NO309799B1 - AnalogifremgangsmÕte for fremstilling av et blodsubstitutt - Google Patents

Abstract

Hemoglobinpreparat som inneholder renset hemoglobin (fortrinnsvis fra storfe) kryssbundet intramolekylært med perjodatoksidert ATP (o-ATP) og intermolekylært med perjodatoksidert adenosin (o-adenosin), og forbundet med redusert glutation (GSH). Forbindelsen er anvendbar som et blodsubstitutt da den (1) har forlenget intravaskulær persistens og kan opprettholde plasmavolumet, (2) har lav oksygenaffinitet og kan fungere som en fysiologisk oksygenbærer og (3) har vasodilatorisk aktivitet og kan redusere vasokonstriksjonen som følger blødning.

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse gjelder en analogifremgangsmåte for fremstilling av et blodsubstitutt som består av hemoglobin kryssbundet intramolekylært med o-adenosin, o-ATP og glutation. Nærmere bestemt gjelder den fremstilling av et nytt hemoglobinpreparat som effektivt opprettholder livet etter alvorlige blødninger hos dyr av forskjellige arter, eventuelt hos mennesker, og som ikke er giftig.

Oppfinnelsens bakgrunn

Blod fyller en rekke funksjoner som alle er vitale. Alvorlige blødninger setter imidlertid livet i fare av to hovedgrunner: (1) fallet i volumet av sirkulerende blod reduserer vevsperfusjonen (iskemi), og (2) reduksjonen i oksygen-transport svekker vevsoksygeneringen (hypoksi). Sirkulasjons-systemet reagerer på disse endringer med vasokonstriksjon som forverrer iskemien og hypoksien ytterligere. I siste instans utvikles endringer i cellemetabolisme og -funksjon som fører til sjokk og død.

I denne sammenheng er et "blodsubstitutt" ikke et preparat som kan erstatte blod i alle dets funksjoner, men en gjenopplivende væske for bruk i nødssituasjoner som kan (a) gjenopprette blodvolumet, (b) transportere oksygen og (c) redusere vasokonstriksjonen. En slik væske må naturligvis være fri for toksiske bivirkninger, så vel som for sykdomsfremkal-lende stoffer som bakterier og virus.

Hemoglobin som blodsubstitutt

I over 50 år har anstrengelser rettet mot utvikling av et blodsubstitutt fokusert på hemoglobin (Hb), da dette er det eneste stoff som er i stand til å oppta tilstrekkelig oksygen fra atmosfærisk luft til å kunne fungere som en fysiologisk oksygenbærer. I tillegg utøver hemoglobin det samme kolloidosmotiske trykk som serumalbumin og kan følgelig gi en økning av plasmavolumet. Disse anstrengelser har imidlertid ikke vært vellykkede grunnet en rekke problemer som bare langsomt er blitt erkjent, og som har vært vanskelige å løse. Disse problemer er: (1) giftighet grunnet kontaminering av hemoglobin med (a) bakterieendotoksiner fra omgivelsene, (b) stromale fosfolipider og (c) ikke-hemproteiner og peptider; (2) hemoglobins høye oksygenaffinitet i løsning, som forstyrrer frigjøringen av oksygen til vevene; (3) Hb-molekylets ustabilitet, med tendens til ekstravasering og hurtig utskil-ling i nyrene; (4) hemoglobins tendens til autooksidasjon med dannelse av met-Hb (ikke-funksjonelt Hb) og toksiske frie oksygenradikaler; og (5) Hb's evne som et blodprodukt til å overføre blodrelaterte sykdommer som hepatitt og AIDS.

Toksisitetsproblemet, dvs. Hb-løsningers evne til å aktivere den intravaskulære blodkoagulering og forårsake nyre-skader, var historisk sett det første problem som ble erkjent. Rabiner fikk i 1960-årene stor oppslutning om oppfatningen at denne giftighet skyldtes stroma fra røde blodceller (membran-fragmenter fra røde blodceller) snarere enn Hb. Han under-streket behovet for "stromafritt hemoglobin". Dette begrep har imidlertid i årevis stått i motsetning til det faktum at hemoglobin som virkelig er fritt for alle stromale elementer, ennå ikke er blitt fremstilt. De toksiske faktorer i membranen fra røde blodceller er blitt identifisert som aminofosfolipidene fosfatidyletanolamin (PE) og -serin (PS), som vanligvis er plassert på membranens cytoplasmatiske side (M. Feola et al., "Toxic factors in the red blood cell membrane", The Journal of Trauma, vol. 29, s. 1065-1075, 1989). Det er blitt vist at disse forbindelser har en spesiell affinitet for Hb (de er vanskeligere å fjerne fra Hb-løsningen enn andre stromale bestanddeler), og når Hb kontaminert med PE og PS infiseres i forsøksdyr (kaniner og aper) i betydelige volumer (minst 1/3 av dyrets beregnede blodvolum), forårsaker det en "systemisk inflammatorisk reaksjon" karakterisert ved aktivering av intravaskulær koagulasjon og komplement, aktivering av leukocytter og blodplater, og utvikling av iskemisk-inflammatoriske skader i de vitale organer (M. Feola et al., "Toxicity of polymerized hemoglobin solutions", Surgery, Gynecology and Obstetrics, vol. 166, s. 211-222, 1988; (M. Feola et al., "Complement activation and the toxicity of stroma-free hemoglobin solutions in primates", Circulatory Shock, vol. 25,

s. 275-290, 1988).

Et problem som bare nylig er blitt erkjent, er hvor lett Hb-løsninger kan kontamineres med bakterieendotoksiner fra omgivelsene. Inntil limulusamøbocyttlysatanalysen ble utviklet benyttet De forente staters farmakope kaninpyrogenisi-tetsanalysen for påvisning av endotoksiner. Artiklene henvist til ovenfor har også rapportert at hemoglobin kontaminert med endotoksiner ved konsentrasjoner godt under pyrogenisitets-nivået forårsaker samme slags toksisitet som hemoglobin kontaminert med aminofosfolipider (den toksiske bestanddel i endotoksin er faktisk et lipid, "lipid A"). Bakterieendotoksiner kan fjernes fra biologiske løsninger ved bruk av affinitets-kromatografikolonner som "Detoxi-Gel"-kolonner (Pierce Chemical Co.). Disse kolonner kan imidlertid ikke fjerne alt endotoksin dersom utgangsstoffer inneholder mer enn to endotoksin-enheter pr. milliliter (bestemt ved bruk av "quantitative chromogenic limulus test" (QCL-1000, Whittaker M.D. Bioproducts, ifølge hvilken 1 EU = 0,1 ng bakterielt lipopoly-sakkarid).

Hemoglobin må renses for ikke-hemproteiner og peptider. Selv om ingen toksisitet er blitt vist å skyldes nærvær av noen spesielle proteiner, nødvendiggjøres rensingen av behovet for å redusere Hb-løsningers immunogenisitet. Det er videre blitt foreslått at et peptid er ansvarlig for den vasokonstriktoriske effekt av Hb-løsninger som er påvist i isolerte organer (hjerte og nyre) og isolerte arterier. En rekke fremgangsmåter for slik rensing er kjent innen faget. Disse omfatter: (1) sentrifugering og filtrering (Doczi, US patentskrift nr. 3.991.181); (2) toluenekstråksjon (Bonsen et al., US patentskrifter nr. 4.001.200 og 4.001.401); (3) ultrafiltrering (Kothe et al., US patentskrift nr. 4.526.715); (4) ultrafiltrering pluss syreutfelling (Bonhard et al., US patentskrifter nr. 4.136.093 og 4.336.248); (5) ionebytter-kromatografi (Meiller, US patentskrift nr. 4.100.149); (6) sinkutfelling (Tye, US patentskrifter nr. 4.473.494 og 4.529.719); og (7) krystallisering (DeVenuto et al., Journal of Laboratory and Clinical Medicine, vol. 89, s. 509-514, 1977). Fremgangsmåtene 1-4 har imidlertid iboende begrens-ninger når det gjelder evnen til fullstendig å atskille Hb fra andre proteiner, mens fremgangsmåtene 5-7 ikke egner seg for rensing i stor skala.

Et problem som ble erkjent i 1970-årene, er den høye oksygenaffinitet av Hb i løsning. Det er denne egenskap som regulerer hemoglobins evne til å ta opp oksygen fra luft i lungene og frigjøre det til vevene. Et mål for denne evne er P50-verdien (det partielle oksygentrykk ved hvilket Hb er 50 % mettet). Jo lavere verdi for P50, jo større er hemoglobins evne til å binde oksygen, noe som medfører en redusert evne til å frigjøre oksygen til vevene. P50 for humant blod er tilnærmet 28 mm Hg, mens P50 for humant Hb i løsning er tilnærmet 13 mm Hg. Forskjellen skyldes det faktum at Hb i røde blodceller reagerer med 2,3-difosfoglyserat (2,3-DPG), som reduserer affiniteten av Hb for oksygen. Utenfor den røde blodcelle går denne gjensidige påvirkning tapt. Følgene er at Hb binder 02 så sterkt at det opphører å fungere som en 02-bærer. For å løse dette problem utviklet Benesch et al. en kovalent reaksjon mellom Hb og pyridoksal-5'-fosfat, en "2,3-DPG-analog". En håpet opprinnelig at en slik reaksjon både ville redusere oksygenaffiniteten og stabilisere Hb-molekylet i tetramer form. Disse håp ble imidlertid ikke oppfylt. Storfehemoglobin i løsning har imidlertid samme P50-verdi som humant blod, og oksygenaffiniteten reguleres av klorider snarere enn av 2,3-DPG (M. Feola et al., "Development of a bovine stroma-free hemoglobin solution as a blood substitute", Surgery, Gynecology and Obstetrics, vol. 157, s. 399-408, 1983). Med utgangspunkt i denne fordelaktige egenskap, samt tilgjengeligheten i stor skala av storfe-RBC og den lave antigenisitet av rent hemoglobin blant pattedyr, er bruk av storfehemoglobin som utgangspunkt for et blodsubstitutt forbundet med fordeler.

