JPH05504766A - プリン誘導体及びグルタチオンで安定化されたポリヘモグロビン - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】

プリン誘導体及びグルタチオンで安定化されたポリヘモグロビン発明の分野 本発明は人工血液及びその調製方法に関する。さらに詳しくは、本発明は様々な 種の動物の（可能であればヒトの）重度の出血後に生命を維持する上で有効であ り、かつ毒性のない新規なヘモグロビン組成物に関する。 発明の背景 血液は多くの機能を有しており、これらはすべて生命に欠くべからざるものであ る。しかし、重度の出血は次の２つの理由で生命を危機にさらす：　（１）循環 血液容量の低下は組織の潅流を減少させる（虚血）；　（２）酸素運搬量の減少 によって組織で酸素が欠乏する（低酸素症）。循環系はこれらの変化に反応して 血管収縮し、虚血と低酸素症いっそう悪化させる。最終的には細胞代謝が変化し 、機能が低下して、ショックと死に至る。 このような状況においては、「人工血液」はすべての機能において血液と置き換 えられるような製剤ではなく、（ａ）血液量の回復、（ｂ）酸素運搬、（Ｃ）血 管収縮の減少、を行うことのできる緊急蘇生用液体である。明らかに、この液体 は毒性のある副作用があってはならず、また細菌やウィルス等の病原体を有して いてはならない。 人工血液としてのヘモグロビン ５０年以上の間、人工血液の開発はヘモグロビン（Ｈｂ）を中心に行われてきた 。 これは、ヘモグロビンが大気中から十分な酸素を取り込み、生理学的酸素運搬体 として働くことのできる唯一の物質であるためである。さらに、ヘモグロビンは 血清アルブミンと同じコロイド浸透圧を有し、したがって、血漿増量剤として役 に立つことができる。しかし、これらの開発の努力は、なかなか認識されずしか も解決の難しい多くの問題のために成功しなかった。問題とは：　（１）（ａ） 環境の細菌性内毒素、（ｂ）ストローマ性リン脂質、及び（Ｃ）非ヘム蛋白質及 びペプチドで汚染されることによる毒性、（２）溶液中のヘモグロビンの酸素親 和性が高いために、組織への酸素放出が妨げられること、（３）ヘモグロビン分 子が不安定であり、血管から溶出し急速に腎臓から排泄される傾向にあること； （４）ヘモグロビンの自動酸化が起こり、メトヘモグロビン（ｍｅｔ−Ｈｂ　： 機能を持たないヘモグロビン）及び毒性のある酸素フリーラジカルを生成する傾 向にあること：及び（５）ヘモグロビンが、肝炎、エイズ等の、血液に関連した 疾病を伝染させる血液副産物となる可能性があることである。 歴史的には、認識されるべき第１の問題は毒性であった。すなわち、ヘモグロビ ン溶液の一部が血管内での血液凝固を促進し、腎臓に障害を与える可能性があっ た。ラビナー（Ｒａｂｉｎｅｒ）は、１９６０年代に、これらの毒性はヘモグロ ビンではなく、赤血球のストローマ（赤血球膜の断片）によるものであるという 考えを発表した。彼は、「無ストローマ・ヘモグロビン」の必要性を強調した。 しかし、実際にはこの言葉に反して、ストローマ性要素を全く含まないヘモグロ ビンは何年もの間製造されなかった。赤血球膜の毒性因子は、フォスファチジル エタノールアミン（ＰＥ）及びフォスファチノルセリン（Ｐ　Ｓ）と（・う、通 常は細胞質側に存在するアミノリン脂質と同定された（フエオラ（Ｍ、　Ｆｅｏ ｌａ）ら、「赤血球膜における毒性因子（”Ｔｏｘｉｃ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎ 　ｔｈｅ　ｒｅｄ　ｂｌｏｏｄ　ｃｅｌｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ−、Ｔｈｅ　Ｊｏ ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｒａｕ＋＊ａ、　Ｖｏｌ、　２９．　ｐａｇｅｓ　１０６ ５−１０７５．１９８９）　Ｊ　）　ｏこれらの化合物はヘモグロビンに対して 特別の親和性を有しており（これらはその他のストローマ性成分と比べて、ヘモ グロビンから除去するのが困難である）、ＰＥ及びＰＳで汚染されたヘモグロビ ンを実験動物（ラビット及びサル）に有意量（少なくとも動物の計真上の血液量 の１７３量）投与すると、「全身性炎症反応」が引き起こされる。 すなわち、血管的血液凝固が生じ、補体が活性化され、白血球及び血小板が活性 化され、生体器官に虚血性炎症障害が発生する（フエオラ（Ｍ、　Ｆｅｏｌａ） ら、「重合ヘモグロビン溶液の毒性（−丁ｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｐｏｌｙａｅ ｒｉｚｅｄ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　５ｏｌｕｔｉｏｎｓ”。 Ｓｕｒｇｅｒｙ、　Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　０ｂｓｔｅｔｒｉｃｓ、　 Ｖｏｌ、　１６６、　ｐａｇｅｓ　２１１−２２２．１９８W）　ｊ及 びフェオラ（Ｍ、Ｆｅｏｌａ）ら、［霊長類における無ストローマ・ヘモグロビ ン溶液の補体活性化と毒性（”Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　 ａｎｄ　ｔｈｅ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｓｔｒｏｍａ−ｆｒｅｅ　ｈｅｍｏ ｇｌｏｂｉｎ　５ｏｌｕｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｐｒｉｍａｔｅｓ−、Ｃ１ｒｃｕｌ ａｔｏｒｙ　５ｈｏｄｋ、　Ｖｏｌ、　２５D　ｐａｇｅｓ ２７５−２９０．１９８８）　Ｊ　）。 最近になって初めて認識されるようになった問題は、環境の細菌性内毒素によっ てヘモグロビン溶液が容易に汚染されることである。リムルスのアメーバ血球ラ イセード試験法が開発されるまでは、米国薬局方は内毒素の検出法としては、ラ ビットによる発熱性物質試験法に頼っていた。上述の引用文献には、発熱性を生 じるレベルよりはるかに低い濃度の内毒素で汚染されたヘモグロビンが、アミノ リン脂質（内毒素の毒性物質は、実際にはりピッドＡという脂質である）で汚染 されたヘモグロビンと同様の毒性を引き起こすことが報告されている。細菌性内 毒素は、ブトキノゲル（Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ）カラム（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅ ｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）等ノアフィニティー・クロマトグラフィーを用いて生物 性の溶液から除去することができる。 しかし、出発材料が２ユニツト／１１１（「定量的色原体リムルス試験（ＱＣＬ −１０００，Ｖｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｍ、Ｄ、　Ｂｊｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）　Ｊに よって測定、ＩＥＵは０．　ｌｎｇの細菌性リポ多糖票に相当）以上の内毒素を 含む場合には、これらのカラムでは内毒素をすべて除去することはできない。 非△、ム蛋白質及びペプチドから△、モグロビンを精製しなくてはならない。毒 性はどの特定の蛋白質の存在とも無関係であるが、ヘモグロビン溶液の免疫原性 を低下させる必要があるため、精製を行わなくてはならない。また、ペプチドは 単離された臓器（心臓及び腎臓）及び動脈において見られる、ヘモグロビン溶液 の血管収縮効果の原因となるという仮説もある。この精製については、従来から 様々な方法が知られている。例えば＝　（１）遠心分離及び濾過（ドクジ（Ｄｏ ｃｚｉ）、米国特許第３．９９１．１８１号）：　（２）　トルエン抽出（ボン セン（Ｂｏｎｓｅｎ）ら、米国特許第４．００１．２００号及び第４．００１． ４０１号）；　（３）限外濾過（コザ（Ｋｏｔｈｅ）ら、米国特許第４．５２６ ．７１５号）：（４）限外濾過及び酸沈澱（ボナード（Ｂｏｎｈａｒｄ）ら、米 国特許第４．１３６．０９３号及び第４．３３５．２４８号）＋　（５）イオン 交換クロマトグラフィー（メイラ−（Ｍｅｉｌｌｅｒ）　、米国特許第４．１０ ０．１４９号）：　（６）亜鉛沈殿（タイ（Ｔｙｅ）、米国特許第４．４７３． ４９４号及び第４．５２９．７１９号）：及び（７）結晶化（デヴエヌー）　（ ＤｅＶｅｎｕｔｏ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ａｎｄ 　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　Ｖｏ戟B ８９、　ｐａｇｅｓ　５０９−５１４．１９７７）　。しかし方法（１）−（４ ）はヘモグロビンを他の蛋白質から完全に分離する能力において本質的に限界が あり、方法（５）〜（７）は大量精製には適していない。 １９７０年代に認識された問題は、溶液中のヘモグロビンが酸素に対して高い親 和性を有することである。酸素親和性とは、肺で空気から酸素を取り込み組織で これを放出するというヘモグロビンの能力を制御している特性である。この性質 はＰｒｏ値（Ｈｂの酸素飽和度が５０％となるときの酸素分圧）で表わされる。 Ｐ５゜が低くなればなるほどヘモグロビンの酸素結合能力は大きくなるが、この ことは、組織において酸素を放出する能力が低下することを意味する。ヒトの血 液ではＰ、０は約２ｋｍＨｇであるが、ヒトヘモグロビンの溶液におけるｐｓｏ は約１３ｍｍＨｇである。 この差は、赤血球中においてはヘモグロビンは２．３−シフオスフォグリン酸（ ２，３−ＤＰＧ）と反応し、酸素に対する親和性が低下しているためである。赤 血球の外では、この相互作用は失われる。その結果、ヘモグロビンはｏ２と非常 に強く結合し、０２運搬体としての機能がなくなる。この問題を解決するために 、ベネンユ（Ｂｅｎｅｓｃｈ）らは、ヘモグロビンとピリドキサール−５°−リ ン酸（２，３−Ｄ　Ｐ　Ｇのアナログ）との共有結合反応法を開発した。最初は このような反応によって酸素親和性が低下し、かつヘモグロビンの分子が４量体 型で安定化されることが期待された。しかし、これは実現しなかった。これに対 して、つ／ヘモグロビン溶液は、ヒト血液と同じＰ２Ｏ値を有し、その酸素親和 性は２．３−Ｄ　Ｐ　Ｇではなく塩化物によって制御された（フエオラ（Ｍ、　 Ｆｅｏｌａ）ら、「人工血液としての無ストローマ・ウノヘモグロビン溶液の開 発（−Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｔｒｏｍａ−ｆｒ ｅｅ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　ａｓ　ａ　ｂｌｏｏｄ　５ｕ ｂｓｔｉｔｕｔｅ”、　Ｓｕｒｇｅｒｙ、Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　０ｂ ｓｔｅ狽窒奄モ刀A　Ｖ ｏｌ、　１５７．　ｐａｇｅｓ　３９９−４０８．１９８３）　Ｊによる）。こ の好ましい性質に加えて、さらにウシ赤血球が大量に入手可能であること、及び 純粋なヘモグロビンは哺乳類の中では免疫原性が低いことからみて、人工血液の 基礎としてつ／ヘモグロビンを用いることは有益である。 １９７０年代に認識されたもうひとつの問題点は、ヘモグロビンの血管内寿命が 短く、急速に温圧することである。これは一般的には、ヘモグロビン４量体（α ２β２）が、毛細血管を通過することのより容易な２量体（２αβ）に解離する 傾向があるためである。現在では、蛋白質の表面電荷もまた重要な役割を果たし ていること、すなわち、長い血管内寿命のためには、負の電荷と低い等電点が好 ましいことが明らかになっている。ヘモグロビンの温圧はい（っかの望ましくな い効果を有する：　（１）血漿増量効果の持続時間が短い：　（２）ヘモグロビ ンが腎臓の腎糸球体を通過すると、浸透圧利尿効果が生じ、血漿量は維持される よりむしろ減少する：　（３）ヘモグロビンが尿細管で再吸収されることによっ て、細管細胞に障害をもたらす：　（４）ヘモグロビンが組織間液中に移動する ため、浮腫と細胞障害をもたらす。従来の技術は、ヘモグロビンの２量化を防ぐ ことにのみ焦点をあてていた。この目的のために３種のヘモグロビン修飾法が開 発されて来た：　（ａ）分子間架橋（重合）；　（ｂ）他の分子との結合、（Ｃ ）α鎖とβ鎖との分子内架橋。最も広く用いられている方法は、グルタルアルデ ヒドを用いたヘモグロビンの分子間架橋（ボンセン（Ｂｏｎｓｅｎ）ら、米国特 許第４．００１．２００号、第４．００１、４０１号および第４．０５３．５９ ０号、モリス（Ｍｏｒｒｉｓ）ら、米国特許第４．０６１．７３６号、ボナード （Ｂｏｎｈａｒｄ）ら、米国特許第４．１３５．０９３号）である。しかし、こ の方法にもいくつかの問題点がある：　（１ングルタルアルデヒドは本来毒性が あり、グルタノげルデヒドの代謝による副生成物の潜在毒性については知られて いない：（２）この化合物は非常に反応性が高く、ヘモグロビン分子の様々な部 位（α−及びε−アミノ基及びスルフヒドリル基）で複数の架橋を形成する傾向 にありいこのため予想できない数の分子種を形成する：　（３）重合反応は制御 が困難であり、４°Ｃにおいて保存している間にも反応が続行しているように見 え、このため高分子の分子量は増加しつづけ、粘度と酸素親和性も増加する＝　 （４）架橋に特異性がないという性質のため、溶液中には依然としてヘモグロビ ンの２量体が残りつる。他の方法としては、デキストラン及びヒドロキシエチル ・スターチ（米国特許第４．０６４．１１８号）、ポリエチレングリコール又は ポリプロピレングリコール（米国特許第４．４１２．９８９号）、イヌリン（米 国特許第４．３７７、５１２号）、ポリアルキレンオキサイド（米国特許第４． ６７０．４１７号）等の、大きな分子にヘモグロビンを結合させた。しかし、こ れらと結合したヘモグロビンは酸素親和性が増加しており、結合に用いられた物 質に特有の望ましくない性質を得る傾向にある。分子内架橋としては、「ジアス ピリン」エステル（タイ（Ｔｙｅ）　、米国特許第４．５２９．７１９号、ウォ ルダ−（Ｙａｌｄｅｒ）　、米国特許第４．５９８．００４号）、及び「過ヨウ 素酸酸化アデノンン三リン酸（ｏ−ＡＴＰ）Ｊ　（スキャノン（Ｆ、　Ｊ、　５ ｃａｎｎｏｎ）、「ヘモグロビンの分子修飾（＋Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｍｏｄｉ ｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ−、Ｃｒ１ｔｉｃａｌ　Ｃａｒ ｅ　Ｍｅｄｉモ■ ｎｅ、　Ｖｏｌ、　１０．　ｐａｇｅｓ　２６＋−２６５，１９８２）　Ｊ　、 グリーンバーブ（Ａ、　Ｇ、　Ｇｒｅｅｎｂｕｒｇ）及びマフイド（Ｐ、　１． 　Ｍａｆｆｕｉｄ）、「ヘモグロビンの修飾−開環ジオール（Ｍｏｄｉｆｉｃａ ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　−Ｒｉｎｇ　ｏｐｅｎｅｄ　ｄｉｏｌ ｓ−、Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｂｌｏｏｄ　５ｕｂｓｔｉ狽浮狽■A＾ ｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８３．　ｐａｇｅｓ　９−１ ７）　Ｊ　）を用いる方法が開発されている。 しかし、ジアスピリン・ヘモグロビンは依然として血管的滞留時間が短く（半減 期３〜４時間）、またＡＴＰヘモグロビンはメトヘモグロビンが多く、かつ、酸 素親和性が高く半減期が短いために、満足できる結果が得られていない。 ヒトヘモグロビンをピリドキサール−５−リン酸及びグルタルアルデヒドと反応 させて重合し、ピリドキサール化ヘモグロビン（ポリーＰＬＰ−ヘモグロビン） を得た研究者は著しい進歩、すなわち、このヘモグロビンが低い酸素親和性とよ り長い血管的滞留時間とを合わせ持つことを報告している（モス（Ｇ、　Ｓ、　 ｌ１ｏｓｓ）ら、「ヘモグロビン溶液−４量体から高分子（”ｌｌｅｍｏｇｌｏ ｂｉｎ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　−Ｆｒｏ＋ｎ　ｔｅｔｒａｍｅｒ　ｔｏ　ｐｏｌｙ ｍｅｒ＋、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｃｅ１ｌｓ　 ａｎｄ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｏｒ■≠獅刀A　Ｖ。 １、１６（１−３）、　ｐａｇｅｓ　５７−６９．１９８１１り　、及びデヴエ ヌート（Ｆ、　ＤｅＶｅｎｕｔｏ）とゼグナ（Ａ、　Ｚｅｇｎａ）、「ピリドキ サール化、重合ヒトヘモグロビンの調製（”Ｐｒｅｐａｒａｔｉ。 ｎ　ａｎｄ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｙｒｉｄｏｘａｌａｔｅｄ−ｐｏ ｌｙ＋ｍｅｒｉｚｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｈｅ＋ａｏｇｌｏｂｉ氏|、Ｊｏｕｒｎａ ｌ ｏｆ　Ｓｕｒｇｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、ＶｏＬ　３４．　ｐａｇｅｓ　２ ０５−２１２．　１９８３）　Ｊ　）　＋＋　しかし、ピリドキサール化は重合 を阻害することが見い出された。したがって、酸素親和性の低下したピリドキサ ール化ヘモグロビンは腎臓から急速に排出され、より長い半減期を有する重合ヘ モグロビンは高い酸素親和性を有している。結論としては、酸素運搬機能に影響 を及ぼさないヘモグロビンの安定化の問題はまだ解決されていない。 ここ数年の間、ヘモグロビンの本質的を毒性に関する疑問が提示されてきた。 血管収縮効果を観察した実験結果が報告されている。また、ヘモグロビンが自動 酸化によりメトヘモグロビンになる傾向（すなわち、ヘム鉄イオンが＋３価の鉄 から＋２価の鉄に酸化され、この反応から毒性のある酸素フリーラジカルが生じ る）にあるため、循環系に注入された場合にこれがプロオキシダントとして作用 すると推測されている。この結果、細胞膜の脂質過酸化反応が生じ、細胞構造に 障害がもたらされる。血管収縮と酸素フリーラジカルの生成という両方の効果に よって、出血によって生じる虚血性・低酸素性障害は緩和されるよりむしろ悪化 する。血管収縮とラジカルの生成は次の３段階で制御することができるという実 験結果が報告されている　（１）ヘモグロビンの完全な精製、（２）メトヘモグ ロビンの形成の少ないヘモグロビン分子の調製と安定化；　（３）酸素ラジカル 捕捉剤の添加（フエオラ（Ｍ、　Ｆｅｏｌａ）ら、「ヘモグロビン溶液の生体適 合性（”Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｈｅｏｏｇｌｏｂｉｎ　５ ｏｌｕｔｉｏｎｓ、　Ｌ　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅ獅 р盾狽■■撃■ ａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｔｏ　ｐｕｒｅ　ａｎｄ　１ｏｐｕｒｅ　ｈｅｍｏｇｌｏｂ ｉｎｓ−、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｏｒｇａｎｓ、　ＶｏｌA　１３（３）。 ｐａｇｅｓ　２０９−２１５．１９８９）　ｊ　）。 最後に、ヘモグロビン溶液は血液製剤伝染性疾病の危険を伴う。細菌及び寄生虫 は濾過や限外濾過によって容易に除去できるが、ウィルスはより深刻な問題を提 起する。従来、ウィルスの不活性化の方法としては、２つの方法が知られている 。ひとつは物理的方法であって、デオキシ型のヘモグロビンを５０６Ｃ，ｐＨ７ ，５で１０時間低温殺菌する。この方法は、モデルウィルス（ンンビス、ポリオ 、ンユードレビー）及びヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）を不活性化させること がわかっている（ニステップ（Ｔ、　Ｎ、　Ｅｓｔｅｐ）ら、「熱によるヘモグ ロビン溶液中のウィルスの不活性化（−Ｖｉｒｕｓ　１ｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ 　ｉｎ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　５ｏｌｕｔｉｏｎｓ　ｂｙ　ｈｅａｔ”、Ｂｉ ｏ■ ａｔｅｒｉａｌｓ、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｃｅ１ｌｓ　ａｎｄ　Ａｒｔｉｆｉ ｃｉａｌ　Ｏｒｇａｎｓ、　Ｖｏｌ、　１６（１−３）、　垂≠■■刀@８１ ６−８２１．１９８３）　Ｊ　）。もうひとつの方法は化学的方法であり、クロ ロホルムで処理するというものである（フエインストン（Ｓ、　１１．　Ｆｅ１ ｎｓｔｏｎ）ら、「クロロホルムによるＢ型及び非Ａ非Ｂ肝炎ウィルスの不活性 化（”Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢ　ｖｉｒｕｓ　 ａｎｄ　ｎｏｎ−Ａ　ｎｏｎ−Ｂ　ｈｅｐｔｉｔｉｓ　ｂｙ　ｃｈｌｏｒｏｆｏ ｒｍ”、　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　hｍ＋ｅｕｎｉｔｙ。 ｙ□ｉ、　４１．　ｐａｇｅｓ　３１６−８２１．１９８３）　Ｊ　）　、しか し、どちらの方法も、特殊な方法を用いない限り、ヘモグロビンを著しく変性さ せる。 本発明の概要 本発明は、人工血液として有用な物質の組成物及びその調製方法に関する。この 組成物は、哺乳類（好ましくはウシ）ヘモグロビン（Ｈｂ）からなり、（ａ）総 合的に、完全に精製し、（ｂ）過ヨウ素酸酸化ＡＴＰ　（ｏ−ＡＴＰ）と分子内 架橋し、かつ、過ヨウ素酸酸化アデノシン（０−アデノンン）と分子間架橋し、 （Ｃ）還元グルタチオン（Ｇ　Ｓ　Ｈ）と反応させ、（ｄ）塩化マグネシウム（ ＭｇＣ１２）とマンニトールを強化した電解質平衡生理食塩水に溶解する。ｏ− ＡＴＰと０−アデノシンは、２つのプリン（Ｐ）を有する誘導体であるため、生 成物はここではＨｂ−ＰＰ−ＧＳＨと表示する。 ヘモグロビン製剤は、その成分の好ましい性質を合わせ持つ。すなわち＝　（１ ）効果的な酸素運搬体である。