CN103690978A - 一种用于血红蛋白及血红蛋白氧载体灭活病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种人源或动物源的血红蛋白及血红蛋白氧载体的病毒灭活方法，从而将其可能含有的病毒部分或全部去除。待处理的血红蛋白或血红蛋白氧载体为溶液形态；该方法包括以下步骤：先用惰性的气体将待处理的血红蛋白或血红蛋白氧载体进行脱氧，然后用强还原剂除去溶液中残余的氧，防止亚铁血红蛋白的氧化，降低溶液至pH4.0左右，在此条件下维持足够时间充分将病毒灭活；再将pH调至7.0—9.0之间，用透析或者超滤的方法将溶液更换为生理溶液后，收集得到的溶液即为灭活病毒后的血红蛋白或者血红蛋白氧载体溶液。

Description

一种用于血红蛋白及血红蛋白氧载体灭活病毒的方法

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及以血红蛋白（hemoglobin,Hb）为原料制备生物制品时病毒灭活的方法。

背景技术

用人或者动物的血红蛋白制备生物制品，为防止病毒的交叉感染，其生产工艺须具备一定的去除/灭活部分病毒能力，将其可能含有的病毒部分或全部去除。

由于不同生物制品潜在的病毒种类不同，所选择病毒去除/灭活方法的侧重点也应有所不同，故而有多种去除/灭活的方法。根据生物我国生物制品《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》，常用的方法有：⑴巴斯德消毒法（巴氏消毒法）；⑵干热法（冻干制品）；⑶有机溶剂/去污剂（S/D）处理法；⑷膜过滤法；⑸低pH孵放法；⑹化学灭活方法。其中低pH孵放法作为一种病毒灭活方法，常见用于生产人免疫球蛋白。

无基质血红蛋白（stroma-free hemoglobin,SFH）具有携氧释氧的能力，一直以来被作为氧载体制剂进行研究代替红细胞的功能，具有潜在的临床应用价值，由人或动物血红蛋白开发出来的代替红细胞携氧释氧功能的制剂被称为血红蛋白氧载体（Hemoglobin-based oxygen carriers,HBOCs）。这种制剂主要通过稳定血红蛋白四聚体并增加分子量或是分子半径的手段来克服天然血红蛋白的缺陷。目前开发的产品主要有四类：（1）聚合血红蛋白；（2）共轭血红蛋白；（3）分子内交联血红蛋白；（4）重组人血红蛋白。

在哺乳动物中，血红蛋白在天然状态下，它由两对亚基组成（2αβ），是一个四聚体的蛋白结构，分子量约为64,000道尔顿，每个亚基上有一个铁卟啉，当铁元素处于II价时，血红蛋白具有携氧释氧的能力，称为亚铁血红蛋白，结合了氧的血红蛋白称为氧合血红蛋白，未结合氧的亚铁血红蛋白称为脱氧血红蛋白；当铁元素处于III价时，铁元素被氧化，血红蛋白不具有携氧释氧的能力，称为高铁血红蛋白。血红蛋白氧载体必须使血红蛋白处于亚铁血红蛋白蛋白时才具有携氧释氧的功能。

不过，由于在低pH条件下，亚铁血红蛋白非常容易被氧化成高铁血红蛋白，因此，本领域技术人员从未考虑采用低pH孵放法对血红蛋白及由其为原料的血红蛋白氧载体进行病毒灭活。

发明内容

本发明的目的是提供一种人源或动物源的血红蛋白及血红蛋白氧载体的病毒灭活方法，从而将其可能含有的病毒部分或全部去除。

本发明的基本原理是：待处理的血红蛋白或血红蛋白氧载体为溶液形态；该方法是先将此溶液用性质较为惰性的气体（常温常压下不溶于水且不与血红蛋白反应的气体）进行脱氧，然后再借鉴低pH孵放法进行灭活病毒，结束后，将pH恢复至中性或碱性，即完成了病毒灭活的过程。

