NO309799B1 - AnalogifremgangsmÕte for fremstilling av et blodsubstitutt - Google Patents
AnalogifremgangsmÕte for fremstilling av et blodsubstitutt Download PDFInfo
- Publication number
- NO309799B1 NO309799B1 NO922551A NO922551A NO309799B1 NO 309799 B1 NO309799 B1 NO 309799B1 NO 922551 A NO922551 A NO 922551A NO 922551 A NO922551 A NO 922551A NO 309799 B1 NO309799 B1 NO 309799B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- hemoglobin
- atp
- adenosine
- blood
- solution
- Prior art date
Links
- 239000003633 blood substitute Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 47
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 11
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 claims abstract description 118
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 claims abstract description 118
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims abstract description 45
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 claims abstract description 40
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 claims abstract description 40
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 claims abstract description 27
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims abstract description 23
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 15
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 10
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- 108010061951 Methemoglobin Proteins 0.000 claims description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 2
- 108010050918 polyhemoglobin Proteins 0.000 claims 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 abstract description 44
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 abstract description 44
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 40
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 17
- 230000002688 persistence Effects 0.000 abstract description 9
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 abstract description 7
- 206010047139 Vasoconstriction Diseases 0.000 abstract description 7
- 230000025033 vasoconstriction Effects 0.000 abstract description 7
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 abstract description 3
- 229940124549 vasodilator Drugs 0.000 abstract 1
- 239000003071 vasodilator agent Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 64
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 42
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 42
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 30
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 29
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 229960001456 adenosine triphosphate Drugs 0.000 description 22
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 21
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 17
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 15
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 13
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 13
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 13
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 12
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 11
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 10
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 9
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 9
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 8
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 8
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical group CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000008015 Hemeproteins Human genes 0.000 description 7
- 108010089792 Hemeproteins Proteins 0.000 description 7
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 7
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 7
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 7
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 7
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 7
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 7
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 7
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 7
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 7
- XOHUEYCVLUUEJJ-UHFFFAOYSA-N 2,3-Bisphosphoglyceric acid Chemical compound OP(=O)(O)OC(C(=O)O)COP(O)(O)=O XOHUEYCVLUUEJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 6
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 6
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- -1 oxygen radicals Chemical class 0.000 description 6
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 6
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 6
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 5
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 5
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 5
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 5
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 5
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 5
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 5
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 5
- INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 2-(furan-2-yl)-7-methyl-1h-1,8-naphthyridin-4-one Chemical compound N=1C2=NC(C)=CC=C2C(O)=CC=1C1=CC=CO1 INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 206010015866 Extravasation Diseases 0.000 description 4
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 4
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 4
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 4
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 4
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 230000036251 extravasation Effects 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011589 pyridoxal 5'-phosphate Substances 0.000 description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 108010001708 stroma free hemoglobin Proteins 0.000 description 4
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 4
- ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N Dialdehyde 11678 Chemical class N1C2=CC=CC=C2C2=C1[C@H](C[C@H](/C(=C/O)C(=O)OC)[C@@H](C=C)C=O)NCC2 ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 3
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 3
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 3
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 3
- 230000036581 peripheral resistance Effects 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 3
- 235000007682 pyridoxal 5'-phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 210000005245 right atrium Anatomy 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- 230000000304 vasodilatating effect Effects 0.000 description 3
- PREOBXYMXLETCA-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-carboxyphenoxy)-4-oxobutanoyl]oxybenzoic acid Chemical class OC(=O)C1=CC=CC=C1OC(=O)CCC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O PREOBXYMXLETCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000592 Artificial Cell Substances 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241001631457 Cannula Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 2
- 230000004872 arterial blood pressure Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 2
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 2
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 2
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 230000002016 colloidosmotic effect Effects 0.000 description 2
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 2
- 108010036302 hemoglobin AS Proteins 0.000 description 2
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- GRPSNTXTTSBKGW-BVGHQBMWSA-J magnesium;potassium;sodium;(3r,4s,5s,6r)-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4,5-tetrol;triacetate;chloride Chemical compound [Na+].[Mg+2].[Cl-].[K+].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GRPSNTXTTSBKGW-BVGHQBMWSA-J 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000012569 microbial contaminant Substances 0.000 description 2
- 230000004089 microcirculation Effects 0.000 description 2
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000003244 pro-oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000002264 triphosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 2
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 2
- 239000005526 vasoconstrictor agent Substances 0.000 description 2
- 230000024883 vasodilation Effects 0.000 description 2
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- XOHUEYCVLUUEJJ-UHFFFAOYSA-I 2,3-Diphosphoglycerate Chemical compound [O-]P(=O)([O-])OC(C(=O)[O-])COP([O-])([O-])=O XOHUEYCVLUUEJJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 206010002660 Anoxia Diseases 0.000 description 1
- 241000976983 Anoxia Species 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 description 1
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M D-gluconate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 208000000655 Distemper Diseases 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 206010019786 Hepatitis non-A non-B Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000724832 Non-A, non-B hepatitis virus Species 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 241000702244 Orthoreovirus Species 0.000 description 1
- 229940079172 Osmotic diuretic Drugs 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 208000004880 Polyuria Diseases 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 1
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010049771 Shock haemorrhagic Diseases 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 206010047141 Vasodilatation Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000001949 anaesthesia Methods 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 230000007953 anoxia Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003119 arrhythmia Diseases 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 238000006701 autoxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 229940064551 bovine heparin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- ZPEIMTDSQAKGNT-UHFFFAOYSA-N chlorpromazine Chemical compound C1=C(Cl)C=C2N(CCCN(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 ZPEIMTDSQAKGNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001076 chlorpromazine Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005796 circulatory shock Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 229940124446 critical care medicine Drugs 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 1
- 230000035487 diastolic blood pressure Effects 0.000 description 1
- YGXMYKTZDMYISM-IDIVVRGQSA-J dimagnesium;[[[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-oxidophosphoryl]oxy-oxidophosphoryl] phosphate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O YGXMYKTZDMYISM-IDIVVRGQSA-J 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 1
- NTBQNWBHIXNPRU-MSQVLRTGSA-L disodium;[[[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-oxidophosphoryl] hydrogen phosphate;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP([O-])(=O)OP(O)([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O NTBQNWBHIXNPRU-MSQVLRTGSA-L 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001882 diuretic effect Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 108010072542 endotoxin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000001105 femoral artery Anatomy 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 1
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 230000000004 hemodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 description 1
- 239000000815 hypotonic solution Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 description 1
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- ICIWUVCWSCSTAQ-UHFFFAOYSA-M iodate Chemical compound [O-]I(=O)=O ICIWUVCWSCSTAQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000012332 laboratory investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 230000002248 lipoperoxidative effect Effects 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 238000002690 local anesthesia Methods 0.000 description 1
- 230000004199 lung function Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003680 myocardial damage Effects 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 1
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002337 osmotic diuretic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 229940083251 peripheral vasodilators purine derivative Drugs 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229920000233 poly(alkylene oxides) Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011176 polyphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 description 1
- 230000004088 pulmonary circulation Effects 0.000 description 1
- 230000035485 pulse pressure Effects 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 230000009103 reabsorption Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001839 systemic circulation Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035488 systolic blood pressure Effects 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- 230000000287 tissue oxygenation Effects 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 210000005233 tubule cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/41—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- A61K38/42—Haemoglobins; Myoglobins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pyrane Compounds (AREA)
- Hydrogenated Pyridines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Hemoglobinpreparat som inneholder renset hemoglobin (fortrinnsvis fra storfe) kryssbundet intramolekylært med perjodatoksidert ATP (o-ATP) og intermolekylært med perjodatoksidert adenosin (o-adenosin), og forbundet med redusert glutation (GSH). Forbindelsen er anvendbar som et blodsubstitutt da den (1) har forlenget intravaskulær persistens og kan opprettholde plasmavolumet, (2) har lav oksygenaffinitet og kan fungere som en fysiologisk oksygenbærer og (3) har vasodilatorisk aktivitet og kan redusere vasokonstriksjonen som følger blødning.
Description
Oppfinnelsens område
Foreliggende oppfinnelse gjelder en analogifremgangsmåte for fremstilling av et blodsubstitutt som består av hemoglobin kryssbundet intramolekylært med o-adenosin, o-ATP og glutation. Nærmere bestemt gjelder den fremstilling av et nytt hemoglobinpreparat som effektivt opprettholder livet etter alvorlige blødninger hos dyr av forskjellige arter, eventuelt hos mennesker, og som ikke er giftig.
Oppfinnelsens bakgrunn
Blod fyller en rekke funksjoner som alle er vitale. Alvorlige blødninger setter imidlertid livet i fare av to hovedgrunner: (1) fallet i volumet av sirkulerende blod reduserer vevsperfusjonen (iskemi), og (2) reduksjonen i oksygen-transport svekker vevsoksygeneringen (hypoksi). Sirkulasjons-systemet reagerer på disse endringer med vasokonstriksjon som forverrer iskemien og hypoksien ytterligere. I siste instans utvikles endringer i cellemetabolisme og -funksjon som fører til sjokk og død.
I denne sammenheng er et "blodsubstitutt" ikke et preparat som kan erstatte blod i alle dets funksjoner, men en gjenopplivende væske for bruk i nødssituasjoner som kan (a) gjenopprette blodvolumet, (b) transportere oksygen og (c) redusere vasokonstriksjonen. En slik væske må naturligvis være fri for toksiske bivirkninger, så vel som for sykdomsfremkal-lende stoffer som bakterier og virus.
Hemoglobin som blodsubstitutt
I over 50 år har anstrengelser rettet mot utvikling av et blodsubstitutt fokusert på hemoglobin (Hb), da dette er det eneste stoff som er i stand til å oppta tilstrekkelig oksygen fra atmosfærisk luft til å kunne fungere som en fysiologisk oksygenbærer. I tillegg utøver hemoglobin det samme kolloidosmotiske trykk som serumalbumin og kan følgelig gi en økning av plasmavolumet. Disse anstrengelser har imidlertid ikke vært vellykkede grunnet en rekke problemer som bare langsomt er blitt erkjent, og som har vært vanskelige å løse. Disse problemer er: (1) giftighet grunnet kontaminering av hemoglobin med (a) bakterieendotoksiner fra omgivelsene, (b) stromale fosfolipider og (c) ikke-hemproteiner og peptider; (2) hemoglobins høye oksygenaffinitet i løsning, som forstyrrer frigjøringen av oksygen til vevene; (3) Hb-molekylets ustabilitet, med tendens til ekstravasering og hurtig utskil-ling i nyrene; (4) hemoglobins tendens til autooksidasjon med dannelse av met-Hb (ikke-funksjonelt Hb) og toksiske frie oksygenradikaler; og (5) Hb's evne som et blodprodukt til å overføre blodrelaterte sykdommer som hepatitt og AIDS.