ウシヘモグロビンは本来酸素結合性が低く　（Ｐ ｓｏ値は２８ｏｎＨｇである）、この値は様々な化学反応によっては影響されな い：　（２）分子内及び分子間架橋したヘモグロビンは長い血管内寿命（半減期 ２４時間）を有しているため、有効な血漿増量剤である：　（３）両方のプリン がノルエピネフリン誘導血管収縮を弛緩させるため、血管拡張性を有する。（４ ）還元グルタチオンとマンニトールが存在するため、プロオキシダント効果を示 さない。 ウシヘモグロビンの好ましい性質については、フエオラ（Ｍ、　Ｆｅｏｌａ）ら の、「ウノ無ストローマ・ヘモグロビン溶液の人工血液としての開発（”Ｄｅｖ ｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆａ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｔｒｏｍａ−ｆｒｅｅ　ｈｅ＋ｓ ｏｇｌｏｂｉｎ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　ａｓ　ａ　ｂｌｏｏｄ　５ｕｂｓｔｉｔｕ ｔｅh、　Ｓｕｒｇｅｒｙ。 Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　０ｂｓｔｅｔｒｉｃｓ、　Ｖｏｌ、　１５７． 　ｐａｇｅｓ　３９９−４０８．１９８３）　Ｊに述べられている。大量に入手 できること、及びヒト血液特有の伝染性疾病（特にエイズ）を回避できることに 加え、ウシヘモグロビンはヒトヘモグロビンの２倍以上のＰ、。値を有しており （１３ｍｄｇに対して２８１１ｍＥｇ）　、２．３−Ｄ　Ｐ　Ｇによる調節を必 要としない。本発明によれば、ウシヘモグロビンの酸素親和性は、塩素イオンの 濃度を増加させることによってさらに低下させることができる。潜在的な免疫学 的問題に関しては、異なった種の哺乳類間における、ヘモグロビン輸血の実施可 能性は十分に示されている。実際には、計算された血液量の１７３から１７２量 の純粋ウシヘモグロビンを繰り返しく６回まで）ラビットやサルに与えた場合、 反応の臨床的形跡はなく、オフタロニーテストによって検出できる抗体の生成も 認められなかった（フエオラ０１．　Ｆｅｏｌａ）ら、［ヘモグロビン溶液の免 疫学的生体適合性（”Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ　ｂｉｏｃｏＩＩｐａｔｉｂｉｌ ｉｔｙ　ｏｆ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　５ｏｌｕｔｉｏｎｓ”、　Ｔｒａｓｆｕ ｓｉｏｎｅ@ｄｅｌ　ｓａｎｇｕ ｅ　（Ｉｔａｌｉａｎ）、　Ｖｏｌ、　３３．　ｐａｇｅｓ　１２１−１２８． １９８８）　Ｊ　）。 細菌性内毒素のないヘモグロビン溶液を製造するために、本調製法において用い られる方法は、汚染を中和するよりもむしろ防止するものである。内毒素のヘモ グロビンに対する親和性のため、いったん著しい汚染が生じると、精製は不可能 ではないが非常に困難になる。防止には次のことが必要である・　（１）出発物 質の汚染が最低限であること：（２）ＦＡ製工程が閉鎖系で行われること：　（ ３）ヘモグロビンと接触するすべての表面が滅菌されており、発熱性物質がない こと：　（４）すべての試薬が精製されていること；　（５）すべての溶液が滅 菌されており、発熱性物質がないこと：　（６）すべての工程において、品質管 理が行われること。内毒素の最も高感度な検出方法は、「定量的色原体リムルス テスト（ＱＣＬ−１０００、Ｔｈ１ｔｔａｋｅｒ　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）　 ｊである。出発材料あるいはいずれかの調製段階のヘモグロビンが、２　ＥＵ／ ｍ１以上の内毒素を含むことを発見した場合には、これを廃棄する。すべての工 程において、汚染レベルを低（保ち、最後に溶液をデトキ／ゲル（Ｄｅｔｏｘｉ −Ｇｅｌ、　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）等のアフィニ ティー・クロマトグラフィーに通すことによって、完全な精製が達成される。 最終精製における全体の汚染の回避と同じ原理を、ストローマ性リン脂質（特に アミノリン脂質）の除去にも適用する。ストローマ性の汚染を避けるためにここ で用いられている方法は、赤血球の透析と限外濾過であり、これはプローチ（Ｊ Ｒ，ＤｅＬｏａｃｈ）らが最初に述べている（＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｖｏｌ、　１５７．　ｐａｇｅｓ　１９１−１９８．１９ ８６）。この方法によれば、まず赤血球をリン酸低張液に対して、督濁液が１６ ｈＯｓｓ／Ｌの浸透圧になるまで透析する。このとき、赤血球は球形を示し、細 胞膜の孔は引き伸ばされる。次に細胞を孔径０．Ｉｎのアミコン（Ａｍｉｃｏｎ ）フィルターを用いて１０ｐｓｉ　（０，７ｋｇ／ａｍ”）のカラム圧で限外濾 過する。したがって、ヘモグロビンは細胞膜を破壊することなく細胞から「絞り 出されるコ。本発明によれば、ひとつの閉鎖系工程を用いて赤血球の透析と限外 濾過を行うことができ、この工程は無菌無発熱性物質の、使い捨ての工程である 。さらに、透析液は、無菌無発熱性物質脱イオン水からなり、リン酸溶液ではな くヘモグロビンの酸化の少ないサム（Ｔｈａｎ）溶液によってｐＨ８，２に調製 する。この工程の結果、ヘモグロビン溶液は約３〜５　ｍｇ／ｄｉのリン脂質（ 「リン脂質テストセット（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｄｉａｇｎ ｏｓｔｉｃｓ、丁ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　Ｉｎｄｉａｎａ）　Ｊを用いて測 定）と、痕跡量のアミノリン脂質ＰＥ及びＰＳ（薄層クロマトグラフィーによっ て測定）を含む。これらの残存リン脂質は、クロロホルム抽出によって除去する 。リン脂質存在量が少ないため、二の工程は、低濃度クロロホルムを用い、短時 間の遠心分離によって行うことができる。したがって、ヘモグロビンの変性を防 ぐことができる。 同じ原理を用いて、ヘモグロビンを、非ヘム蛋白質及びペプチドから精製するこ とができる。この場合には、最初の工程は赤血球を「精製コすることによってす べての血漿蛋白質を除去することである。次に、赤血球膜を大きく破壊すること なく赤血球からヘモグロビンを抽出する方法によって、赤血球からのストローマ 性蛋白質による汚染を防止することができる。最後に、「選択的熱江殿（ベルタ ー（Ｐ、　Ａ、　Ｂｅ１ｔｅｒ）　、クスラー（Ｅ、　Ｌ、　Ｃｕ５ｓｌｅｒ） 　、ター（Ｗ、　Ｓ、　Ｈｕ）　ｍ、「バイオ分離（”Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉ ｏｎｓ”、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１ ９８＆　ｐａｇｅｓ　２２V−２２９） 」を参照）を行う。この方法の科学的根拠は、温度による蛋白質の変性（及び沈 殿）はアレニウスの温度依存性の１次化学反応速度式に従う、という事実にある 。 ここでＰは溶解蛋白質の濃度である。速度定数には次の式で与えられる。 Ｅ／ＲＴ に＝にＱｅ 式中、に。は特性定数であって、「変性の活性化エネルギー」であり、Ｔは温度 である。変性のエネルギーは、蛋白質の種類によって異なる。等式においてＥが 指数として表わされているため、温度がわずかに変動するだけでも大きな影響を 有する。このエネルギーはまた、ｐＨの変化によっても影響される。我々はまた 、−酸化炭素で飽和したヘモグロビン（ＨｂＣＯ）がｐＨ７，５〜７．８におい て温度誘導性沈殿に耐性であることを見い出した。我々は、ｐＨ７，６〜７，８ において、カルボキン型のヘモグロビン１０ｇ／ｄｌの溶液を６０６Ｃ，９時間 の低温殺菌後、７０’Ｃで１時間低温殺菌すると、ヘモグロビンがほとんど変性 せずに、非ヘム蛋白質が沈殿することを見い出した。この方法によって調製され た溶液に非ヘム蛋白質が含まれていないことを、等電点電気泳動（ＩＥＦ）及び サイズ除去陰イオン交換ＨＰＬＣを用いて確認した。ＴＥＦのバンドの［にじみ 」がないこと、及び酸素運搬機能が保存されていること（酸素解離曲線、Ｐ５゜ 、ボーア効果）から、回収されたへモグロビンが変性していないことが示される 。 ウィルスの不活性化も、この精製工程の副産物である。実際、クロロホルム抽出 によって、血漿及び血清中の多くの脂質外被ウィルス、例えばＢ型及び非Ａ非Ｂ 型肝炎ウィルス、バクシニアウィルス、ポックスウィルスが不活性化しているこ とが見い出されている（フエインストン（Ｆｅｉｎｓｔｏｎ）ら、上述の文献） 。脂質を持たないウィルス（レオウィルス）もまた、クロロホルムによって一部 不活性化される。一方、６０°０１１０時間の低温殺菌によって、多くの非脂質 外被ウィルス及びヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）が不活性化されることが示さ れている（ニステップ（Ｔ、　Ｎ、　Ｅｓｔｅｐ）ら、上述の文献）。 グルタルアルデヒドによる重合は望ましくない効果を有するため、本方法におい てはアデノシンす′−三リン酸のジアルデヒド誘導体（０〜ＡＴＰ）を用いて、 ヘモグロビン分子を４量体の形で「安定化」させる方法を用いている。ＡＴＰ分 子は、プリン塩基（アデニン）、糖（Ｄ−リポース）及び三すン酸鎖の３つの基 本的な成分からなる。 ＡＴＰを過ヨウ素酸ナトリウムで酸化すると、リボース環が２’　、　３’シス 位で開環し、２’　、　３’ジオールが対応するジアルデヒドに変換される（ロ ア（Ｐ、　Ｎ、　Ｌｏｖｅ）ら、「過ヨウ素酸酸化アデノンン三リン酸及び関連 化合物の調製とその化学的性質（−Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｐｅｒｉｏｄａｔｅ−ｏｘｉｄｉｚｅ ｄ　ａｄ■獅盾唐奄獅■ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ａｎｄ　ｓｏｍｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｃｏｍｐｏｕ ｎｄｓ”、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ　Ｔ窒≠獅唐≠モ狽■ ａｎｓ、　Ｖｏｌ、７．　ｐａｇｅｓ　１１３１−１１３３．１９７９）Ｊ　） 。 ｏ−ＡＴＰのそれぞれのアルデヒド基はリジンのε−アミノ基と反応し、ノッフ 塩基付加化合物が生成する。 （Ｈｂ）−ＮＨ２＋　０ＣＨ−ＡＴＰ　→　（Ｈｂ）−Ｎ＝ＣＨ−ＡＴＰヘモグ ロビンの２．３−Ｄ　Ｐ　Ｇポケット（ヘモグロビン分子の、２．３−Ｄ　Ｐ　 Ｇと結合する領域）が、２つのリジンを含むため、ｏ−ＡＴＰを用いてこれらの 基を架橋させることができ、したがって分子を４量体の形で安定化することがで きる。三すン酸鎖が存在するためにこの反応の特異性が増加しており、このよう な特性はピリドキサール−５゛−リン酸等の、他のポリリン酸についても見られ る。他の化合物と比べてＡＴＰの利点はアデニン部分にある。インビボにおける 、ＡＴＰからＡＤＰ、ＡＭＰ、最終的にはアデノシンへの加水分解は、主に全身 及び肺の循ｍＪこおける血管拡張という有益な薬理学的効果を生じることが見い 出されている。さらに、ＡＴＰを塩化マグネシウム（ＭｇＣｂ）と組み合わせて 投与すると、出血ショック状態において有益な効果が示される。