FI105256B - Menetelmä verenkorvikkeena käytettäväksi tarkoitetun koostumuksen valmistamiseksi - Google Patents

Description

105256

Menetelmä verenkorvikkeena käytettäväksi tarkoitetun koostumuksen valmistamiseksi * Tämä keksintö koskee menetelmiä verenkorvikkeena 5 käytettäväksi tarkoitetun koostumuksen valmistamiseksi.

Tarkemmin määriteltynä se koskee menetelmää uuden hemoglo-biinikoostumuksen valmistamiseksi, joka on tehokas elämän ylläpitämisessä vakavan verenvuodon jälkeen eri lajisissä eläimissä, mahdollisesti ihmisissä, ja myrkytön.

10 Keksinnön tausta

Verellä on monia tehtäviä, jotka kaikki ovat elintärkeitä. Vakava verenvuoto vaarantaa kuitenkin elämän kahdesta pääsyystä: (1) kierrossa olevan veritilavuuden lasku vähentää kudosperfuusiota (iskemia) ,· ja (2) hapen-15 kuljetuksen väheneminen heikentää kudoksen happitilannetta (hypoksia). Verenkiertojärjestelmä reagoi näihin muutoksiin verisuonten supistumisella, joka edelleen pahentaa iskemiaa ja hypoksiaa. Lopulta kehittyy solujen metaboliassa ja toiminnassa muutoksia, jotka johtavat sokkiin ja 20 kuolemaan.

Tässä yhteydessä "verenkorvike" ei ole valmiste, joka voi korvata veren kaikkien sen toimintojen suhteen, vaan hätätilanteissa käytettävä elvytysneste, jolla on kyky (a) palauttaa veritilavuus, (b) kuljettaa happea ja j 25 (c) vähentää verinsuonten supistumista. On ilmeistä, että tämän nesteen tulee olla vapaa toksisista sivuvaikutuksista samoin kuin sairaudenaiheuttajista, kuten bakteereista ja viruksista.

Hemoglobiini verenkorvikkeena 30 Yli 50 vuoden ajan pyrkimykset kehittää verenkorvi- '· .. kettä ovat keskittyneet hemoglobiiniin (Hb) , koska se on ainoa aine, jolla on kyky ottaa vastaan kylliksi happea • ilmasta toimiakseen fysiologisena hapenkantajana. Lisäksi hemoglobiinilla on sama kolloidisosmoottinen paine kuin 35 seerumin albumiinilla, ja se voi siksi toimia plasmatila- 2 105256 vuuden suurentajana. Nämä yritykset eivät kuitenkaan ole olleet menestyksellisiä monien ongelmien vuoksi, jotka on tunnistettu hitaasti ja ovat vaikeita ratkaista. Näitä ongelmia ovat: (1) myrkyllisyys, joka johtuu hemoglobiinin 5 kontaminoitumisesta (a) ympäristön bakteeriendotoksiineil-la, (b) peruskudoksen fosfolipideillä ja (c) ei-hemipro-teiineilla ja -peptideilä; hemoglobiinin korkea happiaf-finiteetti liuoksessa, joka häiritsee hapen vapautumista kudoksiin; (3) Hb-molekyylin epästabiilius, johon liittyy 10 taipumus poistua suonista ja erittyä nopeasti munuaisten kautta; (4) hemoglobiinin itsehapettumistaipumus, jolloin muodostuu met-Hb:a (toimimatonta Hb:a) ja myrkyllisiä vapaita happiradikaaleja; ja (5) Hb:n kyky veren sivutuotteena välittää vereen liittyviä sairauksia, kuten hepa-15 tiittia ja AIDSia.

Historiallisesti ensimmäinen tiedostettu ongelma oli myrkyllisyys, ts. Hb-liuosten kyky aktivoida verisuon-tensisäinen veren koaguloituminen ja vahingoittaa munuaisia. Rabiner teki 1960-luvulla tunnetuksi havainnon, että 20 tällainen toksisuus johtuu punasolujen peruskudoksesta (punasolujen kalvofragmenteista) eikä Hb:sta. Hän painotti "peruskudoksettoman hemoglobiinin" tarvetta. Tämä ehto on kuitenkin vuosien varrella olut ristiriidasa sen tosiasian kanssa, että kaikista peruskudoselementeistä todella va-; 25 paata hemoglobiinia ei ole tuotettu. Punasolujen kalvon toksisiksi tekijöiksi on tunnistettu aminofosfolipidit fosfatidyylietanoliamiini (PE) ja -seriini (PS), jotka normaalisti sijaitsevat kalvon sytoplasmapuolella [M. Feo-la et ai., Toxic factors in the red blood cell membrane", 30 The Journal of Trauma 29 (1989) 1065 - 1075]. On havaittu, että näillä yhdisteillä on erityinen affiniteetti Hb:n suhteen (ne on vaikeampi poistaa Hb-liuoksesta kuin muut peruskudoskomponentit) ja infusoitaessa PE:n ja PS:n kon-taminoimaa Hb:a koe-eläimiin (kaniineihin ja apinoihin) 35 merkittäviä tilavuuksia (vähintään 1/3 eläimen lasken- 3 105256 nallisesta veritilavuudesta) se aiheuttaa "systeemisen tulehdusreaktion", jolle on tunnusmerkillistä suonensisäisen koagulaation ja komplementin aktivaatio, leukosyyttien ja verihiutaleiden aktivaatio ja iskemia-tulehdusvaurioiden 5 kehittyminen elintärkeissä elimissä [M. Feola et ai., Toxicity of polymerized hemoglobin solutions. Surgery, Gynecology and Obstetrics 166 (1988) 211 - 222; M. Feola et al., Complement activation and the toxicity of stroma-free hemoglobin solutions in primates, Circulatory Shock 10 25 (1988) 275 - 290].

Vasta vähän aikaa sitten tunnistettu ongelma on Hb-liuosten helppo kontaminoituminen ympäristön bakteeriendo-toksiineilla. Ennen molukkirapuamebosyyttilysaattitestin kehittämistä US-farmakopea on ollut riippuvainen kaniinil-15 la tehtävästä pyrogeenisyystestistä määrityksenä endotok-siinien havaitsemiseksi. Edellä mainituissa artikkeleissa on myös raportoitu, että hemoglobiini, jossa on endotok-siiniepäpuhtauksia pitoisuuksina, jotka ovat selvästi py-rogeenisyystason alapuolella, aiheuttaa samankaltaista 20 toksisuutta kuin aminofosfolipidien kontaminoima hemoglobiini (endotoksiinin myrkyllinen komponentti on itse asiassa lipidi, "lipidi A"). Bakteeriendotoksiineja voidaan poistaa biologisista liuoksista käyttämällä affini-teettikromatografiakolonneja, kuten Detoxi-Gel-kolonneja ; 25 (Pierce Chemical Co.). Nämä kolonnit eivät kuitenkaan pys ty poistamaan kaikkea endotoksiinia, jos lähtömateriaali sisältää yli 2 endotoksiiniyksikköä millilitraa kohden [määritettynä käyttämällä "kvantitatiivista kromogeenista molukkiraputestiä" (QCL-1000, Whittaker M.D. Bioproducts), 30 jonka mukaan 1 endotoksiiniyksikkö (EU) = 0,1 nanogrammaa • .. bakteerilipopolysakkaridia.

Hemoglobiini täytyy puhdistaa ei-hemiproteiineista • ja -peptideistä. Vaikka toksisuutta ei ole liitetty minkään määrätyn proteiinin läsnäoloon, puhdistukseen antaa 35 aiheen tarve vähentää Hb-liuosten immunogeenisyyttä. On 4 105256 myös esitetty ajatus, että jokin peptidi aiheuttaa Hb-liuosten vasokonstriktorivaikutuksen, joka havaitaan eristetyissä elimissä (sydämessä ja munuaisessa) ja eristetyissä valtimoissa. Alalla tunnetaan erilaisia menetelmiä 5 tällaisen puhdistuksen tekemiseksi. Niihin kuuluvat (1) sentrifugointi ja suodatus (Dodzi, US-patenttijulkaisu 3 991 181); (2) tolueeniuutto (Bonsen et ai., US-patentti-julkaisut 4 001 200 ja 4 001 401); (2) ultrasuodatus (Kot-he et ai., US-patenttijulkaisu 4 526 715); (4) ultrasuoda-10 tus ynnä happosaostus (Bonhard et ai., US-patenttijulkaisut 4 136 093 ja 4 336 248); (5) ioninvaihtokromatografia (Meiller, US-patenttijulkaisu 4 100 149); (6) sinkkisaos-tus (Tye, US-patenttijulkaisut 4 473 494 ja 4 529 719); ja (7) kiteytys [DeVenuto et ai., Journal of Laboratory and 15 Clinical Medicine 89 (1977) 509 - 514]. Menetelmissä 1-4 on kuitenkin luontaisia rajoituksia, jotka koskevat kykyä erottaa täydellisesti Hb muista proteiineista, kun taas menetelmät 5-7 eivät sovellu laajamittaiseen puhdistukseen.

20 Yksi 1970-luvulla tunnistettu ongelma on liuoksessa olevan Hb:n korkea happiaffiniteetti. Tämä on ominaisuus, joka säätelee hemoglobiinin kykyä ottaa vastaan happea ilmasta keuhkoissa ja vapauttaa se kudoksiin. Yksi tämän ominaisuuden ilmaisutapa on P50-arvo (hapen osapaine, jossa : 25 Hb kyllästyy 50-%:isesti). Mitä alhaisempi P50 on, sitä suurempi on hemoglobiinin kyky sitoa happea, mikä merkitsee alentunutta kykyä vapauttaa se kudoksiin. Ihmisveren P50 on noin 28 mmHg, kun taas ihmisen Hb:n P50 on liuoksessa noin 13 mmHg. Ero johtuu siitä, että punasolussa Hb reagoi 30 2,3-difosfoglyseraatin (2,3-DPG:n) kanssa, mikä alentaa

Hb:n affiniteettia hapen suhteen. Punasolun ulkopuolella tämä vuorovaikutus häviää. Seurauksena on, että Hb sitoo 02:n niin tiukasti, että lakkaa toimimasta 02:n kantajana. Tämän ongelman ratkaisemiseksi Benesch et ai. ovat kehit-35 täneet Hb:n kovalenttisen reaktion pyridoksaali-5'-fos- 5 105256 faatin, erään "2,3-DPG-analogin" kanssa. Aluksi toivottiin, että manitunlainen reaktio sekä heikentäisi happi-affiniteettia että stabiloisi Hb-molekyylin tetrameeriseen muotoon. Tämä ei kuitenkaan ole toteutunut. Naudan hemo-5 globiinilla on kuitenkin liuoksessa sama P50-arvo kuin ihmisen verellä, ja sen happiaffiniteettia säätelevät kloridit 2,3-DPG:n sijasta [M. Feola et ai., Development of a bovine stroma-free hemoglobin solution as a blood substitute, Surgery, Gynecology and Obstetrics, 157 (1983) 399 -10 408]. Kun otetaan huomioon tämä suotuisa ominaisuus ynnä naudan punasolujen saatavuus suurina määrinä ja puhtaan hemoglobiinin alhainen antigeenisuus nisäkkäiden kesken, on olemassa etuja, jotka puolustavat naudan hemoglobiinin käyttöä verenkorvikkeen pohjana.