Et annet problem som ble erkjent i 1970-årene, er den hurtige ekstravasering og korte intravaskulære persistens av hemoglobin. Dette tilskrives vanligvis Hb-tetramerers, a2p2, tilbøyelighet til å dissosiere til dimerer, 2a£, som lettere passerer gjennom blodkapillærene. Det synes nå som om den elektriske ladning på proteinets overflate også spiller en viktig rolle, hvor elektronegativitet og lavt isoelektrisk punkt fremmer intravaskulær persistens. Ekstravasering av hemoglobin har en rekke uønskede virkninger: (1) den utvidende virkning på plasmavolumet er av kort varighet; (2) passasje av Hb gjennom nyreglomerulus gir en osmotisk diuretisk virkning som reduserer, snarere enn å bibeholde, plasmavolumet; (3) reabsorpsjon av Hb i nyretubulus forårsaker skader på tubulus-cellene; og (4) passasje av Hb inn i interstitialvæskene forårsaker ødemer og celleskader. Fagfolk har hittil utelukkende konsentrert seg om å hindre Hb-dimerisering. For dette formål har tre typer Hb-modifisering blitt utviklet: (a) intermolekylær kryssbinding (polymerisering); (b) konjugering av Hb med andre molekyler; og (c) intramolekylær kryssbinding av a-eller (3-kjeder. Den mest benyttede fremgangsmåte er intermolekylær kryssbinding av Hb med glutaraldehyd (Bonsen et al., US patentskrifter nr. 4.001.200, 4.001.401 og 4.053.590; Morris et al., US patentskrift nr. 4.061.736; Bonhard et al., US patentskrift nr. 4.136.093). Det er imidlertid en rekke problemer forbundet med denne fremgangsmåte: (1) glutaraldehyd er i seg selv giftig, og den mulige giftighet av dets metabol-ske biprodukter er ukjent; (2) forbindelsen er svært reaktiv og er tilbøyelig til å danne en rekke kryssbindinger mellom forskjellige seter (a- og e-aminogrupper og sulfhydrylgrupper) i Hb-molekylet, noe som fører til dannelse av et uforutsigbart antall molekylslag; (3) polymeriseringsprosessen er vanskelig å kontrollere og synes å fortsette under lagring ved 4 °C, noe som fører til dannelse av stadig større polymerer med økt viskositet og oksygenaffinitet; (4) kryssbindingens uspesi-fikke natur tillater fortsatt forekomst av Hb-dimerer i løsningen. Som et alternativ er Hb blitt koblet til store molekyler som dekstran og hydroksyetylstivelse (US patentskrift nr. 4.064.118), polyetylen- eller polypropylenglykoler (US patentskrift nr. 4.412.989), inulin (US patentskrift nr. 4.377.512) og polyalkylenoksid (US patentskrift nr. 4.670.417). Disse konjugerte hemoglobiner har imidlertid økt oksygenaffinitet og tilbøyelighet til å få ufordelaktige egenskaper som skyldes de tilkoblede stoffer. Intramolekylær kryssbinding er blitt oppnådd ved bruk av "diaspirin"-estere (Tye, US patentskrift nr. 4.529.719; Walder, US patentskrift nr. 4.598.004) og "perjodatoksidert adenosintrifosfat" (o-ATP)

(F.J. Scannon, "Molecular modification of hemoglobin", Criti-cal Care Medicine, vol. 10, s. 261-265, 1982; A.G. Greenburg og P.W. Maffuid, "Modification of hemoglobin - Ring opened diols", Advances in Blood Substitute Research, Alan R. Liss,

New York, 1983, s. 9-17). Diaspirinhemoglobinene har imidlertid fortsatt kort intravaskulær persistens (en halveringstid på 3-4 timer), mens ATP-hemoglobinene har vist seg utilfreds-stillende grunnet høye nivåer av met-Hb og høy oksygenaffinitet kombinert med en kort halveringstid.

Betydelige fremskritt er blitt rapportert av forskere som har latt humant Hb reagere med pyridoksal-5'-fosfat og glutaraldehyd slik at polymerisert, pyridoksalert Hb ("poly-PLP-hemoglobin") dannes, dvs. et hemoglobin som angivelig skal ha både lav oksygenaffinitet og forlenget intravaskulær persistens (G.S: Moss et al., "Hemoglobin solution - From tetramer to polymer", Biomaterials, Artificial Cells and Artificial Organs, vol. 16 (1-3), s. 57-69, 1988; F. DeVenuto og A. Zegna, "Preparation and evaluation of pyridoxalated-polymerized human hemoglobin", Journal of Surgical Research, vol. 34, s. 205-212, 1983). Det er imidlertid blitt vist at pyri-doksalering forstyrrer polymeriseringen. Det forekommer følge-lig at pyridoksalert Hb med redusert 02-affinitet utskilles hurtig via nyren, mens polymerisert Hb med forlenget halveringstid har høy oksygenaffinitet. Problemet med stabilisering av Hb uten å forstyrre oksygentransportfunksjonen har følgelig ennå ikke blitt løst.

I løpet av de siste par år er det blitt stilt spørs-målstegn vedrørende en eventuelt iboende toksisitet av hemoglobin. Eksperimentelle undersøkelser har rapportert en vaso-konstriktorisk virkning. Siden Hb har tilbøyelighet til å autooksidere til met-Hb (dvs. oksidasjon av hem-jern fra to-verdig til treverdig tilstand, en prosess som danner toksiske frie oksygenradikaler), er det også blitt foreslått at Hb kan virke som en prooksidant ved infusjon i kretsløpet. Denne virkning ville føre til lipoperoksidering av cellemembraner og forårsake skader på cellestrukturer. Begge disse virkninger, vasokonstriksjon og dannelse av frie oksygenradikaler, ville gjøre de iskemisk-hypoksiske skader forårsaket av blødning alvorligere, snarere enn å lette dem. Det er blitt fremlagt resultater av eksperimentelle undersøkelser som viser at vasokonstriksjon og dannelse av radikaler begge kan kontrolleres i tre trinn: (1) fullstendig rensing av Hb; (2) fremstilling og stabilisering av Hb-molekylet med et lavt nivå av met-Hb-dannelse; og (3) tilsetning av stoffer som fjerner oksygenradikaler (M. Feola et al., "Biocompatibility of hemoglobin solutions. I. Reactions of vascular endothelial cells to pure and impure hemoglobins", Artificial Organs, vol. 13 (3),

s. 209-215, 1989).

Endelig medfører bruk av Hb-løsninger faren for blod-produktoverførbare sykdommer. Mens bakterier og parasitter lett kan fjernes ved filtrering under ultrafiltrering, representerer virus et alvorligere problem. To fremgangsmåter for virusinaktivering er kjent innen faget. Den ene er en fysisk fremgangsmåte som består i pasteurisering av hemoglobin i deoksyform ved 60 °C og pH 7,5 i 10 timer. Denne fremgangsmåten er blitt vist å inaktivere modellvirus (sindbis, polio, pseudorabies) så vel som det humane immunodefisiensvirus (HIV)

(T.N. Estep et al., "Virus inactivation in hemoglobin solutions by heat", Biomaterials, Artificial Cells and Artificial Organs, vol. 16 (1-3), s. 129-134, 1988). Den andre er en kjemisk fremgangsmåte som består i behandling med kloroform (S.M. Feinston et al., "Inactivation of hepatitis B virus and non-A non B hepatitis by chloroform", Infection and Immunity, vol. 41, s. 816-821, 1983). Begge fremgangsmåter gir imidlertid betydelig denaturering av hemoglobin med mindre spesielle forholdsregler tas i bruk.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangsmåte for fremstilling av et blodsubstitutt som består av hemoglobin kryssbundet intramolekylært med o-adenosin, o-ATP og glutation, som er kjennetegnet ved at den omfatter omsetning av et hemoglobin med o-ATP og o-adenosin, slik at et kryssbundet produkt dannes, omsetning av det kryssbundne produkt med en mengde redusert glutation og oppløsning av det resulterende produkt i en saltløsning.

Hemoglobinpreparatet kombinerer de fordelaktige egenskaper ved dets bestanddeler: (1) det er en effektiv oksygenbærer ved at storfe-Hb har en naturlig lav oksygenaffinitet (P50-verdi på 28 mm Hg) som ikke påvirkes av forskjellige kjemiske reaksjoner; (2) det utvider effektivt plasmavolumet grunnet det faktum at hemoglobin som er kryssbundet både intra- og intermolekylært, har forlenget intravaskulær persistens (halveringstid på 24 timer); (3) det har vasodilatoriske egenskaper grunnet det faktum at begge puriner reduserer nor-epinefrinindusert vasokonstriksjon; og (4) det innehar ingen prooksidant virkning grunnet nærværet av redusert glutation og mannitol.