Toksisitetsproblemet, dvs. Hb-løsningers evne til å aktivere den intravaskulære blodkoagulering og forårsake nyre-skader, var historisk sett det første problem som ble erkjent. Rabiner fikk i 1960-årene stor oppslutning om oppfatningen at denne giftighet skyldtes stroma fra røde blodceller (membran-fragmenter fra røde blodceller) snarere enn Hb. Han under-streket behovet for "stromafritt hemoglobin". Dette begrep har imidlertid i årevis stått i motsetning til det faktum at hemoglobin som virkelig er fritt for alle stromale elementer, ennå ikke er blitt fremstilt. De toksiske faktorer i membranen fra røde blodceller er blitt identifisert som aminofosfolipidene fosfatidyletanolamin (PE) og -serin (PS), som vanligvis er plassert på membranens cytoplasmatiske side (M. Feola et al., "Toxic factors in the red blood cell membrane", The Journal of Trauma, vol. 29, s. 1065-1075, 1989). Det er blitt vist at disse forbindelser har en spesiell affinitet for Hb (de er vanskeligere å fjerne fra Hb-løsningen enn andre stromale bestanddeler), og når Hb kontaminert med PE og PS infiseres i forsøksdyr (kaniner og aper) i betydelige volumer (minst 1/3 av dyrets beregnede blodvolum), forårsaker det en "systemisk inflammatorisk reaksjon" karakterisert ved aktivering av intravaskulær koagulasjon og komplement, aktivering av leukocytter og blodplater, og utvikling av iskemisk-inflammatoriske skader i de vitale organer (M. Feola et al., "Toxicity of polymerized hemoglobin solutions", Surgery, Gynecology and Obstetrics, vol. 166, s. 211-222, 1988; (M. Feola et al., "Complement activation and the toxicity of stroma-free hemoglobin solutions in primates", Circulatory Shock, vol. 25,
s. 275-290, 1988).
Et problem som bare nylig er blitt erkjent, er hvor lett Hb-løsninger kan kontamineres med bakterieendotoksiner fra omgivelsene. Inntil limulusamøbocyttlysatanalysen ble utviklet benyttet De forente staters farmakope kaninpyrogenisi-tetsanalysen for påvisning av endotoksiner. Artiklene henvist til ovenfor har også rapportert at hemoglobin kontaminert med endotoksiner ved konsentrasjoner godt under pyrogenisitets-nivået forårsaker samme slags toksisitet som hemoglobin kontaminert med aminofosfolipider (den toksiske bestanddel i endotoksin er faktisk et lipid, "lipid A"). Bakterieendotoksiner kan fjernes fra biologiske løsninger ved bruk av affinitets-kromatografikolonner som "Detoxi-Gel"-kolonner (Pierce Chemical Co.). Disse kolonner kan imidlertid ikke fjerne alt endotoksin dersom utgangsstoffer inneholder mer enn to endotoksin-enheter pr. milliliter (bestemt ved bruk av "quantitative chromogenic limulus test" (QCL-1000, Whittaker M.D. Bioproducts, ifølge hvilken 1 EU = 0,1 ng bakterielt lipopoly-sakkarid).
Hemoglobin må renses for ikke-hemproteiner og peptider. Selv om ingen toksisitet er blitt vist å skyldes nærvær av noen spesielle proteiner, nødvendiggjøres rensingen av behovet for å redusere Hb-løsningers immunogenisitet. Det er videre blitt foreslått at et peptid er ansvarlig for den vasokonstriktoriske effekt av Hb-løsninger som er påvist i isolerte organer (hjerte og nyre) og isolerte arterier. En rekke fremgangsmåter for slik rensing er kjent innen faget. Disse omfatter: (1) sentrifugering og filtrering (Doczi, US patentskrift nr. 3.991.181); (2) toluenekstråksjon (Bonsen et al., US patentskrifter nr. 4.001.200 og 4.001.401); (3) ultrafiltrering (Kothe et al., US patentskrift nr. 4.526.715); (4) ultrafiltrering pluss syreutfelling (Bonhard et al., US patentskrifter nr. 4.136.093 og 4.336.248); (5) ionebytter-kromatografi (Meiller, US patentskrift nr. 4.100.149); (6) sinkutfelling (Tye, US patentskrifter nr. 4.473.494 og 4.529.719); og (7) krystallisering (DeVenuto et al., Journal of Laboratory and Clinical Medicine, vol. 89, s. 509-514, 1977). Fremgangsmåtene 1-4 har imidlertid iboende begrens-ninger når det gjelder evnen til fullstendig å atskille Hb fra andre proteiner, mens fremgangsmåtene 5-7 ikke egner seg for rensing i stor skala.
Et problem som ble erkjent i 1970-årene, er den høye oksygenaffinitet av Hb i løsning. Det er denne egenskap som regulerer hemoglobins evne til å ta opp oksygen fra luft i lungene og frigjøre det til vevene. Et mål for denne evne er P50-verdien (det partielle oksygentrykk ved hvilket Hb er 50 % mettet). Jo lavere verdi for P50, jo større er hemoglobins evne til å binde oksygen, noe som medfører en redusert evne til å frigjøre oksygen til vevene. P50 for humant blod er tilnærmet 28 mm Hg, mens P50 for humant Hb i løsning er tilnærmet 13 mm Hg. Forskjellen skyldes det faktum at Hb i røde blodceller reagerer med 2,3-difosfoglyserat (2,3-DPG), som reduserer affiniteten av Hb for oksygen. Utenfor den røde blodcelle går denne gjensidige påvirkning tapt. Følgene er at Hb binder 02 så sterkt at det opphører å fungere som en 02-bærer. For å løse dette problem utviklet Benesch et al. en kovalent reaksjon mellom Hb og pyridoksal-5'-fosfat, en "2,3-DPG-analog". En håpet opprinnelig at en slik reaksjon både ville redusere oksygenaffiniteten og stabilisere Hb-molekylet i tetramer form. Disse håp ble imidlertid ikke oppfylt. Storfehemoglobin i løsning har imidlertid samme P50-verdi som humant blod, og oksygenaffiniteten reguleres av klorider snarere enn av 2,3-DPG (M. Feola et al., "Development of a bovine stroma-free hemoglobin solution as a blood substitute", Surgery, Gynecology and Obstetrics, vol. 157, s. 399-408, 1983). Med utgangspunkt i denne fordelaktige egenskap, samt tilgjengeligheten i stor skala av storfe-RBC og den lave antigenisitet av rent hemoglobin blant pattedyr, er bruk av storfehemoglobin som utgangspunkt for et blodsubstitutt forbundet med fordeler.
Et annet problem som ble erkjent i 1970-årene, er den hurtige ekstravasering og korte intravaskulære persistens av hemoglobin. Dette tilskrives vanligvis Hb-tetramerers, a2p2, tilbøyelighet til å dissosiere til dimerer, 2a£, som lettere passerer gjennom blodkapillærene. Det synes nå som om den elektriske ladning på proteinets overflate også spiller en viktig rolle, hvor elektronegativitet og lavt isoelektrisk punkt fremmer intravaskulær persistens. Ekstravasering av hemoglobin har en rekke uønskede virkninger: (1) den utvidende virkning på plasmavolumet er av kort varighet; (2) passasje av Hb gjennom nyreglomerulus gir en osmotisk diuretisk virkning som reduserer, snarere enn å bibeholde, plasmavolumet; (3) reabsorpsjon av Hb i nyretubulus forårsaker skader på tubulus-cellene; og (4) passasje av Hb inn i interstitialvæskene forårsaker ødemer og celleskader. Fagfolk har hittil utelukkende konsentrert seg om å hindre Hb-dimerisering. For dette formål har tre typer Hb-modifisering blitt utviklet: (a) intermolekylær kryssbinding (polymerisering); (b) konjugering av Hb med andre molekyler; og (c) intramolekylær kryssbinding av a-eller (3-kjeder. Den mest benyttede fremgangsmåte er intermolekylær kryssbinding av Hb med glutaraldehyd (Bonsen et al., US patentskrifter nr. 4.001.200, 4.001.401 og 4.053.590; Morris et al., US patentskrift nr. 4.061.736; Bonhard et al., US patentskrift nr. 4.136.093). Det er imidlertid en rekke problemer forbundet med denne fremgangsmåte: (1) glutaraldehyd er i seg selv giftig, og den mulige giftighet av dets metabol-ske biprodukter er ukjent; (2) forbindelsen er svært reaktiv og er tilbøyelig til å danne en rekke kryssbindinger mellom forskjellige seter (a- og e-aminogrupper og sulfhydrylgrupper) i Hb-molekylet, noe som fører til dannelse av et uforutsigbart antall molekylslag; (3) polymeriseringsprosessen er vanskelig å kontrollere og synes å fortsette under lagring ved 4 °C, noe som fører til dannelse av stadig større polymerer med økt viskositet og oksygenaffinitet; (4) kryssbindingens uspesi-fikke natur tillater fortsatt forekomst av Hb-dimerer i løsningen. Som et alternativ er Hb blitt koblet til store molekyler som dekstran og hydroksyetylstivelse (US patentskrift nr. 4.064.118), polyetylen- eller polypropylenglykoler (US patentskrift nr. 4.412.989), inulin (US patentskrift nr. 4.377.512) og polyalkylenoksid (US patentskrift nr. 4.670.417). Disse konjugerte hemoglobiner har imidlertid økt oksygenaffinitet og tilbøyelighet til å få ufordelaktige egenskaper som skyldes de tilkoblede stoffer. Intramolekylær kryssbinding er blitt oppnådd ved bruk av "diaspirin"-estere (Tye, US patentskrift nr. 4.529.719; Walder, US patentskrift nr. 4.598.004) og "perjodatoksidert adenosintrifosfat" (o-ATP)
(F.J. Scannon, "Molecular modification of hemoglobin", Criti-cal Care Medicine, vol. 10, s. 261-265, 1982; A.G. Greenburg og P.W. Maffuid, "Modification of hemoglobin - Ring opened diols", Advances in Blood Substitute Research, Alan R. Liss,
New York, 1983, s. 9-17). Diaspirinhemoglobinene har imidlertid fortsatt kort intravaskulær persistens (en halveringstid på 3-4 timer), mens ATP-hemoglobinene har vist seg utilfreds-stillende grunnet høye nivåer av met-Hb og høy oksygenaffinitet kombinert med en kort halveringstid.
Betydelige fremskritt er blitt rapportert av forskere som har latt humant Hb reagere med pyridoksal-5'-fosfat og glutaraldehyd slik at polymerisert, pyridoksalert Hb ("poly-PLP-hemoglobin") dannes, dvs. et hemoglobin som angivelig skal ha både lav oksygenaffinitet og forlenget intravaskulær persistens (G.S: Moss et al., "Hemoglobin solution - From tetramer to polymer", Biomaterials, Artificial Cells and Artificial Organs, vol. 16 (1-3), s. 57-69, 1988; F. DeVenuto og A. Zegna, "Preparation and evaluation of pyridoxalated-polymerized human hemoglobin", Journal of Surgical Research, vol. 34, s. 205-212, 1983). Det er imidlertid blitt vist at pyri-doksalering forstyrrer polymeriseringen. Det forekommer følge-lig at pyridoksalert Hb med redusert 02-affinitet utskilles hurtig via nyren, mens polymerisert Hb med forlenget halveringstid har høy oksygenaffinitet. Problemet med stabilisering av Hb uten å forstyrre oksygentransportfunksjonen har følgelig ennå ikke blitt løst.
