유도된 것들과 같은 폴리알데하이드, 디아스피린 화합물, 피리독실 화합물, 트리메소일 화합물 등과 같은 다양한 화학적 가교제를 이용하여 헤모글로빈을 분자내 가교시켜서 전술한 바와 같은 해리로부터 보호하는 여러가지 다양한 방법들이 본 발명의 분야에 공지 및 공개되었다. 또한, 본 발명에서 사용된 헤모글로빈은, 동일 또는 복합 가교제를 이용하여 2개 또는 그 이상의 사량체, 바람직하게는 12개 이하의 사량체를 폴리머 형태로 분자간 결합시킴으로써 중합될 수 있다. 분자내 가교 및 분자간 가교된 서로 다른 2개 이상의 헤모글로빈종들을 포함하는 혼합물이 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 다른 방법으로서, 크로만-카르복실산을 비가교된 헤모글로빈에 커플링시킨 다음 콘쥬게이트의 가교결합을 실시하여 분자내 안정화된 사량체 헤모글로빈-항산화제 착물을 형성하는데, 이 착물은 임의로는 그의 올리고머화물 또는 폴리머화물과의 혼합물 형태일 수 있다. 수득되는 바람직한 생성물 조성을 고려할때 이러한 공정에서 사용되는 가교제로는 산화 개환된 라피노스 (이하, "o-라피노스")가 바람직스럽기는 하나 전술한 것들중 어느 것이라도 사용할 수 있다. 헤모글로빈 가교 반응이 크로만-카르복실산 항산화제로의 콘쥬게이션 이후에 실시되는 경우에 그 반응 조건은 헤모글로빈만을 가교하는데 사용되는 조건과는 현저하게 다르지 않다.
헤모글로빈을 가교시키기 전에 크로만-카르복실산에 콘쥬케이트시키거나 가교된 헤모글로빈을 크로만-카르복실산에 콘쥬게이트시키는 방법중 어느 것을 이용한다면, 크로만-카르복실산을 이용하여 비가교된 임의의 헤모글로빈을 변성시킬 수 있다. 비가교된 헤모글로빈은 산소 소거 효과 (oxygen scavenging effect)가 적용 되어야 하는 반응성 산소종을 발생시킬 가능성을 여전히 가지고 있으며 이러한 비가교 형태의 헤모글로빈은 가교된 헤모글로빈과는 서로 다른 생물학적 분포 특성 (biodistribution property)를 가지고 있는 것으로 알려져 있어서, 전술한 개질 방법은 유용하다. 비가교된 헤모글로빈을 제거하는 공지된 방법을 이용하여 비가교된 헤모글로빈종의 양을 제어할 수 있다.
본 발명은 폴리머에 콘쥬게이트된 헤모글로빈, 예를 들면 적절하게 관능화된 폴리에틸렌 옥사이드 (PEG), 폴리사카라이드, 폴리아미노산, 단백질 및 불용성 지지체, 및 캡슐화된 헤모글로빈과 같은 다른 개질된 형태의 헤모글로빈과 함께 사용될 수 있다. 전술한 것처럼, 이들은 모두 결합된 항산화제 분자가 존재함으로 인해 비롯되는 이득일 수 있다.
본 발명의 콘쥬게이트에서 사용되는, 상기 화학식의 크로만-카르복실산은 비타민 E 카르복실산 유도체 (예를 들면, 라디칼 R이 탄소수 16의 측쇄형 알킬기인 유도체임)일 수 있는데, 구체적으로는 여러가지 가능한 임의의 입체적 배열을 갖는 4,8,12-트리메틸-트리데실 또는 4,8,12-트리메틸-3,7,11-트리데카트리에닐일 수 있다. R1, R2 및 R3중 적어도 하나가 메틸이고 R4가 직접 결합 (direct bond)인 화합물들이 바람직하다. 다른 바람직한 화합물 부류는 상기 화학식에서 R이 메틸인 화합물들이다.
본 발명에서 사용되는 크로만-카르복실산 중에서 가장 바람직한 것은 통상 트롤록스(Trolox)라고 알려져 있는 하기 화학식의 2,5,7,8-테트라메틸-2-카르복시- 크로만-6-올이다:
Figure 112001022563755-pct00003
본 발명에서는 기재상의 편의를 위하여 트롤록스를 이용하는 구체적인 예를 들어 설명될 것이나, 본 발명이 이 예로 제한되어서는 안된다. 비타민 E보다는 수용성이 우수한 비타민 E 유사체인 트롤록스는 항산화 활성을 갖는다. 본 발명의 이러한 태양에 따르면, 트롤록스를 헤모글로빈에 콘쥬게이트시키면 트롤록스의 수용성이 증가하여 유리 트롤록스에 의해 달성할 수 있는 것보다 더 높은 유효 농도를 달성함으로써 보다 우수한 항산화 효과를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 트롤록스의 질량이 콘쥬게이션을 통하여 증가함으로써 트롤록스의 생체내 순환 반감기가 현저하게 증가한다.