De fordelaktige egenskaper ved storfehemoglobin er blitt vist (M. Feola et al., "Development of a bovine stroma-free hemoglobin solution as a blood substitute", Surgery, Gynecology and Obstetrics, vol. 157, s. 399-408, 1983). Ved siden av tilgjengeligheten i stor skala og det at en unngår sykdommer som spesielt overføres av humant blod (i særdeleshet AIDS), har storf e-Hb en P50-verdi som er mer enn dobbelt så stor som den for humant Hb (28 mot 13 mm Hg), og det trenger ikke modulering med 2,3-DPG. Ifølge foreliggende oppfinnelse kan oksygenaffiniteten til storfe-Hb ytterligere reduseres ved forhøyede konsentrasjoner av kloridioner. Når det gjelder mulige immunologiske problemer, er gjennomførbarheten av Hb-transfusjoner mellom pattedyrarter godt dokumentert. Rent storfehemoglobin er faktisk blitt tilført gjentatte ganger (opptil seks ganger) til kaniner og aper i volumer som tilsvarer 1/3-1/2 av de beregnede blodvolumer, uten klinisk på-visbare reaksjoner og uten dannelse av antistoffer som kan påvises ved Ouchterlonys test (M. Feola et al., "Immunologic biocompatibility of hemoglobin solutions", Trasfusione del sangue (italiensk), vol. 33, s. 121-128, 1988).

For å fremstille en Hb-løsning fri for bakterieendotoksiner er strategien benyttet i foreliggende fremgangsmåte for fremstilling å forhindre, snarere enn å korrigere for, kontaminering. Grunnet endotoksins affinitet for hemoglobin er rensing uhyre vanskelig, for ikke å si umulig, å oppnå når først kontaminering av noen betydning har forekommet. For forebygging kreves: (1) at utgangsmaterialet er minimalt kontaminert; (2) at fremstillingstrinnene utføres i et lukket system; (3) at alle overflater som kommer i berøring med Hb er sterile og pyrogenfrie; (4) at alle kjemikalier er rene; (5) at alle løsninger er sterile og pyrogenfrie; og (6) at kvali-tetskontroll utføres for hvert trinn. Den mest følsomme fremgangsmåte for påvisning av endotoksin er "quantitative chromogenic limulus test" (QCL-1000, Whittaker Bioproducts). Dersom utgangsmaterialet eller hemoglobin ved noen av fremstillingstrinnene vises å inneholde mer enn 2 EU/ml, kasseres det. Ved å bibeholde et lavt kontamineringsnivå gjennom fremgangsmåten, kan fullstendig rensing oppnås ved til slutt å la løsningen passere gjennom en affinitetskromatografikolonne, som f.eks. "Detoxi-Gel" (Pierce Chemical Company).

Det samme utgangspunkt med å unngå alvorlig kontaminering kombinert med avsluttende rensing benyttes for fjerning av stromale fosfolipider (spesielt aminofosfolipider). For å redusere stromal kontaminering benytter foreliggende fremgangsmåte en metode for dialyse og ultrafiltrering av røde blodceller som opprinnelig ble beskrevet av J.R. DeLoach et al. i Analytical Biochemistry, vol. 157, s. 191-198, 1986. Ifølge denne fremgangsmåten dialyseres RBC først mot en hypoton fosfatløsning inntil suspensjonen når en osmolaritet på 160 mOsm/l. På dette stadium inntar RBC en kuleform, og porene i cellemembranen er utstrukket. Cellene blir så ultrafiltrert gjennom Amicon-filtre med 0,1 pm porediameter under et kolonnetrykk på 10 psi. Hemoglobin "presses" således ut av cellene uten at cellemembranen ødelegges. Ifølge foreliggende oppfinnelse benyttes en enkelt prosess i et lukket system som er sterilt, pyrogenfritt og som kan kastes etter bruk, både til RBC-dialyse og ultrafiltrering. I tillegg består dialyse-væsken av sterilt, pyrogenfritt, deionisert vann justert til pH 8,2 med Tham-løsning, snarere enn en fosfatløsning, noe som reduserer oksidasjon av hemoglobin. Resultatet av denne prosess er en Hb-løsning som inneholder tilnærmet 3-5 mg/dl fosfolipider (målt ved "phospholipid test set", Boehringer-Mannheim Diagnostics, Indianapolis, Indiana), med bare spor av aminofosfolipidene PE og PS (bestemt ved tynnsjiktskromatografi). Disse gjenværende fosfolipider fjernes ved kloroformekstraksjon. Grunnet det lave nivå av fosfolipider kan dette trinn utføres ved bruk av lave kloroformkonsentrasjoner og korttidssentrifugeringer. På denne måte forhindres denaturering av hemoglobin.

Det samme prinsipp benyttes for rensing av hemoglobin fra ikke-hemproteiner og peptider. I dette tilfellet består første trinn i fjerning av alle plasmaproteiner under "rensingen" av røde blodceller. Dernest forhindrer fremgangsmåten for Hb-ekstraksjon fra RBC uten vesentlig ødeleggelse av røde blodcellemembraner kontaminering med stromale proteiner. Endelig oppnås rensing ved "selective thermal precipitation"

(se P.A. Belter, E.L. Cussler, W.S. Hu, red., Bioseparations, John Wiley & Sons, New York, 1988, s. 227-229). Det vitenskapelige grunnlag for denne fremgangsmåte hviler på det faktum at temperaturavhengig denaturering (og utfelling) av proteiner følger en førsteordens kjemisk kinetikk med tempera-turavhengighet ifølge Arrhenius:

hvor P er konsentrasjonen av oppløst protein. Hastighets-konstanten k er gitt ved:

hvor k0 er en karakteristisk konstant som representerer "akti-ver ingsenergien for denaturering" og T er temperaturen. Ener-gien for denaturering varierer fra protein til protein. Da E forekommer i eksponentiell form i ligningen, har den en stor virkning selv ved små temperaturforandringer. Denne energi påvirkes også av pH-endringer. Vi har også funnet at hemoglobin mettet med karbonmonoksid (HbCO) er motstandsdyktig mot temperaturindusert utfelling ved pH 7,6-7,8. Vi har funnet at pasteurisering ved 60 °C i 9 timer fulgt av pasteurisering ved 70 °C i 1 time ved pH 7,6-7,8 av en hemoglobinløsning i karboksyform ved en konsentrasjon på 10 g/dl gir utfelling av alle ikke-hemproteiner med bare liten denaturering av hemoglobin. Fravær av ikke-hemoglobinproteiner i løsningen fremstilt ved foreliggende fremgangsmåte er bekreftet ved bruk av isoelektrisk fokusering (IEF) og ved størrelseseksklusjons- og anionbytterhøytrykksvæskekromatografi (HPLC). Manglende denaturering av det gjenvunne hemoglobin vises ved fravær av "utspredning" av fokuserte bånd ved IEF og ved bibehold av oksygentransportfunksjon (oksygendissosiasjonskurver, P50,

Bohr-effekt).

Et biprodukt ved fremstillingsprosessen er inakti-vering av virus. Kloroformekstraksjon er faktisk blitt vist å inaktivere en rekke virus med lipidholdige kapper, som f.eks. hepatitt B-virus, ikke-A-ikke-B-hepatittvirus, kukoppevirus og koppevirus, både i plasma og serum (Feinston et al., henvist til ovenfor). Noen virus uten lipider (reovirus) kan også del-vis inaktiveres med kloroform. På den annen side er det vist at pasteurisering ved 60 "Ci 10 timer inaktiverer en rekke virus uten lipidkappe så vel som det humane immunodefisiensvirus (HIV) (T.N. Estep et al., henvist til ovenfor).

Grunnet de uønskede virkninger av polymerisering med glutaraldehyd "stabiliserer" foreliggende fremgangsmåte Hb-molekylet i tetramer form ved bruk av dialdehydderivatet av adenosin-5'-trifosfat (o-ATP). ATP-molekylet har tre basiske bestanddeler: purinbasen adenin, sukkeret D-ribose og en tri-fosf atkjede:

Oksidasjon av ATP med natriumperjodat åpner ribose-ringen ved 2',3'-cis-setet og overfører 2',3'-diolen til det tilsvarende dialdehyd (P.N. Lowe et al., "Preparation and chemical properties of periodate-oxidized adenosine triphosphate and some related compounds", Biochemical Society Trans-actions, vol. 7, s. 1131-1133, 1979):

Hver aldehydgruppe i o-ATP-molekylet kan reagere med e-aminogruppen i lysin og danne en Schiffsk base:

Da 2,3-DPG-lommen i hemoglobin (området i Hb-molekylet som binder 2,3-DPG) inneholder to lysiner, kan o-ATP benyttes til kryssbinding av disse grupper og således stabilisere molekylet i tetramer form. Nærværet av trifosfatkjeden øker denne reaksjons spesifisitet, da slik spesifisitet er blitt vist å forandre polyfosfater som f.eks. pyridoksal-5'-fosfat. Fordelen med ATP fremfor andre forbindelser gis av adeninresten. In vlvo er hydrolyse av ATP til ADP, AMP og endelig til adenosin blitt vist å gi fordelaktige farmako-logiske virkninger, særlig vasodilatasjon, både i det systemiske kretsløp og lungekretsløpet. Ytterligere fordelaktige virkninger er blitt vist når ATP gis sammen med magnesiumklorid (MgCl2) i forbindelse med blødningsindusert sjokk. Disse omfatter forbedret mikrosirkulasjon, forbedret cellemembranfunksjon og en "utløsende" virkning på gjenoppret-telsen av intracellulære adeninnukleotider (I.H. Chaudry og A.E. Baue, "Overview of hemmorrhagic shock", Pathophysiology of shock, anoxia and ischemia, R.A. Cowley og B.F. Trump, red., Williams og Wilkins, Baltimore, Maryland, 1982, s. 203-219).