15 Yksi 1970-luvulla tunnistettu ongelma on hemoglo biinin nopea poistuminen verisuonista ja lyhyt viipymisai-ka suonissa. Tämä liitetään yleensä Hb-tetrameerien, α2β2, taipumukseen hajota dimeereiksi, 2αβ, jotka läpäisevät helpommin hiussuoniston. Nyt näyttää siltä, että proteii-20 nin pinnan sähkövarauksella on myös tärkeä merkitys; elek-tronegatiivisuus ja alhainen isoelektrinen piste suosivat viipymistä verisuonissa. Hemoglobiinin poistumisella verisuonista on muutamia epätoivottavia vaikutuksia: (1) plasmatilavuutta suurentava vaikutus on lyhytkestoinen; (2) : 25 Hb:n kulku munuaiskerästen läpi saa aikaan osmoottisen diureettisen vaikutuksen, joka pienentää plasmatilavuutta sen ylläpitämisen sijasta; (3) Hb:n takaisinabsorboitumi-nen munuaistiehyeissä vahingoittaa tiehytsoluja; ja (4) Hb:n kulku välitilanesteisiin aiheuttaa turvotusta ja so-30 luvaurioita. Tekniikan tason mukaisesti on keskitytty yk-; . sinomaan Hb:n dimeroitumisen ehkäisemiseen. Tähän tarkoi tukseen on kehitetty kolmea tyyppiä olevia tapoja muuntaa Hb:a: (a) molekyylienvälinen silloitus (polymerointi ); (b) Hb:n kytkeminen muihin molekyyleihin; ja (c) molekyylinsi-35 säinen a- ja β-ketjujen silloitus. Laajimmin käytetty me- 6 105256 netelmä on Hb:n molekyylienvälinen silloitus glutaarial-dehydillä (Bonsen et ai., US-patenttijulkaisut 4 001 200; 4 001 401 ja 4 053 590; Morris et ai., US-patenttijulkai-su 4 061 736; Bonhard et ai., US-patenttijulkaisu 5 4 136 093). Tähän menetelmään liittyy kuitenkin muutamia ongelmia: (1) glutaarialdehydi on luonnostaan myrkyllistä, eikä sen metabolisten sivutuotteiden potentiaalista toksisuutta tunneta; (2) yhdiste on hyvin reaktiivinen ja sillä on taipumus muodostaa erilaisia siltoja Hb-molekyylin eri 10 kohtien (a- ja 6-aminoryhmien ja sulfhydryyliryhmien) kanssa, mikä johtaa erilaisten molekyylispesieksien muodostumiseen, joiden lukumäärä ei ole ennustettavissa; (3) polymerointiprosessia on vaikea kontrolloida, ja se näyttää jatkuvan varastoinnin aikana lämpötilassa 4 °C, mikä 15 johtaa koko ajan kasvavien polymeerien muodostumiseen, joilla on suurentunut viskositeetti ja happiaffiniteetti; (4) silloituksen epäspesifinen luonne voi mahdollistaa Hb-dimeerien läsnäolon edelleen liuoksessa. Vaihtoehtoisesti Hb:a on kytketty suurikokoisiin molekyyleihin, kuten 20 dekstraaniin ja hydroksietyylitärkkelykseen (US-patenttijulkaisu 4 064 118), polyetyleeni- tai polypropyleenigly-koleihin (US-patenttijulkaisu 4 412 989), inuliiniin (US-patenttijulkaisu 4 377 512) ja polyalkyleenioksidiin (US-patenttijulkaisu 4 670 417). Näillä kytketyillä hemoglo-: 25 biineilla on kuitenkin suurentunut happiaffIniteetti ja taipumus omaksua epäsuotuisia, kytkentäaineille tyypillisiä ominaisuuksia. Molekyylinsisäinen silloitus on saatu aikaan käyttämällä "diaspiriiniestereitä" (Tye, US-patenttijulkaisu 4 529 719; Walder, US-patenttijulkaisu 30 4 598 004) ja "perjodaatilla hapetettua adenosiinitrifos- faattia" (o-ATP) [F. J. Scannon, Molecular modification of hemoglobin. Critical Care Medicine, 10 (1982) 261 - 265; A. G. Greenburg ja P. W. Maffuid, Modification of hemoglobin - Ring opened diols, Advances in Blood Substitute 35 Research, Alan R.Liss, New York 1983, s. 9 - 17]. Diaspi- 7 105256 riinihemoglobiineilla on kuitenkin edelleen lyhyt viipy-misaika verisuonissa (puoliintumisaika 3-4 tuntia), kun • taas ATP-hemoglobiinit on havaittu epätyydyttäviksi kor keiden met-Hb-pitoisuuksien ja suuren happiaffiniteetin 5 vuoksi yhdistyneinä lyhyeen puoliintumisaikaan.

Merkittävästä edistymisestä ovat raportoineet tutkijat, jotka ovat saattaneet ihmisen Hb:n reagoimaan pyri-doksaali-5’-fosfaatin ja glutaarialdehydin kanssa, jolloin syntyy polymeroitua pyridoksaloitua Hb:a ("poly-PLP-hemo-10 globiinia"), ts. hemoglobiinia, jolla väitetään olevan sekä alhainen happiaffiniteetti ettiä pitkittynyt viipyminen verisuonissa [G. S. Moss et ai., Hemoglobin solution -From tetramer to polymer, Biomaterials, Artificial Cells and Artificial Organs, 16(1 - 3) (1988) 57 - 69 F. De- 15 Venuto ja A. Zegna, Preparation and evaluation of pyridoxalated-polymerized human hemoglobin, Journal of Surgical Research 34 (1983) 205 - 212]. On kuitenkin havaittu, että pyridoksalaatio häiritsee polymerointia. Niinpä pyridoksaloitu Hb, jonka 02-affiniteettia on alen-20 nettu, erittyy nopeasti munuaisten kautta, kun polymeroi-dulla Hb:11a, jolla on pidennetty puoliintumisaika, on korkea happiaffiniteetti. Johtopäätöksenä on, ettei vielä ole ratkaistu ongelmaa, joka koskee Hb:n stabilointia heikentämättä hapenkuljetustoimintaa.

; 25 Viimeisten muutaman vuoden aikana on noussut esiin kysymyksiä, jotka koskevat hemoglobiinin luontaista myrkyllisyyttä. On kuvattu koehavaintoja verisuonia supistavista vaikutuksista. Koska Hb:11a on taipumus itsehapettua met-Hb:ksi (ts. hemirauta hapettuu +2:n arvoisesta ferro-30 tilasta +3:n arvoiseen ferritilaan, jossa prosessissa syn-i . tyy myrkyllisiä vapaita happiradikaaleja), on myös esitet ty ajatus, että se saattaisi toimia hapettimen esiasteena verenkiertoon infusoituna. Tämä ilmiö aiheuttaisi solukalvojen lipoperoksidaation ja vaurioittaisi solurakenteita. 35 Nämä molemmat ilmiöt, verisuonten supistuminen ja vapaiden « 8 105256 happiradikaalien syntyminen, pahentaisivat lievittämisen sijasta verenvuodon aiheuttamia iskemia-hypoksiavaurioita. On kuvattu kokeellisten tutkimusten tuloksia, jotka osoittavat, että sekä verisuonten supistumista että radikaalien 5 muodostumista voidaan kontrolloida kolmella toimenpiteellä: (1) Hb.-n täydellisellä puhdistuksella; (2) sellaisen

Hb-molekyylin valmistuksella ja stabiloinnilla, jossa met-Hb:n muodostuminen on vähäistä; ja (3) happiradikaaleja sitovien aineiden lisäämisellä [M. feola et ai., Biocompa-10 tibility of hemoglobin solutions. I. Reactions of vascular entothelial cells to pure and impure hemoglobins, Artificial Organs, 13(3) (1989) 209 - 215].

Hb-liuokset tuovat lisäksi mukanaan verituotteiden kautta välittyvien sairauksien vaaran. Vaikka bakteerit ja 15 parasiitit voidaan helposti poistaa suodattamalla tai ult-rasuodattamalla, virukset ovat vakavampi ongelma. Alalla tunnetaan kaksi menetelmää virusten inaktivoimiseksi. Toinen on fysikaalinen menetelmä, jossa pastöroidaan deoksi-muodossa olevaa hemoglobiinia 10 tuntia lämpötilassa 60 °C 20 pH:n ollessa 7,5. Tämän menetelmän on havaittu inaktivoi-van malliviruksia (sindbis, polio, pseudorabies) samoin kuin ihmisen immuunikatoviruksen (HIV) [T. N. Estep et ai.. Virus inactivation in hemoglobin solutions by heat, Biomaterials, Artificial Cells ja Artificial Organs, ; 25 16(1 - 3) (1988) 129 - 134] . Toinen on kemiallinen mene telmä, jossa tehdään käsittely kloroformilla [S. M. Fein-ston et ai., Inactvation of hepatitis B virus and non-A non-B hepatitis by chloroform, Infection and Immunity 41 (1983) 816 - 821] . Molemmat menetelmät saavat kuitenkin 30 aikaan hemoglobiinin merkittävän denaturoitumisen, ellei ryhdytä erityistoimenpiteisiin.

Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö koskee patenttivaatimuksissa määriteltyjä menetelmiä verenkorvikkeena käyttökelpoisen koos-35 tumuksen valmistamiseksi. Tällainen koostumus sisältää ni- 105256 säkkään (edullisesti naudan) hemoglobiinia (Hb), joka on (a) kokonaan ja täydellisesti puhdistettua; (b) silloitet-• tu molekyylinsisäisesti perjodaatilla hapetetulla ATPrlla (o-ATP) ja molekyylienvälisesti perjodaatilla hapetetulla 5 adenosiinilla (o-adenosiini); (c) saatettu reagoimaan pelkistetyn glutationin (GSH) kanssa; ja (d) liuotettu elektrolyyttien suhteen tasapainotettuun, magnesiumkloridin (MgCl2) ja mannitolin suhteen rikastettuun fysiologiseen suolaliuokseen. Koska o-ATP ja o-adenosiini ovat kaksi 10 puriini (P) -johdannaista, tuotteesta käytetään tässä merkintää Hb-PP-GSH.

Tässä hemoglobiinivalmisteessa yhdistyvät sen rakenneosien suotuisat ominaisuudet: (1) se on tehokas ha- penkantaja, koska naudan Hb:11a on luonnostaan alhainen 15 happiaffiniteetti (P50-arvo 28 mmHg) , johon eivät vaikuta erilaiset kemialliset reaktiot; (2) se on tehokas plasmatilavuuden suurentaja sen ansiosta, että sekä intra- että intermolekulaarisesti silloitetulla hemoglobiinilla on pitkittynyt viipymisaika verisuonissa (puoliintumisaika 24 20 tuntia); (3) sillä on verisuonia laajentavia ominaisuuksia siitä syystä, että molemmat puriinit vähentävät norepinef-riinin indusoimaa verisuonten supistumista; ja (4) sillä ei ole hapetinesiastevaikutusta pelkistetyn glutationin ja mannitolin läsnäolon ansiosta.

; 25 Naudan hemoglobiinin suotuisat ominaisuudet on to distettu [M. Feola et ai., Development of a bovine stroma-free hemoglobin solution as a blood substitute, Surgery, Gynecology and Obstetrics, 157 (1983) 399 - 408]. Sen lisäksi että naudan Hb:a on saatavissa suuria määriä ja sen 30 avulla vältetään ihmisverelle ominaiset välittyvät sairau-. det (erityisesti AIDS) , sen PS0-arvo on yli kaksinkertainen ihmisen Hb:n vastaavaan arvoon nähden (28 ja 13 mmHg) eikä se tarvitse 2,3-DPG-modulaatiota. Tämän keksinnön mukaisesti naudan Hb:n happiaffiniteettia voidaan vielä laskea 35 suurennetuilla kloridi-ionipitoisuuksilla. Mahdollisten immunologisten ongelmien suhteen eri nisäkäslajien välis- * 10 105256 ten Hb-siirtojen järkevyys on todistettu hyvin. Itse asiassa puhdasta naudan hemoglobinia on annettu toistuvasti (jopa 6 kertaa) kaniineille ja apinoille tilavuuksina, jotka vastaavat 1/3 - 1/2 laskennallisesta veritilavuudes-5 ta ilman reaktioiden ilmaantumista kliinisesti ja Ouchter-lonyn testillä detektoitavissa olevien vasta-aineiden muodostumista [M. Feola et ai., Immunologic biocompatibility of hemoglobin solutions, Transfusione del sanque (italiankielinen) 33 (1988) 121 - 128].