I løpet av de siste par år er det blitt stilt spørs-målstegn vedrørende en eventuelt iboende toksisitet av hemoglobin. Eksperimentelle undersøkelser har rapportert en vaso-konstriktorisk virkning. Siden Hb har tilbøyelighet til å autooksidere til met-Hb (dvs. oksidasjon av hem-jern fra to-verdig til treverdig tilstand, en prosess som danner toksiske frie oksygenradikaler), er det også blitt foreslått at Hb kan virke som en prooksidant ved infusjon i kretsløpet. Denne virkning ville føre til lipoperoksidering av cellemembraner og forårsake skader på cellestrukturer. Begge disse virkninger, vasokonstriksjon og dannelse av frie oksygenradikaler, ville gjøre de iskemisk-hypoksiske skader forårsaket av blødning alvorligere, snarere enn å lette dem. Det er blitt fremlagt resultater av eksperimentelle undersøkelser som viser at vasokonstriksjon og dannelse av radikaler begge kan kontrolleres i tre trinn: (1) fullstendig rensing av Hb; (2) fremstilling og stabilisering av Hb-molekylet med et lavt nivå av met-Hb-dannelse; og (3) tilsetning av stoffer som fjerner oksygenradikaler (M. Feola et al., "Biocompatibility of hemoglobin solutions. I. Reactions of vascular endothelial cells to pure and impure hemoglobins", Artificial Organs, vol. 13 (3),
s. 209-215, 1989).
Endelig medfører bruk av Hb-løsninger faren for blod-produktoverførbare sykdommer. Mens bakterier og parasitter lett kan fjernes ved filtrering under ultrafiltrering, representerer virus et alvorligere problem. To fremgangsmåter for virusinaktivering er kjent innen faget. Den ene er en fysisk fremgangsmåte som består i pasteurisering av hemoglobin i deoksyform ved 60 °C og pH 7,5 i 10 timer. Denne fremgangsmåten er blitt vist å inaktivere modellvirus (sindbis, polio, pseudorabies) så vel som det humane immunodefisiensvirus (HIV)
(T.N. Estep et al., "Virus inactivation in hemoglobin solutions by heat", Biomaterials, Artificial Cells and Artificial Organs, vol. 16 (1-3), s. 129-134, 1988). Den andre er en kjemisk fremgangsmåte som består i behandling med kloroform (S.M. Feinston et al., "Inactivation of hepatitis B virus and non-A non B hepatitis by chloroform", Infection and Immunity, vol. 41, s. 816-821, 1983). Begge fremgangsmåter gir imidlertid betydelig denaturering av hemoglobin med mindre spesielle forholdsregler tas i bruk.
Oppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangsmåte for fremstilling av et blodsubstitutt som består av hemoglobin kryssbundet intramolekylært med o-adenosin, o-ATP og glutation, som er kjennetegnet ved at den omfatter omsetning av et hemoglobin med o-ATP og o-adenosin, slik at et kryssbundet produkt dannes, omsetning av det kryssbundne produkt med en mengde redusert glutation og oppløsning av det resulterende produkt i en saltløsning.
Hemoglobinpreparatet kombinerer de fordelaktige egenskaper ved dets bestanddeler: (1) det er en effektiv oksygenbærer ved at storfe-Hb har en naturlig lav oksygenaffinitet (P50-verdi på 28 mm Hg) som ikke påvirkes av forskjellige kjemiske reaksjoner; (2) det utvider effektivt plasmavolumet grunnet det faktum at hemoglobin som er kryssbundet både intra- og intermolekylært, har forlenget intravaskulær persistens (halveringstid på 24 timer); (3) det har vasodilatoriske egenskaper grunnet det faktum at begge puriner reduserer nor-epinefrinindusert vasokonstriksjon; og (4) det innehar ingen prooksidant virkning grunnet nærværet av redusert glutation og mannitol.
De fordelaktige egenskaper ved storfehemoglobin er blitt vist (M. Feola et al., "Development of a bovine stroma-free hemoglobin solution as a blood substitute", Surgery, Gynecology and Obstetrics, vol. 157, s. 399-408, 1983). Ved siden av tilgjengeligheten i stor skala og det at en unngår sykdommer som spesielt overføres av humant blod (i særdeleshet AIDS), har storf e-Hb en P50-verdi som er mer enn dobbelt så stor som den for humant Hb (28 mot 13 mm Hg), og det trenger ikke modulering med 2,3-DPG. Ifølge foreliggende oppfinnelse kan oksygenaffiniteten til storfe-Hb ytterligere reduseres ved forhøyede konsentrasjoner av kloridioner. Når det gjelder mulige immunologiske problemer, er gjennomførbarheten av Hb-transfusjoner mellom pattedyrarter godt dokumentert. Rent storfehemoglobin er faktisk blitt tilført gjentatte ganger (opptil seks ganger) til kaniner og aper i volumer som tilsvarer 1/3-1/2 av de beregnede blodvolumer, uten klinisk på-visbare reaksjoner og uten dannelse av antistoffer som kan påvises ved Ouchterlonys test (M. Feola et al., "Immunologic biocompatibility of hemoglobin solutions", Trasfusione del sangue (italiensk), vol. 33, s. 121-128, 1988).
For å fremstille en Hb-løsning fri for bakterieendotoksiner er strategien benyttet i foreliggende fremgangsmåte for fremstilling å forhindre, snarere enn å korrigere for, kontaminering. Grunnet endotoksins affinitet for hemoglobin er rensing uhyre vanskelig, for ikke å si umulig, å oppnå når først kontaminering av noen betydning har forekommet. For forebygging kreves: (1) at utgangsmaterialet er minimalt kontaminert; (2) at fremstillingstrinnene utføres i et lukket system; (3) at alle overflater som kommer i berøring med Hb er sterile og pyrogenfrie; (4) at alle kjemikalier er rene; (5) at alle løsninger er sterile og pyrogenfrie; og (6) at kvali-tetskontroll utføres for hvert trinn. Den mest følsomme fremgangsmåte for påvisning av endotoksin er "quantitative chromogenic limulus test" (QCL-1000, Whittaker Bioproducts). Dersom utgangsmaterialet eller hemoglobin ved noen av fremstillingstrinnene vises å inneholde mer enn 2 EU/ml, kasseres det. Ved å bibeholde et lavt kontamineringsnivå gjennom fremgangsmåten, kan fullstendig rensing oppnås ved til slutt å la løsningen passere gjennom en affinitetskromatografikolonne, som f.eks. "Detoxi-Gel" (Pierce Chemical Company).
Det samme utgangspunkt med å unngå alvorlig kontaminering kombinert med avsluttende rensing benyttes for fjerning av stromale fosfolipider (spesielt aminofosfolipider). For å redusere stromal kontaminering benytter foreliggende fremgangsmåte en metode for dialyse og ultrafiltrering av røde blodceller som opprinnelig ble beskrevet av J.R. DeLoach et al. i Analytical Biochemistry, vol. 157, s. 191-198, 1986. Ifølge denne fremgangsmåten dialyseres RBC først mot en hypoton fosfatløsning inntil suspensjonen når en osmolaritet på 160 mOsm/l. På dette stadium inntar RBC en kuleform, og porene i cellemembranen er utstrukket. Cellene blir så ultrafiltrert gjennom Amicon-filtre med 0,1 pm porediameter under et kolonnetrykk på 10 psi. Hemoglobin "presses" således ut av cellene uten at cellemembranen ødelegges. Ifølge foreliggende oppfinnelse benyttes en enkelt prosess i et lukket system som er sterilt, pyrogenfritt og som kan kastes etter bruk, både til RBC-dialyse og ultrafiltrering. I tillegg består dialyse-væsken av sterilt, pyrogenfritt, deionisert vann justert til pH 8,2 med Tham-løsning, snarere enn en fosfatløsning, noe som reduserer oksidasjon av hemoglobin. Resultatet av denne prosess er en Hb-løsning som inneholder tilnærmet 3-5 mg/dl fosfolipider (målt ved "phospholipid test set", Boehringer-Mannheim Diagnostics, Indianapolis, Indiana), med bare spor av aminofosfolipidene PE og PS (bestemt ved tynnsjiktskromatografi). Disse gjenværende fosfolipider fjernes ved kloroformekstraksjon. Grunnet det lave nivå av fosfolipider kan dette trinn utføres ved bruk av lave kloroformkonsentrasjoner og korttidssentrifugeringer. På denne måte forhindres denaturering av hemoglobin.
Det samme prinsipp benyttes for rensing av hemoglobin fra ikke-hemproteiner og peptider. I dette tilfellet består første trinn i fjerning av alle plasmaproteiner under "rensingen" av røde blodceller. Dernest forhindrer fremgangsmåten for Hb-ekstraksjon fra RBC uten vesentlig ødeleggelse av røde blodcellemembraner kontaminering med stromale proteiner. Endelig oppnås rensing ved "selective thermal precipitation"
(se P.A. Belter, E.L. Cussler, W.S. Hu, red., Bioseparations, John Wiley & Sons, New York, 1988, s. 227-229). Det vitenskapelige grunnlag for denne fremgangsmåte hviler på det faktum at temperaturavhengig denaturering (og utfelling) av proteiner følger en førsteordens kjemisk kinetikk med tempera-turavhengighet ifølge Arrhenius:
hvor P er konsentrasjonen av oppløst protein. Hastighets-konstanten k er gitt ved:
hvor k0 er en karakteristisk konstant som representerer "akti-ver ingsenergien for denaturering" og T er temperaturen. Ener-gien for denaturering varierer fra protein til protein. Da E forekommer i eksponentiell form i ligningen, har den en stor virkning selv ved små temperaturforandringer. Denne energi påvirkes også av pH-endringer. Vi har også funnet at hemoglobin mettet med karbonmonoksid (HbCO) er motstandsdyktig mot temperaturindusert utfelling ved pH 7,6-7,8. Vi har funnet at pasteurisering ved 60 °C i 9 timer fulgt av pasteurisering ved 70 °C i 1 time ved pH 7,6-7,8 av en hemoglobinløsning i karboksyform ved en konsentrasjon på 10 g/dl gir utfelling av alle ikke-hemproteiner med bare liten denaturering av hemoglobin. Fravær av ikke-hemoglobinproteiner i løsningen fremstilt ved foreliggende fremgangsmåte er bekreftet ved bruk av isoelektrisk fokusering (IEF) og ved størrelseseksklusjons- og anionbytterhøytrykksvæskekromatografi (HPLC). Manglende denaturering av det gjenvunne hemoglobin vises ved fravær av "utspredning" av fokuserte bånd ved IEF og ved bibehold av oksygentransportfunksjon (oksygendissosiasjonskurver, P50,
Bohr-effekt).