本发明的基本解决方案如下：

先用惰性的气体将待处理的血红蛋白或血红蛋白氧载体进行脱氧，所述惰性的气体可以是氮气、氦气、氖气、氩气、氙气、氡气、氢气等；然后用强还原剂除去溶液中残余的氧，防止亚铁血红蛋白的氧化，降低溶液至pH4.0左右，在此条件下维持足够时间充分将病毒灭活；再将pH调至7.0—9.0之间，用透析或者超滤的方法将溶液更换为生理溶液后，收集得到的溶液即为灭活病毒后的血红蛋白或者血红蛋白氧载体溶液。

具体的方案如下：

步骤1：在密闭容器中加入待处理的血红蛋白或者血红蛋白氧载体溶液并进行搅拌，将容器连接气体交换膜，液相一侧接通溶液，气相一侧连接惰性的气体，对血红蛋白或血红蛋白氧载体进行脱氧，在溶液上方同时也通入惰性的气体，将溶液上方的空气排出；或者仅在溶液上方连续通入惰性的气体以降低氧分压使血红蛋白脱氧；待脱氧血红蛋白大于95%且氧分压低于2mmHg时进行步骤2；

步骤2：加入连二亚硫酸钠，去除残余的氧；

步骤3：逐滴加入酸，使溶液pH逐渐降低至4.0±0.2，继续通入惰性的气体或停止通入惰性的气体但密封容器，阻止容器内部与大气交换；

步骤4：低于20℃条件下，搅拌21天；

步骤5：逐滴加入碱，使溶液pH升至7.0以上，此时溶液可接触大气；

步骤6：用透析或者超滤的方法将含有连二亚硫酸钠的溶液系统更换为生理溶液系统；收集得到的溶液即为灭活病毒后的血红蛋白或者血红蛋白氧载体溶液。

基于以上具体方案，本发明对各个环节做如下优化：

步骤2加入5%-12%（质量分数）连二亚硫酸钠，使其终浓度达到1%，反应1.5h，去除残余的氧。

步骤3所用的酸为盐酸或硫酸。

步骤4是在4℃～15℃条件下，搅拌21天。

步骤5所用的碱为氢氧化钠或氢氧化钾，使溶液pH升至7.2～7.7。

步骤6是以生理盐水为透析液，充分透析步骤5所得溶液系统，收集得到的溶液即为灭活病毒后的血红蛋白或者血红蛋白氧载体溶液。

或者，步骤6是以乳酸林格氏液为透析液，以30kDa超滤膜将步骤5所得溶液系统更换为乳酸林格氏液系统，更换完毕收集得到的溶液即为灭活病毒后的血红蛋白或者血红蛋白氧载体溶液。

本发明具有以下优点：

①实现了在低pH条件下对血红蛋白或血红蛋白氧载体进行病毒灭活；②不会引起亚铁血红蛋白的氧化，可使血红蛋白维持最初的生理活性状态；③对血红蛋白及血红蛋白氧载体都适用，特别是血红蛋白氧载体，血红蛋白氧载体可以被制备成氧亲和力较低的形式，将其转化为脱氧血红蛋白时更容易。

具体实施方式

考虑到在低pH条件下，亚铁血红蛋白非常容易被氧化成高铁血红蛋白，因此，本发明在借鉴低pH孵放法进行病毒灭活时，首先对血红蛋白及由其为原料的血红蛋白氧载体进行脱氧，使之转化为脱氧血红蛋白，然后再采用低pH孵放法进行灭活病毒。

以下给出三例病毒灭活验证实验，并相应限定了较佳的具体操作环节和参数；但以下示例不应理解为对本发明权利要求的限制。

实施例一：

步骤1：在一可密闭容器中加入10mg/mL的猪血红蛋白80mL，再加入10ml猪伪狂犬病毒（PRV），搅拌，在溶液上方通入氮气，再将蛋白溶液用气体交换膜进行脱氧处理，液相一侧接溶液，气相一侧通入氮气，将亚铁血红蛋白转化成脱氧血红蛋白，待转化率大于95%并且溶液中的氧分压低于2mmHg时进行步骤2；