트롤록스와 전술한 형태중 임의의 형태를 갖는 헤모글로빈을 화학적으로 결합시킬 수 있다. 트롤록스 잔기의 카르복실 관능기는 적절한 활성화를 거쳐서 헤모글로빈의 글로빈 사슬 상에 있는 1차 아민기, 즉 라이신 잔기와 반응하여 아미드 공유 결합을 형성한다.
1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸 카보디이미드 히드로클로라이드(EDC) 또는 다른 카보디이미드 (단독으로 사용되거나, N-히드록시설폰숙신이미드와 같은 다른 활성화제와 혼합하여 사용함), 우드워드 시약 K (Woodward's reagent K)와 같은 이 속사졸륨 유도체, 클로로포르메이트, N, N'-카보닐디이미다졸, N-카브알콕시디히드로퀴놀린 등과 같은 활성화제 화합물을 이용하면 트롤록스와 헤모글로빈의 반응을 촉진시킬 수 있다. 트롤록스는 산, 산 유도체 또는 대칭형 무수물 형태로 사용될 수 있다. EDC와 같은 활성화 화합물을 먼저 트롤록스와 반응시켜서 EDC 관능성을 제거하면서 트롤록스 카보닐기를 활성화시킨 다음, 헤모글로빈의 아미노기와 반응시킨다. 이러한 활성화 화합물을 사용하게 되면 트롤록스가 헤모글로빈에 더 많이 로딩하게 되고, 로딩양을 보다 잘 제어할 수 있다. 필요에 따라서는 여러가지 용매를 수용성 헤모글로빈 용액과 합하여 사용함으로써 트롤록스와 커플링제의 용해를 돕는다.
헤모글로빈이 그러한 카보디이미드 화합물과 반응하는 조건 및 공정은 당업자들에게는 잘 알려져 있다. 반응은 수용액을 이용하여 실온에서 적절하게 실시된다.
직접 결합하는 대신, 화학적 스페이서 또는 링커를 이용하면 콘쥬게이트가 하나 이상의 비-트롤록스 분자들이 결합되어 있는 헤모글로빈을 포함하고 트롤록스가 비-트롤록스 화학 잔기에 결합하도록 할 수 있다. 그러한 링커의 예로는 관능화 당 및 폴리사카라이드, 폴리라이신과 같은 폴리아미노산, PEG 유도체 및 다양한 2가 또는 다가 관능성 링커가 있다. 이러한 링커를 사용하면 헤모글로빈에 결합할 때마다 여러개의 트롤록스 부착위치를 제공하여 헤모글로빈을 많이 변성시키지 않으면서 트롤록스를 많이 로딩할 수 있다. 또한, 적절한 링커를 선택함으로써 콘쥬게이트의 특성 (용해성, 활성 등)을 다양하게 변화시킬 수 있다.
임의로는 링커를 통해 트롤록스에 결합하는데 사용되는 글로빈 사슬 상의 정확한 기(들)가 중요한 것으로는 보이지 않는다. 부착 위치는 알파 글로빈 상슬 이나 베타 글로빈 사슬중 어느 하나 상에 또는 두개의 사슬 모두 상에 존재할 수 있다. 화학적 결합을 고려할 때, 아미노기뿐 아니라, 티올, 카복실레이트, 구아니디노, 이미다졸 또는 히드록실과 같은 헤모글로빈종의 다른 관능기를 사용함과 동시에 링커와 그에 적용할 수 있는 화학을 적절히 선택할 수 있다.
본 발명 방법의 바람직한 특징은 소정량의 트롤록스를 한번에 전량 가하지 않고 여러번, 예를 들면 2-5번에 걸쳐 나누어서 연속적으로 가한다는 것이다. 이러한 연속적 첨가에 의하면 트롤록스가 헤모글로빈 상에 로딩되는 양이 증가하고 보다 항산화 활성이 우수한 생성물이 생성된다.
본 발명에 있어서 헤모글로빈에 콘쥬게이트된 트롤록스의 바람직한 양은 항산화 능력인 라디칼 소거 기능을 제공하기에는 충분하지만 HBOC의 산소 친화력 및 산소 운반 능력을 저해할 정도로 많지는 않은 양이어야 한다는 것을 근거로 하여 결정된다. 컨쥬게이트가 만들어지는 반응 용액 중에 첨가되는 활성화 물질 및/또는 트롤록스의 양을 제어함으로써 트롤록스의 바람직한 양을 제어한다. 헤모글로빈과 트롤록스의 적절한 상대량은 약 1 : 약 100이고, 가장 바람직한 범위는 약 10 : 약 100이다.
전술한 대로 콘쥬게이트를 제조한 후, 필요에 따라서는 생성물을 조심스럽고 철저하게 정제하여 반응하지 않은 시약과 기타 다른 불순물들을 제거한다. 정제는 크로마토 그래피 (크기배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친 화 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 등)에 의해 이루어지거나, 투석 / 투석여과 (diafiltration), 한외여과 또는 선택적 침전법, 원심분리, 추출법 및 그외 다른 형태의 분리 방법을 포함하여 본 발명의 분야에서 알려져 있는 다른 방법에 의해 이루어질 수 있다. 컨쥬게이트는 밀봉된 비산화 조건 하에 4℃ 또는 그 이상의 냉장 온도에서, 필요할 때 환자에게 투여할 수 있는 수용액의 형태로 보관하는 것이 적절하다. 동결건조된 파우더 및 냉동 용액과 같은 다른 보관 형태도 사용될 수 있다.