Et biprodukt ved fremstillingsprosessen er inakti-vering av virus. Kloroformekstraksjon er faktisk blitt vist å inaktivere en rekke virus med lipidholdige kapper, som f.eks. hepatitt B-virus, ikke-A-ikke-B-hepatittvirus, kukoppevirus og koppevirus, både i plasma og serum (Feinston et al., henvist til ovenfor). Noen virus uten lipider (reovirus) kan også del-vis inaktiveres med kloroform. På den annen side er det vist at pasteurisering ved 60 "Ci 10 timer inaktiverer en rekke virus uten lipidkappe så vel som det humane immunodefisiensvirus (HIV) (T.N. Estep et al., henvist til ovenfor).
Grunnet de uønskede virkninger av polymerisering med glutaraldehyd "stabiliserer" foreliggende fremgangsmåte Hb-molekylet i tetramer form ved bruk av dialdehydderivatet av adenosin-5'-trifosfat (o-ATP). ATP-molekylet har tre basiske bestanddeler: purinbasen adenin, sukkeret D-ribose og en tri-fosf atkjede:
Oksidasjon av ATP med natriumperjodat åpner ribose-ringen ved 2',3'-cis-setet og overfører 2',3'-diolen til det tilsvarende dialdehyd (P.N. Lowe et al., "Preparation and chemical properties of periodate-oxidized adenosine triphosphate and some related compounds", Biochemical Society Trans-actions, vol. 7, s. 1131-1133, 1979):
Hver aldehydgruppe i o-ATP-molekylet kan reagere med e-aminogruppen i lysin og danne en Schiffsk base:
Da 2,3-DPG-lommen i hemoglobin (området i Hb-molekylet som binder 2,3-DPG) inneholder to lysiner, kan o-ATP benyttes til kryssbinding av disse grupper og således stabilisere molekylet i tetramer form. Nærværet av trifosfatkjeden øker denne reaksjons spesifisitet, da slik spesifisitet er blitt vist å forandre polyfosfater som f.eks. pyridoksal-5'-fosfat. Fordelen med ATP fremfor andre forbindelser gis av adeninresten. In vlvo er hydrolyse av ATP til ADP, AMP og endelig til adenosin blitt vist å gi fordelaktige farmako-logiske virkninger, særlig vasodilatasjon, både i det systemiske kretsløp og lungekretsløpet. Ytterligere fordelaktige virkninger er blitt vist når ATP gis sammen med magnesiumklorid (MgCl2) i forbindelse med blødningsindusert sjokk. Disse omfatter forbedret mikrosirkulasjon, forbedret cellemembranfunksjon og en "utløsende" virkning på gjenoppret-telsen av intracellulære adeninnukleotider (I.H. Chaudry og A.E. Baue, "Overview of hemmorrhagic shock", Pathophysiology of shock, anoxia and ischemia, R.A. Cowley og B.F. Trump, red., Williams og Wilkins, Baltimore, Maryland, 1982, s. 203-219).
Som bemerket ovenfor har tidligere forsøk på kryssbinding av Hb med o-ATP ikke vært vellykket, da den kjemiske reaksjon gir uaksepterbare nivåer av met-Hb (opptil 30 %), og at Hb modifisert med o-ATP fortsatt har kort intravaskulær persistens. I tillegg har ATP en uønsket tilbøyelighet til å chelatbinde divalente kationer i karsystemet.
Vi har funnet at den oksiderende virkning av o-ATP skyldes spor av jodat (I04 og I03) som foreligger i forbindelsen. Fullstendig rensing av o-ATP (se eksempel I) korrigerer faktisk dette problem. Vi har også funnet at met-Hb-dannelse kan minimaliseres ved å la o-ATP reagere med karboksy-Hb (Hb mettet med karbonmonoksid), snarere enn med deoksy-Hb som tidligere. Vi har funnet at reaksjonen mellom o-ATP og karboksy-Hb vil foregå dersom løsningens pH reduseres til tilnærmet 7,20. Når det gjelder den kationchelaterende virkning, har vi bekreftet rapporten fra Chaudry og Baue (se ovenfor) om at tilsetning av magnesiumklorid (MgCl2) i ekvimolar mengde med ATP fjerner dette problem. Problemet med kort intravaskulær persistens er imidlertid fortsatt til stede. Vi har funnet at Hb kryssbundet intramolekylært i tetramer form fortsatt kan filtreres gjennom nyreglomerulus og forårsake skader i nyre-tubuli. Det var følgelig nødvendig å kryssbinde hemoglobin inter- så vel som intramolekylært for å oppnå en tilstrekkelig intravaskulær levetid.
Foreliggende oppfinnelse benytter et annet purinderi-vat, dialdehydderivatet av adenosin, eller perjodatoksidert adenosin (o-adenosin) som det andre kryssbindende stoff. Da Hb-molekylet bærer 44 lysinaminogrupper på overflaten, kan o-adenosin benyttes som bro mellom to eller flere av disse grupper og binde to eller flere Hb-tetramerer sammen. For-delene med adenosin fremfor andre forbindelser er flere. For det første har adenosin grunnet nærværet av adenin en vasodilatorisk virkning som tilsvarer den til ATP (C. Su, "Extra-cellular functions of nucleotides in heart and blood vessels", Annual Review of Physiology, vol. 47, s. 665-676, 1985). I tillegg hemmer adenosin blodplateaggregering og gir forbedret glomerulær filtrering i nyren, begge disse virkninger er fordelaktige etter blødning og reperfusjon (R.M. Berne: Regula-tory Functions of Adenosine, Martin Nijhoff Publisher, Boston, Massachusetts, 1983). Reaksjonen mellom hemoglobin og o-adenosin har hittil vært ukjent innen faget. Det er også viktig at reaksjonen utføres med hemoglobin i karboksyform for å redusere dannelsen av met-Hb. Endelig forløper reaksjonen svært langsomt ved 4 °C, slik at den kan stoppes når som helst etter dannelsen av det ønskede molekylaggregat. Denne egenskap tillater fremstilling av Hb-polymerer med forskjellige molekyl-størrelser på en planlagt, reproduserbar måte (noe som ikke kan gjøres ved .bruk av andre kryssbindende stoffer som glutaraldehyd). Kryssbindingen av hemoglobin med o-adenosin stoppes ved tilsetning av redusert glutation (GSH), som i likhet med lysin inneholder en e-aminogruppe. Ved å delta i denne reaksjonen blir GSH en del av Hb-preparatet.
Valget av GSH er basert på viten om at denne forbindelse forekommer i store mengder i de røde blodceller, hvor
dens viktigste oppgave er å fungere som en "oksidasjonsmiddel-felle" som beskytter hemoglobin mot oksiderende påvirkning (A. Larsson: Functions of Glutathione: Biochemical, Physiological, Toxicological and Clinical Aspects, Raven Press, New York, 1983). Vi har bekreftet at GSH beskytter hemoglobin i løsning så vel som inne i erytrocyttene. Det er også blitt vist at kryssbinding med o-adenosin fulgt av reaksjonen med GSH gir et økt antall negative ladninger på Hb-molekylets overflate og reduserer det isoelektriske punkt til Hb fra 6,8 til 6,1-6,2. Dette bidrar til stabilisering av hemoglobin i den forstand at det forlenger intravaskulær persistens og forhindrer filtrering gjennom nyren.
o-ATP og o-adenosin kan erholdes fra kommersielle kilder (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), eller de kan fremstilles ifølge de fremgangsmåter som beskrives nedenfor som eksempel I og eksempel II. Redusert glutation erholdes fra en kommersiell kilde.
Etter disse reaksjoner og tilbakeføringen av karboksy-Hb til oksy-Hb løses den nye forbindelse (Hb-PP-GSH) i en elektrolyttbalansert saltløsning anriket med magnesiumklorid (MgCl2) og mannitol. MgCl2 tilsettes i ekvimolar mengde med ATP. Dette har flere fordelaktige virkninger: (1) det kontrol-lerer den divalente kationchelaterende virkning av ATP; (2) det supplerer ATP i dets gunstige virkninger på mikrosirkula-sjonen; og (3) det gir et overskudd av kloridioner som modu-lerer affiniteten av Hb for oksygen nedover (hjelper til å bibeholde en høy P50-verdi). Mannitol tilsettes i små mengder basert på kunnskap om at det virker som en fjerner av OH<*->radikaler (de mest giftige oksygenavledede frie radikaler), og muligens av andre radikaler også (B.A. Freeman og J.D. Crapo, "Free radicals and tissue injury", Laboratory Investigation, vol. 47, s. 412-426, 1982).
Det er foreliggende oppfinnelses formål å tilveie-bringe en kjemisk forbindelse som er anvendbar som et blodsubstitutt, dvs. i stand til (a) å gjenopprette og bibeholde plasmavolumet, (b) å forsyne de vitale organer med oksygen, og (c) lette vasokonstriksjonen etter blødning.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 viser en spektrumanalyse av rent storfehemoglobin erholdt ved HPLC med en størrelseseksklusjonskolonne. Kromatogrammet viser en enkelt topp lokalisert ved 9,4 minutter, som viser hemoglobin i tetramer form (64.000 dalton). Figur 2 viser en spektrumanalyse av rent storfehemoglobin erholdt ved HPLC med en DEAE-kolonne. Kromatogrammet viser flere topper lokalisert mellom 20 og 36 minutter, som tilsvarer forskjellige isoelektriske punkter av forskjellige Hb-bestanddeler. Figurene 3A-B viser spektrumindeksen for storfehemoglobin før (3A) og etter (3B) rensing ved pasteurisering (HPLC med DEAE-kolonne, spektrumbølgelengde 230-599 nm). I figur 3A kan ikke-Hb-proteiner ses ved retensjonstidene 17 og 51 minutter. I figur 3B kan ikke-Hb-proteiner ikke lenger ses. Figur 4 viser en spektrumanalyse ved HPLC-størrelses-eksklusjon av storfe-Hb kryssbundet intramolekylært med o-ATP og intermolekylært med o-adenosin, og kombinert med redusert glutation. Kromatogrammet viser et Hb-molekylaggregat som består av seks topper. Figur 5 viser en spektrumanalyse ved HPLC-DEAE-kolonne av storfe-Hb modifisert som i figur 4. Kromatogrammet viser en enkelt topp med retensjonstid 51 minutter. Det isoelektriske punkt av Hb er endret (sammenlignet med ikke-modifisert Hb) grunnet økningen i elektronegative ladninger på overflaten. Figur 6 viser en undersøkelse ved isoelektrisk fokusering (IEF - Pharmacia). Figur 7 viser absorbansen ved 258 nm av på hverandre følgende fraksjoner av o-ATP- og natriumperjodatreaksjons-blandingen eluert fra en "Sephadex"-kolonne med vann. Figur 8 viser absorbansene ved 258 og 232 nm av på hverandre følgende fraksjoner av o-adenosin- og natriumper-jodatreaksjonsblandingen eluert fra en anionbytterkolonne med elueringsmiddel A.
Beskrivelse av den foretrukne utførelse
Eksempel I
Den foretrukne fremgangsmåte for fremstilling av det komplekse produkt omfatter fem trinn: (A) rensing av røde blodceller; (B) ekstraksjon av hemoglobin; (C) rensing av hemoglobin; (D) modifisering av hemoglobin (reaksjon med o-ATP, o-adenosin og glutation); og (E) fremstilling av sluttproduktet (Hb-PP-GSH)n.