効果としては、 微小循環の改善、細胞膜機能の改善、及び細胞内アデニン核酸の回復における「 ブライミング」効果などがある（チャウトリ−（１，Ｈ，Ｃｈａｕｄｒｙ）　、 バラ（Ａ、　Ｅ、　Ｂａｕｅ）、［溶血シｉｉ＋−／りの概要（”Ｏｖｅｒｖｉ ｅｗ　ｏｆ　ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ　５ｈｏｃｋ”、　Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉ ｏｌｏｇｙ　ｏｆ　５ｈｏｃｋ、@ａｎ。 ｘｉａ　ａｎｃｌ　ｉｓｃｈｅｍｉａ、　Ｒ，Ａ、Ｃｏｖｌｅｙ　ａｎｄ　Ｂ、 Ｆ、Ｔｒｕｍｐ、　ｅｄｉｔｏｒｓ、　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　≠獅п@Ｗｉｌｋｉ ｎ ｓ、　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、　１ｌａｒｙｌａｎｄ、　１９８２゜ｐａｇｅｓ　 ２０３−２１９）　ｊ　）。 上述のように、ヘモグロビンとｏ−ＡＴＰとを架橋させるというこれまでの試み は、化学反応によって許容されないレベルのメトヘモグロビン（３０％まで）が 生じること、及び○−ＡＴＰ修飾ヘモク七ビンが依然として短い血管内寿命しか 有していないために成功しなかった。さらに、ＡＴＰは血管系の２価カチオンと 結合してキレートを生成するという望ましくない傾向を有している。 我々は、ｏ−ＡＴＰのオキシダント効果は化合物中に存在するヨウ化物（ＩＯ。 及び１０ｇ）の痕跡によるものであることを見い出した。実際、叶ＡＴＰを完全 に精製すると（実施例Ｉを参照のこと）、この問題は解決する。我々はまた、以 前に行われていたような、ｏ−ＡＴＰとデオキシ−Ｈｂとの反応ではなく、むし ろ０−ＡＴＰとカルボキシーＨｂ（−酸化炭素飽和Ｈｂ）との反応によって、メ トヘモグロビンの生成を最小限にすることができることを見い出した。我々はま た、溶液のｐＨが７．２０まで下がるとｏ−ＡＴＰとカルボキン−Ｈｂとの反応 が起こることを発見した。カチオンのキレート効果に関しては、我々は、ＡＴＰ と等モルの壜化マグネシウム（ＭｇＣ１□）を添加することによってこの問題が 解決されるという、チャウドリーとバラの報告（上記を参照）を確認した。しか し、短い血管内寿命という問題はまだ残っている。我々は分子内架橋した４量体 ヘモグロビンは、依然として腎臓の腎糸球体を通り抜け、胃管に障害を与えるこ とを見い出した。したがって、適当な血管的保持時間を達成するためには、ヘモ グロビンを分子内架橋とともに分子間架橋させることが必要である。 不発明においては、第２プリン誘導体、アデノシンのジアルデヒド誘導体、また は過ヨウ素酸酸化アデノンン（Ｏ−アデノシン）を第２架橋剤として用いる。ヘ モグロビン分子はその表面にリジンのアミン基を４４個有しているため、Ｏ−ア デノシンを用いて２以上のこれらの基を架橋し、２以上のヘモグロビン４量体を 架橋することができる。他の化合物に対する、アデノシンの利点はいくつかある 。策１に、アデニンが存在するために、アデノシンはＡＴＰと同様の血管拡張効 果を有する（スー（Ｃ，Ｓｕ）、「心臓及び血管における核酸の細胞外機能（” Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｏｔｊｄ ｅｓ　ｉｎ　ｈｅａｒｔ　ａｎｄ　ｂｌｏｏｄ　ｖｅｓｓｅｌｓ”、　Ａｎｎｕ ≠戟@Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、ｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　４７．　ｐａｇｅＳ　６６５−６ ７６、１９８５）　Ｊ　）　、さらに、アデノシンは血小板凝集を阻害し、かつ 、腎臓における腎糸球体濾過を改良し、これら２つの効果は出血後及び再潅流後 に有益である（バーン（Ｒ，Ｍ、　Ｂｅｒｎｅ）、「アデノシンの制御機能（Ｒ ｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ、　Ｍａ ｒｔｉｎ　Ｎ１ｊｈｏｆｆ　Ｐｕｂｌｉｓｈ■秩B Ｂｏｓｔｏｎ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｅｓ、　１９８３）　Ｊ　）　ｏ　 ヘモグロビンとＯ−アデノシンの反応は従来は知られていなかった。メトヘモグ ロビンの生成を抑制するために、カルボキン形のヘモグロビンを用いて反応させ ることもまた重要である。最後に、反応は４６Ｃにおいては非富にゆっくりと進 行し、所望の分子凝集が生成した後いつでも停止させることができる。この性質 によって、異なる分子量のへモグロビンポリマーを計画通りに、再現性よく調製 することが可能になる（これはグルタルアルデヒド等の他の架橋剤を用いた場合 にはできない）。ヘモグロビンとＯ−アデノノンの架橋反応は、リジンのように ε−アミノ基を有する還元グルタチオン（ＧＳＨ）を添加することによって停止 させることができる。ＧＳＨは、この反応に入ることによって、ヘモグロビン組 成物の一部になる。 ＧＳＨの選択は、この化合物が赤血球中に大量に存在し、かつ、赤血球中におけ るＧＳＨの第１の機能が「オキシダント・トラップ」として働き、ヘモグロビン をオキシダントの刺激から保護することである（ラーソン（Ａ、　Ｌａｒｓｓｏ ｎ）、「グルタチオンの機能（Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　に１ｕｔａｔｈｉｏ ｎｅ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ。 Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｃ１１ｉｃａｌ　Ａｓｐｅｃｔｓ、　Ｒ ａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８３）　S　、とい う知見に基づいている。我々は、ＧＳＨが溶液中と同様に赤血球環境においても ヘモグロビンを保護することを確認した。また、叶アデノンンと架橋した後にＧ ＳＨと反応させることによって、ヘモグロビン分子の表面の電気的陰性度が増加 し、ヘモグロビンの等電点が６．８から６，１〜６．２に減少することも見い出 した。このことによってヘモグロビンの安定性が高まる。すなわち、血管内寿命 が長くなり、腎臓からの濾過か防止される。 ｏ−ＡＴＰと０−アデノシンは市販されており（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ 　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ。 Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）　、また、下記に実施例Ｉ及び■として述べる方法によって 調製してもよい。還元グルタチオンは市販されている。 これらの反応及びカルボキンヘモグロビンからオキシヘモグロビンへの再変換の 後、新規化合物（Ｈｂ−ＰＰ−ＧＳＨ）を、塩化マグネシウム（ＭｇＣ１□）と マンニトールを強化した電解質平衡生理食塩水に溶解する。ＭｇＣ１，はＡＴＰ と等モル量を加える。このことは以下のようないくつかの有益な効果を有する・ 　（１）ＡＴＰの２価カチオンキレート効果を制御する：　（２）微小循環にお けるＡＴＰの有益な効果を補完する：　（３）過剰の塩素イオンを供給し、ヘモ グロビンの酸素親和性を下方調節する（高いＰ５゜値の維持に役立つ）。マンニ トールを少量加えるが、これはマンニトールがＯＨ・ラジカル（最も毒性の高い 酸素由来のフリーラジカル）及び、おそらくは他のランカルに対しても捕捉剤と して働くという知見（フリーマン（Ｂ、　Ａ、　Ｆｒｅｅｍａｎ）　、クラポ（ Ｊ、　Ｄ、　Ｃｒａｐｏ）、「フリーラジカルと組織障害（’Ｆｒｅｅ　ｒａｄ ｉｃａｌｓ　ａｎｄ　ｔｉｓｓｕｅ　１ｎｊｕｒｙ”、　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏ氏A　Ｖ ｏｌ、　４７．　ｐａｇｅｓ　４１２−４２６．１９８２）　Ｊ　）に基づいて いる。 本発明の目的は、人工血液として有用な、すなわち、（ａ）血漿量を維持、回復 することができ、（ｂ）生体器官に酸素を供給することができ、（Ｃ）出血後の 血管収縮を弛緩させることのできる、化合物を提供することにある。 さらに本発明の目的は、毒性のない人工血液を提供することにある。 本発明のその他の目的は、ヘモグロビンから人工血液を調製する方法を提供する ことにある。 本発明のその他の目的、特徴、及び利点は、後述する本発明の好ましい具体例の 詳細な説明によって明らかとなるであろう。 図面の簡単な説明 図１は、サイズ除去カラムを装着したＨＰＬＣによって得られた純粋ウシヘモグ ロビンのスペクトル分析を示す。クロマトグラムは、９．４分のところに単一ピ ークを示し、これは４量体ヘモグロビン（６４，０００ダルトン）と同定された 。 図２は、ＤＥＡＥカラムを装着したＨＰＬＣによって得られた純粋ウシヘモグロ ビンのスペクトル分析を示す。クロマトグラムは、２０から３６分の間に複数の ピークを示し、これは等電点の異なる様々なヘモグロビン成分に対応する。 図３Ａ−Ｂは、低温殺菌による精製の前（３Ａ）及び後（３Ｂ）のウソヘモグロ ビンのスペクトルインデックスを示す（ＤＥＡＥカラム付きＨＰＬＣ，スペクト ル波長２３０−５９９ｎｍ）。図３Ａにおいては、保持時間１７分と５１分に、 非ヘム蛋白質が見られる。図３Ｂにおいては、非ヘム蛋白質はもはや見られない 。 図４は、叶ＡＴＰで分子内架橋し、０−アデノシンで分子間架橋し、還元グルタ チオンと結合させたウシヘモグロビンを、ＨＰＬＣサイズ除去カラムによるスペ クトル分析を示す。クロマトグラムは、凝集ヘモグロビンの６つのピークを示す 。 図５は、図４と同様に修飾したウソヘモグロビンの、ＨＰＬＣ−ＤＥＡＥカラム のスペクトル分析を示す。タロマドグラムは、保持時間５１分のところに単一ピ ークを示す。ヘモグロビンの等電点は、表面の負電荷の増加によってシフト（修 飾していないヘモグロビンと比べて）している。 図６は、等電点電気泳動（ＩＥＦ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）による実験を示す。 図７は、セファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ　）カラムから水で溶出された、ｏ −ＡＴＰと過ヨウ素酸ナトリウムとの反応混合物の連続分画の、２５８止におけ る吸光度を示す。 図８は、陰イオン交換カラムから溶出剤Ａで溶出された、０−アデノシンと過ヨ ウ素酸ナトリウムとの反応混合物の連続分画の、２５８ｎｍ及び２３２ｒ＋ｍに おける吸光度（実施例１） 本発明による複合製品の好ましい調製工程は、次の５段階からなる。（Ａ）赤血 球の精製、（Ｂ）ヘモグロビンの抽出：　（Ｃ）ヘモグロビンの精製：　（Ｄ） ヘモグロビンの修飾（ｏＡ　Ｔ　Ｐ　ＳＯ−アデノシン、及びグルタチオンとの 反応）；（Ｅ）最終生成物（Ｈｂ−ＰＰ−ＧＳＨ）ｎの調製。 Ａ　赤血球の精製 上述の理由により、好ましい出発材料はウシ血液である。しかし、この調製方法 は、ほかの哺乳類（ヒトも含む）の血液を出発物質とした場合にも用いることが できる。