步骤2：加入10mL10%连二亚硫酸钠，使其终浓度达到1%，反应1.5h，去除残余的氧；

步骤3：逐滴加入0.5mol/L盐酸，使溶液pH逐渐降低至4.0左右，停止通入氮气，密封容器，阻止容器内部与大气交换；

步骤4：在15℃条件下，搅拌21天；

步骤5：逐滴加入0.5mol/L氢氧化钠，使溶液pH升至7.5，打开容器；

步骤6：以氯化钠为透析液，充分透析上述溶液，收集得到的蛋白溶液即为灭活病毒后的蛋白溶液。

分别在灭活前、灭活后第2、7、12、17、21天取样，生理盐水透析后，用细胞感染法检测灭活过程中病毒残余的滴度，细胞为叙利亚仓鼠肾细胞系（BHK-21），检验结果病毒滴度降大于4log值，通过盲传三代实验，也未发现细胞异常，无病毒毒性。

实施例二：

步骤1：在一可密闭容器中加入7mg/mL的猪血红蛋白90mL，其中PRV病毒滴度大于6log值；搅拌，在溶液上方通入氮气，将亚铁血红蛋白转化成脱氧血红蛋白，待转化率大于95%并且溶液中的氧分压低于2mmHg时进行步骤2；

步骤2：加入10mL12%连二亚硫酸钠，使其终浓度达到1.2%，反应2.0h，去除残余的氧；

步骤3：逐滴加入0.4mol/L盐酸，使溶液pH逐渐降低至4.1，停止通入氮气，密封容器，阻止容器内部与大气交换；

步骤4：在8℃条件下，搅拌21天；

步骤5：逐滴加入1mol/L氢氧化钠，使溶液pH升至7.4，打开容器；

步骤6：以生理盐水为透析液，以20倍的体积透析蛋白溶液，每6小时一次，共透析4次，收集得到的蛋白溶液即为灭活病毒后的蛋白溶液。

分别在灭活前、灭活后第2、7、12、17、21天取样，生理盐水透析后，用细胞感染法检测灭活过程中病毒残余的滴度，细胞为叙利亚仓鼠肾细胞系（BHK-21），检验结果病毒滴度降大于4log值，通过盲传三代实验，也未发现细胞异常，无病毒毒性。

实施例三：

步骤1：在一可密闭容器中加入4mg/mL的聚合猪血红蛋溶液（血红蛋白氧载体）80mL，其中PRV病毒滴度大于6log值；搅拌，在溶液上方通入氩气，再将气体交换膜液相一侧接蛋白溶液，气相一侧接氩气，将亚铁血红蛋白转化成脱氧血红蛋白，待转化率大于95%并且溶液中的氧分压低于2mmHg时，撤去气体交换膜；

步骤2：加入20mL5%连二亚硫酸钠，使其终浓度达到1%，反应1.5h，去除残余的氧；

步骤3：逐滴加入0.6mol/L硫酸，使溶液pH逐渐降低至4.0左右，继续通入氩气，阻止容器内部与大气交换；

步骤4：在15℃条件下，搅拌21天；

步骤5：逐滴加入0.7mol/L氢氧化钾，使溶液pH升至7.7，停止通入氩气，打开容器；

步骤6：以乳酸林格氏液为透析液，以30kDa超滤膜将溶液系统更换为乳酸林格氏液系统，更换完毕收集得到的蛋白溶液即为灭活病毒后的聚合猪血红蛋溶液。

分别在灭活前、灭活后第2、7、12、17、21天取样，生理盐水透析后，用细胞感染法检测灭活过程中病毒残余的滴度，细胞为叙利亚仓鼠肾细胞系（BHK-21），检验结果病毒滴度降大于4log值，通过盲传三代实验，也未发现细胞异常，无病毒毒性。