10 Bakteeriendotoksiineja sisältämättömän Hb-liuoksen valmistamiseksi tässä valmistusmenetelmässä käytettävä strategia on kontaminoitumisen ehkäiseminen sen korjaamisen sijasta. Kun otetaan huomioon entotoksiinin affiniteetti hemoglobiinin suhteen, puhdistaminen on äärimmäisen 15 vaikeaa ellei mahdotonta, kun merkittävää kontaminoitumista on tapahtunut. Ehkäiseminen vaatii, että (1) lähtömateriaali on hyvin vähäisessä määrin kontaminoitunutta; (2) valmistusvaiheet toteutetaan suljetussa järjestelmässä; (3) kaikki Hb:n kanssa kosketukseen joutuvat pinnat ovat 20 steriilejä ja pyrogeenittömiä; (4) kaikki kemikaalit ovat puhtaita; (5) kaikki liuokset ovat steriilejä ja pyrogeenittömiä; ja (6) laatua tarkkaillaan kaikissa vaiheissa. Herkin menetelmä entotoksiinin detektoimiseksi on "kvantitatiivinen kromogeeninen molukkiraputesti" (QCL-1000, 25 Whittaker Bioproducts). Jos lähtömateriaalin tai hemoglobiinin havaitaan missä tahansa valmistusvaiheessa sisältävän yli 2 endotoksiiniyksikköä/ml (EU/ml), se heitetään pois. Pitämällä yllä alhainen kontaminaatiotaso koko prosessin ajan, voidaan täydellinen puhdistus saada aikaan 30 johtamalla liuos lopuksi affiniteettikromatografiakolon-nin, kuten Detoxi-Gel-kolonnin (Pierce Chemical Company), läpi.

Samaa periaatetta, voimakkaan kontaminaation välttämistä yhdistyneenä loppupuhdistukseen, sovelletaan pe-35 ruskudoksen fosfolipidien (erityisesti aminofosfolipidien) il 105256 poistamiseen. Peruskudoskontaminaation välttämiseksi tässä menetelmässä sovelletaan punasolujen dialysointi- ja ult- • rasuodatusmenetelmää, jonka ovat alunperin esittäneet J.

R. DeLoach et ai. [Analytical Biochemistry 157 (1986) 5 191 - 198]. Tämän menetelmän mukaisesti punasoluja dialy- soidaan ensin hypotonista fosfaattiliuosta vastaan, kunnes suspension osmolaarisuus saavuttaa arvon 160 mosm/1. Tässä vaiheessa punasolut omaksuvat pallomaisen muodon ja solukalvon huokoset venyvät. Sitten soluille tehdään ultra-10 suodatus Amicon-suodattimien läpi, joiden huokoskoko on 0,1 pm, kolonnissa vallitsevan paineen ollessa 60 kPa. Siten hemoglobiini "tulee puristetuksi ulos" soluista solukalvojen rikkoutumatta. Tämän keksinnön mukaisesti käytetään sekä punasolujen dialysointiin että ultrasuodatuk-15 seen menettelyä, joka toteutetaan yhdessä suljetussa järjestelmässä, joka on steriili, pyrogeenitön ja kertakäyttöinen. Lisäksi dialysointineste koostuu steriilistä, py-rogeenittömästä deionisoidusta vedestä, jonka pH on säädetty arvoon 8,2 Tham-liuoksella fosfaattiliuoksen sijas-20 ta, mikä vähentää hemoglobiinin hapettumista. Tämän menettelyn tuloksena on Hb-liuos, joka sisältää noin 3-5 mg/ dl fosfolipidejä (mitattuna "fosfolipiditestivälineistöl-lä", Boehringer-Mannheim Diagnostics, Indianapolis, Indiana) ja vain hyvin pieniä määriä aminofosfolipidejä PE ja ; 25 PS (määritettynä ohutkerroskromtaografisesti). Nämä fos- folipidijäännökset poistetaan kloroformiuutolla. Läsnä olevien fosfolipidien alhaisen pitoisuuden vuoksi tämä vaihe voidaan toteuttaa käyttämällä alhaisia kloroformi-pitoisuuksia lyhyissä sentrifugoinneissa. Siten estetään 30 hemoglobiinin denaturoituminen.

• . Sama periaate pätee hemoglobiinin puhdistamiseen ei-hemiproteiineista ja -peptideistä. Tässä tapauksessa ensimmäistä vaihetta edustaa kaikkien plasmaproteiinien poistaminen punasolujen "puhdistuksen" aikana. Toiseksi 35 menetelmä Hb:n uuttamiseksi punasoluista rikkomatta suu- 12 105256 ressa määrin punasolujen kalvoja estää peruskudosproteii-nikontaminaatiota. Lopuksi puhdistus saadaan aikaan "selektiivisellä lämpösaostuksella" (katso Bioseparations, toim. P. A. Belter, E. L. Cussler ja W. S. Hu, John Wiley 5 & Sons, New York 1988, s. 227 - 229). Tämän menetelmän tieteellisenä perustana on, että proteiinien denaturoituminen (ja saostuminen) lämpötilan vaikutuksesta noudattaa ensimmäisen kertaluvun kemiallista kinetiikkaa ja Arrhe-niuksen lämpötilariippuvuutta: 10 . .

jossa P on liuenneen proteiinin pitoisuus. Nopeusvakio saadaan kaavasta, 15 jossa K0 on tunnusmerkillinen vakio "denaturaation aktivaatioenergia" ja T on lämpötila. Denaturaatioenergia vaihte-20 lee proteiinista toiseen. Koska E on yhtälössä eksponentissa, sillä on suuri vaikutus, kun lämpötila muuttuu edes vähän. Tähän energiaan vaikuttavat myös pH-muutokset. Olemme myös havaineeet, että hiilimonoksidilla kyllästetty hemoglobiini (HbCO) on kestävä lämpötilan indusoimaa saos-25 tumista vastaan pH:n ollessa 7,6 - 7,8. Olemme havainneet, että pastöroitaessa liuosta, joka sisältää pitoisuutena 10 g/dl karboksimuodossa olevaa hemoglobiinia, lämpötilassa 60 °C 9 tuntia ja sen jälkeen lämpötilassa 70 eC 1 tunti pH:n ollessa 7,6 - 7,8, kaikki ei-hemiproteiinit saos-30 tuvat hemoglobiinin denaturoitumisen ollessa vähäistä. Ei-hemoglobiiniproteiinien poissaolo keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetusta liuoksesta on todistettu käyttämällä isoelektristä fokusointia (IEF) ja kokoeksluusio- ja anioninvaihtosuurpainenestekromatografiällä (HPLC). Tal-35 teen otetun hemoglobiinin denaturoitumattomuuden osoittaa 13 105256 IEF:ssä fokusoitujen vyöhykkeiden "tahrattomuus" ja hapen-kuljetustoiminnan säilyminen (happidissosiaatiokäyrät, P50, Bohrin ilmiö).

Tämän puhdistusmenetelmän yksi sivutuote on virus-5 ten inaktivoituminen. Kloroformiuuton on itse asiassa havaittu inaktivoivan joukon lipidivaipalllsia viruksia, kuten hepatiitti B, non-A non-B hepatiitti, lehmärokko ja pox-virukset, sekä plasmassa että seerumissa (Feinston et ai., supra). Jotkin lipidittömät virukset (reovirukset) 10 voivat myös inaktivoitua osittain kloroformin vaikutuksesta. Toisaalta on osoitettu, että lämpötilassa 60 *C 10 tuntia kestävä pastörointi inaktivoi joukon viruksia, joilla ei ole lipidivaippaa, samoin kuin ihmisen immuunikatoviruksen (HIV) (T. N. Enstep et ai., supra).

15 Glutaarialdehydillä tehtävän polymeroinnin epätoi vottavien vaikutusten vuoksi tässä menetelmässä Hb-mole-kyyli "stabiloidaan" tetrameeriseen muotoon käyttämällä adenosiini-5'-trifosfaatin(o-ATP) dialdehydijohdannaista. ATP-molekyylissä on kolme peruskomponenttia: puriiniemäs 20 adeniini, sokeri D-riboosi ja trifosfaattiketju.

NH, n' c \ | | CH Adeniini hcn ^./ o-o-o- 9C I I I * *0—P—O—P—O—P—O—CH. .0.

• I I 1/ \ O O O C H H Ci l\1 1/1 H VmC' h I I-'

ÖP OH

Adenosiinitrifosfaatti (ΛΤΡ) 30 ATP:n hapetus perjodaatilla avaa riboosirenkaan 2',3'-cis-kohdasta ja muuttaa 2',3'-diolin vastaavaksi dialdehydiksi [P. N. Lowe et ai., Preparation and chemical properties of periodate-oxidized adenosine triphosphate and some related compounds, Biochemical Society Transac-35 tions 7 (1979) 1131 - 1133]: 14 105256 -k 7V‘"

Jxz * v™· 5

Kukin o-ATP-molekyylin aldehydiryhmä voi reagoida lysiinin 6-aminoryhmän kanssa, jolloin muodostuu Schiff-emäsadditiotuote:

10 (HB)-NH2 + OCH-ATP - (HB)-N=CH-ATP

Koska hemoglobiinin 2,3-DPG-tasku (Hb-molekyylin alue, joka sitoo 2,3-DPG:n) sisältää kaksi lysiiniä, on mahdollista käyttää o-ATP:tä näiden ryhmien silloittamiseen ja 15 siten molekyylin stabilointiin tetrameeriseen muotoon. Trifosfaattiketjun läsnäolo parantaa tämän reaktion spesifisyyttä, jollainen spesifisyys on todistettu muiden poly-fosfaattien, kuten pyridoksaali-5'-fosfaattien, kohdalla. ATP:n etuna muihin yhdisteisiin nähden on adeniiniryhmit-20 tymä. ATP:n hydrolyysin ADPrksi, AMPrksi ja lopulta adeno-siiniksi in vivo on havaittu aiheuttavan suotuisia farmakologisia vaikutuksia, pääasiassa verisuonten laajenemista sekä yleis- että keuhkoverenkierrossa. Muita suotuisia vaikutuksia on osoitettu annettaessa ATP:tä yhdessä magne-25 siumkloridin (MgCl2) kanssa verenvuotoshokin hoidossa. Niihin kuuluvat mikroverenkierron paraneminen, solukalvotoi-minnan paraneminen ja "pohjustava" vaikutus solunsisäisten adeniininukleotidien palauttamisessa (I. H. Chaudry ja A. E. Baue, Overview of hemorrhagic shock, Pathophysiology of 30 shock, anoxia and ischemia, toim. R. A. Cowley ja B. F. Trump, Williams and Wilkins, Baltimore, Maryland 1982, s. 203 - 219).

Kuten edellä mainittiin, aiemmat yrityksen silloittaa Hb o-ATP:llä eivät ole onnistuneet, koska kemiallinen 35 reaktio tuottaa hyväksyttävää suurempia met-Hb-pitoisuuk- 15 105256 siä (jopa 30 %) ja o-ATP:llä muunnetulla Hb:11a on edelleen lyhyt viipymisaika verisuonissa. Lisäksi ATP:llä on epätoivottava taipumus kelatoida divalenttisia kationeja verisuonistosta.

5 Olemme havainneet, että o-ATP:n hapetusvaikutus johtuu yhdisteessä läsnä olevista jodaattijäännöksistä (I04 ja I03). Itse asiassa o-ATP:n täydellinen puhdistus (katso esimerkki I) ratkaisee tämän ongelman. Olemme myös havainneet, että met-Hb:n muodostuminen voidaan minimoida säätiö tamalla o-ATP reagoimaan karboksi-Hb:n (hiilimonoksidilla kyllästetyn Hb:n) kanssa eikä deoksi-Hb:n kanssa, kuten aiemmin on tehty. Olemme havainneet, että o-ATP:n reaktio karboksi-Hb:n kanssa tapahtuu, jos liuoksen pH lasketaan suunnilleen arvoon 7,20. Mitä kationeja kelatoivaan vaiku-15 tukseen tulee, olemme vahvistaneet Chaudryn ja Bauen (supra) raportin, jonka mukaan magnesiumkloridin (MgCl2) lisääminen yhtä suurina moolimäärinä ATP:n kanssa eliminoi tämän ongelman. Jäljellä on kuitenkin ongelma, joka koskee lyhyttä viipymisaikaa verisuonissa. Olemme havainneet, 20 että molekyylinsisäisesti silloitettu, tetrameerimuodossa oleva Hb suodattuu edelleen munuaiskerästen läpi ja vahingoittaa munuaistiehyeitä. Siksi on välttämätöntä silloittaa hemoglobiini sekä inter- että intramolekulaarisesti, jos on määrä saavuttaa riittäviä suonensisäisiä viipymis-• 25 aikoja.