Som bemerket ovenfor har tidligere forsøk på kryssbinding av Hb med o-ATP ikke vært vellykket, da den kjemiske reaksjon gir uaksepterbare nivåer av met-Hb (opptil 30 %), og at Hb modifisert med o-ATP fortsatt har kort intravaskulær persistens. I tillegg har ATP en uønsket tilbøyelighet til å chelatbinde divalente kationer i karsystemet.

Vi har funnet at den oksiderende virkning av o-ATP skyldes spor av jodat (I04 og I03) som foreligger i forbindelsen. Fullstendig rensing av o-ATP (se eksempel I) korrigerer faktisk dette problem. Vi har også funnet at met-Hb-dannelse kan minimaliseres ved å la o-ATP reagere med karboksy-Hb (Hb mettet med karbonmonoksid), snarere enn med deoksy-Hb som tidligere. Vi har funnet at reaksjonen mellom o-ATP og karboksy-Hb vil foregå dersom løsningens pH reduseres til tilnærmet 7,20. Når det gjelder den kationchelaterende virkning, har vi bekreftet rapporten fra Chaudry og Baue (se ovenfor) om at tilsetning av magnesiumklorid (MgCl2) i ekvimolar mengde med ATP fjerner dette problem. Problemet med kort intravaskulær persistens er imidlertid fortsatt til stede. Vi har funnet at Hb kryssbundet intramolekylært i tetramer form fortsatt kan filtreres gjennom nyreglomerulus og forårsake skader i nyre-tubuli. Det var følgelig nødvendig å kryssbinde hemoglobin inter- så vel som intramolekylært for å oppnå en tilstrekkelig intravaskulær levetid.

Foreliggende oppfinnelse benytter et annet purinderi-vat, dialdehydderivatet av adenosin, eller perjodatoksidert adenosin (o-adenosin) som det andre kryssbindende stoff. Da Hb-molekylet bærer 44 lysinaminogrupper på overflaten, kan o-adenosin benyttes som bro mellom to eller flere av disse grupper og binde to eller flere Hb-tetramerer sammen. For-delene med adenosin fremfor andre forbindelser er flere. For det første har adenosin grunnet nærværet av adenin en vasodilatorisk virkning som tilsvarer den til ATP (C. Su, "Extra-cellular functions of nucleotides in heart and blood vessels", Annual Review of Physiology, vol. 47, s. 665-676, 1985). I tillegg hemmer adenosin blodplateaggregering og gir forbedret glomerulær filtrering i nyren, begge disse virkninger er fordelaktige etter blødning og reperfusjon (R.M. Berne: Regula-tory Functions of Adenosine, Martin Nijhoff Publisher, Boston, Massachusetts, 1983). Reaksjonen mellom hemoglobin og o-adenosin har hittil vært ukjent innen faget. Det er også viktig at reaksjonen utføres med hemoglobin i karboksyform for å redusere dannelsen av met-Hb. Endelig forløper reaksjonen svært langsomt ved 4 °C, slik at den kan stoppes når som helst etter dannelsen av det ønskede molekylaggregat. Denne egenskap tillater fremstilling av Hb-polymerer med forskjellige molekyl-størrelser på en planlagt, reproduserbar måte (noe som ikke kan gjøres ved .bruk av andre kryssbindende stoffer som glutaraldehyd). Kryssbindingen av hemoglobin med o-adenosin stoppes ved tilsetning av redusert glutation (GSH), som i likhet med lysin inneholder en e-aminogruppe. Ved å delta i denne reaksjonen blir GSH en del av Hb-preparatet.

Valget av GSH er basert på viten om at denne forbindelse forekommer i store mengder i de røde blodceller, hvor

dens viktigste oppgave er å fungere som en "oksidasjonsmiddel-felle" som beskytter hemoglobin mot oksiderende påvirkning (A. Larsson: Functions of Glutathione: Biochemical, Physiological, Toxicological and Clinical Aspects, Raven Press, New York, 1983). Vi har bekreftet at GSH beskytter hemoglobin i løsning så vel som inne i erytrocyttene. Det er også blitt vist at kryssbinding med o-adenosin fulgt av reaksjonen med GSH gir et økt antall negative ladninger på Hb-molekylets overflate og reduserer det isoelektriske punkt til Hb fra 6,8 til 6,1-6,2. Dette bidrar til stabilisering av hemoglobin i den forstand at det forlenger intravaskulær persistens og forhindrer filtrering gjennom nyren.

o-ATP og o-adenosin kan erholdes fra kommersielle kilder (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), eller de kan fremstilles ifølge de fremgangsmåter som beskrives nedenfor som eksempel I og eksempel II. Redusert glutation erholdes fra en kommersiell kilde.

Etter disse reaksjoner og tilbakeføringen av karboksy-Hb til oksy-Hb løses den nye forbindelse (Hb-PP-GSH) i en elektrolyttbalansert saltløsning anriket med magnesiumklorid (MgCl2) og mannitol. MgCl2 tilsettes i ekvimolar mengde med ATP. Dette har flere fordelaktige virkninger: (1) det kontrol-lerer den divalente kationchelaterende virkning av ATP; (2) det supplerer ATP i dets gunstige virkninger på mikrosirkula-sjonen; og (3) det gir et overskudd av kloridioner som modu-lerer affiniteten av Hb for oksygen nedover (hjelper til å bibeholde en høy P50-verdi). Mannitol tilsettes i små mengder basert på kunnskap om at det virker som en fjerner av OH<*->radikaler (de mest giftige oksygenavledede frie radikaler), og muligens av andre radikaler også (B.A. Freeman og J.D. Crapo, "Free radicals and tissue injury", Laboratory Investigation, vol. 47, s. 412-426, 1982).

Det er foreliggende oppfinnelses formål å tilveie-bringe en kjemisk forbindelse som er anvendbar som et blodsubstitutt, dvs. i stand til (a) å gjenopprette og bibeholde plasmavolumet, (b) å forsyne de vitale organer med oksygen, og (c) lette vasokonstriksjonen etter blødning.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 viser en spektrumanalyse av rent storfehemoglobin erholdt ved HPLC med en størrelseseksklusjonskolonne. Kromatogrammet viser en enkelt topp lokalisert ved 9,4 minutter, som viser hemoglobin i tetramer form (64.000 dalton). Figur 2 viser en spektrumanalyse av rent storfehemoglobin erholdt ved HPLC med en DEAE-kolonne. Kromatogrammet viser flere topper lokalisert mellom 20 og 36 minutter, som tilsvarer forskjellige isoelektriske punkter av forskjellige Hb-bestanddeler. Figurene 3A-B viser spektrumindeksen for storfehemoglobin før (3A) og etter (3B) rensing ved pasteurisering (HPLC med DEAE-kolonne, spektrumbølgelengde 230-599 nm). I figur 3A kan ikke-Hb-proteiner ses ved retensjonstidene 17 og 51 minutter. I figur 3B kan ikke-Hb-proteiner ikke lenger ses. Figur 4 viser en spektrumanalyse ved HPLC-størrelses-eksklusjon av storfe-Hb kryssbundet intramolekylært med o-ATP og intermolekylært med o-adenosin, og kombinert med redusert glutation. Kromatogrammet viser et Hb-molekylaggregat som består av seks topper. Figur 5 viser en spektrumanalyse ved HPLC-DEAE-kolonne av storfe-Hb modifisert som i figur 4. Kromatogrammet viser en enkelt topp med retensjonstid 51 minutter. Det isoelektriske punkt av Hb er endret (sammenlignet med ikke-modifisert Hb) grunnet økningen i elektronegative ladninger på overflaten. Figur 6 viser en undersøkelse ved isoelektrisk fokusering (IEF - Pharmacia). Figur 7 viser absorbansen ved 258 nm av på hverandre følgende fraksjoner av o-ATP- og natriumperjodatreaksjons-blandingen eluert fra en "Sephadex"-kolonne med vann. Figur 8 viser absorbansene ved 258 og 232 nm av på hverandre følgende fraksjoner av o-adenosin- og natriumper-jodatreaksjonsblandingen eluert fra en anionbytterkolonne med elueringsmiddel A.