도 1 및 2는 하기 실시예 2의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3 및 4는 하기 실시예 7의 결과를 나타내는 그래프이다.
하기 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세하게 설명할 것이나, 이들 실시예가 본 발명을 제한하지는 않는다.
실시예 1 - 콘쥬게이트의 제법 및 특성
하기 표 1에 설정된 서로 다른 조건 하에서 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(EDC)를 커플링제로서 이용하여 트롤록스(TX)를 카본모노옥시헤모글로빈(COHb)에 콘쥬게이트시키는 일련의 실험을 실시하였다. 각 실험에서, EDC, EDC와 트롤록스(TX)를 실온에서 10분 동안 아세토니트릴에 등몰 농도로 합하여 TX-EDC 원액 (1.55M)을 수득하였다. 필요에 따라서는, Hb를 가하기 직전에 TX-EDC 원액을 아세토니트릴로 희석하여 콘쥬게이션 반응의 아세토니트릴과 TX-EDC의 최종 함량이 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 되도록 하였다. 모든 콘쥬게이션 반응을 표에 나타낸 pH로 40-50mM에서 실시하였다. 반응 혼합물을 CO 가스 하에 24시간까지 22℃로 유지시켰다. 샘플을 여과하고 인산염 완충 식염수(PSB)(pH 7.4)로 투석한 다음 분석하였다.
[표 1] 트롤록스-Hb 반응 용액의 제조
Rxn 트롤록스(mM) CO-Hb (mM) TX:Hb 비율 pH 시간 (hr) 아세토니트릴 (부피%)
1 1.55 1.55 1 7 24 10
2 1.55 0.155 10 7 24 10
3 15.5 1.55 10 7 24 10
4* 15.5 0.155 100 7 24 10
5* 155 1.55 100 7 24 10
6 155 1.55 100 7 20 10
7 15.5 0.155 100 7 20 1
8 155 1.55 100 7 4 10
9 155 1.55 100 6 4 10
이렇게 제조된 콘쥬게이트의 특성을 살펴보기 위하여, 역상 HPLC를 이용하여 콘쥬게이트의 글로빈 사슬 (천연 또는 변성)을 분리하였다. 헴 역시 분리한다. 역상 HPLC와 연계된 전기분사 질량분석기 (Electrospary mass spectrometry coupled to reverse phase HPLC)(LCMS)를 이용하여 상기 글로빈 사슬의 분자량을 측정하였다 (표 2). 통상, 변성 사슬은 비변성 사슬보다 나중에 용출되었다. 3종류의 주요 변성 사슬, 즉 하나의 트롤록스 분자가 결합된 베타 사슬 (β(TX)1), 하나 또는 두개의 트롤록스 분자가 결합된 알파 사슬 (각각 (α(TX)1) 또는 (α(TX)2))이 LCMS에 의해 확인되었다 (표 3). 질량은 아미드-결합 콘쥬게이트와 일치한다. Hb를 아세토니트릴만으로 처리한 제어 반응에서는 글로빈 사슬 변성 증거가 전혀 나타나지 않았다.
글로빈 사슬 변성 데이타에 대한 검사는 반응 조건의 적절한 조작에 의해 제어되는 것을 보여준다. 콘쥬게이션시의 TX와 헤모글로빈의 비율은 글로빈 사슬 변성에 가장 큰 영향을 미친다. 1.55mM Hb에서, TX:Hb 비율이 1:1에서 10:1 내지 100:1로 증가하면 글로빈 사슬 변성율은 1.5에서 24.0 내지 50.5로 증가한다 (각각 반응예 1, 3 및 5). 0.155mM Hb에서, TX:Hb 비율이 10:1에서 100:1로 증가하면 글로빈 사슬 변성율은 22.0에서 79.5%로 증가한다 (각각 반응예 2 및 4). TX:Hb 비율이 10:1이면 반응물 농도 상승에는 거의 영향을 미치지 못하는데, 0.155 및 1.55mM에서 사슬 변성율은 각각 22.0 및 24.0%였다 (반응예 2 및 3). TX:Hb 비율이 100:1일때 글로빈 변성은 Hb 농도가 0.155mM에서 1.55mM로 증가함에 따라 낮아졌다 (79.5%에서 50.5%로). TX:Hb 비율을 100:1로 고정시킨 상태에서 모든 반응물을 10배 희석하면 글로빈 변성율은 약간 감소하고 (반응예 6과 7 비교), 반응 시간은 단축되며 (반응예 5와 8 비교), pH는 6에서 7로 증가한다 (반응예 8과 9 비교). 아세토니트릴 함량이 10%에서 1%(v/v)로 감소하면 글로빈 변성율은 79.5% 및 57.4%이다 (각각 반응예 5와 8).