Tässä keksinnössä hyödynnetään yhtä toista puriini-johdannaista, adenosiinin dialdehydijohdannaista, eli per-jodaatilla hapetettua adenosiinia (o-adenosiinia) toisena silloitusaineena. Koska Hb-molekyylin pinnalla on 44 ly-30 siiniaminoryhmää, on mahdollista käyttää o-adenosiinia • . muodostamaan siltoja kahden tai useamman tällaisen ryhmän välille tai sitomaan kaksi tai useampia Hb-tetrameerejä. Adenosiinilla on monia etuja muihin yhdisteisiin nähden. Ensinnäkin adenosiinilla on adeniinin läsnäolon ansiosta 35 samankaltainen verisuonia laajentava vaikutus kuin ATP:llä 16 105256 [C. Su, Extracellular functions of nucleotides in heart and blood vessels, Annual Review of Physiology 47 (1985) 665 - 676]. Lisäksi adenosiini estää verihiutaleiden agg-regoitumista ja parantaa filtraatiota munuaiskeräsissä, 5 jotka molemmat vaikutukset ovat suotuisia verenvuodon ja reperfuusion jälkeen (R. M. Berne, Regulatory Functions of Adenosine, Martin Nijhoff Publisher, Boston, Massachusetts 1983). Hemoglobiinin reaktio o-adenosiinin kanssa ei ole ollut aiemmin tunnettu. On myös tärkeää, että reaktio teh-10 dään hemoglobiinin ollessa karboksimuodossa, jotta vähennetään met-Hb:n muodostumista. Lopuksi mainittakoon, että reaktio etenee hyvin hitaasti lämpötilassa 4 °C, niin että se voidaan keskeyttää milloin tahansa halutun molekyyli-aggregaatin muodostumisen jälkeen. Tämä ominaisuus mahdol-15 listaa molekyylikooltaan erilaisten Hb-polymeerien valmistuksen suunnitelmallisella, toistettavissa olevalla tavalla (mitä ei voida tehdä käytettäessä muita silloitusainei-ta, kuten glutaarialdehydiä). Hemoglobiinin silloittaminen o-adenosiinilla keskeytetään lisäämällä pelkistettyä glu-20 tationia (GSH), joka, samoin kuin lysiini, sisältää e-ami-noryhmän. Tullessaan mukaan tähän reaktioon GSHrsta tulee osa Hb-koostumusta.

GSH:n valinta perustuu siihen, että tätä yhdistettä on runsaasti punasolussa, jossa sen päätehtävänä on toimia : 25 "hapetinloukkuna", joka suojaa hemoglobiinia hapetinrasi- tukselta (A. Larsson, Functions of Glutathione: Biochemical, Physiological, Toxicological and Clinical Aspects, Raven Press, New York 1983). Olemme osoittaneet, että GSH suojaa hemoglobiinia liuoksessa samoin kuin erytrosyytti-30 ympäristössä. On myös havaittu, että silloitus o-adenosii-nilla, jota seuraa reaktio GSH:n kanssa, saa aikaan elek-tronegatiivisten varausten lisääntymisen Hb-molekyylin pinnalla, jolloin Hb:n isoelektrinen piste laskee arvosta 6,8 arvoon 6,1 - 6,2. Tämä edistää hemoglobiinin stabiloi- 105256 17 tumista siinä mielessä, että se pidentää viipymistä verisuonissa ja estää suodattumista munuaisten läpi.

* o-ATP:ta ja o-adenosiinia on saatavissa kaupalli sesti (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), tai niitä 5 voidaan valmistaa jäljempänä esimerkeissä I ja II kuvattavin menetelmin. Pelkistettyä glutationia on saatavana kaupallisesti.

Kun nämä reaktiot on toteutettu ja karboksi-HB muutettu takaisin oksi-Hb:ksi, uusi yhdiste (Hb-PP-GSH) liuo-10 tetaan elektrolyyttien suhteen tasapainotettuun fysiologiseen suolaliuokseen, joka on rikastettu magnesiumkloridin (MgCl2) ja mannitolin suhteen. MgCl2:a lisätään ATP-mooli-määrää vastaava moolimäärä. Tällä on muutamia suotuisia vaikutuksia: (1) se säätelee ATP:n divalenttisia kationeja 15 kelatoivaa vaikutusta; (2) se täydentää ATP:n suotuisia vaikutuksia mikroverenkiertoon; ja (3) se antaa ylimäärin kloridi-ioneja, mikä heikentää Hb:n happiaffiniteettia (auttaa pitämään yllä korkean P50-arvon). Mannitolia lisätään pieniä määriä, koska sen tiedetään toimivan OH-radi-20 kaalien (myrkyllisimpien happiperäisten vapaiden radikaalien) ja ehkä myös muiden radikaalien sitojana [B. A. Freeman ja J. D. Crapo, Free radicals and tissue injury, Laboratory Investigation 47 (1982) 412 - 426].

Tämän keksinnön päämääränä on tarjota käyttöön ke-• 25 miallinen yhdiste, joka on käyttökelpoinen verenkorvik- keena, ts. jolla on kyky (a) palauttaa ja ylläpitää plasmatilavuus, (b) toimittaa elintärkeisiin elimiin happea ja (c) vähentää verisuonten supistumista verenvuodon jälkeen.

Tämän keksinnön yhtenä lisäpäämääränä on tarjota 30 käyttöön mainitunlainen verenkorvike, joka on myrkytön.

. Tämän keksinnön päämääränä on myös tarjota käyttöön menetelmä verenkorvikkeen valmistamiseksi hemoglobiinista.

Keksinnön muut päämäärät, piirteet ja edut käyvät ilmi seuraavasta keksinnön mukaisen suorutusmuotoesimerkin 35 yksityiskohtaisesta kuvauksesta.

» 18 105256

Piirustusten lyhyt kuvaus

Kuvio 1 esittää HPLC:llä kokoeksluusiokolonnilla saadun puhtaan naudan hemoglobiinin spektrianalyysiä. Kro-matogrammissa näkyy yksi piikki kohdassa 9,4 minuuttia, 5 joka vastaa tetrameerisessä muodossa olevaa hemoglobiinia (64 000 daltonia).

Kuvio 2 esittää HPLCrllä DEAE-kolonnilla saadun puhtaan naudan hemoglobiinin spektrianalyysiä. Kromato-grammissa näkyy muutamia piikkejä alueella 20 - 36 minuut-10 tia, jotka vastaavat eri Hb-komponenttien erilaisia iso-elektrisiä pisteitä.

Kuviot 3a ja 3B esittävät naudan puhtaan hemoglobiinin spektrejä ennen pastörointipuhdistusta (HPLC, DEAE-kolonni, spektrin aallonpituusalue 230 - 599 nm) (3A) ja 15 sen jälkeen (3B). Kuviossa 3A on näkyvissä ei-Hb-proteii-neja retentioaikojen 17 ja 51 minuuttia kohdalla, Kuviossa 3B ei-Hb-proteiineja ei enää ole näkyvissä.

Kuvio 4 esittää intramolekulaarisesti o-ATP:llä ja intermolekulaarisesti o-adenosiinilla silloitetun ja pel-20 kistetyn glutationin kanssa yhdistetyn naudan Hb:n spek trianalyysiä HPLC-kokoeksluusiokromatografiän jälkeen. Kromatogrammissa näkyy kuusi Hb-molekyyliaggregaattipiik-kiä.

Kuvio 5 esittää kuvion 4 yhteydessä esitetyllä ta-25 valla muunnetun naudan Hb:n spektrianalyysiä HPLC-DEAE- kolonnikromatografiän jälkeen. Kromatogrammissa näkyy yksi piikki retentioajan 51 minuuttia kohdalla. Hb:n isoelek-trinen piste on siirtynyt (verrattuna muuntamattomaan Hb:iin) pinnan elektronegatiivisten varausten lisääntymi-30 sen vuoksi.

Kuvio 6 esittää isoelektrisellä fokusoinnilla (IEF - Pharmacia) tehtyä tutkimusta.

Kuvio 7 esittää Sephadex-kolonnista vedellä eluoi-tujen, o-ATP- ja natriumperjodaattireaktioseoksesta saatu- 19 105256 jen peräkkäisten fraktioiden absorbanssia aallonpituudella 258 nm.

Kuvio 8 esittää anioninvaihtokolonnista eluentilla A eluoitujen, o-adenosiini- ja natriumperjodaattireaktio-5 seosta saatujen peräkkäisten fraktioiden absorbanssia aallonpituuksilla 258 ja 232 nm.

Edullisen suoritusmuodon kuvaus

Esimerkki I

Edullinen menetelmä tämän keksinnön mukaisen komp-10 leksisen tuotteen valmistamiseksi sisältää seuraavat viisi vaihetta: (A) punasolujen puhdistus; (B) hemoglobiinin eristys; (C) hemoglobiinin puhdistus; (D) hemoglobiinin muuntaminen (reaktio o-ATP:n, o-adenosiinin ja glutationin kanssa); ja (E) lopputuotteen (Hb-PP-GSH)n valmistus.

15 A. Punasolujen (RBC:iden) puhdistus

Edullinen lähtömateriaali on naudan veri edellä käsitellyistä syistä. Tätä valmistusmenetelmää voidaan kuitenkin käyttää lähtien muiden nisäkkäiden, ihminen mukaan luettuna, verestä. Naudan verta voidaan ottaa useista 20 terveistä luovuttajista tai yksittäisistä teurastamoon menevistä eläimistä. Ensin mainitussa tapauksessa otetaan kiinni aikuinen nauta, ajellaan kaula ja käsitellään iho antiseptisellä saippualla. Verta otetaan aseptisissa olosuhteissa ulompaan kaulalaskimoon tehdyn piston kautta.

*, ' 25 Yhdestä eläimestä voidaan ottaa noin 1 500 ml verta, ke rätä se tyhjäksi imettyyn, steriiliin, pyrogeenittömään 2 l:n pulloon, joka sisältää 200 ml ACD-antikoagulanttia (Virbac, Inc., Lenexa, Kansas). Toisessa tapauksessa, kun eläin on tainnutettu ennen teurastusta, toinen puoli kau-30 lasta "preparoidaan" nopeasti ja sijoitetaan pistoputki . " ihonalaisesti yhteiseen päänvaltimoon. Yhdestä aikuisesta lehmästä voidaan ottaa noin 10 1 verta. Eri eläimistä peräisin olevia verieriä ei sekoiteta. Pullot pidetään jäissä laboratorioon siirtämisen aikana.

• · 20 105256

Erityisesti käytettäessä lähtömateriaalina naudan verta on tärkeää, että punasolut (erytrosyytit) erotetaan täydellisesti valkosoluista (leukosyyteistä), verihiutaleista ja plasmasta. Tämä vaihe vähentää ei-hemiproteii-5 nien ja muiden aineiden aiheuttamaa kuormitusta, josta hemoglobiini on lopulta puhdistettava. Kaikkien leukosyyttien poistaminen poistaa myös näihin soluihin, erityisesti lymfosyytteihin, liittyvät virukset (sytomegalovirus, ihmisen immuunikatovirus jne.).