Beskrivelse av den foretrukne utførelse

Eksempel I

Den foretrukne fremgangsmåte for fremstilling av det komplekse produkt omfatter fem trinn: (A) rensing av røde blodceller; (B) ekstraksjon av hemoglobin; (C) rensing av hemoglobin; (D) modifisering av hemoglobin (reaksjon med o-ATP, o-adenosin og glutation); og (E) fremstilling av sluttproduktet (Hb-PP-GSH)n.

A. Rensing av røde blodceller ( RBC)

Det foretrukne utgangsmateriale er storfeblod, av grunner som er diskutert ovenfor. Fremstillingsfremgangsmåten kan imidlertid benyttes med utgangspunkt i andre typer patte-dyrblod, heriblant menneskeblod. Storfeblod kan erholdes fra et antall friske givere eller fra enkeltdyr som skal slaktes. I første tilfelle fastholdes en voksen ku, nakken barberes, og huden behandles med antiseptisk såpe. Blod tappes ved punksjon av den ytre halsvene under aseptiske betingelser. Tilnærmet 1.500 ml blod kan erholdes fra ett dyr, oppsamlet i en 2-liters lufttom, steril, pyrogenfri flaske som inneholder 200 ml ACD-antikoagulant (Virbac, Inc., Lenexa, Kansas). I det andre tilfellet "behandles" én side av nakken raskt etter at dyret er bedøvd forut for slaktingen, og en trokar innføres perkutant i halspulsåren. Tilnærmet 10 1 blod kan fjernes fra hver voksen ku. Blod fra forskjellige dyr blandes ikke. Flaskene holdes på is under transport til laboratoriet.

Det er viktig, særlig når utgangspunktet er storfeblod, at RCB (erytrocytter) skilles fullstendig fra hvite blodceller (leukocytter), blodplater og plasma. Dette trinn reduserer mengden ikke-hemproteiner og andre forbindelser fra hvilke hemoglobin før eller senere må renses. Fjerning av alle leukocytter fjerner i tillegg de virus som er forbundet med disse celler, særlig med lymfocytter (cytomegalovirus, humant immunodefisiensvirus og andre).

RBC renses ved en "spin-cool-filter"-metode. "Spin"-trinnet består av en rekke sentrifugeringer utført i et lukket system ved bruk av en blodbankcelleseparator, som f.eks. DIDECO-systemet (Electromedics Inc., Englewood, Colorado) på

følgende måte:

1. sentrifugering ved 1.100 rpm ved 15 °C i

20 minutter for å fjerne blodplater og plasma;

2. sentrifugering ved 4.500 rpm ved 15 °C i

10 minutter for mer fullstendig fjerning av plasma; 3. vask (x 4) med isoton saltløsning (RBC/saltvann 1:4) ved sentrifugering ved 4.100 rpm ved 4 °C i 10 minutter; 4. endelig vask med isoton Tham-løsning, pH 8,1-8,2 (Tham USP, Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois). Dette tillater suspensjon av vaskede RBC i en elektrolytt f ri løsning med høy pH, som beskytter hemoglobinet fra oksidasjon.

For "cool"-delen av prosessen lagres RBC i "transfer packs" (sterile, pyrogenfrie plastikk-beholdere fremstilt av Fenwal Laboratories, Deerfield, Illinois) ved 4 °C over natten, eller i 18 timer. Ved lav temperatur har de hvite blodceller tilbøyelighet til å aggregere til små klumper. For "filter"-trinnet passeres cellene gjennom et 20 um cellulosefilter, f.eks. et "high capacity transfusion filter" fremstilt av Fenwal, som fjerner leukocyttaggregatene.

For å bekrefte fravær av leukocytter og blodplater utføres celletellinger ved hjelp av en Coulter-celleteller, og fravær av proteiner i suspensjonen bekreftes ved vanlige kjemiske metoder. Nærvær av bakterieendotoksin bestemmes ved bruk av "quantitative chromogenic limulus test" (QCL-1000, Whittaker Bioproducts, Walkersville, Maryland).

B. Ekstraksjon av hemoglobin

Ekstraksjon av hemoglobin fra RBC utføres i to trinn. Først dialyseres 1 1 RBC suspendert i isoton Tham-løsning, pH 8,1-8,2, ved en konsentrasjon på 20 % (hematokrit 0,20) mot 10 1 hypoton (230 mOsm/l) Tham-løsning ved hjelp av en kunstig nyre med 0,20 um porøsitet, som f.eks. "Krosflo II Filtration Module with 10 Ft<2> Surface Area" (Microgon Inc., Laguna Hills, California). Dialysen utføres inntil dialysatet blir rødfarget

(et skjær av hemoglobin). På dette stadium er RBC oppsvulmet til kuler, og de utstrukne cellemembraner blir permeable overfor Hb. I det andre trinn settes et trykk på 10 psi på den kunstige nyre, slik at Hb blir klemt ut av cellene uten at cellemembraner ødelegges. Membran-"ghosts" kasseres etter én passering gjennom filteret. Etter hvert som hemoglobin går inn i reservoaret for den hypotone løsning, bibeholdes volumet i RBC-reservoaret ved tilsetning av Tham-løsning, 230 mOsm/1. Det ekstraherte hemoglobin filtreres gjennom et 0,20 um filter, f.eks. "Posidyne I.V. Filter" (PALL Biomedical Inc., Fajardo, Puerto Rico) for å fjerne gjenværende partikkelrester eller mikrobielle kontaminanter, og lagres i "transfer packs" ved 4 °C.

Resultatet av denne prosess er en Hb-løsning som inneholder 3-5 mg/dl fosfolipider (målt ved bruk av "phospholipid test set", Boehringer-Mannheim Diagnostics, Indianapolis, Indiana), med bare spor av aminofosfolipidene PE og PS (bestemt ved tynnsjiktskromatografi).

C. Rensing av hemoglobin

Dette utføres i fire trinn:

1. Pasteurisering av hemoglobin i karboksvform

( HbCO)

Dette utføres i en forsterilisert, pyrogenfri, bio-logisk reaktor som f.eks. "Microlift-15 liter sterilizable-in-place bioreactor with NBS Model ML-4100 control system" (New Brunswick Scientific Co., Edison, New Jersey). Dette er en lukket beholder med flere seter for innføring av gasser og væsker, kraner for uttak av prøver, en agitator for røring og temperaturkontroller. Bioreaktoren er installert under et ut-blåsningsavtrekk. Hemoglobinet mettes med karbonmonoksid (99,99 % renhet, Criogenic Rare Cas Co., Hanahan, South Carolina) ved gjentatt gjennomstrømning med steril gass ved 760 mm Hg, 4 °C, under langsom røring. Fullstendig metning bekreftes ved bruk av et kooksimeter (modell 282, Instrumentation Laboratories, Lexington, Massachusetts). Prosessen tar tilnærmet 15 minutter. Løsningen oppbevares under CO ved 760 mm Hg. Pasteurisering utføres så ved langsom heving av temperaturen i bioreaktoren fra 4 til 60 °C og henstand ved dette nivå i 9 timer, hvoretter temperaturen heves til 70 °C i 1 time. Etter disse tidsrom reduseres temperaturen langsomt tilbake til 4 °C.

2. Sentrifugering med kloroform

I dette trinn filtreres Hb-løsningen gjennom et

0,20 um filter ned i 250 ml sterile, pyrogenfrie sentrifuge-flasker forseglet med egnede hetter ("polyallomer"-flasker motstandsdyktige overfor kloroform, proteiner og alkohol, erholdt fra Sorvall Division, Du Pont Co., Wilmington, Delaware).

En serie på tre sentri fugas joner utføres ved bruk av en Sorvall-sentrifuge (modell OTD75B med rotor TFA 20.250), på følgende måte: a. sentrifugering av hemoglobin blandet med kloroform i forholdet 15:1 (for hver flaske: 232 ml Hb, 18 ml kloroform) ved 760 x g ved 4 °C i

30 minutter. Supernatanten overføres i en ny

serie med flasker ved hjelp av sterile, pyrogenfrie slanger og en peristaltisk pumpe i en sterilbenk med laminær luftstrømning,

b. sentrifugering av Hb blandet med kloroform i forholdet 16:1 ved 1.600 x g, 4 °C, i 15 minutter, og ved 3.800 x g i 15 minutter. Supernatanten overføres til en tredje serie med flasker,

c. sentrifugering uten kloroform ved 61.400 x g i

60 minutter.

Etter den tredje sentrifugering overføres Hb-løs-ningen til 1.000 ml sterile, pyrogenfrie, lufttomme flasker (Abbot Laboratories) med magnetrørepinner, i hvilke gjenværende rester av kloroform fjernes fra løsningen ved gjennom-strømning av steril CO-gass under langsom røring ved 4 °C i 2 timer.

Kloroformen som benyttes i dette trinn, er av HPLC-kvalitet med UV-"cut-off" 244 nm (Fisher Scientific Co., Fair Lawn, New Jersey). Flaskene kan brukes flere ganger etter behandling med (a) "E-T0XA-Clean"-såpe (Sigma Chemicals), (b) 100 % etanol og (c) sterilisering ved 120 °C i 80 minutter. Denne serien med sentrifugeringer fjerner ikke bare alle fosfolipider, men skiller også det rensede hemoglobin fra ikke-hemproteinene som ble denaturert og utfelt i det foregående pasteuriseringstrinn.