ウノ血液は、多数の健康なドナーから、または屠殺場に出された個々の 動物から得ることができた。前者の場合には、成熟雌牛を拘束して首の毛を剃り 、防腐性石鹸で皮膚を処理した。血液は無菌条件下で外頚静脈に穿刺して吸引し た。１頭の動物から約１．５００ｍ１の血液が得られ、これをＡＣＤ抗凝集剤２ ０ｋｌ　（Ｖｉｒｂａｃ、　Ｉｎｃ、　Ｌｅｎｅｘａ、　Ｋａｎｓａｓ）の入っ た無菌無発熱性物質の、２１の空の瓶に集めた。後者の場合には、動物を屠殺す る前に気絶させ、首の片側を速やかに「用意」し、頚動脈にドローカーを経皮的 に挿入した。それぞれの成人雌牛から約１０１の血液を除去することができた。 異なる動物から得た血液は混合しなかった。 実験室までの運搬中、瓶は水中に保った。 特にウノ血液から出発する場合に重要なことは、赤血球（エリスロサイト）を白 血球（ロイコサイト）、血小板及び血漿から完全に分離することである。この工 程によって、最終的にヘモグロビンの精製のために除去する必要のある非ヘム蛋 白質及びその他の物質の負荷を減少させることができる。また、すべての白血球 を除去することによって、白血球、特にリンパ球に付随するウィルス（サイトメ ガロウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、その他）を除去することができる。 赤血球は「スピン・クール・フィルタ刊法ｊ二よって精製した。「スピンＪ工程 は、閉鎖系においてＤＩＤＥＣＯシステム（Ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｄｉｃｓ　Ｉｎ ｃ、、　Ｅｎｇｌｅｖｏｏｄ、　Ｃｏ１ｏｒａｄｏ）等の血液銀行用細胞分離機 を用いた多段階の遠心分離からなり、次のような方法で行った。 １、１．１１００ｒｐ、１５°Ｃｌ２Ｏ分の遠心分離によって、血小板と血漿と を除去した。 ２、４．５００ｒｐｍ、１５°Ｃ１１０分の遠心分離によって、血漿をさらに完 全に除去した。 ３、等張生理食塩水（赤血球　生食＝１：４）で、４．１１００ｒｐ、４°ＣＸ １０分間洗浄した（４回）。 ４、等張サム溶液、ｐＨ８，１〜８．２　（Ｔｈａｗ　ＵＳＰ、Ａｂｂｏｔｔ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈｉｃａｇｏ、　ｌ１ｌｉｎｏｉ ｓ）を用いて最終洗浄を行った。この工程によって、洗浄赤血球の懸濁液は、ヘ モグロビンを酸化から保護する、無電解質高ｐＨ溶液となった。 「冷却」工程においては、赤血球は「トランスファーパック（無菌無発熱性物質 のプラスチック容器（Ｆｅｎｗａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｄｅｅｒｆ ｉｅｌｄ、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ）　Ｊにおいて、４°Ｃで一晩もしくは１８時間 、放置した。低温において、白血球は凝集して小さな固まりを形成する傾向にあ る。「濾過」工程においては、２ｏｌ１１＆の「高容量輸血フィルター（ｈｉｇ ｈ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　ｆｉｌｔｅｒ、Ｆｅｎｖａ１ 社製）」等のセルロースフィルターに細胞を通して、白血球凝塊を除去した。 白血球と血小板がないことを確認するために、コールタ＝（Ｃｏｕｌｔｅｒ）細 胞計数器を用いて細胞数を計測し、通常の化学的方法によって、懸濁液に蛋白質 が存在しないことを確認した。細菌性内毒素は、「定量的色原体リムルステスト （ＱＣＬ−１０００，ｆｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｗａｌ ｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）　Ｊを用いて検出した。 Ｂ、ヘモグロビンの抽出 赤血球からのヘモグロビンの抽出は、２段階で行った。最初に等張サム溶液（ｐ Ｈ８，１〜８．２）　Ｉ：：２０％の濃度で（ヘマトクリッｌ−０，２０）懸濁 した赤血球１１を、「タロスフｏ　ｒｌ　（Ｋｒｏｓｆｌｏ　Ｉ［Ｆｉｌｔｒａ ｔｉｏｎ　Ｍｏｄｕｌｅ　ｗｉｔｈ　１０　Ｆｔ”　５ｕｒｆａｃｅ　Ａｒｅａ 、　lｉｃｒ。 ｇｏｎ、　Ｉｎｃ、、　Ｌａｇｕｎａ　Ｈｉｌｌｓ、　Ｃａｌｉｆｏｒｍｉａ） 　Ｊ等の、孔径０．２Ｏｎの人工腎臓を用いて、１０１の低張（２３ｈＯｓｍ／ Ｌ）サム溶液に対して透析した。透析は透析液が赤い色（ヘモグロビン色）を呈 するようになるまで行った。このとき、赤血球は球形に膨潤し、細胞膜が引き伸 ばされてヘモグロビンが透過できるようになった。第２段階として、人工腎臓に １０ｐｓｉ　（０，７ｋｇ／ｃｍ２）の圧力をかけ、細胞膜を破壊することなく ヘモグロビンを細胞から絞り出した。「ゴースト」膜は、１工程を終えた後、廃 棄した。ヘモグロビンが低張溶液リザーバーに入るため、２３０ｍ０５ｍルのサ ム溶液を加えることによって赤血球リザーバーの容量を維持した。抽出されたヘ モグロビンは、「ポジダインＩＶフィルター（Ｐｏｓｉｄｙｎｅ　ｒ、　Ｖ、　 Ｆｉｌｔｅｒ、　ＰＡＬＬ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｃ、、　Ｆａｊａｒｄ ｏ、　Ｐｕｅｒｔｏ　Ｒｉｃｏ）　Ｊ等の０．２０＝ｍのフィルターを用いて濾 過して残った粒子残骸と汚染微生物を除去し、「トランスファーパック」におい て、４°Ｃで保存した。 この工程の結果、ヘモグロビン溶液は３〜５　ｍｇ／ｄｉのリン脂質（リン脂質 テストキット（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｈｅｉｍ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ 、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　Ｉｎｄｉａｎａ）を用いて測定）と、痕跡量 のアミノリン脂質Ｐ　Ｅ及びＰＳ（薄層り；マドグラフィーを用いて測定）を含 んでいた。 Ｃ，ヘモグロビンの精製 ヘモグロビンの精製は、次の４段階で行った。 １、カルボキン型ヘモグロビン（ＨｂＣ○）の低温殺菌この操作は「マイクロリ フト・バイオリアクター（Ｍｉｃｒｏｌｉｆｔ−１５１ｉｔｅｒ　５ｔｅｒｉ１ ｉｚａｂｌｅ−ｉｎ−ｐｌａｃｅ　ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ　Ｗｉｔｈ　ＮＢＳ　 Ｍｏｄｅｌ　ＭＬ−４１００Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｙｓｔｅ香A　Ｎｅｗ　Ｂ ｒｕｎｓｖｉｃｋ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ、、　Ｅｄｉｓｏｎ、　Ｎｅｗ 　Ｊｅｒｓｅｙ）　Ｊ等の、無菌無発熱性物質の生物反応層の中で行った。これ は気体と液体の入り口が複数あり、サンプリング用の口と撹拌器を有し、温度制 御のできる閉鎖系容器である。このバイオリアクターを、排気「ヒユームフード 」の下に設置した。ゆっくりと撹拌しながら無菌ガスを７６ｈｄｇ、４°Ｃで連 続フラッシングすることによって、ヘモグロビンを一酸化炭素（純度９９．９９ ％、Ｃｒｉｏｇｅｎｉｃ　Ｒａｒｅ　Ｇａｓ　Ｃｏ、　、　Ｈａｎａｈａｎ、　 ５ｏｕｔｈ　Ｃａｒｏｌｉｎａ）で飽和させた。総飽和度はコオキシメーター（ Ｍｏｄｅｌ　２８２．　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ、　Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて確認 した。この工程には約１５分間を要した。溶液は、７６ｈｍＨｇのＣｏ中に放！ した。次に、バイオリアクターを４°Ｃから６０°Ｃへと徐々に昇温し、その温 度において９時間放置し、その後１時間かけて７０６Ｃに昇温することによって 、低温殺菌を行った。その後、温度を徐々に４°Ｃまで下げた。 ２　クロロホルムとともに遠心分離 この工程のために、ヘモグロビン溶液を０，２０μ篇のフィルターを用いて濾過 し、２５０ｍ１の無菌無発熱性物質の、適当な蓋で７−ルされた遠心管（クロロ ホルム、蛋白質、７／ｌ／：ｌ−ルニ耐性の「ボリア０７−Ｊ遠心管（Ｓｏｒｖ ａｌｌ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｄｕ　Ｐａｎｔ　Ｃｏ、、　ｆｉｌｍｉｎｇｔｏ ｎ、Ｄｅｌａｗａｒｅ）に入れた。 ツルポール遠心分離機（Ｓｏｒｖａｌｌ、　Ｍｏｄｅｌ　０ＴＤ７５Ｂ）により 、ＴＦＡ２０．２５０のローターを用いて、以下のようにして３回の遠心分離を 行った。 ａ、１５：１の割合（遠心管１本あたり、ヘモグロビン２３２ｍ１、クロロホル ム１８０１）でヘモグロビンとクロロホルムを混合し、７６０ｘｇ、４°Ｃ１３ ０分の遠心分離を行った。上清を、層流フードにおいて、無菌無発熱性物質の管 とペリスタポンプを用いて次の遠心管に移した。 ｂ、１６・１で混合したヘモグロビンとクロロホルムを、１．６００ｘｇ、４° Ｃ１１５分間、つづいて３．８００Ｘｇで１５分間、遠心分離した。上清を第３ の遠心管に移した。 Ｃ，クロロホルムを加えずに、６１．、４００Ｘ　ｇで６０分間遠心分離した。 ３回目の遠心の後、ヘモグロビン溶液を１．００軸１の、無菌無発熱性物質の、 撹拌子の入った減圧排気した管（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に 移し、ゆっくりと撹拌しながら４°Ｃ，２時間、無菌ＣＯガスをフラッシングす ることによって、残っている痕跡量のクロロホルムを溶液から除去した。 この工程に用いたクロロホルムは、ＵＶカットオフ２４４ｎａのＨＰＬＣグレー ドのもの（Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｔｉｃ　Ｃｏ、、　Ｆａｉｒ　Ｌａｗ ｎ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）であった。遠心管は次の処理を施すことによって 再使用できる：　（ａ）　Ｅ−ＴＯＸＡクリーン石鹸（Ｅ−ＴＯＸＡ−Ｃ１ｅａ ｎ　５ｏａｐ、　Ｓｉｇｏａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　；　（ｂ）　１９０プル ーフ（９５％）のエタノール。 （Ｃ）１２０°Ｃ１８０分間の滅菌。 二の一連の遠心分離によって、すべてのリン脂質のみならず、前工程の低温殺菌 において変性して沈殿した非ヘム蛋白質をも、精製ヘモグロビンから除去するこ とができた。 ３．内毒素アフィニティ・クロマトグラフィー・カラムによる濾過ヘモグロビン 溶液を、ブトキンゲルカラム（Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ　ｃｏｌｕ＋ｓｎ、　Ｐｉ ｅｒｃｅ　Ｃｈｅｗｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ｌ１ｌｉｎｏｉ ｓ）等のアフィニティータロマドグラフィー・カラムを用い、入り口と出口に「 トランスファーバック」とペリスタポンプを用いて閉鎖系を形成したカラムで濾 過した。この工程はクラス１００の層流フードにおいて行った。 