10 RBC:t puhdistetaan "pyöritys-jäähdytys-suodatusmenetelmällä" . "Pyöritysvaihe" koostuu useista sentrifugoin- neista, jotka tehdään suljetussa järjestelmässä käyttämällä veripankkisoluerotinta, kuten DIDECO-järjestelmää (Electromedics Inc., Englewood, Colorado), seuraavasti: 15 1. sentrifugointi kierrostaajuudella 1 100 min'1 lämpötilassa 15 °C 20 minuuttia verihiutaleiden ja plasman poistamiseksi; 2. sentrifugointi kierrostaajuudella 4 500 min'1 lämpötilassa 15 °C 10 minuuttia plasman poistamiseksi täy- 20 dellisemmin; 3. pesu (4 kertaa) isotonisella suolaliuoksella (punasolujen ja suolaliuoksen suhde 1:4) sentrifugoimalla kierrostaajuudella 4 100 min'1 lämpötilassa 4 °C 10 minuuttia;

25 4. lopullinen pesu isotonisella Tham-liuoksella, pH

8,1 - 8,2 (Tham USP, Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois). Tämä mahdollistaa pestyjen punasolujen suspen-doinnin elektrolyytittömään, pH-arvoltaan korkeaan liuokseen, joka suojaa hemoglobiinia hapettumiselta.

30 Menettelyn "jäähdytysosan" yhteydessä punasoluja säilytetään "siirtopakkauksissa" (steriilejä, pyrogeenit-tömiä muovisäiliöitä, valmistaja Fenwal Laboratories, Deerfield, Illinois) lämpötilassa 4 °C yön yli eli 18 tuntia. Valkosoluilla on alhaisessa lämpötilassa taipumus 35 aggregoitua pieniksi rykelmiksi. "Suodatusvaiheessa" solut 105256 21 johdetaan 20 μπι:η selluloosasuodattimen, kuten Fenwalin valmistaman "suurikapasiteettisen transfuusiosuodattimen" läpi, jolloin leukosyyttiaggregaatit poistuvat.

Leukosyyttien ja verihiutaleiden poissaolon varmis-5 tamiseksi tehdään solulaskenta käyttämällä Coulter-solu-laskuria ja proteiinien poissaolo suspensiosta varmistetaan tavanomaisin kemiallisin menetelmin. Bakteeriendotok-siinien läsnäolo määritetään käyttämällä "kvantitatiivista kromogeenista molukkiraputestiä" (QC-1000, Whittaker Bio-10 products, Walkersville, Maryland).

B. Hemoglobiinin eristys

Hemoglobiinin eristäminen punasoluista tehdään kahdessa vaiheessa. Ensin dialysoidaan 1 1 suspensiota, joka sisältää punasoluja isotonisessa Tham-liuoksessa pitoisuu-15 tena 20 % (hematokriitti 0,20), hypotonista (230 mosm/1) Tham-liuosta (10 1) vastaan käyttämällä keinomunuaista, jonka huokoskoko on 0,20 pm, kuten tuotetta "Krosflo II Filtration Module with 10 Ft2 Surface Area" (Microgon Inc., Laguna Hills, Kalifornia). Dialyysiä jatketaan, kunnes 20 dialysaatti muuttuu punertavaksi (hemoglobiinin sävyttämäksi). Tässä vaiheessa punasolut turpoavat pallomaisiksi ja venyneet solukalvot muuttuvat Hb:a läpäiseviksi. Toisena vaiheena keinomunuaiseen kohdistetaan 69 kPa:n paine, joka puristaa Hb:n ulos soluista rikkomatta solukalvoja. t - 25 Hemoglobiinin siirtyessä hypotonista liuosta sisältävään säiliöön punasolusäiliössä pidetään yllä tilavuus lisäämällä Tham-liuosta (230 osm/1). Eristetty hemoglobiini suodatetaan käyttämällä 0,20 pm:n suodatinta, kuten "Posi-dyne I.V. Filter" -suodatinta (PALL Biochemical Inc., Fa-30 jardo, Puerto Rico), hiukkasmaisten mikrobiepäpuhtausjään- , '· nösten poistamiseksi ja varastoidaan "siirtopakkauksissa" lämpötilassa 4 °C.

, Tämän menettelyn tuloksena on Hb-liuos, joka sisäl tää 3-5 mg/dl fosfolipidejä (mitattuna käyttämällä "fos-35 folipiditestivälineistöä", Boehringer-Mannheim Diagnos- • · 105256 22 tics, Indianapolis, Indiana) ja vain hyvin pieniä määriä aminofosfolipidejä PE ja PS (määritettynä ohutkerroskroma-tografiällä).

C. Hemoglobiinin puhdistus 5 Tämä tehdään neljässä vaiheessa: 1. Karboksimuodossa olevan hemoglobiinin (HbC0:n) pastörointi Tämä tehdään käyttämällä ennalta steriloitua, pyro-geenitöntä biologista reaktoria, kuten "15 l:n paikallaan 10 steriloitavissa olevaa Microlift-bioreaktoria, joka on varustettu NBS Model ML-4100 -ohjausjärjestelmällä" (New Brunswick Scientific Co., Edison, New Jersey). Se on suljettu säiliö, jossa on useita sisäänmenokohtia kaasuja ja nesteitä varten, näytteenottoportit, sekoitin ja lämpöti-15 lansäätimet. Bioreaktori sijoitetaan vetokaappiin. Hemoglobiini kyllästetään hiilimonoksidilla (puhtausaste 99,99 %, Criogenic Rare Cas Co., Hanahan, Etelä-Carolina) huuhtomalla useaan kertaan peräkkäin steriloidulla kaasulla paineella 100 kPa lämpötilassa 4 °C hitaasti sekoit-20 taen. Täydellinen kyllästys varmistetaaan käyttämällä Cooximeter-laitetta (malli 282, Instrumentation Laboratories, Lexington, Massachusetts). Menettely kestää noin 15 minuuttia. Liuos jätetään CO:n alle, jonka paine on 100 kPa. Sitten tehdään pastörointi nostamalla bioreakto-25 rissa vallitseva lämpötila asteittain 4 °C:sta 60 °C:seen, antamalla sen olla tässä arvossa 9 tuntia ja nostamalla se sitten 70 °C:seen 1 tunnin ajaksi. Näiden jaksojen jälkeen lämpötila lasketaan asteittain takaisin 4 °C:seen.

2. Sentrifugointi yhdessä kloroformin kanssa 30 Tätä vaihetta varten Hb-liuos suodatetaan 0,20 pm:n suodattimen läpi steriileihin pyrogeenittömiin 250 ml:n sentrifugipulloihin, jotka on suljettu sopivin tulpin ("polyallomeeripullot", jotka kestävät kloroformia, proteiineja ja alkoholia, toimittaja Sorvali Division, Du 35 Pont Co., Wilmington, Delaware).

105256 23

Toteutetaan kolmen sentrifugoinnin sarja käyttämällä Sorvall-sentrifugia (malli 0TD75B, roottori TFA 20.250) seuraavasti: a. Setrifugoidaan hemoglobiinia, joka on sekoitettu 5 kloroformin kanssa suhteessa 15:1 (kussakin pullossa 232 ml Hb:a ja 18 ml kloroformia), kiihtyvyydellä 760·G lämpötilassa 4 °C 30 minuuttia. Supernatantti johdetaan toiseen sarjaan pulloja käyttämällä steriiliä pyrogeenitöntä letkua ja peristalttista pumppua laminaarivirtausvetokaapis-10 sa.

b. Sentrifugoidaan Hb:a, joka on sekoitettu kloroformin kanssa suhteessa 16:1, kiihtyvyydellä 1 600·G lämpötilassa 4 °C 15 minuuttia ja kiihtyvyydellä 3 800*G 15 minuuttia. Supernatantti siirretään kolmanteen sarjaan 15 pulloja.

c. Sentrifugoidaan ilman kloroformia kiihtyvyydellä 61 400·G 60 minuuttia.

Kolmannen sentrifugoinnin jälkeen Hb-liuos siirretään steriileihin, pyrogeenittömiin, tyhjiksi imettyihin 20 100 ml:n pulloihin (Abbott Laboratories, joissa on sekoi- tussauva, ja jäljellä olevat kloroformijäännökset poistetaan liuoksesta huuhtomalla steriloidulla CO-kaasulla 2 tuntia hitaasti sekoittaen lämpötilassa 4 °C.

Tässä vaiheessa käytettävä kloroformi on HPLC-laa- 25 tua, ja sen UV-aallonpituusraja on 244 nm (Fisher Scien- tific Co., Fair Lawn, New Jersey). Pullot voidaan käyttää uudelleen, kun ne on käsitelty (a) E-TOXA-Clean-pesuai-neella (Sigma Chemicals) ja (b) 45-%:isella etanolilla ja (c) steriloitu lämpötilassa 120 °C 80 minuuttia.

30 Tämä sentrifugointisarja ei pelkästään poista kaik- . " kia fosfolipidejä vaan myös erottaa puhdistetun hemoglo biinin ei-hemiproteiineista, jotka ovat denaturoituneet ja saostuneet aiemmassa pastörointivaiheessa.

•« 24 105256 3. Suodatus endotoksiiniaffiniteettikromatografia-kolonnin läpi

Hb-liuos johdetaan affiniteettikromatografiakolon-nin, kuten Detoxi-Gel-kolonnin (Pierce Chemical Co., Rock-5 ford, Illinois), läpi käyttämällä sisäänmenossa ja ulostulossa "siirtopakkauksia" ja peristalttista pumppua, jolloin muodostuu suljettu järjestelmä. Menettely tehdään Class 100 -laminaarivirtausvetokaapissa.

Tällä vaiheella voidaan endotoksiinipitoisuus alen-10 taa arvosta 2,0 - 2,5 EU/ml arvoon <0,10 EU/ml.

4. Dialysointi

Hb-liuos dialysoidaan steriiliä, pyrogeenitöntä, deionisoitua vettä vastaan, jota käytetään suhteessa 1:10 ja jonka pH on säädetty arvoon 7,20 lisäämällä Tham-liuos-15 ta. Dialyysi tehdään käyttämällä keinomunuaista, jonka huokoskoko vastaa moolimassa 6 000 daltonia, kuten "90 SCA - Artificial Kidneyllä" (C-DAK Co., Miami Lakes, Florida). Tämä vaihe (a) eliminoi pienet molekyylit, (b) konsentroi hemoglobiinin pitoisuuteen 10 g/dl ja (c) alentaa 20 Hb-liuoksen pH:n noin 8,2;sta noin 7,2:een.

Menettelyn tässä vaiheessa on valmistettu "puhdasta" hemoglobiinia, ts. hemoglobiinia, joka on täysin vapaata (a) bakteeriendotoksiineista, (b) peruskudoksen lipideistä ja fosfolipideistä ja (c) ei-hemiproteiineista.

• 25 0,20 pm:n suodattimien läpi prosessin eri vaiheissa tehty jen toistuvien suodatusten odotetaan poistaneen kaikki mikrobiepäpuhtaudet, kun taas pastöroinnin ja kloroformi-käsittelyn odotetaan inaktivoineen sekä lipidivaipattomat että lipidivaipalliset virukset. Lisäksi karboksimuodossa 30 olevan hemoglobiinin käyttö mahdollistaa sen puhdistamisen ’ hapettumisen ollessa vähäistä (met-hemoglobiinia muodostuu 1 - 2,5 %).