3. Filtrering gjennom endotoksinaffinitetskromato-graf ikolonne

Hb-løsningen passeres gjennom en affinitetskromatografikolonne, som f.eks. "Detoxi-Gel"-kolonnen (Pitirce Chemical Co., Rockford, Illinois) med "transfer packs" ved innløp og utløp og en peristaltisk pumpe, slik at et lukket system blir dannet. Fremgangsmåten utføres i en klasse 100 sterilbenk med laminær luftstrøm.

I dette trinn kan konsentrasjonen av endotoksin reduseres fra 2,0-2,5 EU/ml til < 0,10 EU/ml.

4. Dialyse

Hb-løsningen dialyseres i forholdet 1:10 mot sterilt, pyrogenfritt, deionisert vann justert til pH 7,20 ved tilsetning av Tham-løsning. Dialysen utføres ved bruk av en kunstig nyre med 6.000 dalton porøsitet, som f.eks. "90 SCE - Artificial Kidney" (C-DAK Co., Miami Lakes, Florida). Dette trinn vil (a) fjerne små molekyler, (b) konsentrere hemoglobin til 10 g/dl og (c) senke pH i Hb-løsningen fra tilnærmet 8,2 til tilnærmet 7,2.

Ved dette trinn i prosessen er "rent" hemoglobin blitt fremstilt, dvs. hemoglobin fullstendig fritt for (a) bakterieendotoksiner, (b) stromale lipider og fosfolipider og (c) ikke-hemproteiner. Gjentatte filtreringer gjennom 0,20 um filtre på forskjellige trinn i prosessen forventes videre å ha fjernet alle mikrobielle kontaminanter, mens pasteurisering og kloroformbehandling forventes å ha inaktivert både ikke-lipid-og lipidomkapslede virus. Videre tillater bruken av hemoglobin i karboksyform rensing av dette med en lav grad av oksidasjon (1-2,5 % met-hemoglobindannelse).

D. Modifisering av hemoglobin

Reaksjonen av hemoglobin med o-ATP, o-adenosin og redusert glutation utføres i den biologiske reaktor som følger. Hemoglobin i karboksyform, 10 g/dl i vann justert med Tham til pH 7,20, gjeninnføres i bioreaktoren og holdes ved

4 °C med langsom røring under en atmosfære med karbonmonoksid. o-ATP fremstilt ifølge eksempel III og lagret i pulverform oppløses i sterilt, pyrogenfritt vann justert til pH 7,20, og tilsettes umiddelbart til Hb-løsningen i et molart forhold Hb/o-ATP 1:3. Reaksjonen får forløpe ved 4 °C og 150 rpm røring under CO i 24 timer. Prøver av løsningen tas ut hver 6. time og undersøkes ved HPLC med en størrelseseksklu-sjonskolonne for å kontrollere økningen i molekylvekt av hemoglobin, og med en anionbytterkolonne for å kontrollere endringen i elektrisk ladning. Et Waters HPLC-system som omfatter en Waters 600 E-systemkontroller, en Waters 712-injek-tor, en Waters 990-fotodiodedetektor og en NEC Power Mate 2-datamaskin benyttes. Størrelseseksklusjonskolonnen (Protein Pak 300 SW) og anionbytterkolonnen (DEAE-5 PW) erholdes også fra Waters (Waters Chromatography Division, Millipore Co., Milford, Massachusetts). Den ideelle kryssbindingstilstand opptrer ved tilnærmet 24 timer, hvor undersøkelse ved anion-bytter-HPLC viser at 90-95 % av det tilsatte o-ATP er blitt forbrukt i den kjemiske reaksjon. Resultatet er dannelse av et molekylaggregat som består av:

Med andre ord gir o-ATP under disse reaksjonsbeting-elser hovedsakelig intramolekylær kryssbinding, men også noe intermolekylær kryssbinding. Dette forstyrrer imidlertid ikke den følgende reaksjon.

Etter 24 timer oppløses o-adenosin, fremstilt ifølge eksempel IV og lagret i pulverform, i sterilt vann, pH 7,20, ved tilsetning av Tham, med noen få dråper etanol. Denne forbindelse tilsettes til Hb-løsningen i et molart forhold mellom Hb og o-adenosin på 1:5, og reaksjonen får forløpe under de samme betingelser i 24 timer. Ved dette tidspunkt tilsettes en ny dose o-adenosin i det samme molare forhold på 1:5 og får reagere i ytterligere 24 timer. Prøver undersøkes med HPLC, og den kjemiske reaksjon stoppes når nivået av Hb-tetramerer er blitt redusert fra 70 til 30 %. Dersom reaksjonen forløper langt ut over dette punkt, vil overdrevent store polymerer dannes. GSH oppløst i vann + Tham, pH 7,20, tilsettes så til Hb-løsningen i et molart forhold Hb/GSH på 1:20 og får reagere i 16 timer.

På dette punkt omfatter hemoglobinmolekylaggregatet:

Dette aggregat gir en enkelt topp med HPLC-DEAE ved 50-51 minutter.

Etter disse kjemiske reaksjoner tilbakeføres hemoglobin fra karboksy- til oksyform ved gjentatt gjennomblåsing av sterilt oksygen ved 35 psi under forsiktig røring ved 4 °C, samt eksponering for 20 sekunders pulser med sterkt lys fra en "quartzline lamp, DWY, 120 V, 650 W (General Electric Co., Cleveland, Ohio) koblet til en "type 4051 molequartz" (Mole-Richardson Co., Hollywood, California). Reoksygeneringen av hemoglobin kan bekreftes ved bruk av et IL-kooksimeter.

E. Fremstilling av sluttproduktet

I avslutningstrinnet dialyseres Hb-løsningen først mot 50 mM Tham-løsning, pH 8,1, deretter mot en elektrolyttbalansert saltløsning (Normosol R, pH 7,4, med 140 mekv/1 natrium, 5 mekv/1 kalium, 3 mekv/1 magnesium, 98 mekv/1 klorid, 27 mekv/1 acetat og 23 mekv/1 glukonat; Abbot Laboratories ). Molekylstørrelsesprofilen av det endelige Hb-aggregat er:

Den hyppigst forekommende molekyltype består således av fire Hb-tetramerer og har en molekylvekt på 260.000 dalton. Aggregatet gir en enkelt topp ved HPLC-DEAE ved 50-51 minutter, som viser en endring i isoelektrisk punkt fra 6,8 til 6,1.

Dialysatet som inneholder passert hemoglobin, kan konsentreres til 10 g/dl Hb ved dialyse med en 6.000 dalton kunstig nyre (90 SCE kunstig nyre, C-DAK Co.) og benyttes på nytt for intramolekylær kryssbinding med o-adenosin.

I sin endelige form oppløses det modifiserte hemoglobin i Normosol R, pH 7,4, ved en konsentrasjon på 10 g/dl. Magnesiumklorid (MgCl2) erholdt fra Matheson Coleman & Bell, Norwood, Ohio, tilsettes løsningen i en mengde som er ekvimolar med ATP. Mannitol erholdt fra GIBCO-Dexter Co., Chagrin Falls, Ohio, tilsettes i en mengde på 2 mg/ml løsning.

Eksempel II

De følgende fremgangsmåter ble benyttet for karak-terisering av det nye produkt. Konsentrasjoner av hemoglobin, met-Hb og karboksy-Hb ble målt i et kooksimeter (modell 282, Instrumentation Laboratories, Lexington, Massachusetts). Elek-trolyttkonsentrasjonen og osmolariteten av løsningen ble bestemt ved hjelp av et ASTRA-apparat (Beckman Co., Palo Al to, California). Osmotisk trykk ble anslått ved bruk av et Weil-osmometer (Instrumentation Laboratories). Viskositeten ble bestemt ved 37 "C og en forskyvningshastighet på 100/sekund ved bruk av et Brookfield viskometer (Brookfield Engineering Laboratories, Stoughton, Massachusetts). Renheten av Hb for andre proteiner, fosfolipider og bakterieendotoksiner ble anslått som beskrevet ovenfor. Den oksygenbindende kapasitet ble beregnet fra målingen av Hb-konsentrasjon og oksygenvolum-innholdet erholdt i kooksimeteret. Hb-oksygendissosiasjonskurver ble erholdt med et Hem-O-Scan-apparat (SLM Aminco, American Instruments, Silver Spring, Maryland). P50-verdier ble avlest på disse kurver under standardbetingelser for temperatur (37 °C), pH (7,40) og pC02 (40 torr). Analyse av fosfat-innhold ble utført ved fremgangsmåten til Fiske og Subbarow (Journal of Biological Chemistry, vol. 66, s. 375-380, 1925). Bestemmelse av GSH-innhold ble utført ifølge fremgangsmåten til Reed et al. (Analytical Biochemistry, vol. 106, s. 55-62, 1980). Adenosin ble bestemt ved bruk av HPLC og absorbans-måling ved 258 nm og beregning av tilført mengde og mengde inkorporert i hemoglobin. ATP ble beregnet ut fra fosfat-bestemmelsen.