A. Rensing av røde blodceller ( RBC)
Det foretrukne utgangsmateriale er storfeblod, av grunner som er diskutert ovenfor. Fremstillingsfremgangsmåten kan imidlertid benyttes med utgangspunkt i andre typer patte-dyrblod, heriblant menneskeblod. Storfeblod kan erholdes fra et antall friske givere eller fra enkeltdyr som skal slaktes. I første tilfelle fastholdes en voksen ku, nakken barberes, og huden behandles med antiseptisk såpe. Blod tappes ved punksjon av den ytre halsvene under aseptiske betingelser. Tilnærmet 1.500 ml blod kan erholdes fra ett dyr, oppsamlet i en 2-liters lufttom, steril, pyrogenfri flaske som inneholder 200 ml ACD-antikoagulant (Virbac, Inc., Lenexa, Kansas). I det andre tilfellet "behandles" én side av nakken raskt etter at dyret er bedøvd forut for slaktingen, og en trokar innføres perkutant i halspulsåren. Tilnærmet 10 1 blod kan fjernes fra hver voksen ku. Blod fra forskjellige dyr blandes ikke. Flaskene holdes på is under transport til laboratoriet.
Det er viktig, særlig når utgangspunktet er storfeblod, at RCB (erytrocytter) skilles fullstendig fra hvite blodceller (leukocytter), blodplater og plasma. Dette trinn reduserer mengden ikke-hemproteiner og andre forbindelser fra hvilke hemoglobin før eller senere må renses. Fjerning av alle leukocytter fjerner i tillegg de virus som er forbundet med disse celler, særlig med lymfocytter (cytomegalovirus, humant immunodefisiensvirus og andre).
RBC renses ved en "spin-cool-filter"-metode. "Spin"-trinnet består av en rekke sentrifugeringer utført i et lukket system ved bruk av en blodbankcelleseparator, som f.eks. DIDECO-systemet (Electromedics Inc., Englewood, Colorado) på
følgende måte:
1. sentrifugering ved 1.100 rpm ved 15 °C i
20 minutter for å fjerne blodplater og plasma;
2. sentrifugering ved 4.500 rpm ved 15 °C i
10 minutter for mer fullstendig fjerning av plasma; 3. vask (x 4) med isoton saltløsning (RBC/saltvann 1:4) ved sentrifugering ved 4.100 rpm ved 4 °C i 10 minutter; 4. endelig vask med isoton Tham-løsning, pH 8,1-8,2 (Tham USP, Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois). Dette tillater suspensjon av vaskede RBC i en elektrolytt f ri løsning med høy pH, som beskytter hemoglobinet fra oksidasjon.
For "cool"-delen av prosessen lagres RBC i "transfer packs" (sterile, pyrogenfrie plastikk-beholdere fremstilt av Fenwal Laboratories, Deerfield, Illinois) ved 4 °C over natten, eller i 18 timer. Ved lav temperatur har de hvite blodceller tilbøyelighet til å aggregere til små klumper. For "filter"-trinnet passeres cellene gjennom et 20 um cellulosefilter, f.eks. et "high capacity transfusion filter" fremstilt av Fenwal, som fjerner leukocyttaggregatene.
For å bekrefte fravær av leukocytter og blodplater utføres celletellinger ved hjelp av en Coulter-celleteller, og fravær av proteiner i suspensjonen bekreftes ved vanlige kjemiske metoder. Nærvær av bakterieendotoksin bestemmes ved bruk av "quantitative chromogenic limulus test" (QCL-1000, Whittaker Bioproducts, Walkersville, Maryland).
B. Ekstraksjon av hemoglobin
Ekstraksjon av hemoglobin fra RBC utføres i to trinn. Først dialyseres 1 1 RBC suspendert i isoton Tham-løsning, pH 8,1-8,2, ved en konsentrasjon på 20 % (hematokrit 0,20) mot 10 1 hypoton (230 mOsm/l) Tham-løsning ved hjelp av en kunstig nyre med 0,20 um porøsitet, som f.eks. "Krosflo II Filtration Module with 10 Ft<2> Surface Area" (Microgon Inc., Laguna Hills, California). Dialysen utføres inntil dialysatet blir rødfarget
(et skjær av hemoglobin). På dette stadium er RBC oppsvulmet til kuler, og de utstrukne cellemembraner blir permeable overfor Hb. I det andre trinn settes et trykk på 10 psi på den kunstige nyre, slik at Hb blir klemt ut av cellene uten at cellemembraner ødelegges. Membran-"ghosts" kasseres etter én passering gjennom filteret. Etter hvert som hemoglobin går inn i reservoaret for den hypotone løsning, bibeholdes volumet i RBC-reservoaret ved tilsetning av Tham-løsning, 230 mOsm/1. Det ekstraherte hemoglobin filtreres gjennom et 0,20 um filter, f.eks. "Posidyne I.V. Filter" (PALL Biomedical Inc., Fajardo, Puerto Rico) for å fjerne gjenværende partikkelrester eller mikrobielle kontaminanter, og lagres i "transfer packs" ved 4 °C.
Resultatet av denne prosess er en Hb-løsning som inneholder 3-5 mg/dl fosfolipider (målt ved bruk av "phospholipid test set", Boehringer-Mannheim Diagnostics, Indianapolis, Indiana), med bare spor av aminofosfolipidene PE og PS (bestemt ved tynnsjiktskromatografi).
C. Rensing av hemoglobin
Dette utføres i fire trinn:
1. Pasteurisering av hemoglobin i karboksvform
( HbCO)
Dette utføres i en forsterilisert, pyrogenfri, bio-logisk reaktor som f.eks. "Microlift-15 liter sterilizable-in-place bioreactor with NBS Model ML-4100 control system" (New Brunswick Scientific Co., Edison, New Jersey). Dette er en lukket beholder med flere seter for innføring av gasser og væsker, kraner for uttak av prøver, en agitator for røring og temperaturkontroller. Bioreaktoren er installert under et ut-blåsningsavtrekk. Hemoglobinet mettes med karbonmonoksid (99,99 % renhet, Criogenic Rare Cas Co., Hanahan, South Carolina) ved gjentatt gjennomstrømning med steril gass ved 760 mm Hg, 4 °C, under langsom røring. Fullstendig metning bekreftes ved bruk av et kooksimeter (modell 282, Instrumentation Laboratories, Lexington, Massachusetts). Prosessen tar tilnærmet 15 minutter. Løsningen oppbevares under CO ved 760 mm Hg. Pasteurisering utføres så ved langsom heving av temperaturen i bioreaktoren fra 4 til 60 °C og henstand ved dette nivå i 9 timer, hvoretter temperaturen heves til 70 °C i 1 time. Etter disse tidsrom reduseres temperaturen langsomt tilbake til 4 °C.
2. Sentrifugering med kloroform
I dette trinn filtreres Hb-løsningen gjennom et
0,20 um filter ned i 250 ml sterile, pyrogenfrie sentrifuge-flasker forseglet med egnede hetter ("polyallomer"-flasker motstandsdyktige overfor kloroform, proteiner og alkohol, erholdt fra Sorvall Division, Du Pont Co., Wilmington, Delaware).
En serie på tre sentri fugas joner utføres ved bruk av en Sorvall-sentrifuge (modell OTD75B med rotor TFA 20.250), på følgende måte: a. sentrifugering av hemoglobin blandet med kloroform i forholdet 15:1 (for hver flaske: 232 ml Hb, 18 ml kloroform) ved 760 x g ved 4 °C i
30 minutter. Supernatanten overføres i en ny
serie med flasker ved hjelp av sterile, pyrogenfrie slanger og en peristaltisk pumpe i en sterilbenk med laminær luftstrømning,
b. sentrifugering av Hb blandet med kloroform i forholdet 16:1 ved 1.600 x g, 4 °C, i 15 minutter, og ved 3.800 x g i 15 minutter. Supernatanten overføres til en tredje serie med flasker,
c. sentrifugering uten kloroform ved 61.400 x g i
60 minutter.
Etter den tredje sentrifugering overføres Hb-løs-ningen til 1.000 ml sterile, pyrogenfrie, lufttomme flasker (Abbot Laboratories) med magnetrørepinner, i hvilke gjenværende rester av kloroform fjernes fra løsningen ved gjennom-strømning av steril CO-gass under langsom røring ved 4 °C i 2 timer.
Kloroformen som benyttes i dette trinn, er av HPLC-kvalitet med UV-"cut-off" 244 nm (Fisher Scientific Co., Fair Lawn, New Jersey). Flaskene kan brukes flere ganger etter behandling med (a) "E-T0XA-Clean"-såpe (Sigma Chemicals), (b) 100 % etanol og (c) sterilisering ved 120 °C i 80 minutter. Denne serien med sentrifugeringer fjerner ikke bare alle fosfolipider, men skiller også det rensede hemoglobin fra ikke-hemproteinene som ble denaturert og utfelt i det foregående pasteuriseringstrinn.
3. Filtrering gjennom endotoksinaffinitetskromato-graf ikolonne
Hb-løsningen passeres gjennom en affinitetskromatografikolonne, som f.eks. "Detoxi-Gel"-kolonnen (Pitirce Chemical Co., Rockford, Illinois) med "transfer packs" ved innløp og utløp og en peristaltisk pumpe, slik at et lukket system blir dannet. Fremgangsmåten utføres i en klasse 100 sterilbenk med laminær luftstrøm.
I dette trinn kan konsentrasjonen av endotoksin reduseres fra 2,0-2,5 EU/ml til < 0,10 EU/ml.
4. Dialyse
Hb-løsningen dialyseres i forholdet 1:10 mot sterilt, pyrogenfritt, deionisert vann justert til pH 7,20 ved tilsetning av Tham-løsning. Dialysen utføres ved bruk av en kunstig nyre med 6.000 dalton porøsitet, som f.eks. "90 SCE - Artificial Kidney" (C-DAK Co., Miami Lakes, Florida). Dette trinn vil (a) fjerne små molekyler, (b) konsentrere hemoglobin til 10 g/dl og (c) senke pH i Hb-løsningen fra tilnærmet 8,2 til tilnærmet 7,2.
Ved dette trinn i prosessen er "rent" hemoglobin blitt fremstilt, dvs. hemoglobin fullstendig fritt for (a) bakterieendotoksiner, (b) stromale lipider og fosfolipider og (c) ikke-hemproteiner. Gjentatte filtreringer gjennom 0,20 um filtre på forskjellige trinn i prosessen forventes videre å ha fjernet alle mikrobielle kontaminanter, mens pasteurisering og kloroformbehandling forventes å ha inaktivert både ikke-lipid-og lipidomkapslede virus. Videre tillater bruken av hemoglobin i karboksyform rensing av dette med en lav grad av oksidasjon (1-2,5 % met-hemoglobindannelse).