D. Hemoglobiinin muuntaminen

Hemoglobiinin reaktio o-ATP:n, o-adenosiinin ja 35 pelkistetyn glutationin kanssa toteutetaan biologisessa 25 105256 reaktorissa seuraavasti. Liuos, joka sisältää 10 g/dl kar-boksitilassa olevaa hemoglobiinia vedessä, jonka pH on säädetty Thamilla arvoon 7,20, syötetään takaisin bioreak-toriin ja pidetään lämpötilassa 4 °C hitaasti sekoittaen 5 hiilimonoksidipaineen 100 kPa alaisena.

o-ATP, joka on valmistettu esimerkin III mukaisesti ja säilytetty jauheen muodossa, liuotetaan steriiliin, pyrogeenittömään veteen, jonka pH on säädetty arvoon 7,20, ja lisätään välittömästi Hb-liuokseen siten, että mooli-10 suhde Hb:o-ATP on 1:3. Reaktion annetaan edetä lämpötilassa 4 °C sekoittaen kierrostaajuudella 150 min'1 CO:n alla 24 tuntia. Liuoksesta otetaan näytteitä 6 tunnin välein ja ne tutkitaan HPLC:llä käyttämällä kokoeksluusiokolonnia hemoglobiinin moolimassan kasvun tarkistamiseksi ja anio-15 ninvaihtokolonnia sähköisen varauksen muutoksen tarkista miseksi. Käytetään Watersin HPLC-järjestelmää, joka käsittää Waters 600 E System Controller -yksikön. Waters 712 -injektorin, Waters 9990 Photodiode Detector -yksikön ja NEC Power Mate 2 -tietokoneen. Kokoeksluusiokolonnin (Pro-20 tein Pak 300 SW) ja anonivaihtokolonnin (DEAE-5 PW) toimittaja on myös Waters (Waters Chromatography Division, Millipore Co., Milford, Massachusetts). Ideaalinen silloi-tustilanne saavutetaan noin 24 tunnin kuluttua, jolloin anioninvaihto-HPLC-tutkimus osoittaa, että 90 - 95 % 25 o-ATP:stä on kulunut kemiallisessa reaktiossa. Tuloksena on molekyyliaggregaatti, jonka koostumus on seuraava:

Moolimassa (kD) 1. Hemoglobiinitetrameereja 64 70 % 30 2. Hemoglobiinioktameereja 130 21 % 3. Hemoglobiinidodekameereja 195 8 % Näissä reakio-olosuhteissa o-ATP saa toisin sanoen aikaan etupäässä intramolekulaarista mutta myös jonkin • § 105256 26 verran molekyylienvälistä silloittumista. Tämä ei kuitenkaan häiritse seuraavaa reaktiota.

24 tunnin kuluttua o-adenosiini, joka on valmistettu esimerkin IV mukaisesti ja säilytetty jauhemuodossa, 5 liuotetaan steriiliin veteen, jonka pH on säädetty arvoon 7,20 lisäämällä Thamia ja sisältää muutaman pisaran etanolia. Tätä seosta lisätään Hb-liuokseen siten, että Hb:n ja o-adenosiinin moolisuhteeksi tulee 1:5, ja reaktion annetaan edetä samoissa olosuhteissa 24 tuntia. Tässä vaihees-10 sa lisätään toinen annos o-adenosiinia samassa moolisuh-teessa 1:5 ja reaktion annetaan edetä vielä 24 tuntia. Näytteet tutkitaan HPLC:llä ja kemiallinen reaktio keskeytetään, kun Hb-tetrameerien osuus on laskenut 70 %:sta 30 %:iin. Jos reaktio etenee paljon tätä pidemmälle, muo-15 dostuu liian suuria polymeerejä. Sitten Hb-liuokseen lisätään GSH:ta liuotettuna Tham-pitoiseen veteen (pH 7,20) Hb:n ja GSH:n moolisuhteen ollessa 1:20 ja reaktion annetaan edetä 16 tuntia.

Tässä vaiheessa hemoglobiinimolekyyliaggregaatin 20 koostumus on seuraava:

Moolimassa (kD) 1. Hemoglobiinitetrameereja 64 30 % 2. " " x 2 130 20 % 25 3. " " x 3 195 20 % 4. " " x 4 - x 6 256 - 390 30 % Tämä aggregaatti muodosta yhden piikin DEAE-HPLC:ssä kohdalla 50 - 51 minuuttia.

30 Näiden kemiallisten reaktioiden lopuksi hemoglobii- • ni muutetaan karboksimuodosta takaisin oksimuotoon huuhtomalla useaan kertaa steriilillä hapella paineella 241 kPa sekoittaen varovasti lämpötilassa 4 °C ja valottamalla lisäksi 20 sekuntia kestävillä voimakkailla valopulsseilla 35 käyttämällä "Quartzline Lamp, DWY, 120 V, 650 W" -lamppua • · 105256 27 (General Electric Co., Cleveland, Ohio), joka on kytketty "Type 4051 Molequartz" -laitteeseen (Mole-Richradson Co., Hollywood, Kalifornia). Hemoglobiinin takaisinhapettuminen voidaan varmistaa käyttämällä IL Cooximeter -laitetta.

5 E. Lopputuotteen valmistus

Viimeisessä vaiheessa Hb-liuosta dialysoidaan ensin Tham-liuosta (50 mmol/1, pH 8,1) vastaan ja sitten elektrolyyttien suhteen tasapainotettua suolaliuosta vastaan (Normosol R, pH 7,4, sisältää 140 mekv/1 natrium, 5 mekv/1 10 kaliumia, 3 mekv/1 magnesiumia, 98 mekv/1 kloridia, 27 mekv/1 asetaattia ja 23 mekv/1 glukonaattia; Abbott Laboratories). Lopullisen Hb-aggregaatin molekyylikoko jakautuma on seuraava: 15 Moolimassa (daltonia)

Hb-tetrameeri 64 000 5 %

Hb-tetrameeri x 2 130 000 18 %

Hb-tetrameeri x 3 195 000 20 %

Hb-tetrameeri x 4 260 000 30 % 20 Hb-tetrameeri x 5 325 000 16 %

Hb-tetrameeri x 6 390 000 10 %

Niinpä suurimpana prosenttiosuutena esiintyvä mole-kyylispesies koostuu neljästä Hb-tetrameerista, ja sen • 25 moolimassa on 260 000 daltonia. Tämä aggregaatti esiintyy yhtenä piikkinä DEAE-HPLC:ssä kohdalla 50 - 51 minuuttia, mikä heijastaa isoelektrisen pisteen muutosta 6,8:sta 6,1:een.

Pois heitettyä hemoglobiinia sisältävä dialysaatti 30 voidaan konsentroida Hb-pitoisuuteen 10 g/dl dialysoimalla . ·· 6 000 daltonin keinomunuaisella (90 SCE Artificial Kidney, • » C-DAK Co.) ja käyttää uudelleen o-adenosiinilla tehtävään molekyylienväliseen silloitukseen.

Valmiissa muodossa oleva muunnettu hemoglobiini 35 liuotetaan Normosol R:ään, pH 7,4, pitoisuudeksi 10 g/dl.

105256 28

Liuokseen lisätään magnesiumkloridia (MgCl2) (Matheson Coleman & Bell, Norwood, Ohio) ATP:n kanssa ekvivalentti-nen moolimäärä. Mannitolia (GIBCO-Dexter Co., Chagrin Falls, Ohio) lisätään liuokseen pitoisuudeksi 2 mg/ml.

5 Esimerkki II

Uuden tuotteen karakterisointiin käytettiin seuraa-via menettelyjä. Hemoglobiini-, met-Hb- ja karboksi-Hb-pi-toisuudet mitattiin Cooximeter-laitteella (Model 232 Cooximeter, Instrumentation Laboratories, Lexington, Mas-10 sachusetts). Liuoksen elektrolyyttipitoisuudet ja osmolaa-risuus määritettiin ASTRA-laitteella (Beckman Co., Palo Aito, Kalifornia). Onkoottinen paine määritettiin käyttämällä Weil-onkometriä (Instrumentation Laboratories). Viskositeetti määritettiin lämpötilassa 37 °C leikkausnopeu-15 della 100 s'1 käyttämällä Brookfield-viskosimetriä (Brookfield Engineering Laboratories, Stoughton, Massachusetts). Hb:n puhtaus muista proteiineista, fosfolipideistä ja bak-teeriendotoksiineista määritettiin edellä kuvatulla tavalla. Hapensitomiskapasiteetti laskettiin Hb-pitoisuudesta 20 ja Cooximeter-laitteella mitatusta hapen tilavuusosuudes-ta. Hb:n happijakautumakäyrät mitattiin Hem-O-Scan-lait-teella (SLM Aminco, American Instruments, Silver Spring, Maryland). P50-arvot saatiin näiltä käyriltä standardiolo-suhteissa lämpötilan (37 °C), pH:n (7,40) ja pC02:n (5,3 25 kPa) suhteen. Fosfaattipitoisuus analysoitiin Fisken ja Subbarowin menetelmällä [Journal of Biological Chemistry 66 (1925) 375 - 380]. GSH-pitoisuus määritettiin Reedin et ai. menetelmällä [Analytical Biochemistry 106 (1980) 55 -62]. Adenosiini määritettiin HPLC:llä mittaamalla absor-30 banssi aallonpituudella 258 nm ja laskemalla syötetty mää-‘ rä ja hemoglobiiniin sisällytetyksi tullut määrä. ATP-mää- rä laskettiin fosfaattimäärityksen tuloksesta.

Tässä kuvattu tuote indentifioidaan (Hb-PP-GSH)n:ksi, jossa Hb on puhdistettu naudan hemoglobiini, PP 35 on kaksi puriinijohdannaista, o-ATP ja o-adenosiini ja GSH

» » I

29 105256 on pelkistetty glutationi. Perusmolekyyli on tetrameeri-sessä muodossa oleva Hb, jota esittävät kuviot 1 ja 2. Sen puhdistusta muista proteiineista valaistaan kuviossa 3. Yhdiste sisältää yhtä millimoolia (mmol) kohden hemoglo-5 biinia 1,05 mmol ATP:tä, 10 mmol adenosiinia ja 7 mmol GSH:ta. Tämä kemiallinen koostumus ynnä eri vaiheissa valmistuksen aikana tehdyt HPLC-analyysit osoittavat, että o-ATP osallistuu pääasiassa Hb:n molekyylinsisäiseen silloitukseen, kun taas o-adenosiini saa aikaan molekyylien-10 välisen silloittumisen. Lisäksi o-adenosiini kytkee GSH-molekyylin Hb:iin. Yhdistettä valaistaan kuvioissa 4 ja 5. Kokoeksluusio-HPLC:llä tehty spektrianalyysi (kuvio 4) osoittaa, että yhdiste koostuu seuraavista kuudesta mole-kyylispesieksestä: 15 1. Hb (tetrameeri) <5 % 2. (Hb)2 18 % 3. (Hb)3 20 % 4. (Hb )4 30 % 20 5. (Hb)5 16 % 6. (Hb)6 10 % Käy ilmi, että vallitseva spesies niiden joukossa on (Hb)4, ts. neljän tetrameerin aggregaatti. DEAE-HPLC-25 kolonnilla tehty analyysi (kuvio 5) antaa tulokseksi yhden piikin kohdalla 50 - 51 minuuttia, mikä osoittaa, että yhdisteellä on yhtenäinen, redusoitunut (muuntamattomaan Hb:iin nähden) isoelektrinen piste. Isoelektrisellä fokusoinnilla (IEF) tehtu analyysi (kuvio 6) osoittaa nämä 30 Hb:n muuntumiset toiselta kannalta katsottuna.

- " Kun on tehty dialyysi käyttämällä elektrolyyttien suhteen tasapainotettua suolaliuosta, jonka pH on säädetty arvoon 7,4 lisäämällä Tham-liuosta, ja lisätty MgCl2:a ja mannitolia, on lopullisella hemoglobiiniliuoksella seuraa-35 vassa taulukossa esitettävä koostumus.

• * 30 105256

Hb-pitoisuuden ollessa 10 g/dl tämä Hb-liuos kuljettaa oltuaan alttiina normaalipainoiselle ilmalle 13 tilavuus-% happea, mikä osoittaa hapensitomiskapasiteetin olevan lähes 100 % (1,3 tilavuusosaa happea/1 g Hb:a). 5 Tämän liuoksen P50-arvo on korkea (noin 28 mmHg) huolimatta suuren kloridipitoisuuden aiheuttamasta polymeroitumisesta. Osmolaarisuus on korkeampi kuin plasman mutta viskositeetti alhaisempi kuin kokoveren. Kolloidisosmoottinen paine on alempi kuin plasman huolimatta korkeasta hemoglo-10 biinipitoisuudesta (albumiiniin verrattuna) sen vuoksi, että hemoglobiini on polymeroitunut, niin että "Hb-hiuk-kasten" lukumäärä on alentunut.