[표 2] 다양한 TX-Hb 반응 조건 하의 변성 글로빈 사슬 분포
반응예 번호 사슬변성율 (%) α(TX)1 (%) α(TX)2 (%) β(TX)1(%) 기타(%) 콘쥬게이트된 TX:Hb비율*
1 1.5 1.5 0.0 0.0 0.0 0.1
2 22.0 13.9 1.1 4.0 3.1 0.8
3 24.0 12.4 0.0 6.0 5.6 0.7
4 79.5 26.3 21.0 24.5 7.6 3.7
5 50.5 32.8 4.7 4.8 8.2 1.9
6 66.7 35.6 7.0 11.5 12.6 2.4
7 59.4 25.3 3.9 10.4 19.8 1.7
8 43.7 26.4 3.9 5.4 7.9 1.6
9 52.6 33.6 3.6 8.2 7.2 2.0
* 콘쥬게이트된 TX:Hb 비율은 기타로 나타낸 비특화성된 종은 포함하지 않는다.
[표 3] Hb-TX 콘쥬게이트의 글로빈 사슬 질량의 계산값 및 측정값
글로빈 사슬 질량 계산값 (Da) 질량 측정값 (Da)
α 15126 15125
β 15868 15864
α(TX)1 15358 15358
α(TX)2 15591 15595
β(TX)1 16100 16099

실시예 2 : 항산화 활성의 측정방법
혈액을 헤파린화 튜브에 수거하고 원심분리하여 적혈구를 분리한 다음 10볼륨의 PBS (pH 7.4)로 3회 세척하였다. 마지막회 세척시에 적혈구를 1000x g에서 10분 동안 원심분리하여 압착 충진된 적혈구 제제를 수득하였다. 참고문헌 [Miki et al., (M. Miki, H.Tamai, M.Mino, Y.Yamamoto 및 E.Niki), Arch Biochem. Biophys. 258:373-380 (1987)]에 개시된 변성방법을 이용하여 퍼옥실 라디칼로 매개된 용혈 측정을 실시하였다. PBS (pH 7.4)중의 30% 신선한 적혈구 현탁액, 테스트 샘플 및 300mM 2,2-아조-비스(2-아미디노프로판 디히드로클로라이드)(AAPH, 라디칼 발생제) 동일 볼륨을 순서대로 합하였다. CO 기체 하에서 혼합물을 제조하였으며 RBC 측정 현탁액 중의 테스트 헤모글로빈 농도는 12-13㎎/㎖이었다. 혼합물을 37℃에서 유지시킨 다음 분획들을 PBS에 20배로 희석하고 100x g에서 10분 동안 원심분리하였다. Hb가 모두 CN-metHb로 전환된 후에 참고문헌 [Tentori (Meth. Enzymology 75:707 (1981)]에 개시된 방법에 따라서 540nm에서 상등액의 흡광도를 측정하여 RBC 용혈에 의해 방출된 Hb를 측정하였다. 테스트 샘플에 Hb를 가하여 상등액의 Hb 농도를 보정하였다.
2종류의 생성물에 대한 결과를 도 1에 나타내었는데, 도 1은 여러가지 생성물에 대한 상대적 RBC 용혈 정도를 시간에 대하여 나타낸 도표이다. 분석된 생성물들은 실시예 1의 표 1의 반응예 6 (Hb-트롤록스 B)과 반응예 7 (Hb-트롤록스 A)에 기대된 대로 제조된 것이었다. 콘쥬게이트가 없는 경우 (AAPH만 해당됨), 상등액중 Hb 농도가 항온기 (incubation period)에 걸쳐서 상승하는 것으로부터 RBC 용혈 현상이 입증된다. Hb-트롤록스 콘쥬게이트를 포함하는 혼합물에서 상등액중 Hb 농도는 상기 항온기에 걸쳐서 나타나는 것과 동일한 정도의 농도까지는 상승하지 않는데, 이는 라디칼 생성기의 용혈 효과로부터 보호되는 것을 의미한다. 이러한 상대적 보호 효과는 RBC 용혈물질 흡광도-시간 곡선하 면적 (AUC) 비교에 의해 측정될 수도 있다. AUC는 RBC 용혈 개시시간, 용혈 속도 및 전반적인 용혈 정도에 의해 측정된다. AUC값이 적을수록 RBC가 용혈로부터 더 많이 보호되는 것을 의미한다. Hb-트롤록스 A 및 B에 대한 AUC는 상응하는 대조 반응예 (표 4에서 TX-EDC 무첨가)로부터 얻은 생성물보다 현저하게 낮다.