D. Modifisering av hemoglobin
Reaksjonen av hemoglobin med o-ATP, o-adenosin og redusert glutation utføres i den biologiske reaktor som følger. Hemoglobin i karboksyform, 10 g/dl i vann justert med Tham til pH 7,20, gjeninnføres i bioreaktoren og holdes ved
4 °C med langsom røring under en atmosfære med karbonmonoksid.
o-ATP fremstilt ifølge eksempel III og lagret i pulverform oppløses i sterilt, pyrogenfritt vann justert til pH 7,20, og tilsettes umiddelbart til Hb-løsningen i et molart forhold Hb/o-ATP 1:3. Reaksjonen får forløpe ved 4 °C og 150 rpm røring under CO i 24 timer. Prøver av løsningen tas ut hver 6. time og undersøkes ved HPLC med en størrelseseksklu-sjonskolonne for å kontrollere økningen i molekylvekt av hemoglobin, og med en anionbytterkolonne for å kontrollere endringen i elektrisk ladning. Et Waters HPLC-system som omfatter en Waters 600 E-systemkontroller, en Waters 712-injek-tor, en Waters 990-fotodiodedetektor og en NEC Power Mate 2-datamaskin benyttes. Størrelseseksklusjonskolonnen (Protein Pak 300 SW) og anionbytterkolonnen (DEAE-5 PW) erholdes også fra Waters (Waters Chromatography Division, Millipore Co., Milford, Massachusetts). Den ideelle kryssbindingstilstand opptrer ved tilnærmet 24 timer, hvor undersøkelse ved anion-bytter-HPLC viser at 90-95 % av det tilsatte o-ATP er blitt forbrukt i den kjemiske reaksjon. Resultatet er dannelse av et molekylaggregat som består av:
Med andre ord gir o-ATP under disse reaksjonsbeting-elser hovedsakelig intramolekylær kryssbinding, men også noe intermolekylær kryssbinding. Dette forstyrrer imidlertid ikke den følgende reaksjon.
Etter 24 timer oppløses o-adenosin, fremstilt ifølge eksempel IV og lagret i pulverform, i sterilt vann, pH 7,20, ved tilsetning av Tham, med noen få dråper etanol. Denne forbindelse tilsettes til Hb-løsningen i et molart forhold mellom Hb og o-adenosin på 1:5, og reaksjonen får forløpe under de samme betingelser i 24 timer. Ved dette tidspunkt tilsettes en ny dose o-adenosin i det samme molare forhold på 1:5 og får reagere i ytterligere 24 timer. Prøver undersøkes med HPLC, og den kjemiske reaksjon stoppes når nivået av Hb-tetramerer er blitt redusert fra 70 til 30 %. Dersom reaksjonen forløper langt ut over dette punkt, vil overdrevent store polymerer dannes. GSH oppløst i vann + Tham, pH 7,20, tilsettes så til Hb-løsningen i et molart forhold Hb/GSH på 1:20 og får reagere i 16 timer.
På dette punkt omfatter hemoglobinmolekylaggregatet:
Dette aggregat gir en enkelt topp med HPLC-DEAE ved 50-51 minutter.
Etter disse kjemiske reaksjoner tilbakeføres hemoglobin fra karboksy- til oksyform ved gjentatt gjennomblåsing av sterilt oksygen ved 35 psi under forsiktig røring ved 4 °C, samt eksponering for 20 sekunders pulser med sterkt lys fra en "quartzline lamp, DWY, 120 V, 650 W (General Electric Co., Cleveland, Ohio) koblet til en "type 4051 molequartz" (Mole-Richardson Co., Hollywood, California). Reoksygeneringen av hemoglobin kan bekreftes ved bruk av et IL-kooksimeter.
E. Fremstilling av sluttproduktet
I avslutningstrinnet dialyseres Hb-løsningen først mot 50 mM Tham-løsning, pH 8,1, deretter mot en elektrolyttbalansert saltløsning (Normosol R, pH 7,4, med 140 mekv/1 natrium, 5 mekv/1 kalium, 3 mekv/1 magnesium, 98 mekv/1 klorid, 27 mekv/1 acetat og 23 mekv/1 glukonat; Abbot Laboratories ). Molekylstørrelsesprofilen av det endelige Hb-aggregat er:
Den hyppigst forekommende molekyltype består således av fire Hb-tetramerer og har en molekylvekt på 260.000 dalton. Aggregatet gir en enkelt topp ved HPLC-DEAE ved 50-51 minutter, som viser en endring i isoelektrisk punkt fra 6,8 til 6,1.
Dialysatet som inneholder passert hemoglobin, kan konsentreres til 10 g/dl Hb ved dialyse med en 6.000 dalton kunstig nyre (90 SCE kunstig nyre, C-DAK Co.) og benyttes på nytt for intramolekylær kryssbinding med o-adenosin.
I sin endelige form oppløses det modifiserte hemoglobin i Normosol R, pH 7,4, ved en konsentrasjon på 10 g/dl. Magnesiumklorid (MgCl2) erholdt fra Matheson Coleman & Bell, Norwood, Ohio, tilsettes løsningen i en mengde som er ekvimolar med ATP. Mannitol erholdt fra GIBCO-Dexter Co., Chagrin Falls, Ohio, tilsettes i en mengde på 2 mg/ml løsning.
Eksempel II
De følgende fremgangsmåter ble benyttet for karak-terisering av det nye produkt. Konsentrasjoner av hemoglobin, met-Hb og karboksy-Hb ble målt i et kooksimeter (modell 282, Instrumentation Laboratories, Lexington, Massachusetts). Elek-trolyttkonsentrasjonen og osmolariteten av løsningen ble bestemt ved hjelp av et ASTRA-apparat (Beckman Co., Palo Al to, California). Osmotisk trykk ble anslått ved bruk av et Weil-osmometer (Instrumentation Laboratories). Viskositeten ble bestemt ved 37 "C og en forskyvningshastighet på 100/sekund ved bruk av et Brookfield viskometer (Brookfield Engineering Laboratories, Stoughton, Massachusetts). Renheten av Hb for andre proteiner, fosfolipider og bakterieendotoksiner ble anslått som beskrevet ovenfor. Den oksygenbindende kapasitet ble beregnet fra målingen av Hb-konsentrasjon og oksygenvolum-innholdet erholdt i kooksimeteret. Hb-oksygendissosiasjonskurver ble erholdt med et Hem-O-Scan-apparat (SLM Aminco, American Instruments, Silver Spring, Maryland). P50-verdier ble avlest på disse kurver under standardbetingelser for temperatur (37 °C), pH (7,40) og pC02 (40 torr). Analyse av fosfat-innhold ble utført ved fremgangsmåten til Fiske og Subbarow (Journal of Biological Chemistry, vol. 66, s. 375-380, 1925). Bestemmelse av GSH-innhold ble utført ifølge fremgangsmåten til Reed et al. (Analytical Biochemistry, vol. 106, s. 55-62, 1980). Adenosin ble bestemt ved bruk av HPLC og absorbans-måling ved 258 nm og beregning av tilført mengde og mengde inkorporert i hemoglobin. ATP ble beregnet ut fra fosfat-bestemmelsen.
Produktet som her er karakterisert, er identifisert som (Hb-PP-GSH)n, hvor Hb = renset storfehemoglobin, PP = de to purinderivater o-ATP og o-adenosin, og GSH = redusert glutation. Hovedmolekylet er Hb i tetramer form, som vist i figurene 1 og 2. Dets renhet for andre proteiner er vist i figur 3. For hvert millimol (mM) av hemoglobin inneholder forbindelsen 1,05 mM ATP, 10 mM adenosin og 7 mM GSH. Denne kjemiske sammensetning samt HPLC-analyse utført ved forskjellige trinn i fremstillingen viser at o-ATP hovedsakelig deltar i den intramolekylære kryssbinding av Hb, mens o-adenosin gir den intermolekylære kryssbinding. I tillegg forankrer o-adenosin GSH-molekylet til Hb. Forbindelsen er illustrert i figurene 4 og 5. Spektrumanalyse ved HPLC-størrelseseksklusjon (figur 4) viser at forbindelsen består av seks molekyltyper:
Blant disse synes (Hb)4, dvs. aggregatet av fire tetramerer, å være den dominerende type. Analyse ved HPLC-DEAE-kolonne (figur 5) viser en enkelt topp ved 50-51 minutter som tyder på at forbindelsen har et uniformt, redusert (relativt til ikke-modifisert Hb) isoelektrisk punkt. Analyse ved isoelektrisk fokusering (IEF) (figur 6) viser disse modifikasjoner av Hb fra en annen synsvinkel.
Etter dialyse mot den elektrolyttbalanserte salt-løsning, justert til pH 7,4 ved tilsetning av Tham-løsning, og etter tilsetning av MgCl2 og mannitol, har den endelige hemo-globinløsning sammensetningen som er vist i den påfølgende tabell.
Ved konsentrasjonen på 10 g/dl transporterer denne
Hb-løsning etter eksponering for atmosfærisk luft 13 %
(vol/vol) oksygen, noe som tyder på en oksygenbindende evne nær 100 % (1,3 volumer oksygen pr. 1 g Hb). P50-verdien for løsningen er høy (tilnærmet 28 mm Hg) trass i polymeriseringen, grunnet den høye kloridkonsentrasjon. Osmolariteten er høyere enn for plasma, men viskositeten er lavere enn for helblod. Det kolloidosmotiske trykk er lavere enn for plasma trass i den høye hemoglobinkonsentrasjon (sammenlignet med albumin) grunnet det faktum at hemoglobin er polymerisert, slik at antallet "Hb-partikler11 er redusert.
Eksempel III
Fremstilling av o- ATP 1 stor skala
Utgangsfremgangsmåten for fremstilling av o-ATP er kjent innen faget (se S.B. Easterbrook-Smith et al., "Pyruvate Carboxylase: Affinity labelling of the magnesium adenosine triphosphate binding site", European Journal of Biochemistry, vol. 62, s. 125-130, 1976).
Endringer ble gjort for å fremstille større mengder materiale og sikre en tilfredsstillende kjemisk reaksjon med hemoglobin.
Adenosin-5'-trifosfat-dinatriumsalt-hydrat (ATP), formelvekt 551,15, og natriumperjodat (NaI04) av 99 % renhet, formelvekt 213,89, ble erholdt fra Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin. Ti 120 ml "Sephadex" G-10-kolonner ble erholdt fra Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey. For hver kolonne ble 550 mg ATP oppløst i 15 ml sterilt, pyrogenfritt vann (vann for injeksjon, Abbott Laboratories), justert med Tham-løsning til pH 7,0, ved 0 °C. Natriumperjodat ble tilsatt i et molart forhold (ATP/NaI04) på 1:1,1, og løsningen fikk stå ved 4 °C i mørke i 1 time. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av etylenglykol i et molart forhold (ATP/etylenglykol) på 2:1 i 15 minutter. Reaksjonsblandingen ble påsatt "Sephadex" G-10-kolonnen som på forhånd var ekvilibrert med "vann for injeksjon" ved 4 °C. Kolonnen ble eluert med 200 ml vann. Den fremste halvpart av nukleotidtoppen, fraksjonene 20-30, som vist i figur 7, ble slått sammen og umiddelbart frysetørket med en Labconco "Freeze-Dry System with Stoppering Tray Dryer, (Labconco Co., Kansas City, Missouri) med et vakuum på < 10 pm Hg ved -40 °C. Pulveret ble lagret i mørke flasker ved -90 °C inntil det skulle benyttes.