Taulukko: 15 Hemoglobiiniliuoksen (lopputuotteen) ominaisuudet 1. Hemoglobiini (g/dl) 10,0 ±0,5 2. Met-Hb, (% hemoglobiinista) 3,5 ± 0,5 3. Karboksi-Hb (% hemoglobiinista) 1,5 ± 0,5 4. pH, yksikköä 7,40 20 5. Natrium (mekv/1) 140 ±2,0 6. Kalium (mekv/1) 4,0 ± 0,5 7. Magnesium (mmol/mol Hb:a) 0,8 ± 0,2 8. Kloridi (mekv/1) 120 ± 5,0 9. Mannitoli (mg/dl) 200 ± 5,0 : 25 10. Kolloidisosmoottinen paine (mmHg) 22 ± 2,0 11. Viskositeetti (cP) 1,74 ± 0,04 12. Osmolaarisuus (mosml/1) 325 ± 10 13. Ei-Hb-proteiinit ei havaittavissa 14. Peruskudoksen fosfolipidit ja lipidit 30 15. Bakteeriendotoksiinit " 16. Steriiliys steriili 17. Stabiilius lämpötilassa -60 °C rajoittamaton 31 105256

Esimerkki III

o-ATP:n laajamittainen valmistus

Perusmenetelmä o-ATP:n valmistamiseksi on alalla tunnettu [katso S. B. Easterbrook-Smith et ai., Pyruvate 5 Carboxylase: Affinity labelling of the magnesium adenosine triphosphate binding site, European Journal of Biochemistry 62 (1976) 125 - 130].

Siihen tehtiin muunnoksia suurten ainemäärien valmistamiseksi ja tyydyttävän kemiallisen reaktion takaami-10 seksi hemoglobiinin kanssa.

Adenosiini-5' -trifosfaattidinatriumsuolahydraatin (ATP), F.W. 551.15, ja natriumperjodaatin (NaI04), puhtausaste 99 %, F.W. 213.89, toimitti Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin. Kymmenen 120 ml:n Sephadex 15 G-10 -kolonnia toimitti Pharmacia Fine Chemicals, Pis- cataway, New jersey. Kutakin kolonnia kohden liuotettiin lämpötilassa 0 °C 550 mg ATP:tä 15 ml:aan steriiliä pyro-geenitöntä vettä (injektiovesi, Abbott Laboratories), jonka pH oli säädetty Tham-liuoksella arvon 7,0. Lisättiin 20 natriumperjodaattia moolisuhteessa (ATP:NaI04) 1:1,1 ja liuoksen annettiin seistä lämpötilassa 4 °C pimeässä 1 tunti. Reaktio keskeytettiin käsittelemällä 15 minuuttia etyleeniglykolilla moolisuhteessa (ATP:etyleeniglykoli) 2:1. Reaktioseos laitettiin Sephadex G-10 -kolonnille, : 25 joka oli ennalta tasapainotettu "injektiovedellä", lämpö tilassa 4 °C. Kolonni eluoitiin 200 ml :11a vettä. Ensimmäinen puolisko nukleotidipiikistä, fraktiot 20 - 30 (kuvio 7), yhdistettiin ja kylmäkuivattiin välittömästi Labconco Freeze-Dry System -laitteella, joka oli varustet-30 tu Stoppering Tray Dryer -yksiköllä (Labconco Co., Kansas City, Missouri) alennetussa paineessa <1,3 Pa lämpötilassa -40 °C. Jauhe säilytettiin tummissa pulloissa lämpötilassa -90 °C käyttöön asti.

o-ATP-pitoisuus määritetään mittaamalla absorbanssi 35 aallonpituudella 258 nm, kun taas perjodaatin läsnäolo 32 1 0 5 2 5 6 määritetään mittaamalla absorbanssi aallonpituudella 232 nm. Kolonneja pestään 30 tuntia injektiovedellä lämpötilassa 4 °C, kunnes eluaatin absorbanssi on alle 0,043 aallonpituudella 232 nm, ts. kunnes perjodaatti on kokonaan 5 huuhtoutunut pois, ennen uudelleenkäyttöä.

Tämän keksinnön kannalta ovat tärkeitä kaksi toimenpidettä: (1) talteen otetaan vain o-ATP:tä sisältävät fraktiot, joissa ei ole pieniäkään perjodaattijäännöksiä; ja (2) nämä fraktiot kylmäkuivataan välittömästi ja pakas-10 tetaan lämpötilassa -90 °C. Nämä toimenpiteet estävät hemoglobiinin hapettumisen kemiallisen reaktion aikana.

Esimerkki IV

o-adenosiinin laajamittainen valmistus

Perusmenetelmä o-adenosiinin valmistamiseksi on 15 alalla tunnettu [katso J. X. Khym ja W. E. Cohn, Characterizations and some chemical reactions of periodate-oxidized nucleotides, Journal of Americal Chemical Society 82 (1960) 6380 - 6386]. Siihen tehtiin muunnoksia suurten ainemäärien valmistamiseksi ja tyydyttävän kemiallisen 20 reaktion takaamiseksi hemoglobiinin kanssa.

Adenosiinin, jonka puhtausaste oli 98 %, toimitti Sigma Chemical Co., kun taas perjodaatin toimitti Aldrich Chemical Co. Adenosiini (6 g) liuotettiin 200 ml:aan liuosta, joka sisälsi 150 mmol/1 NaI04:a vedessä, huoneen-: 25 lämpötilassa 30 minuutin aikana. Liuos johdettiin 300 ml: n

kolonnin läpi, joka sisälsi asetaattimuodossa olevaa anio-ninvaihtohartsia AG l-X-8, 100 - 200 meshiä (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia) ja joka oli ennalta tasapainotettu etikkahappoliuoksella (20 mmol/1; eluentti A) 30 (Fisher Scientific Co). Kolonni eluoitiin 2 litralla eluenttia A virtausnopeudella 15 ml/min lämpötilassa 4 °C

keräten 150 ml:n fraktioita. Otettiin talteen vain fraktiot 2-15 (kuvio 8), jotka kylmäkuivattiin välittömästi ja pakastettiin o-ATP:n yhteydessä kuvatulla tavalla.

33 105256

Ennen uudelleenkäyttöä kolonniin syötettiin 6 1 ammoniumkloridiliuosta (100 mmol/1; eluentti B) kaiken perjodaatin vapauttamiseksi. Perjodaattipitoisuus fraktioissa määritettiin mittaamalla absorbanssi aallonpi-5 tuudella 232 nm. Tämän jälkeen kolonni pestiin 6 1:11a "injektiovettä" ja tasapainotettiin uudelleen etikkahap-poliuoksella (20 mmol/1).

Tämän keksinnön kannalta ovat tärkeitä kaksi toimenpidettä: (1) talteen otetaan vain o-adenosiinia sisäl-10 tävät fraktiot, joissa ei ole pieniäkään perjodaattijäännöksiä; ja (2) nämä fraktiot kylmäkuivataan välittömästi ja pakastetaan lämpötilassa -90 °C. Nämä toimenpiteet estävät hemoglobiinin hapettumisen kemiallisen reaktion aikana.

15 Keksinnön sovellusten kuvaus

Esimerkki V

Toksisuus kaniineissa Tämän uuden koostumuksen (Hb-PP-GSH:n) toksisuus testattiin kaniineissa tieteellisessä kirjallisuudessa 20 aiemmin kuvatulla menetelmällä [M. Feola et ai., Toxicity of polymerized hemoglobin solutions, Surgery, Gynecology and Obstetrics 166 (1988) 211 - 222)].

Kaniineille (New Zealand, 12 eläintä, paino 4,0 kg) sijoitettiin lidokaiinilla (1 %) tehdyssä paikallispuudu-: 25 tuksessa steriilit kanyylit toisen korvan keskusvaltimoon ja toisen korvan reunalaskimoon. Virtsarakkoon sijoitettiin steriili katetri. Raajoihin sijoitettiin paikal-lispuuduksessa termistorianturi ja EKG-neulaelektrodit. Elektrokardiogrammia (EKG), verenpainetta, ruumiin lämpö-30 tilaa ja virtsantuotantoa seurattiin jatkuvasti kolmen . · tunnin ajan, minkä jälkeen katetrit ja elektrodit poistet tiin ja eläimet palautettiin häkkeihinsä. 30 minuuttia . kestäneen stationaaritilan (perustaso) jälkeen, otettiin valtimolinjasta 5 minuutin aikana 80 ml verta, joka määrä 35 vastaa 1/3:aa veritilavuudesta [kaniinin laskennallinen 34 105256 veritilavuus = 6 % painosta (kg)]. Infusoitiin yhtä suuri tilavuus Hb-PP-GSH:ta laskimolinjan kautta 30 minuutin aikana. Tämä vastaa suunnilleen 2 g:aa hemoglobiinia. Veren otto aiheutti verenpaineen laskun ja pulssin nopeutumisen.

5 Nämä muutokset korjautuivat nopeasti. Lisäksi pulssipaine (systolisen ja diastolisen paineen erotus), joka laski alhaiseksi verenoton jälkeen, palautui ensin normaaliksi ja kohosi sitten perustason yläpuolelle, mikä osoittaa Hb-liuksen verisuonia laajentavan vaikutuksen. Tämä vaikutus 10 kesti koko kolme tuntia kestäneen tarkkailun ajan. EKGissä ei näkynyt sydämen rytmihäiriöitä. Virtsantuotanto säilyi normaalina, eikä hemoglobiinia poistunut virtsaan.

Verinäytteet, joita otettiin 30 minuutin ja 1, 3 ja 24 tunnin kuluttua verenkorvikkeen annosta osoittivat seu-15 raavaa: (1) ei valkosolujen eikä verihiutaleiden vähentymistä enempää kuin veren laimenemista vastaavassa määrin; (2) ei suonensisäisen koagulaation eikä fibrinolyysin aktivoitumista määritettynä mittaamalla seerumin fibrinogee-ni, protrombiiniaika ja fibriinin hajoamistuotteet; (3) ei 20 kreatiinifosfokinaasiaivoisoentsyymin (CPK-BB) eikä -sy-dänlihasisoentsyymin (CPK-MB) lisääntymistä, joka viittaasi aivo- tai sydänlihavaurioon); (4) ei maksavaurioon viittavaa seerumin glutamiinipalorypälehappotransaminaasin (SPGT) lisääntymistä; (5) normaali valtimoveren kaasuti-; 25 lanne, joka osoittaa normaalin keuhkotoiminnan; ja (5) normaali seerumin kreatiniini, joka viittaa munuaisten normaaliin toimintaan. 3 ja 24 tunnin kuluttua otetut veri- ja virtsanäytteet osoittivat yhdessä normaalin kreati-niinin poistumisen, mikä myös osoittaa munuaisten normaa-30 Iin toiminnan. Kokoveren happidissosiaatiokäyrissä ei näkynyt P50-arvon muutosta, ts. hemoglobiinin aiheuttamaa happiaffiniteetin kasvua. Plasman Hb-pitoisuus oli 24 tunnin kuluttua noin 50 % alkutasosta, mikä viittaa siihen, että hemoglobiinin puoliintumisaika on 24 tuntia.

35 105256

Eläimet näyttivät normaaleilta ja käyttäytyivät normaalisti kyseisten 24 tunnin aikana. Tässä vaiheessa ne lopetettiin ja elintärkeät elimet tutkittiin histologises-ti. Mitään tieteellisessä kirjallisuudessa aiemmin kuvat-5 tuja patologisia muutoksia ei havaittu (a) sydämessä, (b) keuhkoissa, (c) maksassa eikä (d) munuaisissa. Nämä havainnot ovat selvästi vastakkaisia kuin aiemmin epäpuhtaan, glutaarialdehydillä silloitetun hemoglobiinin käytön j älkeen kuvatut (supra).

10 Esimerkki VI

Teho kaniineissa

Tuotteen teho verenkorvikkeena testattiin kaniineissa. Kun oli sijoitettu edellisessä esimerkissä kuvattujen kaltaiset laitteet, vertailuryhmältä (10 New Zea-15 land -kaniinia, paino 4,0 kg) poistettiin 1/3 laskennallisesta veritilavuudesta [veritilavuus = 6 % painosta (kg)], minkä jälkeen poistettiin toinen 1/3 15 minuutin kuluttua. Kaikki nämä eläimet kuolivat ilman hoitoa 15 minuutin kuluttua. 10 kaniinista koostuvalle koeryhmälle 20 toteutettiin sama menettely, mutta eläimet saivat infuu-siona kokonaisverihäviötä vastaavan tilavuuden Hb-PP-GSH:ta. Kaikki nämä eläimet pysyivät elossa, ja niiden hematokriittiarvot (punasolupitoisuudet) palautuivat perustasolle 7 päivän kuluessa.