[표 4] Hb-트롤록스 콘쥬게이트 및 대조군에 의한 항산화 보호도
샘플 트롤록스(TX) 농도 (mM) 헤모글로빈 농도 (mM) AAPH 대조군 대비 상대 AUC (%)
AAPH 0 0 100
유리 트롤록스 0.50 0 88
유리 Hb(A) 0 0.20 39
유리 Hb(B) 0 0.20 35
유리 TX+Hb 0.50 0.20 28
Hb-트롤록스 A 0.32 0.20 10
Hb-트롤록스 B 0.45 0.20 4
PBS 0 0 0
유리 트롤록스, 유리 (대조군) 헤모글로빈, 및 유리 트롤록스와 헤모글로빈의 혼합물이 존해하는 경우의 RBC 용혈에 대한 AUC 데이타도 나타낸다. 트롤록스와 헤모글로빈 모두는 각각 동량의 헤모글로빈과 동일 또는 더 낮은 농도의 트롤록스가 결합된 형태로 포함되어 있는 상응하는 헤모글로빈-트롤록스 콘쥬게이트보다 다 낮은 보호효과를 나타낸다. 유리 트롤록스와 헤모글로빈의 혼합물은 양쪽 화합물중 어느 하나의 화합물 동일 농도보다 더 우수한 보호 효과를 나타내지만 동량의 헤모글로빈과 동일 또는 더 낮은 농도의 트롤록스가 결합된 형태로 포함되어 있는 상응하는 헤모글로빈-트롤록스 콘쥬게이트보다는 낮은 보호 효과를 나타낸다. 콘쥬게이트와 혼합물은 동일한 헤모글로빈 함량을 가지며 콘쥬게이트는 혼합물과 동일하거나 그보다 낮은 트롤록스를 포함하기 때문에 콘쥬게이트의 보다 높은 활성은 콘쥬게이션에 의한 전반적인 항산화 활성의 증가로 인해 나타나는 시너지 효과라 할 수 있다.
실시예 3 : 트롤록스로 변성된 헤모글로빈의 중합화
실시예 1에서 제조된 헤모글로빈-트롤록스 콘쥬게이트 (Hb-트롤록스 A 및 B)를 50mM 비스-트리스 버퍼 (pH 6.8)에 대하여 투석시켰다. 물에 용해시켜 제조한 3당량의 o-라피노스 (미국 특허 제5,532,352호, Pliura et al.)를 헤모글로빈-트롤록스 용액에 가하여 최종 헤모글로빈 농도가 42 ㎎/㎖이 되도록 하였다. 이 혼합물을 22℃에서 24시간 동안 CO 기체 하에 두었다. 이 용액을 아세트산나트륨에 넣어 30mM이 되도록 하고 o-라피노스 함량 대비 20당량의 수성 디메틸아민보란을 가하였다. 24시간 후, 이 용액을 물 및 PBS (pH 7.4)에 차례로 투석시켰다. 해리, 비변성 조건하에서 크기배제 크로마토그래피한 결과, 분자내 및 분자간 가교된 헤모글로빈 트롤록스종이 형성된 것으로 나타났다 (표 5). o-라피노스에 의해 가교되지 않은 Hb-트롤록스는 사용된 크로마토그래피 조건하에서 32kDa 알파-베타 글로빈 이량체로서 용출된다. 이러한 비가교된 Hb종은, 필요에 따라서는 한외여과 또는 크로마토그래피와 같은 통상의 수단에 의해 제거될 수 있다. 비가교된 Hb종의 양을 제어하는 조건을 최적화할 수 있다.
[표 5] o-라피노스 중합된 헤모글로빈-트롤록스의 분자량 분포
분자량 (kDa) 분자량 분포 (%)
중합된 Hb-트롤록스 A 중합된 Hb-트롤록스 B
32 12.2 11.8
64 44.7 41.1
>64 43.1 47.1

실시예 4 - 트롤록스-중합된 Hb 콘쥬게이트 제조방법
실시예 1의 방법을 이용하여 트롤록스를 o-라피노스 가교된 Hb (폴리OR-Hb, 미국 특허 제5,532,352호, Pliura et al.)에 콘쥬게이트시켰다. 100배몰 과량의 TX-EDC를 100mM MES 버퍼 (pH 5, 6 및 7)에서 폴리OR-Hb와 반응시켰다. 모든 샘플들을 크기배제 크로마토그래피 (SEC) 및 역상(RP) HPLC로 정제하였다. 폴리OR-Hb에서, 알파 및 베타 사슬을 TX-EDC와 반응시키기 전에 o-라피노스로 각각 33% 및 90% 변성시킨다 (표 6). 3개의 서로 다른 pH 값에서 TX-EDC와 반응시킨후, 알파 및 베타 사슬 변성율은 각각 67 - 77% 및 93 - 99%로 증가하였으며, RP HPLC 결과 여러개의 새로운 변성 사슬이 발견되었다. 이들 TX-변성 사슬들중 일부는 실시예 1에 표시된 것처럼, Hb와 TX-EDC의 반응후 발견된 것들에 해당한다.
[표 6] 폴리OR-Hb-TX 콘쥬게이트의 글로빈 사슬의 변성
반응예 번호 샘플 반응예 pH Hb 대비 글로빈 변성율 (%) 폴리OR-Hb 대비 글로빈 변성율 (%)
베타 알파 베타 알파
1 Hb n/a n/a n/a n/a n/a
2* 폴리OR-Hb n/a 90.2 33.3 n/a n/a
3 폴리OR-Hb-TX 7 93.4 75.6 3.2 42.3
4 폴리OR-Hb-TX 6 99.7 77.1 9.5 43.8
5 폴리OR-Hb-TX 5 96.6 67.3 6.4 34
* 대조군 반응, 트롤록스 또는 EDC 무첨가.