Konsentrasjonen av o-ATP bestemmes ved måling av absorbansen ved 258 nm, mens nærvær av perjodat anslås ved måling av absorbansen ved 232 nm. Kolonnene vaskes med vann for injeksjon i 30 timer ved 4 °C, inntil eluatet har en absorbans på mindre enn 0,043 ved 232 nm, dvs. inntil alt perjodat er utvasket, før de brukes på nytt.
To tiltak er viktige for foreliggende oppfinnelses formål: (1) at bare fraksjoner som inneholder o-ATP uten spor av perjodat oppsamles og (2) at disse fraksjoner umiddelbart frysetørkes og fryses ved -90 °C. Disse tiltak vil forhindre oksidasjon av hemoglobin under den kjemiske reaksjon.
Eksempel IV
Fremstilling av o- adenosin i stor skala
Utgangsfremgangsmåten for fremstilling av o-adenosin er kjent innen faget (se J.X. Khym og W.E. Cohn, "Characteri-zations and some chemical reactions of periodate-oxidized nucleotides", Journal of American Chemical Society, vol. 82, s. 6380-6386, 1960). Endringer ble gjort for fremstilling av større stoffmengder og for å sikre en tilfredsstillende kjemisk reaksjon med hemoglobin.
Adenosin av 98 % renhet ble erholdt fra Sigma Chemical Co., mens natriumperjodat ble erholdt fra Aldrich Chemical Co. 6 g adenosin ble oppløst i 200 ml 150 mM NaI04 i vann ved værelsestemperatur i 30 minutter. Løsningen ble passert gjennom en 300 ml kolonne med anionbytterharpiks AG l-X-8, 100-200 mesh på acetatform (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California), som på forhånd var ekvilibrert med 20 mM eddiksyre (elueringsmiddel A) erholdt fra Fisher Scientific Co. Kolonnen ble eluert med 2 1 elueringsmiddel A ved en strømningshastig-het på 15 ml/minutt og en temperatur på 4 °C, og fraksjoner på 150 ml ble oppsamlet. Bare fraksjonene 2-15 ble tatt vare på
(som vist i figur 8), disse ble umiddelbart frysetørket og nedfrosset, som for o-ATP.
Før ny bruk ble 6 1 100 mM ammoniumklorid (elueringsmiddel B) påsatt kolonnen for å fjerne alt perjodat. Perjodat-konsentrasjonen i fraksjonene ble bestemt ved å måle absorbansen ved 232 nm. Etter dette ble kolonnen vasket med 6 1 "vann for injeksjon" og så ekvilibrert på ny med 20 mM eddiksyre.
To tiltak er viktige for foreliggende oppfinnelses formål: (1) at bare fraksjoner som inneholder o-adenosin uten spor av perjodat oppsamles og (2) at disse fraksjoner umiddelbart frysetørkes og fryses ved -90 °C. Disse tiltak vil forhindre oksidasjon av hemoglobin under den kjemiske reaksjon.
Beskrivelse av anvendelser av oppfinnelsen
Eksempel V
Toksisitet i kaniner
Toksisiteten av den nye forbindelse (Hb-PP-GSH) ble analysert i kaniner ifølge en fremgangsmåte som tidligere er beskrevet i den vitenskapelige litteratur (M. Feola et al., "Toxicity of polymerized hemoglobin solutions", Surgery, Gynecology and Obstetrics, vol. 166, s. 211-222, 1988).
Tolv New Zealand-kaniner med kroppsvekt 4,0 kg fikk under lokalbedøvelse med 1 % lidokain innsatt sterile kanyler i sentralarterien i et øre og den marginale vene i det andre øret. Et sterilt kateter ble innsatt i urinblæren. En termistorprobe og ECG-nålelektroder ble innsatt i lemmene under lokalanestesi. Elektrokardiogram (ECG), blodtrykk, kroppstemperatur og urinutskillelse ble kontinuerlig målt i 3 timer, hvoretter kateteret og elektroder ble fjernet og dyrene satt tilbake i burene. Etter 30 minutter med "steady state" (grunn-linje) ble 80 ml blod, tilsvarende 1/3 av blodvolumet (beregnet blodvolum hos kaniner = 6 % av kroppsvekten i kg) fjernet via arterien over et tidsrom på 5 minutter. Et tilsvarende volum Hb-PP-GSH ble infusert via venen over et tidsrom på 30 minutter. Dette tilsvarte tilnærmet 2 g hemoglobin. Fjerningen av blod forårsaket et fall i blodtrykk og en økt hjertefrekvens. Disse endringer ble hurtig korrigert. Videre returnerte pulstrykket (forskjellen mellom systolisk og dia-stolisk trykk), som ble lavt etter blødningen, først til normalverdien, hvoretter det ble større enn ved grunnlinjen, noe som viser en vasodilatorisk virkning av Hb-løsningen. Denne effekt varte gjennom hele den akutte observasjonsperiode på 3 timer. ECG viste ingen hjertearytmi. Urinutskillelsen forble normal, uten ekstravasering av hemoglobin i urinen.
Blodprøver tatt 30 minutter, 1, 3 og 24 timer etter blodutskiftingen viste: (1) ingen reduksjon av hvite blodceller og blodplater ut over den blodfortynnende virkning; (2) ingen aktivering av intravaskulær koagulering og fibrinolyse, bestemt ved måling av serumfibrinogen, protrombintid og spaltingsprodukter av fibrin; (3) ingen økning av kreatin-fosfokinasehjerneisoenzym (CPK-BB) eller myokardielt isoenzym
(CPK-MB) som kunne tyde på cerebral eller myokardlell skade; (4) Ingen økning av glutaminsyre-pyrodruesyretransaminase i serum (SGPT) som kunne tyde på leverskade; (5) normale arterieblodgasser som viste normal lungefunksjon; og (6) normalt serumkreatinin, som tyder på normal nyrefunksjon. De kombinerte blod- og urinprøver ved 3 og 24 timer viste normal kreatininutskilling, som igjen tyder på normal nyrefunksjon. Oksygendissosiasjonskurver for helblod viste ingen forandring i P50-verdi, dvs. ingen økt oksygenaf f ini tet grunnet hemoglobin. Plasma-Hb-nivået ved 24 timer var tilnærmet 50 % av utgangsnivået, noe som tyder på en hemoglobinhalveringstid på 24 timer.
Dyrene virket og oppførte seg normalt i 24 timer. På dette tidspunkt ble de drept og de vitale organer undersøkt histologisk. Ingen av de patologiske endringer som tidligere er blitt beskrevet i den vitenskapelige litteratur, ble funnet i (a) hjertet, (b) lunger, (c) lever og (d) nyrer. Disse funn står i sterk kontrast til dem tidligere beskrevet (se refe-ranser ovenfor) etter bruk av urent hemoglobin kryssbundet med glutaraldehyd.
Eksempel VI
Effektivitet i kaniner
Effektiviteten av produktet som et blodsubstitutt ble undersøkt i kaniner. Etter instrumentering som tilsvarer den beskrevet i foregående eksempel, ble en tredjedel av beregnet blodvolum (blodvolum = 6 % av kroppsvekt i kg) fjernet fra en kontrollgruppe på 10 New Zealand-kaniner med kroppsvekt 4,0 kg, fulgt av fjerning av ytterligere 1/3 etter 15 minutter. Uten behandling døde alle disse dyr i løpet av 1 time. En eksperimentell gruppe på 10 kaniner ble utsatt for samme behandling, men mottok en infusjon med Hb-PP-GSH i samme volum som det totale blodtap. Alle disse dyr overlevde og gjenopp-rettet sin opprinnelige hematokrit (konsentrasjon av røde blodceller) i løpet av 7 dager.
Eksempel VII
Vasodilataslon etter bloderstatnin<q> hos rotter
Tolv Sprague-Dawley-rotter med kroppsvekt 350-450 g ble bedøvd ved intraperitoneal injeksjon av natriumpentobarbi-tal, 45 mg/kg, og plassert på ryggen på et operasjonsbord. Høyre femoralarterie, halspulsåre og eksterne halsvene ble kirurgisk frigjort og kanylert med polyetylenkatetvaret (modell PE 50; Intramedic, New York). Det eksterne halsvenekateter ble ført inn i høyre forkammer, mens en termistorprobe (modell IF, Columbus Instruments, Columbus, Ohio) ble ført gjennom halspulsåren inn i den oppadgående del av aorta. Hvert kateter ble fylt med saltvann som inneholdt 5 IU/ml storfeheparin. Det femoralarterielle og det halsvenøse uttak ble forbundet med trykkmålere. Nålelektroder ble innført subkutant i lemmene og benyttet for opptak av elektrokardiogram (ECG). Varmelamper ble justert for å gi konstant kroppstemperatur.
Hjertefrekvensen ble bestemt fra ECG-målingen og hjertets minuttvolum målt ved termodilutering, ved injeksjon av 200 ul saltvann ved værelsestemperatur (20-22 °C) inn i høyre forkammer og opptak av en termodilusjonskurve fra termi-storen i aorta. Den systemiske karmotstand ble beregnet som det gjennomsnittlige arterietrykk minus trykket i høyre forkammer dividert med hjertets minuttvolum.
Etter opptak av hemodynamiske basisdata ble 1/3 av det beregnede blodvolum (blodvolum hos rotte = 7 % av kroppsvekt i kg) fjernet via det arterielle uttak over en 5 minut-ters periode. Etter 15 minutter ble Hb-PP-GSH i samme volum infisert via veneuttaket. Hjertefrekvens, gjennomsnittlig arterietrykk og minuttvolum ble målt og den systemiske karmotstand beregnet ved utgangstilstanden (Tx), 15 minutter etter fjerning av blod (T2) og 15 minutter etter hemoglobininfusjon (T3). Statistisk analyse av målingene ble utført ved bruk av Student's t-test for parede data.
Resultatene som er oppsummert nedenfor, viser økt systemisk karmotstand etter fjerning av blod, fulgt av reduksjon til normalverdi og av vasodilatasjon, selv relativt til utgangsverdien, etter bloderstatning.
Eksempel VIII
Dannelse av frie oksygenradikaler 1 kaniner
Tolv New Zealand-kaniner med kroppsvekt 4,0 kg ble bedøvd med klorpromazin (5 mg/kg, intramuskulært) og utstyrt med begrenset instrumentering. Sterile plastikkanyler ble innsatt i sentralarterien og kantvenen i et øre, og en termistorprobe og nålelektroder ble innsatt subkutant i lemmene. En tredjedel av det beregnede blodvolum (2 % av kroppsvekten i kg) ble fjernet fra arterieuttaket over et tidsrom på 5 minutter, og det samme volum med Hb-løsning ble infisert gjennom venen over et tidsrom på 30 minutter. En kontrollgruppe på seks kaniner fikk umodifisert Hb, mens eksperimentgruppen (seks kaniner) fikk Hb-PP-GSH. Virkningene ble undersøkt med hensyn på plasmanivåer av hydrogenperoksid (H202) og lipidperoksider målt ved utgangstUstanden og 15 minutter, 1 time, 3 timer og 24 timer etter Hb-infusjon. Plasma-Hb og met-Hb ble også målt ved de samme tidspunkter.