Produktet som her er karakterisert, er identifisert som (Hb-PP-GSH)n, hvor Hb = renset storfehemoglobin, PP = de to purinderivater o-ATP og o-adenosin, og GSH = redusert glutation. Hovedmolekylet er Hb i tetramer form, som vist i figurene 1 og 2. Dets renhet for andre proteiner er vist i figur 3. For hvert millimol (mM) av hemoglobin inneholder forbindelsen 1,05 mM ATP, 10 mM adenosin og 7 mM GSH. Denne kjemiske sammensetning samt HPLC-analyse utført ved forskjellige trinn i fremstillingen viser at o-ATP hovedsakelig deltar i den intramolekylære kryssbinding av Hb, mens o-adenosin gir den intermolekylære kryssbinding. I tillegg forankrer o-adenosin GSH-molekylet til Hb. Forbindelsen er illustrert i figurene 4 og 5. Spektrumanalyse ved HPLC-størrelseseksklusjon (figur 4) viser at forbindelsen består av seks molekyltyper:

Blant disse synes (Hb)4, dvs. aggregatet av fire tetramerer, å være den dominerende type. Analyse ved HPLC-DEAE-kolonne (figur 5) viser en enkelt topp ved 50-51 minutter som tyder på at forbindelsen har et uniformt, redusert (relativt til ikke-modifisert Hb) isoelektrisk punkt. Analyse ved isoelektrisk fokusering (IEF) (figur 6) viser disse modifikasjoner av Hb fra en annen synsvinkel.

Etter dialyse mot den elektrolyttbalanserte salt-løsning, justert til pH 7,4 ved tilsetning av Tham-løsning, og etter tilsetning av MgCl2 og mannitol, har den endelige hemo-globinløsning sammensetningen som er vist i den påfølgende tabell.

Ved konsentrasjonen på 10 g/dl transporterer denne

Hb-løsning etter eksponering for atmosfærisk luft 13 %

(vol/vol) oksygen, noe som tyder på en oksygenbindende evne nær 100 % (1,3 volumer oksygen pr. 1 g Hb). P50-verdien for løsningen er høy (tilnærmet 28 mm Hg) trass i polymeriseringen, grunnet den høye kloridkonsentrasjon. Osmolariteten er høyere enn for plasma, men viskositeten er lavere enn for helblod. Det kolloidosmotiske trykk er lavere enn for plasma trass i den høye hemoglobinkonsentrasjon (sammenlignet med albumin) grunnet det faktum at hemoglobin er polymerisert, slik at antallet "Hb-partikler11 er redusert.

Eksempel III

Fremstilling av o- ATP 1 stor skala

Utgangsfremgangsmåten for fremstilling av o-ATP er kjent innen faget (se S.B. Easterbrook-Smith et al., "Pyruvate Carboxylase: Affinity labelling of the magnesium adenosine triphosphate binding site", European Journal of Biochemistry, vol. 62, s. 125-130, 1976).

Endringer ble gjort for å fremstille større mengder materiale og sikre en tilfredsstillende kjemisk reaksjon med hemoglobin.

Adenosin-5'-trifosfat-dinatriumsalt-hydrat (ATP), formelvekt 551,15, og natriumperjodat (NaI04) av 99 % renhet, formelvekt 213,89, ble erholdt fra Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin. Ti 120 ml "Sephadex" G-10-kolonner ble erholdt fra Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey. For hver kolonne ble 550 mg ATP oppløst i 15 ml sterilt, pyrogenfritt vann (vann for injeksjon, Abbott Laboratories), justert med Tham-løsning til pH 7,0, ved 0 °C. Natriumperjodat ble tilsatt i et molart forhold (ATP/NaI04) på 1:1,1, og løsningen fikk stå ved 4 °C i mørke i 1 time. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av etylenglykol i et molart forhold (ATP/etylenglykol) på 2:1 i 15 minutter. Reaksjonsblandingen ble påsatt "Sephadex" G-10-kolonnen som på forhånd var ekvilibrert med "vann for injeksjon" ved 4 °C. Kolonnen ble eluert med 200 ml vann. Den fremste halvpart av nukleotidtoppen, fraksjonene 20-30, som vist i figur 7, ble slått sammen og umiddelbart frysetørket med en Labconco "Freeze-Dry System with Stoppering Tray Dryer, (Labconco Co., Kansas City, Missouri) med et vakuum på < 10 pm Hg ved -40 °C. Pulveret ble lagret i mørke flasker ved -90 °C inntil det skulle benyttes.

Konsentrasjonen av o-ATP bestemmes ved måling av absorbansen ved 258 nm, mens nærvær av perjodat anslås ved måling av absorbansen ved 232 nm. Kolonnene vaskes med vann for injeksjon i 30 timer ved 4 °C, inntil eluatet har en absorbans på mindre enn 0,043 ved 232 nm, dvs. inntil alt perjodat er utvasket, før de brukes på nytt.

To tiltak er viktige for foreliggende oppfinnelses formål: (1) at bare fraksjoner som inneholder o-ATP uten spor av perjodat oppsamles og (2) at disse fraksjoner umiddelbart frysetørkes og fryses ved -90 °C. Disse tiltak vil forhindre oksidasjon av hemoglobin under den kjemiske reaksjon.

Eksempel IV

Fremstilling av o- adenosin i stor skala

Utgangsfremgangsmåten for fremstilling av o-adenosin er kjent innen faget (se J.X. Khym og W.E. Cohn, "Characteri-zations and some chemical reactions of periodate-oxidized nucleotides", Journal of American Chemical Society, vol. 82, s. 6380-6386, 1960). Endringer ble gjort for fremstilling av større stoffmengder og for å sikre en tilfredsstillende kjemisk reaksjon med hemoglobin.

Adenosin av 98 % renhet ble erholdt fra Sigma Chemical Co., mens natriumperjodat ble erholdt fra Aldrich Chemical Co. 6 g adenosin ble oppløst i 200 ml 150 mM NaI04 i vann ved værelsestemperatur i 30 minutter. Løsningen ble passert gjennom en 300 ml kolonne med anionbytterharpiks AG l-X-8, 100-200 mesh på acetatform (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California), som på forhånd var ekvilibrert med 20 mM eddiksyre (elueringsmiddel A) erholdt fra Fisher Scientific Co. Kolonnen ble eluert med 2 1 elueringsmiddel A ved en strømningshastig-het på 15 ml/minutt og en temperatur på 4 °C, og fraksjoner på 150 ml ble oppsamlet. Bare fraksjonene 2-15 ble tatt vare på

(som vist i figur 8), disse ble umiddelbart frysetørket og nedfrosset, som for o-ATP.

Før ny bruk ble 6 1 100 mM ammoniumklorid (elueringsmiddel B) påsatt kolonnen for å fjerne alt perjodat. Perjodat-konsentrasjonen i fraksjonene ble bestemt ved å måle absorbansen ved 232 nm. Etter dette ble kolonnen vasket med 6 1 "vann for injeksjon" og så ekvilibrert på ny med 20 mM eddiksyre.

To tiltak er viktige for foreliggende oppfinnelses formål: (1) at bare fraksjoner som inneholder o-adenosin uten spor av perjodat oppsamles og (2) at disse fraksjoner umiddelbart frysetørkes og fryses ved -90 °C. Disse tiltak vil forhindre oksidasjon av hemoglobin under den kjemiske reaksjon.

Beskrivelse av anvendelser av oppfinnelsen

Eksempel V

Toksisitet i kaniner

Toksisiteten av den nye forbindelse (Hb-PP-GSH) ble analysert i kaniner ifølge en fremgangsmåte som tidligere er beskrevet i den vitenskapelige litteratur (M. Feola et al., "Toxicity of polymerized hemoglobin solutions", Surgery, Gynecology and Obstetrics, vol. 166, s. 211-222, 1988).

Tolv New Zealand-kaniner med kroppsvekt 4,0 kg fikk under lokalbedøvelse med 1 % lidokain innsatt sterile kanyler i sentralarterien i et øre og den marginale vene i det andre øret. Et sterilt kateter ble innsatt i urinblæren. En termistorprobe og ECG-nålelektroder ble innsatt i lemmene under lokalanestesi. Elektrokardiogram (ECG), blodtrykk, kroppstemperatur og urinutskillelse ble kontinuerlig målt i 3 timer, hvoretter kateteret og elektroder ble fjernet og dyrene satt tilbake i burene. Etter 30 minutter med "steady state" (grunn-linje) ble 80 ml blod, tilsvarende 1/3 av blodvolumet (beregnet blodvolum hos kaniner = 6 % av kroppsvekten i kg) fjernet via arterien over et tidsrom på 5 minutter. Et tilsvarende volum Hb-PP-GSH ble infusert via venen over et tidsrom på 30 minutter. Dette tilsvarte tilnærmet 2 g hemoglobin. Fjerningen av blod forårsaket et fall i blodtrykk og en økt hjertefrekvens. Disse endringer ble hurtig korrigert. Videre returnerte pulstrykket (forskjellen mellom systolisk og dia-stolisk trykk), som ble lavt etter blødningen, først til normalverdien, hvoretter det ble større enn ved grunnlinjen, noe som viser en vasodilatorisk virkning av Hb-løsningen. Denne effekt varte gjennom hele den akutte observasjonsperiode på 3 timer. ECG viste ingen hjertearytmi. Urinutskillelsen forble normal, uten ekstravasering av hemoglobin i urinen.