실시예 5:
i) o-라피노스 중합된 헤모글로빈으로의 트롤록스의 콘쥬게이션 : 트롤록스를 한번에 첨가하거나 여러번에 나누어 첨가함.
미국 특허 제5,532,352호 (Pliura et al.)에 개시된 방법에 따라서 o-라피노스 중합된 헤모글로빈 (폴리OR-Hb)을 제조하였다. 약 50㎖의 125mM MES 버퍼 (pH 7.0)에 0.50g의 폴리OR-Hb가 용해된 두개의 서로 다른 용액 (반응액 A 및 B) 각각에, 실온에서 1㎖ 아세토니트릴중의 0.148g EDC와 10 - 20분 동안 미리 반응시킨 0.194g의 트롤록스를 가하였다. 동량의 트롤록스 / EDC를 5시간과 19시간째에 반응액 B에 가하여 총 3회 가하도록 하였다. 반응액 A에는 1㎖ 부피의 아세토니트릴을 동일 횟수만큼 가하였다. 두 반응액 모두를 22℃에서 총 27시간 동안 CO 기체 하에서 교반하였다. 샘플들을 여과한 다음, 물, 트리스-완충 0.5M MgCl2 및 인산염 완충식염수 (pH 7.4)에 대하여 투석하여 분석하였다. 크로마토그래피 결과, 유리 트롤록스가 검출되지 않았다. 트롤록스를 첨가하지 않으면서 EDC하고만 반응시켜서 대조군 생성물을 제조하였다.
ⅱ) 용혈에 대한 RBC의 시험관내 보호방법 :
실시예 2에 개시된 방법에 따라서, 두개의 콘쥬게이트에 대한 항산화 활성을 측정하였다. 샘플을 CO-용해시켰으며, 콘쥬게이트와 대조군의 RBC 분석 현탁액중의 농도는 12 ㎎/㎖이었다. 트롤록스 콘쥬게이트는 모두 트롤록스를 가지고 있지 않은 상응하는 대조군에 비하여 더 우수한 보호 효과를 나타냈다. 보호효과는 트롤록스 3회 첨가후 얻은 생성물에서 가장 우수하였는데, 이는 역상 HPLC 결과 트롤록스를 한번에 가하여 얻은 생성물보다 트롤록스에 의해 더 많이 변성된 것으로 나타났다. 3회 첨가 생성물의 AUC는 대조군의 3%인데 반하여, 한번에 첨가한 생성물의 AUC는 대조군의 33%였다. 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
[표 7] 폴리OR-Hb-Tx 콘쥬게이와 대조군에 의한 항산화 보호율
샘플 AAPH 대조군 대비 AUC(%)
AAPH 100
1X 대조군 83
3X 대조군 69
1X TX-EDC (반응액 A) 27
3X TX-EDC (반응액 B) 2
PBS 0

실시예 6 :
(i) o-라피노스 중합 헤모글로빈 (폴리OR-Hb-TX)의 트롤록스 콘쥬게이트의 양산방법
미국 특허 제5,532,352호 (Pliura et al.)에 개시된 방법에 따라서 o-라피노스 중합된 헤모글로빈 (폴리OR-Hb)을 제조하였다. 4.01g의 트롤록스를 40㎖ 아세토니트릴중의 EDC 3.07g과 실온에서 10 -20분 동안 반응시켰다. 이 용액을 2L의 126mM MES 버퍼 (pH 7.0)중의 18.9g 폴리OR-Hb에 가하였다. 3.5 시간후 및 21 시간후에 동량의 트롤록스 / EDC를 첨가하여 총 3회 첨가하였다. 반응 내내 반응액을 22℃에서 CO 기체 하에서 교반하였다. 26시간의 총 반응시간 경과후, 이 용액을 여과한 다음, 물, 인산염 완충식염수, 및 링거 락트산염 (Ringer's lactate)에 대하여 투석시켜서 최종 Hb 농도가 77 ㎎/㎖가 되도록 하였다. 링거 락트산염 투석이 진행되는 동안 묽은 NaOH를 이용하여 pH를 7.4로 조절하였다. 크로마토그래피 결과 유리 트롤록스가 검출되지 않았다. 더 분석하기에 앞서 생성물 일부를 산화시켰다.
ⅱ) 용혈에 대한 RBC의 시험관내 보호방법 :
실시예 1에 개시된 방법을 이용하여 폴리OR-Hb-TX의 항산화 활성을 측정하였다. 테스트된 생성물은 산소와 CO-용해 폴리OR-Hb (TX 또는 EDC로 처리하지 않음), 전술한 대로 산화반응 전에 저장된 CO-용해 생성물, 및 산화 생성물을 포함하고 있었다. 모든 생성물들을 RBC 용혈 분석 현탁액에 11.7 ㎎/㎖로 존재하였다. 결과를 하기 표 8에 나타내었다. 이들 결과로부터, 대조군보다는 산화형 및 카보모노옥시 형의 트롤록스 콘쥬게이트에 의하여 RBC가 용혈로부터 더 우수하게 보호되는 것을 알 수 있다.