この工程によって、内毒素の濃度を、２．０−２．５　ＥＵ／ｍｌから０．１０ 　ＥＵ／ｍ１未満に減少させることができた。 ４　透析 ヘモグロビン溶液を、サム溶液によってｐＨ７，２０に調整した無菌無発熱性物 質の脱イオン水に対して１．１０の割合で透析した。透析は、ｒ９０ｓｃＥ−人 工腎臓（Ｃ−ＤＡＫ　Ｃｏ、、　Ｍｉａｍｉ　Ｌａｋｅｓ、　Ｆｌｏｒｉｄａ） 　Ｊ等の、６．０００ダルトンの孔径を有する人工腎臓を用いて行った。この工 程によって、（ａ）小さい分子が除去され、（ｂ）ヘモグロビンの濃度は１０ｇ ／ｄｌとなり、（Ｃ）ヘモグロビン溶液のｐＨが約８２から約７．２に下がった 。 工程中のこの時点において、「純粋な」ヘモグロビンが生成し、すなわち、（ａ ）細菌性内毒素、（ｂ）ストローマ性脂質とリン脂質、及び（Ｃ）非ヘム蛋白質 、を全く含まないヘモグロビンが得られた。また、工程の様々な点で、０．２０ μ菖のフィルターを用いた濾過を繰り返すことによって、汚染微生物をすべて除 去したことが期待され、一方、低温殺菌とクロロホルム処理によって、非脂質及 び脂質外被ウィルスを不活性化させたことが期待される。さらに、ヘモグロビン をカルボキン型で用いることにより、酸化を低く抑えた精製（１〜２，５％の５ ｅｔ−Ｈｂが生成）が可能になった。 Ｄ　ヘモグロビンの修飾 ヘモグロビンとｏ−ＡＴＰ、ｏ−アデノノン、及び還元型グルタチオンとの反応 は、以下のようなバイオリアクターを用いて行った。サム溶液でｐＨを７２０に 真！した水に、カルボキノ型のヘモグロビンをＩＯｇ／ｄｉとなるように懸濁し 、これを再びバイオリアクターに導入して、１気圧の一酸化炭素下で、ゆっくり と撹拌しなが特表子５−５０４７６６　（７） ら４″Ｃに保った。 実施例■に従って調製し、粉体形で保存した。−ＡＴＰを、ｐＨを７．２０に調 整した無菌無発熱性物質水に溶解し、これをただちに、Ｈｂ：ｏ−ＡＴＰのモル 比が１：３となるようにヘモグロビン溶液に加えた。４°Ｃ，ＣＯ存在下で、１ ５０ｒｐｍで撹拌しながら２４時間反応させた。溶液のサンプルを６時間ごとに 採取し、ヘモグロビンの分子量の増加をサイズ除去カラムを装着したＨＰＬＣに よって、電荷の変化を陰イオン交換カラムを装着したＨＰＬＣによって、それぞ れ測定した。測定には、ウォーターズ４ａｔｅｒｓ）のＨＰＬＣシステム（ｆａ ｔｅｒｓ　６００Ｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ、　Ｗａｔｅｒｓ　 ７１２１ｎｊｅｃｔｏｒ、　ｆａｔｅｒｓ　９９０　Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ　Ｄ ｅｔｅｃｔｏｒ及びＩＩＥｃ@Ｐｏｗｅ ｒ　Ｍａｔｅ　２　ｃｏｍｐｕｔｅｒからなる）を用いた。サイズ除去カラム（ Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐａｋ　３００　ＳＷ）及び陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥ− ５ＰＩ）もまたウォーターズ（ｆａｔｅｒｓ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　 Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏ、　、輩１１ｆｏｒｄ、　Ｍａ ｓｓａｔｕｓｅｔｔｅ）より入手した。 架橋の理想的な条件は約２４時間後に生じ、このとき陰イオン交換ＨＰＬＣの実 験によって９０〜９５％のｏ−ＡＴＰが化学反応に用いられた二とが示された。 この結果、次の各成分からなる分子凝集体が生成した。

【表１】 分子量（ｋダルトン） １　ヘモグロビン４量体　６４７０％ ２　ヘモグロビン８量体　１３０　２１％３、　ヘモグロビン１２量体　１９５ ８％すなわち、この反応の条件下では、ｏ−ＡＴＰは王に分子内架橋を生成する が、一部に分子間架橋も生成する。しかし、このことによって以下の反応は阻害 されなかった。 ２４時間後、実施例■に従って２１製し、粉体形で保存したＯ−アデノシンを、 サム溶液によってｐＨ７，２０に調整し、エタノール数滴を加えた滅菌水に溶解 した。この化合物をヘモグロビン溶液にＨｂ・０−アデノシンのモル比が１・５ になるように加え、同じ条件下でさらに２４時間反応を続けた。この時点で、第 ２回分の０−アデノシンを同じモル比１５で加え、さらに２４時間反応させた。 ＨＰＬＣを用いてサンプルを測定し、ヘモグロビン４量体のレベルが７０から３ ０％に低下した時に反応を停止させた。反応がこの点をはるかに越えて進行する と、サイズの大きすぎるポリマーが生成する。次に、サムを加えた水（ｐＨ７， ２０）に溶解したＧＳＨをヘモグロビン溶液に、Ｈｂ・ＧＳＨのモル比が１２０ となるように加え、１６時間反応させた。 この時点で、ヘモグロビンの分子凝集体は、以下に示すものであった。

【表２】 分子量（キロダルトン） １、　ヘモグロビン４量体　６４３０％２、　ヘモグロビン４量体　Ｘ　２　１ ３０　２０％３、　ヘモグロビン４量体　Ｘ　３　１９５　２０％４　ヘモグロ ビン４量体　×４〜Ｘ　６　２５６−３９０　３０％この凝集体は、ＨＰＬＣ− ＤＥＡＥにおいて、５０−５１分に単一ピークを示した。 これらの化学反応の最後に、４６Ｃで、穏やかに撹拌しながら、滅菌した酸素を ３５ｐｓｉ　Ｃ２，５ｋｇ／ｃｍ”）繰り返しフラノノングし、同時に「タイプ ４０５１モルクォーツ（−ｍｏｌｅｑｕａｒｔｓ−９Ｍｏｌｅ−Ｒｉｃｈａｒｄ ｓｏｎ　Ｃｏ、、　ｌ１ｏｌｌｙｖｏｏｄ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）　Ｊと接 続■■ 「クォーツライン・ランプ（”ｑｕａｒｔｚｌｉｎｅ　ｌａｍｐ”、　ＤＷＹ、 　１２０Ｖ、　６５０１．　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｅｌｅｃｔｒｊｃ　Ｃｏ、、　Ｃ １ｅａｖｌａｎｄ、　０ｈｉｏ）　Ｊを用いて、強い光を２０秒のノくルスで照 射し、ヘモグロビンをカルボキシ型からオキシ型へ再変換させた。このヘモグロ ビンの再酸化反応はＩＬコオキシメーターを用いて確認した。 モグロビン凝集体の分子量分布は以下の通りであった。

【表３】 分子量（ダルトン） ヘモグロビン４量体　６４．０００　５％ヘモグロビン４量体　Ｘ　２　１３０ ．０００　１８％ヘモグロビン４量体　Ｘ　３　１９５．０００　２０％ヘモグ ロビン４量体　Ｘ　４　２６０．０００　３Ｑ％ヘモグロビン４量体　ｘ　５　 ３２５．０００　１６％ヘモグロビン４量体　ｘ　５　３９０．　（１００１０ ％したがって、最も多い分子種は、４つのヘモグロビン４量体からなり、分子量 ２６０、０００ダルトンのものであった。この凝集体は、ＨＰＬＣ−ＤＥＡＥに おいて５０−５１分に単一ピークを示し、これは等電点が６．８から６１に変化 したことを示す。 廃棄されたヘモグロビンを含む透析液は、６．０００ダルトンの人工腎臓（９０ ５ＣＥａｒｉｉｆｉｃｉａｌ　ｋｉｄＯｎｅｙ、　Ｃ−ＤＡＫ　Ｃｏ、　）を用 いて透析することによって、ヘモグロビン濃度を１０ｇ／ｄｌまで濃縮し、０− アデノシンとの分子間架橋に再利用することができる。 この最後の形態における修飾ヘモグロビンを、ノルモゾールＲ（Ｎｏｖ＋ｍｏｓ ｏｌ　Ｒ。 ｐＨ７，４）　、に１０ｇ／ｄｉの濃度で溶解した。この溶液にＡＴＰと等モル の塩化マグネシウム（ＭｇＣ１ｉ）　（Ｍａｔｈｅｓｏｎ　Ｃｏｌｅｍａｎ　＆ 　Ｂｅ１１．　Ｎｏｒｖｏｏｄ、　０ｈｉｏ）を加えた。コノ溶液にマンニトー ル（ＧＩＢＣＯ−Ｄｅｘｔｅｒ　Ｃｏ、、　Ｃｈａｇｒｉｎ　Ｆａｌｌｓ、　０ ｈｉｏ）を２国ｇ／ｌ１１１となるように加えた。 （実施例■） この新規製品の特性は次のようにして測定した。ヘモグロビン、メトヘモグロビ ン、及びカルボキンヘモグロビンの濃度は、コオキシメーター（Ｍｏｄｅｌ　２ ８２　Ｃ。 ｏｓｉＩｌｅｔｅｒ、　Ｉｎ５ｔｒｕｏｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ、　Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、　１ｉａｓｓａｃｈｕｓｅ狽狽刀jによっ て測定した。溶液の電解買濃度及び浸透圧は、Δ５ＴＲＡ装！（Ｂｅｃｋｍａｎ 　Ｃｏ、、　Ｐａ１ｏ＾ｌｔｏ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を用いて測定した。 膠實浸透圧はウニイルオンコメ−ター　（Ｖｅｉｌ　ｏｎｃｏｍｅｔｅｒ、　Ｉ ｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて測定した 。粘度は、ブルックフィールド粘度計（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅ ｒｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ、　Ｍａｓｓａｃ ｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、３７″Ｃにおいて、剪断速度１００／ｓで測定した 。その他の蛋白質、リン脂質、細菌性内毒素に対するヘモグロビンの純度は、前 述のようにして評価した。酸素結合容量は、ヘモグロビン濃度とコオキシメータ ーによる酸素容積から計算した。ヘモグロビン・酸素解離曲線は、ヘム−０−ス キャン装置ｆ（■ｅＩ１１−０−３ｃａｎ、乳Ｍ　Ａｍ１ｃｏ、　Ａｍｅｒｉｃ ａｎ　Ｉｎ５ｔｒｕ＋ｏｅｈｔｓ、　５ｉｌｖｅｒ　ＳｐｒｉｎｇAＭａｒｙｌ ａ ｎｄ）によって得た。ＰＳＯ値は、標準状！！（温度３７°Ｃ，ｐＨ７，４０， １）ＣＯ２４，０ｔｏｒｒ）　ｉ：おける解離曲線からめた。リン酸濃度の分析 は、フィスケ（Ｆｉｓｋｅ）とスバロウ（Ｓｕｂｂａｒｏｖ）の方法（Ｊｏｕｒ ｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｖｏｌ、　６６ 、　ｐａｇｅｓ　R７ ５−３８０．１９２５）に従って行った。ＧＳＨ濃度は、リード（Ｒｅｅｄ）ら の方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｖｏｌ、　１０ ６．　ｐａｇｅｓ　５５−６２．１９８０）に従って決定した。アデノシンはＨ ＰＬＣを用いて測定吸光度２５８止で測定し、入光量とヘモグロビンに取り込ま れた光量から計算した。ＡＴＰは、リン酸の測定から計算した。 ここで特性を測定した製品は、（Ｈｂ−ＰＰ−ＧＳＨ）ｎ、（ただし、Ｈｂは精 製ウノヘモグロビン、ＰＰは２つのプリン誘導体、すなわち、叶ＡＴＰ及び０− アデノシンであり、ＧＳＨは還元グルタチオンである。）と同定された。基本分 子は図１おび図２に示すヘモグロビン４量体である。図３に、他の蛋白質からの 精製を示す。この化合物には、ヘモグロビン１ｍＭに対し１．Ａ　Ｔ　Ｐ　１． ０５ｍＭ、アデノシン１０ｄＳＧＳＨ７ｍＭが含まれていた。調製の過程におい て様々な間隔でこの化学組成とＨＰＬＣ分析を行ったところ、ｏ−ＡＴＰは主と してヘモグロビンの分子内架橋に関与し、一方、０−アデノシンは分子間架橋を 形成した。さらに、０−アデノシンはＧ３８分子をヘモグロビンに繋ぐアンカー となった。この化合物を図４及び図５に示す。ＨＰＬＣサイズ除去によるスペク トル分析（図４）によって、この化合物が６つの分子種からなることが示された 。