Claims (9)

1.一种用于血红蛋白及血红蛋白氧载体灭活病毒的方法，待处理的血红蛋白或血红蛋白氧载体为溶液形态；该方法包括以下步骤：

先用惰性的气体将待处理的血红蛋白或血红蛋白氧载体进行脱氧，然后用强还原剂除去溶液中残余的氧，防止亚铁血红蛋白的氧化，降低溶液至pH4.0左右，在此条件下维持足够时间充分将病毒灭活；再将pH调至7.0—9.0之间，用透析或者超滤的方法将溶液更换为生理溶液后，收集得到的溶液即为灭活病毒后的血红蛋白或者血红蛋白氧载体溶液。

2.根据权利要求1所述的用于血红蛋白及血红蛋白氧载体灭活病毒的方法，其特征在于：所述惰性的气体为氮气、氦气、氖气、氩气、氙气、氡气或氢气。

3.根据权利要求2所述的用于血红蛋白及血红蛋白氧载体灭活病毒的方法，其特征在于，该方法具体步骤如下：

步骤（1）：在密闭容器中加入待处理的血红蛋白或者血红蛋白氧载体溶液并进行搅拌，将容器连接气体交换膜，液相一侧接通溶液，气相一侧连接惰性的气体，对血红蛋白或血红蛋白氧载体进行脱氧，在溶液上方同时也通入惰性的气体，将溶液上方的空气排出；或者仅在溶液上方连续通入惰性的气体以降低氧分压使血红蛋白脱氧；待脱氧血红蛋白大于95%且氧分压低于2mmHg时进行步骤（2）；

步骤（2）：加入连二亚硫酸钠，去除残余的氧；

步骤（3）：逐滴加入酸，使溶液pH逐渐降低至4.0±0.2，继续通入惰性的气体或停止通入惰性的气体但密封容器，阻止容器内部与大气交换；

步骤（4）：低于20℃条件下，搅拌21天；

步骤（5）：逐滴加入碱，使溶液pH升至7.0以上，此时溶液可接触大气；

步骤（6）：用透析或者超滤的方法将步骤（5）所得溶液系统更换为生理溶液系统；收集得到的溶液即为灭活病毒后的血红蛋白或者血红蛋白氧载体溶液。

4.根据权利要求3所述的用于血红蛋白及血红蛋白氧载体灭活病毒的方法，其特征在于：步骤（2）加入5%-12%（质量分数）连二亚硫酸钠，使其终浓度达到1%，反应1.5h，去除残余的氧。

5.根据权利要求3所述的用于血红蛋白及血红蛋白氧载体灭活病毒的方法，其特征在于：步骤（3）所用的酸为盐酸或硫酸。

6.根据权利要求3所述的用于血红蛋白及血红蛋白氧载体灭活病毒的方法，其特征在于：步骤（4）是在4℃～15℃条件下，搅拌21天。

7.根据权利要求3所述的用于血红蛋白及血红蛋白氧载体灭活病毒的方法，其特征在于：步骤（5）所用的碱为氢氧化钠或氢氧化钾，使溶液pH升至7.2～7.7。

8.根据权利要求3所述的用于血红蛋白及血红蛋白氧载体灭活病毒的方法，其特征在于：步骤（6）是以生理盐水为透析液，充分透析步骤（5）所得溶液系统，收集得到的溶液即为灭活病毒后的血红蛋白或者血红蛋白氧载体溶液。

9.根据权利要求3所述的用于血红蛋白及血红蛋白氧载体灭活病毒的方法，其特征在于：步骤（6）是以乳酸林格氏液为透析液，以30kDa超滤膜将步骤（5）所得溶液系统更换为乳酸林格氏液系统，更换完毕收集得到的溶液即为灭活病毒后的血红蛋白或者血红蛋白氧载体溶液。