[표 8] 폴리OR-Hb-TX 및 대조군에 의한 항산화 보호율
샘플 AAPH 대조군 대비 AUC (%)
AAPH 100
폴리OR-Hb (Oxy형) 39
폴리OR-Hb (CO형) 47
폴리OR-Hb-TX (Oxy형) 15
폴리OR-Hb-TX (CO형) 6
PBS 0

실시예 7 - 의식있는 랫트에게 10% 톱로드 주입 (topload infusion)후 폴리OR-Hb-TX의 혈핵역학적 효과
체중이 250 - 350g인 숫컷 스프래드-돌리 랫트 (Sprague-Dawley rat)를 실험일에 이소플루란으로 마취시켰다. 우측 넙다리 동맥과 정맥에 캐뉼라를 삽입하였다. 외과시술로부터 회복한지 1.5시간후에 의식이 돌아온 대사 우리 (metabolic cage) 안의 동물들에게 다음의 두가지 용액: 실시예 6에서 제조된 산화된 폴리OR-TX 또는 폴리OR-Hb (TX-EDC 처리하지 않음; 두 용액 모두 링거 락트산염 용액에서 7.7 g/dl임)중 어느 하나를 주입하였다. 주입된 부피는 동물의 예상 혈액량의 10%에 해당한다. 평균 동맥 혈압 (MAP)와 심박수 (HR)을 주입하기 30분 전에 기록하여 주입시 및 주입후 2시간 동안에 대한 기준값을 정하였다 (도 3 및 4). 4마리 동물을 2개 그룹 각각에 대하여 테스트하였다. 주입전의 기저 MAP는 101±4 ㎜Hg (폴리OR-Hb) 및 110±3 ㎜Hg (폴리OR-Hb-TX)였다. 주입후에는 MAP가 102±7 ㎜Hg 및 151±1 ㎜Hg (각각 폴리OR-Hb 및 폴리OR-Hb-TX)로 현저하게 (P<0.01) 증가하였 다. 상승차는 두 군에서 크게 다르지 않았다 (P>0.05). 주입전 HR은 407±17 bpm (분당 박동수) 및 394±17 bpm (각각 폴리OR-Hb 및 폴리OR-Hb-TX)이었다. 주입후 HR은 345±16 bpm 및 316±10 bpm(각각, 폴리OR-Hb 및 폴리OR-Hb-TX)로 현저하게 감소하였다 (P<0.01). 두 군간의 감소차는 크게 다르지 않았다 (P>0.05). 트롤록스의 콘쥬게이션은 본 연구에서 HBOC 폴리OR-Hb의 혈액역학적 특성을 변경시키지 않았다.
실시예 8 - 산소 제거 조건하의 콘쥬게이션
트롤록스를 탈산소 조건하에서 폴리OR-Hb에 콘쥬게이트시켜서 P50이 높고 HBOC로 이용하기에 훨씬 적합한 생성물을 제조하였다. 통상의 방법에 따라서 폴리OR-Hb와 MES 버퍼를 탈산소시켰다. 실온에서, 0.78g의 트롤록스를 4㎖의 아세토니르틸중 0.60g EDC와 10 - 20분 동안 반응시켰다. 이 용액을 200㎖의 120mM MES (pH 7.0)중의 2.04g 폴리OR-Hb에 가하였다. 4시간 및 21시간 후에 두번 동량 첨가하였다. 최초 첨가한지 27시간 경과후에 반응 혼합물을 CO 기체로 충전시키고, 여과 및 농축시킨 다음 PBS에 대하여 집중적으로 투석하였다. 헤목스-분석기 (Hemox-Analyzer; TCS Instruments, Southampton, Pennsylvania, U.S.A.)를 이용하여 분석한 결과, 출발물질인 폴리OR-Hb, 이 실시예에서 제조된 콘쥬게이트 및 실시예 6에서 제조된 콘쥬게이트의 P50은 37℃에서 각각 41, 40 및 16mmHg였다.
실시예 9 - 항산화 활성의 비교
실시예 1에 개시된 방법을 이용하여, 탈산소 조건 (실시예 8) 및 CO 조건 ( 실시예 6) 하에 제조된 폴리OR-Hb-TX 생성물의 항산화 활성을 측정하였다. 샘플을 CO-용해시키고 RBC 분석 현탁액중의 콘쥬게이트 및 대조군 농도는 12 ㎎/㎖이었다. 테스트 용액에서 수용성 한도의 1배 및 0.5배인 2개의 트롤록스 농도뿐 아니라 동일 농도의 폴리OR-Hb를 평가하였다.
콘쥬게이트는 모두 폴리OR-Hb 및 트롤록스 대조군에 비해 보다 우수한 보호 효과를 나타냈다. 결과를 하기 표 9에 나타냈다. 보호 효과를 탈산소 조건 및 CO 조건하에서 제조된 생성물과 비교하였다.