H202 økte i gruppen som mottok umodifisert Hb fra
2 ± 2 til 70 ± 5 pmol/ml etter 1 time, og avtok så til 50
5 pmol/ml ved 3 timer og til 10 ± 5 pmol/ml ved 24 timer. I eksperimentgruppen økte H202 bare fra 2 <+> 2 til 10+2 umol/ml ved 1 time, og vendte tilbake til utgangsverdien etter 3 timer. Tilsvarende økte lipidperoksider fra 1,5 ± 0,9 nmol/ ml i utgangstilstanden til 4,0 ± 1,0 nmol/ml etter 1 time i kontrollgruppen. Ingen signifikant økning forekom i eksperimentgruppen. Plasma-met-Hb økte fra 0 til 15 % i løpet av 1 time i gruppen som mottok umodifisert Hb. Det økte fra 0 til 5 % i gruppen som mottok Hb-PP-GSH. Forskjellen mellom de to grupper i disse variabler ble vist å være signifikant ved statistisk analyse, Student's t-tester og uparede og parede prøver samt ANOVA.
Selv om oppfinnelsen er blitt beskrevet i forbindelse med den foregående spesifikke utførelse, vil mange alternativer, variasjoner og modifikasjoner være åpenbare for fagfolk. Disse alternativer, variasjoner og modifikasjoner er ment å ligge innenfor påfølgende krav, ånd og område.
Claims (7)
1. Analogi fremgangsmåte for fremstilling av et blodsubstitutt som består av hemoglobin kryssbundet intramolekylært med o-adenosin, o-ATP og glutation, karakterisert ved at den omfatter omsetning av et hemoglobin med o-ATP og o-adenosin, slik at et kryssbundet produkt dannes, omsetning av det kryssbundne produkt med en mengde redusert glutation og oppløsning av det resulterende produkt i en saltløsning.
2. Analogifremgangsmåte ifølge krav 1, hvor blodsubsti-tuttet videre omfatter en tilsetning av magnesiumklorid ved en konsentrasjon som er tilnærmet ekvimolar med konsentrasjonen av o-ATP,
karakterisert ved at det anvendes tilsvarende utgangsmaterialer.
3. Analogif remgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, hvor hemo-globinet kryssbindes intramolekylært med perjodatoksidert ATP og intermolekylært med perjodatoksidert adenosin, slik at molekyler av polyhemoglobin dannes, karakterisert ved at det anvendes tilsvarende utgangsmaterialer.
4. Analogif remgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, hvor hemoglobinet, o-ATP, o-adenosinet og glutationet foreligger i molare forhold på henholdsvis ca 1:3:10:20,
karakterisert ved at det anvendes tilsvarende utgangsmaterialer.
5. Analogifremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, hvor de kryssbundne hemoglobinmolekyler har molekylvekter i området fra tilnærmet 130 til tilnærmet 390 kilodalton,
karakterisert ved at det anvendes tilsvarende utgangsmaterialer.
6. Analogif remgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, hvor mindre enn 5 % av hemoglobinet oksi-deres til met-hemoglobin,
karakterisert ved at det anvendes tilsvarende utgangsmaterialer.
7. Analogifremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, hvor hemoglobinet er fra storfe, karakterisert ved at det anvendes tilsvarende utgangsmaterialer.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US45907189A | 1989-12-29 | 1989-12-29 | |
PCT/US1990/007442 WO1991009615A1 (en) | 1989-12-29 | 1990-12-12 | Polyhemoglobin stabilized by purine derivatives and glutathione |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO922551D0 NO922551D0 (no) | 1992-06-26 |
NO922551L NO922551L (no) | 1992-08-28 |
NO309799B1 true NO309799B1 (no) | 2001-04-02 |
Family
ID=23823294
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO922551A NO309799B1 (no) | 1989-12-29 | 1992-06-26 | AnalogifremgangsmÕte for fremstilling av et blodsubstitutt |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0507870B1 (no) |
JP (1) | JP2954347B2 (no) |
KR (1) | KR0168866B1 (no) |
AT (1) | ATE136466T1 (no) |
AU (1) | AU650439B2 (no) |
CA (1) | CA2072081C (no) |
DE (1) | DE69026513T2 (no) |
DK (1) | DK0507870T3 (no) |
ES (1) | ES2086532T3 (no) |
FI (1) | FI105256B (no) |
GR (1) | GR3019775T3 (no) |
IE (1) | IE73248B1 (no) |
NO (1) | NO309799B1 (no) |
PT (1) | PT96398B (no) |
WO (1) | WO1991009615A1 (no) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5650388A (en) * | 1989-11-22 | 1997-07-22 | Enzon, Inc. | Fractionated polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions |
EP0586381B1 (en) * | 1991-02-12 | 1998-11-11 | Texas Tech University Health Sciences Center | Improved blood substitute |
US5334706A (en) * | 1992-01-30 | 1994-08-02 | Baxter International | Administration of low dose hemoglobin to increase perfusion |
US5900477A (en) * | 1992-01-30 | 1999-05-04 | Baxter International, Inc. | Use of hemoglobin in the treatment of hemorrhagic shock |
US5264555A (en) * | 1992-07-14 | 1993-11-23 | Enzon, Inc. | Process for hemoglobin extraction and purification |
US6242417B1 (en) | 1994-03-08 | 2001-06-05 | Somatogen, Inc. | Stabilized compositions containing hemoglobin |
US5631219A (en) * | 1994-03-08 | 1997-05-20 | Somatogen, Inc. | Method of stimulating hematopoiesis with hemoglobin |
JPH10501823A (ja) * | 1995-04-10 | 1998-02-17 | バクスター、インターナショナル、インコーポレイテッド | クモ膜下出血の治療における架橋ヘモグロビンの使用 |
US5741894A (en) * | 1995-09-22 | 1998-04-21 | Baxter International, Inc. | Preparation of pharmaceutical grade hemoglobins by heat treatment in partially oxygenated form |
KR100674690B1 (ko) * | 1999-07-01 | 2007-01-25 | 시스멕스 가부시키가이샤 | 헤모글로빈 안정화수단 |
CN116941603A (zh) * | 2023-07-21 | 2023-10-27 | 浙江康嘉基因技术有限公司 | 一种新型醛化鸡红细胞的制备方法及其应用 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4061736A (en) * | 1975-02-02 | 1977-12-06 | Alza Corporation | Pharmaceutically acceptable intramolecularly cross-linked, stromal-free hemoglobin |
US4401652A (en) * | 1980-12-31 | 1983-08-30 | Allied Corporation | Process for the preparation of stroma-free hemoglobin solutions |
US4473496A (en) * | 1981-09-14 | 1984-09-25 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Intramolecularly crosslinked hemoglobin |
US4831012A (en) * | 1984-03-23 | 1989-05-16 | Baxter International Inc. | Purified hemoglobin solutions and method for making same |
GB8710598D0 (en) * | 1987-05-05 | 1987-06-10 | Star Medical Diagnostics Ltd | Hemoglobin based blood substitute |
US4876241A (en) * | 1987-05-22 | 1989-10-24 | Armour Pharmaceutical Company | Stabilization of biological and pharmaceutical products during thermal inactivation of viral and bacterial contaminants |
-
1990
- 1990-12-12 AU AU71425/91A patent/AU650439B2/en not_active Expired
- 1990-12-12 DE DE69026513T patent/DE69026513T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-12 DK DK91902885.2T patent/DK0507870T3/da active
- 1990-12-12 EP EP91902885A patent/EP0507870B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-12 WO PCT/US1990/007442 patent/WO1991009615A1/en active IP Right Grant
- 1990-12-12 JP JP3503266A patent/JP2954347B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-12 CA CA002072081A patent/CA2072081C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-12 AT AT91902885T patent/ATE136466T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-12-12 ES ES91902885T patent/ES2086532T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-28 PT PT96398A patent/PT96398B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-12-28 IE IE471790A patent/IE73248B1/en not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-06-24 FI FI922937A patent/FI105256B/fi active
- 1992-06-26 NO NO922551A patent/NO309799B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-12-12 KR KR1019920701541A patent/KR0168866B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-04-29 GR GR960401155T patent/GR3019775T3/el unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
PT96398B (pt) | 1998-12-31 |
PT96398A (pt) | 1991-10-31 |
AU7142591A (en) | 1991-07-24 |
ATE136466T1 (de) | 1996-04-15 |
NO922551D0 (no) | 1992-06-26 |
ES2086532T3 (es) | 1996-07-01 |
FI922937A (fi) | 1992-06-24 |
FI922937A0 (fi) | 1992-06-24 |
IE904717A1 (en) | 1991-07-17 |
KR0168866B1 (ko) | 1999-01-15 |
EP0507870B1 (en) | 1996-04-10 |
DK0507870T3 (da) | 1996-06-10 |
DE69026513D1 (de) | 1996-05-15 |
NO922551L (no) | 1992-08-28 |
DE69026513T2 (de) | 1996-09-12 |
EP0507870A1 (en) | 1992-10-14 |
EP0507870A4 (en) | 1993-08-11 |
CA2072081C (en) | 2002-07-30 |
AU650439B2 (en) | 1994-06-23 |
IE73248B1 (en) | 1997-05-21 |
KR920703087A (ko) | 1992-12-17 |
WO1991009615A1 (en) | 1991-07-11 |
CA2072081A1 (en) | 1991-06-30 |
JPH05504766A (ja) | 1993-07-22 |
FI105256B (fi) | 2000-07-14 |
JP2954347B2 (ja) | 1999-09-27 |
GR3019775T3 (en) | 1996-07-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5439882A (en) | Blood substitute | |
ES2032802T5 (es) | Sucedaneo de sangre semisintetico extrapuro. | |
US4857636A (en) | Pasteurizable, freeze-driable hemoglobin-based blood substitute | |
RU2475252C1 (ru) | Способ приготовления лекарственного препарата, содержащего переносчик кислорода, стабильного при высоких температурах, и его применение | |
NL194909C (nl) | Werkwijze voor de bereiding van gepolymeriseerd hemoglobine en celvrij vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes op basis daarvan. | |
US5189146A (en) | Pasteurizable, freeze-driable hemoglobin-based blood substitute | |
NO309799B1 (no) | AnalogifremgangsmÕte for fremstilling av et blodsubstitutt | |
JP4581110B2 (ja) | ヘモグロビンの精製方法 | |
KR20070069154A (ko) | 산소 운반 조성물을 사용하여 혈역학적 안정성을향상시키는 방법 | |
CZ310098A3 (cs) | Způsob výroby nebuněčné náhrady červených krvinek a zařízení k provádění tohoto způsobu | |
EP0586381B1 (en) | Improved blood substitute | |
WO2004089404A1 (fr) | Conjugat d'hemoglobine, son procede de preparation et son utilisation | |
Leone | Potential clinical applications of recombinant human haemoglobin in blood conservation | |
JPH03215499A (ja) | ヘモグロビン複合体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK1K | Patent expired |