【表４】 １、Ｈｂ（４量体）　＝　く５％ ２、（Ｈｂ）！　＝　１８％ ３、（Ｈｂ）ｇ　＝　２０％ ４、（Ｈｂ）、　＝　３０％ ５、（Ｈｂ）ｓ　＝　１６％ ６、（Ｈｂ）ａ　＝　１０％ これらのうちで、（Ｈｂ）　４、すなわち４量体４つの凝集体が主要分子種であ った。ＨＰＬＣ−ＤＥＡＥカラムによる分析（図５）は、５０−５１分に単一ピ ークを示し、このことは、この化合物が均一な、還元型の（修飾していないヘモ グロビンに対して）等電点を有していることを示している。等電点電気泳動によ る分析（図６）は、これらのヘモグロビン修飾を別の観点から示している。 サム溶液によってｐＨ７，４に調整した電解質平衡生理食塩水に対して透析し、 さらにＭｇＣ１□とマンニトールを添加した後の最終的なヘモグロビン溶液は、 以下の表に示す組成を有していた。 大気に接触したヘモグロビン溶液は、Ｌｏｇ／ｄｌの濃度において１３容量％の 酸素を運搬し、このことは酸素結合容量がほぼ１００％（ヘモグロビン１ｇあた り１．３容量の酸素）であることを示した。高い塩素濃度による重合にもかかわ らず、この溶液のＰ５゜値は高かった（〜２ｇｍｄｇ）。浸透圧は、血漿より高 く、粘度は全血より低かった。ヘモグロビンの濃度が高い（アルブミンと比較し て）にもかかわらずコロイド浸透圧は血漿より低かった。これはヘモグロビンが 重合しており、ヘモグロビン粒子の数が減少しているという事実のためである。

【表５】 ヘモグロビン溶液（最終製品）の特性 １、　ヘモグロビン（ｇ／ｃｌｌ）　１０．０　±０５２、　ＩＩｅｔ−Ｈｂ　 （Ｈｂに対する％）３．５　±０．５３　カルボキノ−Ｈｂ　（Ｈｂに対する％ ）１．５　土０，５４、　ｐＦ（（単位）　７．４０ ５　ナトリウム（ｍＥｑ／Ｌ）１４０　±２．０６　カリウム（ｍＥｑ／Ｌ）　 ４．０　±０．５７、マグネシウム（ｉｎ／　１モルＨｂ）　０．８　±０．２ ８、　塩化物（ｍＥｑ／Ｌ）　１２０　土５．０９、マンニトール（ｍｇ／ｄｌ ）　２００　土５０１０　コロイド浸透圧（ｍｍＦＪｇ）　２２　ｆ　２．０１ １　粘度（ｃＰ）　１．７４±０．０４１２　浸透圧（ｍＯｓａ＋ル）　３２５ 　”１０１３　非ヘム蛋白質　検出せず １４　ストローマ性リン脂質及び脂質　検出せず１５、　細菌性内毒素　検出せ ず １６、　無菌性　無菌 １７、−６０°Ｃにおける安定性　無限界（実施例■） ０−．６１７Ｐの大量調製 ｏ−、ＡＴＰの基本的調製法は従来から知られている（イースターブルック・ス ミス（Ｓ、　Ｂ、　Ｅａｓｔｅｒｂｒｏｏｋ−３ｍｉｔｈ）ら、「ピルビン酸カ ルボキシラーゼ（”Ｐｙｒｕｖａｔｅ　Ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ：　Ａｆｆｉｎ ｉｔｙ　ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｇｎｅｓｉｕｍ　ａｄｅｎｏ ｓｉｎｅ　ｔｒｉｐｈ盾唐垂■≠狽■@ｂ ｉｎｄｉｎｇ　５ｉｔｅ”、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ、　６２．　ｐａｇｅｓ　１２T−１３０゜ １９７６）Ｊを参照のこと）。 大量の材料を製造し、ヘモグロビンとの十分な化学反応を確実にするために修飾 を行った。 アデノシン−５−三リン酸二ナトリウム塩水和物（ＡＴＰ、　Ｆ、ｊ５５１．１ ５）及び過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯｓ、純度９９％、Ｆ、　ｖ、　２１３ ．８９）はアルドリッチ社（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ＋＊ｐａ ｎｙ、　ｌ１ｉｌｖａｕｋｅｅ、　ｆｉｓｃｏｎｓｉｎ）より入手した。１０本 の１２ｈｌセファデックスＧ−１０カラムはファルマンア社（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｐｉｓｃａｔａ冒ａｙ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒ ｓｅｙ）より入手した。１本のカラムにつき、サム溶液を用いてｐＨ７，０（０ °Ｃ）に調整した無菌無発熱性物質の水（注射用水、＾ｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ）　１５１１１に、５５０ｍｇのＡＴＰを溶解して用いた。過ヨ ウ素酸ナトリウムをＡＴＰ・Ｎ　ａ　Ｉ　Ｏ４のモル比が１１．１となるように 加え、４°Ｃで暗所に１時間放置した。 エチレンクリコールをＡＴＰ　エチレングリコールのモル比が２：ｌとなるよう に、１５分間かけて加えることによって、反応を停止させた。反応混合物を４° Ｃにおいて、あらかじめ注射用水で平衡化したセファデックスＧ−１０カラムに かけた。 カラムは２００＋ｎｌの水で溶出した。核酸のピークの前半（図７の分画２０か ら３０）を集め、ただちにラブコンコ凍結乾燥システム（Ｌａｂｃｏｎｃｏ　Ｆ ｒｅｅｚｅ−Ｄｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｗｉｔｈ　Ｓｔｏｐｐｅｒｉｎｇ　Ｔｒａ ｙ　Ｄｒｙｅｒ、　Ｌａｂｃｏｎｃｏ　Ｃｏ、、　Ｋａｎｓａｓ　Ｃ１ｔｙ、　 ｌ１ｉｓｓｏｕｒｉ）をpＬ＼て、 −４０’Ｃ，＜１０μＩ１ｇで凍結乾燥した。得られた粉体は、使用するまで一 ９０°Ｃにおいて褐色瓶にて保存した。 ｏ−ＡＴＰの濃度は、２５８ｎａ＋の吸光度を測定してめ、過ヨウ素酸の存在は 、２３２ｎｍの吸光度を測定してめた。カラムは再使用の前に、注射用水を用い て４°Ｃで３０時間洗浄し、流出物が２３２止において００４３未満の値を示す まで、すなわちすべての過ヨウ素酸が流出するまで、洗浄した。 本発明においては、次の２つの処置が重要である。（１）ｏ−ＡＴＰを含み過ヨ ウ素酸の痕跡を含まない分画のみを集めること、（２）これらの分画をただちに 凍結乾燥し、−９０°Ｃで凍結すること。これらの処置によって、化学反応によ るヘモグロビンの酸化を防止することができる。 （実施例■） 及びコーン（ｆ、　Ｅ、　Ｃｏｈｎ）、「過ヨウ素酸酸化核酸の特性化といくつ かの化学反応（”Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｓｏｍｅ　ｃ ｈｅ＋ｎ１ｃａｌ　ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｐｅｒｉｏｄａｔｅ−ｏ■奄р 奄嘯■п@ｎ ｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｓ＋ｅｒｉｃａｎ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、Ｖｏｌ。　８２．　ｐａｇ■刀@６３８０−６ ３８６．１９６０）　Ｊを参照のこと）。大量の材料を製造し、ヘモグロビンと の十分な化学反応を確実にするために修飾を行った。 純度９８％（７）７デノ７ンはノグマ社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ 、　）　、過ヨウ素酸ナトリウムはアルドリッチ社（Ａ］、ｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅ ｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）より入手した。６ｇのアデノシンを室温で３０分間、１ ５０ｍＭＮａ　Ｉ○４水溶液２００膳１のに溶解した。この溶液を、あらかじめ ２０ＩＤＭ酢酸（Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｕｃ　Ｃｏ、　）で平衡化し た３００ｍ１の陰イオン交換樹脂（ＡＧＩ−Ｘ−８、［０−２００メツ／ユ、酢 酸形）のカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｂｍｏ ｎｄ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）に通した。このカラムを２１の溶出液Ａを用い 、流速１５ｍ１／ｗｉｎ、温度４６Ｃで溶出し、１５ｈｌの分画を得た。分画２ 〜１５を集め（図８に示す）、ｏ−、ＡＴＰと同様にただちに凍結乾燥し、凍結 した。 再使用の前には、６１の１００ｍＭ塩化アンモニウム（溶出液Ｂ）をカラムに通 し、すべての過ヨウ素酸を解離させた。分画中の過ヨウ素酸の濃度は、２３２ｒ ＋ｍの吸光度を測定してめた。この後、カラムを６１の注射用水で洗浄し、２０ ｍｊｌの酢酸で平衡化した。 本発明の目的には、次の２つの処置が重要である。（１）Ｏ−アデノシンを含み 、過ヨウ素酸の痕跡を含まない分画のみを集めること、（２）これらの分画をた だちに凍結乾燥し、−９０６Ｃで凍結すること。これらの処置によって、化学反 応によるヘモグロビンの酸化を防止することができる。 本発明の詳細な説明 （実施例Ｖ） ラビットにおける毒性 新規組成物（Ｈｂ−ＰＰ−ＧＳＨ）の毒性を、科学文献に報告されている方法（ フェオラ（Ｍ、　Ｆｅｏｌａ）ら、「高分子化ヘモグロビン溶液の毒性（”Ｔｏ ｘｉｃｉｔｙ　ｏｆｐｏｌｙＩＩｅｒｉｚｅｄ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　５ｏｌ ｕｔｉｏｎｓ”、　Ｓｕｒｇｅｒｙ、　Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　０ｂｓ 狽■狽窒奄モ刀AＶ ｏｌ、　１６６、　ｐａｇｅｓ　２１１−２２２．１９８８）　ｊ　）に従って 、ラビットで試験した。 体重４．０ｋｇのニューシーラント・ラビット１２匹に、１％のりドカインによ る局部麻酔下で、滅菌したカニユーレを片方の耳の中心動脈及び他方の耳の縁静 脈内に挿入した。滅菌したカテーテルを膀胱に挿入した。サーミスタプローブ及 びＥＣＧ針電極を局部麻酔下で四肢に挿入した。心電図（ＥＣＧ）　、血圧、体 温及び排出尿を３時間連続してモニターした。その後カテーテルと電極を取り除 き、動物をケージに戻した。３０分間の定常状態（ベースライン）の後、血液量 の１７３にあたる（ラビットの血液量をｋｇで表わした体重の６％として計算） ８ｈｌの血液を５分間かけて動脈系から除去した。等量のＨｂ−ＰＰ−ＧＳＨを ３０分間かけて静脈系から輸血した。この量は、約２ｇのヘモグロビンに相当す る。血液を除去すると、血圧が低下し、心拍数が増加した。これらの変化はすみ やかにもとに戻った。さらに、出血後細くなった脈圧（収縮期血圧と拡張期血圧 の差）は、まず正常値に戻り、次にベースラインより大きくなった。このことは 、ヘモグロビンの血管拡張効果を示す。この効果は、３時間の観察の間ずっと見 られた。排泄尿は正常であり、ヘモグロビンの尿への逸出は見られなかった。 血液交換の後３０分、１．３、及び２４時間後に血液をサンプリングしたところ （１）血液希釈効果を越えた、白血球及び血小板の減少は見られず、（２）血清 フィブリノーゲン、プロトロンビン時間及びフィブリン分解生成物を測定したと ころ、血管内血液凝固及びフィブリン溶解の活性化は見られず：　（３）クレア チニンフォスフォキナーゼ脳アイソザイム（ＣＰＫ−ＢＢ）及び心筋アイソザイ ム（、ＣＰＫ−ＭＢ）の上昇は見られず、すなわち、脳及び心筋の障害はなく　 ：　（４）肝臓障害を示す、血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ ＳＧＰＴ）の上昇は見られず、（５）動脈血液ガスは正常であって、肺機能が正 常であることを示し：　（６）血清クレアチニンは正常であって、腎機能が正常 であることを示した。