Blodprøver tatt 30 minutter, 1, 3 og 24 timer etter blodutskiftingen viste: (1) ingen reduksjon av hvite blodceller og blodplater ut over den blodfortynnende virkning; (2) ingen aktivering av intravaskulær koagulering og fibrinolyse, bestemt ved måling av serumfibrinogen, protrombintid og spaltingsprodukter av fibrin; (3) ingen økning av kreatin-fosfokinasehjerneisoenzym (CPK-BB) eller myokardielt isoenzym

(CPK-MB) som kunne tyde på cerebral eller myokardlell skade; (4) Ingen økning av glutaminsyre-pyrodruesyretransaminase i serum (SGPT) som kunne tyde på leverskade; (5) normale arterieblodgasser som viste normal lungefunksjon; og (6) normalt serumkreatinin, som tyder på normal nyrefunksjon. De kombinerte blod- og urinprøver ved 3 og 24 timer viste normal kreatininutskilling, som igjen tyder på normal nyrefunksjon. Oksygendissosiasjonskurver for helblod viste ingen forandring i P50-verdi, dvs. ingen økt oksygenaf f ini tet grunnet hemoglobin. Plasma-Hb-nivået ved 24 timer var tilnærmet 50 % av utgangsnivået, noe som tyder på en hemoglobinhalveringstid på 24 timer.

Dyrene virket og oppførte seg normalt i 24 timer. På dette tidspunkt ble de drept og de vitale organer undersøkt histologisk. Ingen av de patologiske endringer som tidligere er blitt beskrevet i den vitenskapelige litteratur, ble funnet i (a) hjertet, (b) lunger, (c) lever og (d) nyrer. Disse funn står i sterk kontrast til dem tidligere beskrevet (se refe-ranser ovenfor) etter bruk av urent hemoglobin kryssbundet med glutaraldehyd.

Eksempel VI

Effektivitet i kaniner

Effektiviteten av produktet som et blodsubstitutt ble undersøkt i kaniner. Etter instrumentering som tilsvarer den beskrevet i foregående eksempel, ble en tredjedel av beregnet blodvolum (blodvolum = 6 % av kroppsvekt i kg) fjernet fra en kontrollgruppe på 10 New Zealand-kaniner med kroppsvekt 4,0 kg, fulgt av fjerning av ytterligere 1/3 etter 15 minutter. Uten behandling døde alle disse dyr i løpet av 1 time. En eksperimentell gruppe på 10 kaniner ble utsatt for samme behandling, men mottok en infusjon med Hb-PP-GSH i samme volum som det totale blodtap. Alle disse dyr overlevde og gjenopp-rettet sin opprinnelige hematokrit (konsentrasjon av røde blodceller) i løpet av 7 dager.

Eksempel VII

Vasodilataslon etter bloderstatnin<q> hos rotter

Tolv Sprague-Dawley-rotter med kroppsvekt 350-450 g ble bedøvd ved intraperitoneal injeksjon av natriumpentobarbi-tal, 45 mg/kg, og plassert på ryggen på et operasjonsbord. Høyre femoralarterie, halspulsåre og eksterne halsvene ble kirurgisk frigjort og kanylert med polyetylenkatetvaret (modell PE 50; Intramedic, New York). Det eksterne halsvenekateter ble ført inn i høyre forkammer, mens en termistorprobe (modell IF, Columbus Instruments, Columbus, Ohio) ble ført gjennom halspulsåren inn i den oppadgående del av aorta. Hvert kateter ble fylt med saltvann som inneholdt 5 IU/ml storfeheparin. Det femoralarterielle og det halsvenøse uttak ble forbundet med trykkmålere. Nålelektroder ble innført subkutant i lemmene og benyttet for opptak av elektrokardiogram (ECG). Varmelamper ble justert for å gi konstant kroppstemperatur.

Hjertefrekvensen ble bestemt fra ECG-målingen og hjertets minuttvolum målt ved termodilutering, ved injeksjon av 200 ul saltvann ved værelsestemperatur (20-22 °C) inn i høyre forkammer og opptak av en termodilusjonskurve fra termi-storen i aorta. Den systemiske karmotstand ble beregnet som det gjennomsnittlige arterietrykk minus trykket i høyre forkammer dividert med hjertets minuttvolum.

Etter opptak av hemodynamiske basisdata ble 1/3 av det beregnede blodvolum (blodvolum hos rotte = 7 % av kroppsvekt i kg) fjernet via det arterielle uttak over en 5 minut-ters periode. Etter 15 minutter ble Hb-PP-GSH i samme volum infisert via veneuttaket. Hjertefrekvens, gjennomsnittlig arterietrykk og minuttvolum ble målt og den systemiske karmotstand beregnet ved utgangstilstanden (Tx), 15 minutter etter fjerning av blod (T2) og 15 minutter etter hemoglobininfusjon (T3). Statistisk analyse av målingene ble utført ved bruk av Student's t-test for parede data.

Resultatene som er oppsummert nedenfor, viser økt systemisk karmotstand etter fjerning av blod, fulgt av reduksjon til normalverdi og av vasodilatasjon, selv relativt til utgangsverdien, etter bloderstatning.

Eksempel VIII

Dannelse av frie oksygenradikaler 1 kaniner

Tolv New Zealand-kaniner med kroppsvekt 4,0 kg ble bedøvd med klorpromazin (5 mg/kg, intramuskulært) og utstyrt med begrenset instrumentering. Sterile plastikkanyler ble innsatt i sentralarterien og kantvenen i et øre, og en termistorprobe og nålelektroder ble innsatt subkutant i lemmene. En tredjedel av det beregnede blodvolum (2 % av kroppsvekten i kg) ble fjernet fra arterieuttaket over et tidsrom på 5 minutter, og det samme volum med Hb-løsning ble infisert gjennom venen over et tidsrom på 30 minutter. En kontrollgruppe på seks kaniner fikk umodifisert Hb, mens eksperimentgruppen (seks kaniner) fikk Hb-PP-GSH. Virkningene ble undersøkt med hensyn på plasmanivåer av hydrogenperoksid (H202) og lipidperoksider målt ved utgangstUstanden og 15 minutter, 1 time, 3 timer og 24 timer etter Hb-infusjon. Plasma-Hb og met-Hb ble også målt ved de samme tidspunkter.

H202 økte i gruppen som mottok umodifisert Hb fra

2 ± 2 til 70 ± 5 pmol/ml etter 1 time, og avtok så til 50

5 pmol/ml ved 3 timer og til 10 ± 5 pmol/ml ved 24 timer. I eksperimentgruppen økte H202 bare fra 2 <+> 2 til 10+2 umol/ml ved 1 time, og vendte tilbake til utgangsverdien etter 3 timer. Tilsvarende økte lipidperoksider fra 1,5 ± 0,9 nmol/ ml i utgangstilstanden til 4,0 ± 1,0 nmol/ml etter 1 time i kontrollgruppen. Ingen signifikant økning forekom i eksperimentgruppen. Plasma-met-Hb økte fra 0 til 15 % i løpet av 1 time i gruppen som mottok umodifisert Hb. Det økte fra 0 til 5 % i gruppen som mottok Hb-PP-GSH. Forskjellen mellom de to grupper i disse variabler ble vist å være signifikant ved statistisk analyse, Student's t-tester og uparede og parede prøver samt ANOVA.

Selv om oppfinnelsen er blitt beskrevet i forbindelse med den foregående spesifikke utførelse, vil mange alternativer, variasjoner og modifikasjoner være åpenbare for fagfolk. Disse alternativer, variasjoner og modifikasjoner er ment å ligge innenfor påfølgende krav, ånd og område.

Claims (7)

1. Analogi fremgangsmåte for fremstilling av et blodsubstitutt som består av hemoglobin kryssbundet intramolekylært med o-adenosin, o-ATP og glutation, karakterisert ved at den omfatter omsetning av et hemoglobin med o-ATP og o-adenosin, slik at et kryssbundet produkt dannes, omsetning av det kryssbundne produkt med en mengde redusert glutation og oppløsning av det resulterende produkt i en saltløsning.

2. Analogifremgangsmåte ifølge krav 1, hvor blodsubsti-tuttet videre omfatter en tilsetning av magnesiumklorid ved en konsentrasjon som er tilnærmet ekvimolar med konsentrasjonen av o-ATP, karakterisert ved at det anvendes tilsvarende utgangsmaterialer.

3. Analogif remgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, hvor hemo-globinet kryssbindes intramolekylært med perjodatoksidert ATP og intermolekylært med perjodatoksidert adenosin, slik at molekyler av polyhemoglobin dannes, karakterisert ved at det anvendes tilsvarende utgangsmaterialer.

4. Analogif remgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, hvor hemoglobinet, o-ATP, o-adenosinet og glutationet foreligger i molare forhold på henholdsvis ca 1:3:10:20, karakterisert ved at det anvendes tilsvarende utgangsmaterialer.

5. Analogifremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, hvor de kryssbundne hemoglobinmolekyler har molekylvekter i området fra tilnærmet 130 til tilnærmet 390 kilodalton, karakterisert ved at det anvendes tilsvarende utgangsmaterialer.

6. Analogif remgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, hvor mindre enn 5 % av hemoglobinet oksi-deres til met-hemoglobin, karakterisert ved at det anvendes tilsvarende utgangsmaterialer.

7. Analogifremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, hvor hemoglobinet er fra storfe, karakterisert ved at det anvendes tilsvarende utgangsmaterialer.