; 25 Esimerkki VII

Verisuonten laajeneminen veren korvaamisen jälkeen rotissa 12 Sprague-Dawley-rottaa, joiden paino oli 350 -450 g, nukutettiin injektoimalla intraperitoneaalisesti 30 45 mg/kg natriumpentobarbitaalia ja ne laitettiin leik- . · kauspöydälle selälleen. Oikea reisivaltimo, yhteinen pään- valtimo ja ulompi kaulalaskimo paljastettiin kirurgisesti , ja niihin sijoitettiin polyeteenikanyylit (malli PE 50;

Intramedic, New York). Ulommassa kaulalaskimossa oleva 35 katetri työnnettiin oikeaan eteiseen ja termistorianturi 36 105256 (malli IF, Columbus Instruments, Columbus, Ohio) päänval-timon kautta nousevaan aorttaan. Kukin katetri täytettiin fysiologisella suolaliuoksella, joka sisälsi 5 ky/ml naudan hepariinia. Reisivaltimo- ja kaulalaskimolinjat kyt-5 kettiin paineantureihin. Raajoihin sijoitettiin ihon alle neulaelektrodit, joita käytettiin elektrokardiogrammin (EKG) seuraamiseen. Lämpölamput säädettiin pitämään ruumiinlämpö vakiona.

Pulssia seurattiin EKG-käyrältä ja sydämen lyönti-10 tilavuutta mitattiin lämpölaimennusmenetelmällä, injektoimalla 200 μΐ huoneenlämpötilassa (20 - 22 °C) pidettyä fysiologista suolaliuosta oikeaan eteiseen ja rekisteröimällä aorttatermistorin välittämä lämpölaimenemiskäyrä. Systeeminen verisuonivastus laskettiin vähentämällä valti-15 mopaineen keskiarvosta oikean eteisen paine ja jakamalla sydämen lyöntitilavuudella.

Kun perustason hemodynaamiset tulokset oli rekisteröity, poistettiin valtimolinjasta 5 minuutin kuluessa 1/3 laskennallisesta veritilavuudesta [rotan veritilavuus = 20 7 % painosta (kg)]. 15 minuutin kuluttua infusoitiin sama tilavuus HbPP-GSH:ta laskimolinjan kautta. Mitattiin pulssi, keskimääräinen valtimopaine ja sydämen lyöntitilavuus ja laskettiin systeeminen verisuonivastus perustasolla (Tj), 15 minuutin kuluttua verenotosta (T2) ja 15 minuutin : 25 kuluttua hemoglobiinin infusoinnista (T3). Tulokset analy soitiin tilastollisesti käyttämällä Studentin t-testiä tulospareille.

Tulokset, joista esitetään jäljempänä yhteenveto, osoittavat systeemisen verisuonivastuksen nousua verenoton 30 jälkeen, minkä jälkeen seuraa lasku normaalitasolle ja verisuonten laajeneminen jopa perustasoon nähden verenkor-vikkeen annon jälkeen.

37 105256

Taulukko:

Hemodynaamiset käyrät veren Hb-PP-GSH:11a korvaamisen jälkeen

Perustaso Verenvuoto Hemoglobiini 5 Pui«ii {lyöntiä/min) 320 ± 5 390 i 10* 300 i 10*

Keskimääräinen valtloopaine (mmHg) 105 i 5 90 ± 3* 105 i 5*

Sydämen lyöntltilavuus 10 [ml/(kg-min)) 425 t 20 275 i 15* 455 t 28*

Systeeminen verisuonivastus [mmHg/(ml-kg-min)] 0.23 t 0.02 0.33 t 0.03* 0.21 t 0,02*

Luvut: Keskiarvo ± standardipoikkeama; * = tilastollisesti merkitsevä ero (P < 0,05) aiempaan jaksoon nähden.

15

Esimerkki VIII

Vapaiden happiradikaalien muodostuminen kaniineissa 12 kaniinia (New Zealand, paino 4,0 kg) rauhoitettiin klooripromatsiinilla (5 mg/kg, lihaksensisäisesti) ja 20 varustettiin rajoitetulla laitteistolla. Steriilit muovi-kanyylit sijoitettiin toisen korvan keskusvaltimoon ja reunalaskimoon ja termistorianturi ja neulaelektrodit ihonlaisesti raajoihin. Poistettiin kolmasosa laskennallisesta veritilavuudesta [2 % painosta (kg)] valtimolinjan 25 kautta 5 minuutin aikana ja infusoitiin sama tilavuus Hb-liuosta laskimon kautta 30 minuutin aikana. Kuudesta ka-. niinistä koostuva vertailuryhmä sai muuntamatonta Hb:a, kun taas koeryhmä (kuusi kaniinia) sai Hb-PP-GSH:ta. Vaikutuksia tutkittiin plasman vetyperoksidpitoisuuden (H202) 30 ja lipidiperoksidien suhteen, jotka määritettiin perustasolla ja 15 minuutin ja 1, 3 ja 24 tunnin kuluttua Hb-in-fuusiosta. Myös plasman Hb ja met-Hb mitattiin samoin aikavälein.

« t H202-pitoisuus oli kasvanut muuntamatonta HB:a saa-35 dussa ryhmässä arvosta 2 ± 2 ymol/ml arvoon 70 ± 5 pmol/ ml tunnin kuluttua ja laskenut sitten arvoon 50 ± 5 pmol/ ml kolmen tunnin kuluttua ja 10 ± 5 pmol/ml 24 tunnin ku- 38 1 0 5 2 5 6 luttua. Koeryhmässä H202-pitoisuus oli noussut arvosta 2 ± 2 pmol/ml vain arvoon 10 ± 2 pmol/ml tunnin kuluttua ja palannut perustasolle kolmen tunnin kuluttua. Vastaavasti lipidiperoksidipitoisuudet olivat nousseet vertailuryhmäs-5 sä perustasolta 1,5 ± 0,9 nmol/ml arvoon 4,0 ± 1,0 nmol/ml tunnin kuluttua. Koeryhmässä ei tapahtunut merkitsevää nousua. Plasman met-Hb nousi 0 %:sta 15 %:iin tunnin aikana ryhmässä, joka sai muuntamatonta Hb:a. Se kasvoi 0 %:sta 5 %:iin Hb-PP-GSH:ta saaneessa ryhmässä. Näiden 10 muuttujien ero kyseisten kahden ryhmän välillä havaittiin merkitseväksi tilastollisella analyysillä, Studentin t-testillä parittomille näytteille ja näytepareille ynnä ANOVA:11a.

Vaikka keksintöä on kuvattu edellä esitetyn eri-15 tyissuoritusmuodon avulla, monet vaihtoehdot, variaatiot ja muunnokset lienevät ilmeisiä ammattimiehille. Mainitut vaihtoehdot, variaatiot ja muunnokset on tarkoitettu liitteenä olevien patenttivaatimusten hengen mukaisiksi ja kuuluviksi niiden suoja-alan piiriin.

Claims (13)

39 105256

1. Menetelmä verenkorvikeena käytettäväksi tarkoitetun koostumuksen valmistamiseksi, tunnettu sii-5 tä, että menetelmä käsittää vaiheet, joissa hemoglobiini saatetaan reagoimaan o-ATP:n ja o-adenosiinin kanssa silloitetuksi tuotteeksi, joka saatetaan reagoimaan jonkin määrän kanssa pelkistettyä glutationia, ja näin saatu tuote liuotetaan fysiologiseen keittosuolaliuokseen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää mag-nesiumkloridin lisäämisen suunilleen samana molaarisena pitoisuutena, jona o-ATP:tä käytetään.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että hemoglobiini silloitetaan mo-lekyylinsisäisesti perjodaatilla hapetetulla ATP:llä ja molekyylienvälisesti perjodaatilla hapetetulla adenosiinilla, jolloin muodostuu polyhemoglobiinimolekyy-lejä.

4. Minkä tahansa aikaisemman patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä lisäksi käytetään glutationia, ja jolloin hemoglobiinia, o-ATP:tä, o-adenosiinia ja vastaavasti glutationia on läsnä suunnilleen moolisuhteessa 1:1,05:10:7. ; 25

5. Minkä tahansa aikaisemman patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hemoglobiini silloitetaan molekyyleiksi, joiden moolimassa on suunnilleen alueella 130 - 390 kilodaltonia.

6. Minkä tahansa aikaisemman patenttivaatimuksen 30 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että alle 5 % . . hemoglobiinista hapetetaan met-hemoglobiiniksi.

7. Minkä tahansa aikaisemman patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään hemoglobiinia, joka on peräisin naudasta. 40 105256

8. Menetelmä verenkorvikkeena käytettäväksi soveltuvan koostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: muutetaan puhdistetun hemoglobiinin liuos karboksi-5 muotoon kyllästämällä hemoglobiini hiilimonoksidilla; dialysoidaan tuloksena oleva karboksihemoglobiini-liuos normotonista liuosta vastaan hemoglobiinin konsent-roimiseksi suunnilleen pitoisuuteen 10 g/dl; saatetaan karboksihemoglobiini reagoimaan hapetetun 10 adenosiinitrifosfaatin (o-ATP:n) kanssa pääasiallisesti molekyyliensisäisen silloitumisen aikaansaamiseksi hemoglobiinimolekyyleissä; saatetaan karboksihemoglobiini reagoimaan hapetetun adenosiinin (o-adenosiinin) kanssa pääasiallisesti mole-15 kyylienvälisen silloitumisen aikaansaamiseksi hemoglobii nimolekyylien kesken; keskeytetään o-adenosiinisilloitusreaktio lisäämällä liuokseen glutationia; ja muutetaan hemoglobiini karboksimuodosta oksimuotoon 20 huuhtomalla liuosta hapella.

9. Minkä tahansa aikaisemman patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hemoglobiini eristetään ja puhdistetaan kokoverestä, joka menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: . 25 sentrifugoidaan kokoveri verihiutaleiden ja plasman poistamiseksi ja suspendoidaan tuloksena oleva leukosyyt-ti-erytrosyyttiseos liuokseen; jäähdytetään leukosyytti-erytrosyyttiseos leukosyyttien aggregoimiseksi; 30 poistetaan leukosyyttiaggregaatti suodattamalla; eristetään hemoglobiini erytrosyyteistä dialysoi-malla hypotonista liuosta vastaan ja tekemällä erytrosyy-teille ultrasuodatus korotetun hydrostaattisen paineen alaisena; 105256 muutetaan hemoglobiini karboksimuotoon kyllästämällä hemoglobiini hiilimonoksidilla; pastöroidaan hemoglobiiniliuos ei-hemiproteiinien denaturoimiseksi ja saostamiseksi; 5 sentrifugoidaan hemoglobiiniliuos seoksena kloro formin kanssa fosfolipidien ja saostuneiden ei-hemiproteiinien poistamiseksi; poistetaan mahdollisesti jäljellä oleva kloroformi supernatanttihemoglobiiniliuoksesta huuhtomalla hiilimo- 10 noksidikaasulla; ja poistetaan endotoksiinit hemoglobiiniliuoksesta johtamalla liuos affiniteettikromatografiakolonnin läpi.

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää vaiheen, 15 jossa hemoglobiinikoostumus liuotetaan magnesiumkloridia sisältävään liuokseen.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää vaiheen, jossa lisätään mannitolia koostumukseen.

12. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 8-11 mukai nen menetelmä, tunnettu siitä, että o-adenosiini ja o-ATP valmistetaan hapettamalla adenosiini ja vastaavasti ATP perjodaatilla, joka poistetaan ennen o-ATP:n ja adenosiinin saattamista reagoimaan hemoglobiinin kanssa. : 25

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään kokoverta, joka on peräisin naudasta. 42 1 0 5 2 5 6