３時間後と２４時間後の、血液と尿のサンプルの組み合わ せは、正常なりレアチニン・クリアランスを有し、腎機能が正常であることを示 した。全血の酸素解離曲線は、ｐｓｏが変化していないこと、すなわち、ヘモグ ロビンによる酸素親和性の増加がないことを示した。２４時間後における血漿ヘ モグロビンのレベルは、最初のレベルの約５０％であり、このことは、ヘモグロ ビンの半減期が２４時間であることを示唆した。 ２４時間の間、動物は、外観、振る舞いとも正常であった。この時点で実験動物 を殺し、生体器官を組織学的に研究した。これまで科学文献に報告されている病 理学的変化は、（ａ）心臓、（ｂ）肺、（Ｃ）肝臓、（ｃｌ）腎臓のいずれにも 観察されなかった。これらの発見は、これまで報告されてきた純粋でないヘモグ ロビンをグルタルアルデヒドによって架橋したものを用いた場合（上述の参考文 献を参照のこと）と鋭い対比を示している。 （実施例■） ラビットにおける薬効 この製品の人工血液としての薬効をラビットで試験した。上記の実施例で述べた 方法と同様に、対照群として、体重４．０ｋｇのニューシーラント・ラビット１ ０匹から１７３量の血液（血液量はｋｇで表わした体重の６％として計算）を除 去し、１５分後にさらに１／３量を除去した。処置を行わない場合には、すべて の動物が１時間以内に死亡した。実験群として、１０匹のラビットに同じ実験を 行い、失われた血液の総量と等しい量のｆ（ｂ−ＰＰ−ＧＳＨを輸血した。これ らの動物はすべて生存し、７日以内にヘマトクリット値（赤血球の濃度）はベー スラインまで戻った。 （実演１閃１ｖｍノ ラットにおける血液交換後の血管拡張 体重３５（１−４５０ｇのスプラグ・ドーリ−（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｖｌｅｙ ）ラット１２匹に、４５ｍｇ／Ｋｇのベントパルビタールナトリウムを腹膜内に 注入して麻酔し、手術台に仰向けに寝かせた。右の大腿部動脈、頚動脈、及び外 題静脈を外科的に開き、ポリエチレンカテーテル（モデルＰＥ５０、Ｉｎｔｒａ ａｅｄｉｃ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）を挿入した。外題静脈カテーテルを右心房の 中に進め、一方、サーミスタプローブ（モデルＩＦ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ　Ｉｎｓ ｔｒｕｍｅｈｔｓ、　Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、　０ｈｉｏ）を頚動脈を通して上行大 動脈中に進めた。 それぞれのカテーテルをウノヘパリン５　ＩＵ／ｍｌを含む生理食塩水で満たし た。大腿部動脈と頚静脈系を血圧変換器に接続した。針電極を四肢内に皮下挿入 し、心電図（ＥＣＧ）のモニターに使用した。温熱ランプを調整して一定の体温 を維持した。 心拍数をＥＣＧトレースから決定し、心拍出量は熱希釈、すなわち、室温（２〇 −２２°Ｃ）に保持した２００μｍの生理食塩水を右心房に注入し、大動脈サー ミスタからの熱希釈曲線を記録することによって測定した。全身血管抵抗は平均 動脈圧から右動脈圧を差し引き、これを心拍出量で割ってめた。 血行動態データのベースラインを記録した後、計算された血液量（ラットの血液 量はｋｇで表わした体重の７％として計算）の１／３量を動脈系から５分間かけ て除去した。１５分後、同量のＨｂ−ＰＰ−ＧＳＨを静脈系から輸血した。ベー スライン（Ｔ、）　、血液除去１５分後（Ｔ２）、ヘモグロビン輸血１５分後（ Ｔ３）において、心拍数、平均動脈血圧、及び心拍出量を測定し、全身血管抵抗 を計算した。 データの統計学的分析は、対データについてスチューデントを検定を用いて行っ た。 下記の表６にその結果を示すが、全身血管抵抗は血液除去後に増加し、血液交換 の後正常値に戻り、ベースラインに対しても、血管拡張が起こった。

【表６】 心拍数（毎分）３２０±５３９０±１叶　３００±１昨平均動脈圧（叩Ｆｉｇ） １０５±５　９０±３本　１０５±５本心拍出量（ｍｌ／Ｋｇ／ｌ１ｉｎ）　４ ２５±２０　２７５±１５本４５５±２８＊全身血管抵抗（ｍｍＨｇ／Ｉ！ｌ／ Ｋｇ／ｗｉｎ）　０．２３±０．０２　０．３３±０，０３零　０．２１±０． ０２本数字＝平均値　士　標準偏差 ＊　＝　前の時間間隔からの統計学的有意差（Ｐ＜０．０５）（実施例■） ラビットにおける酸素フリーラジカルの生成体重４．０ｋｇのニューシーラント ・ラビット１２匹をタロルブコマジン（５ｌｌ１ｇ７ｋｇ、筋注）で沈静させ、 ｇｅｎｎｔｅｉされた測定を行った。滅菌したプラスチックカニユーレを中心動 脈及び片方の耳の縁静脈内に挿入し、サーミスタプローブと針電極を四肢に皮下 挿入した。計算された血液量（ｋｇで表わされた体重の２％）の１７３量を５分 間かけて動脈系から除去し、同量のヘモグロビン溶液を３０分間かけて静脈系か ら輸血した。６匹の対照群には未修飾ヘモグロビンを、実験群（６匹）にはＨｂ −ＰＰ−ＧＳＨを投与した。血漿中の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）及び脂質過酸化物 レベルについて、ベースライン、ヘモグロビン輸血後１５分、１時間、３時間、 及び２４時間後において、輸血の効果を検討した。血漿中のヘモグロビン及びメ トヘモグロビンもまた同じ間隔で測定した。 未修飾ヘモグロビンを投与した群では、Ｈ２Ｏ２が１時間後に２＝２から７０± ５μａｏｌ／＋＊ｌに増加し、３時間後には５０±５　ｕｏｌ／＋ｅｌ、２４時 間後には１０±５　ｇｍｏｌ／ｌｌ１ｌに減少した。実験群では、Ｈ２０□が１ 時間後に２±２から１０±２μｍｏｌ／ｍｌに増加しただけであり、３時間後に はベースラインにまで戻った。同様に、脂質過酸化物については、対照群ではベ ースライン１．５±０．９％ｍｏｌ／ｍｌから、１時間後には４，０：１、０％ ｍｏｌ／ｍｌに増加した。実験群については、有意の増加は起こらなかった。血 漿中のメトヘモグロビンは、未修飾ヘモグロビンを投与した群では、１時間後に ０％から１５％に増加し、Ｈｂ−ＰＰ−ＧＳＨを投与した群では、０％から５％ に増加した。２つの群におけるこれらの差は、統計学的分析、すなわち、弁封及 び対サンプルのスチューデントを検定及び分散分析（ＡＮＯＶＡ＞によって有意 であることが示された。 上述の特定の具体例によって本発明を説明してきたが、多くの変更、応用、修正 が可能であることが、当業者には理解されるであろう。これらの変更、応用及び 修正は、添付した特許請求の範囲の趣旨及び目的の範囲の中に含まれる。 そＮ 要約書 過ヨウ素酸酸化ＡＴＰ　（ｏ−ＡＴＰ）によって分子内架橋し、過ヨウ素酸酸化 アデノノン（０−アデノンン）によって分子間架橋し、かつ、還元グルタチオン （ＧＳＨ）と結合させた精製ヘモグロビン（好ましくはウシヘモグロビン）から なるヘモグロビン製剤。この化合物は以下の理由により、人工血液として有用で ある・　（１）長い血管内寿命を有し、血漿量を維持することができる。（２） 低い酸素親和性を有し、生理学的酸素運搬体として働くことができる；　（３） 血管拡張活性を有し、出血後の血管収縮を弛緩させることができる。 国際調査報告 １Ｍ＃＋＋１１ｄ＋ｌｌＩａｍａｗ會Ｎ・ＰＣＴ／Ｌ！５９０１０７４４２１” 噂−”′°パ°°”１パ′−＾−””””ＰＣＴ／ＵＳ９０１０７ａ４２

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．ｏ−ＡＴＰ及びｏ−アデノシンと反応させて架橋生成物を形成したヘモグロ ビンからなる、人工血液として使用する組成物であって、前記生成物が生理食塩 水に溶解していることを特徴とする組成物。
2. ２．さらに若干の還元グルタチオンを含む、請求項１記載の組成物。
3. ３．さらにｏ−ＡＴＰとほぼ等モルの濃度で塩化マグネシウムを含む、請求項１ 記載の組成物。
4. ４．ヘモグロビンが過ヨウ素酸酸化ＡＴＰによって分子内架橋し、かつ、過ヨウ 素酸酸化アデノシンによって分子間架橋し、ポリヘモグロビンの分子を形成して いる、請求項１記載の組成物。
5. ５．さらにグルタチオンを含み、ヘモグロビン、ｏ−ＡＴＰ、ｏ−アデノシン及 びグルタチオンが、それぞれ約１：１：０５：１０：１０：７のモル比で存在す る、請求項１記載の組成物。
6. ６．架橋されたヘモグロビン分子が約１３０から約３９０キロダルトンの分子量 を有する、請求項１記載の組成物。
7. ７．５％未満のヘモグロビンがメトヘモグロビンに酸化されている、請求項１記 載の組成物。
8. ８．ヘモグロビンがウシ由来である、請求項１記載の組成物。
9. ９．全血から精製ヘモグロビンを抽出する方法であって：全血を遠心分離して血 小板及び血漿を除去し、得られた白血球と赤血球の混合物を溶液中に懸濁する； 白血球と赤血球の混合物を冷却し、白血球を凝集させる；白血球凝集体を濾過に よって除却する；赤血球を低張溶液に対して透析し、かつ、赤血球を高静水圧下 で限外濾過することによって赤血球からヘモグロビンを描出する；ヘモグロビン を一酸化炭素で飽和させ、カルボキシ型に変換する；ヘモグロビン溶液を低温殺 菌し、非ヘム蛋白質を変性させて沈殿させる；ヘモグロビン溶液をクロロホルム と混合して遠心分離し、リン脂質及び沈殿した非ヘム蛋白質を除去する； 一酸化炭素ガスをブラッシングし、上清ヘモグロビン溶液から残りのクロロホル ムを除去する； ヘモグロビン溶液をアフィニティー・クロマトグラフィー・カラムに通し、該溶 液から内毒素を除却する； の各工程からなることを特徴とする方法。
10. １０．人工血液としての使用に適した組成物を製造する方法であって；ヘモグロ ビンを一酸化炭素で飽和させ、精製ヘモグロビン溶液をカルボキシ型に変換する ； 得られたカルボキシヘモグロビン溶液を正常張液に対して透析し、ヘモグロビン を約１０ｇ／ｄｌに濃縮する； カルボキシヘモグロビンを酸化アデノシン三リン酸（ｏ−ＡＴＰ）と反応させ、 ヘモグロビン分子間に主として分子内架橋を形成させる；カルボキシヘモグロビ ンを酸化アデノシン（ｏ−アデノシン）と反応させ、　ヘモグロビン分子間に主 として分子間架橋を形成させる；該溶液にグルタチオンを添加し、ｏ−アデノシ ン架橋反応を停止させる；該溶液に酸素をブラッシングし、ヘモグロビンをカル ボキシ型からオキシ型に変換する； の各工程からなることを特徴とする方法。
11. １１．さらにヘモグロビン組成物を塩化マグネシウムを含む溶液に溶解する工程 を含む、請求項１０記載の方法。
12. １２．さらに該組成物にマンニトールを添加する工程を含む、請求項１１記載の 方法。
13. １３．ｏ−アデノシン及びｏ−ＡＴＰを、それぞれアデノシン及びＡＴＰを過ヨ ウ素酸酸化することによって調製し、ｏ−ＡＴＰ及びアデノシンをヘモグロビン と反応させる前に過ヨウ素酸を除去する、請求項９記載の方法。
14. １４．請求項９記載の方法によって全血から精製ヘモグロビンを得る、請求項１ ２記載の方法。
15. １５．全血がウシ由来である、請求項１４記載の方法。
16. １６．請求項１５記載の方法によって調製される、ヘモグロビン組成物。