[표 9]
샘플 (모든 샘플은 CO형 Hb-함유 샘플임) AAPH 대조군 대비 AUC (%)
AAPH 100
트롤록스 (0.26mM) 87
트롤록스 (0.52mM) 70
폴리OR-Hb (12 ㎎/㎖) 28
폴리OR-Hb-TX (실시예 6으로부터 제조됨, 12 ㎎/㎖) 0
폴리OR-Hb-TX (실시예 8로부터 제조됨, 12 ㎎/㎖) 3
PBS 0

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  7. 산소 운반 물질과, 항산화 특성을 가지며 하기 화학식으로 표시되는 6-히드록시 크로만 화합물의 반응 생성물을 필수적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화학적 조성물.
    Figure 112006065915163-pct00005
    식중, R1, R2 및 R3는 H, C1 - C8 알킬 및 (CH2)nX (식중, n은 0 내지 20의 정수임)로부터 독립적으로 선택되고; R, R4, R5 및 R6는 H, C1 - C20 알킬, X 및 (CH2)mX (식중, m은 0 - 20의 정수임)로부터 독립적으로 선택되며; X는 할로, 카르복실, 아미노, 히드록실, 티올, 아지드, 아조, 알데하이드 및 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기이다.
  8. 제7항에 있어서, 상기 산소 운반 물질이 헴-단백질 고분자이고, X는 상기 헴 단백질 고분자의 단백질 사슬의 아미노산 잔기와 반응할 수 있는 관능기로서 할로, 카르복실, 아미노, 히드록실, 티올, 아지드, 아조, 알데하이드 및 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 헴-단백질 고분자가 헤모글로빈종인 것을 특징으로 하는 화학적 조성물.
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  11. 제7항에 있어서, 상기 크로만 화합물이 하기 화학식으로 표시되는 크로만 카르복실산인 것을 특징으로 하는 화학적 조성물.
    Figure 112006065915163-pct00006
    식중, R'는 H 또는 탄소수 1 - 20의 알킬 라디칼이고, R'1, R'2 및 R'3는 H 및 C1 - C4 알킬로부터 독립적으로 선택되며, R'4는 탄소수 n의 알킬 사슬(n은 0이거나 1 내지 8의 정수)이다.
  12. 제11항에 있어서, 상기 크로만 화합물과 인간 헤모글로빈의 공유 결합 콘쥬게이트인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 콘쥬게이트의 헤모글로빈이 가교제에 의하여 변성된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 헤모글로빈이 상기 가교제에 의해 일부 또는 전부가 안정화되어 안정화된 사량체 단위(stabilized tetrameric unit)를 형성하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 콘쥬게이트의 헤모글로빈이 12개 이하의 안정화된 사량체 단위로 된 올리고머로 일부 또는 전부가 올리고머화된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제13항에 있어서, 크로만 카르복실산에 콘쥬게이트된 안정화된 사량체 헤모글로빈 단위와 크로만 카르복실산에 콘쥬게이트된 안정화된 헤모글로빈 단위 2 - 8개로 된 올리고머의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제13항에 있어서, 상기 헤모글로빈이 폴리알데하이드, 글루타르알데하이드, 디아스피린 화합물, 피리독실 화합물 또는 트리메소일 화합물로 변성되거나 가교된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 헤모글로빈이 폴리사카라이드의 산화 개환 반응으로부터 유도된 폴리알데하이드로 가교된 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 폴리사카라이드가 라피노스인 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제12항 내지 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤모글로빈-크로만 화합물 콘쥬게이트가 생물친화성 폴리머에 결합된 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 생물친화성 폴리머가 폴리에틸렌 글리콜, 폴리사카라이드, 폴리아미노산 또는 불용성 지지체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제11항에 있어서, 크로만 카르복실산의 화학식에서 R'1, R'2 및 R'3 중 하나 이상이 메틸인 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제11항에 있어서, 상기 크로만 카르복실산의 화학식 중, R'4에서 n이 0인 것을 특징으로 하는 조성물.
  24. 제11항에 있어서, 상기 크로만 카르복실산이 2,5,7,8-테트라메틸-2-카르복시-크로만-6-올인 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. 헤모글로빈과 제7항 기재의 히드록시 크로만 화합물을 화학적으로 반응시켜서 공유 결합된 화학적 콘쥬게이트를 형성하는 것을 특징으로 하는, 항산화 활성을 갖는 헤모글로빈 조성물의 제조방법.
  26. 제25항에 있어서, 헤모글로빈을 히드록시 크로만 화합물에 콘쥬게이션하기 전에 가교제와 반응시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  27. 제25항에 있어서, 헤모글로빈-히드록시 크로만 화합물 콘쥬게이트를 헤모글로빈 가교제와 후속 반응시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 가교제가 폴리알데하이드인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 폴리알데하이드가 o-라피노스인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 헤모글로빈이 o-라피노스와의 추가 반응에 의하여 전부 또는 일부가 올리고머화되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  31. 제25항에 있어서, 헤모글로빈과 히드록시 크로만 화합물 간의 반응이 활성화 화합물의 존재하에서 실시되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 활성화 화합물이 카보디이미드인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 카보디이미드가 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸 카 보디이미드인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  34. 제25항 내지 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 히드록시 크로만 화합물이 2,5,7,8-테트라메틸-2-카복시-크로만-6-올인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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