CN103705959B - 紫外辐照灭活血红蛋白及血红蛋白氧载体中病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种人源或动物源的血红蛋白及血红蛋白氧载体的病毒灭活方法，从而将其可能含有的病毒部分或全部去除。待处理的血红蛋白或血红蛋白氧载体为溶液形态；该方法包括以下步骤：先用性质较为惰性的气体将氧合血红蛋白进行脱氧，使之转化为脱氧血红蛋白，防止亚铁血红蛋白的氧化，再用紫外灯对脱氧血红蛋白溶液进行照射，设置照射至液面时的紫外线强度为50-110μw/cm²，并根据照射面积及溶液体积调整照射时间，照射完成后即完成了病毒灭活的过程。

Description

紫外辐照灭活血红蛋白及血红蛋白氧载体中病毒的方法

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及以血红蛋白（hemoglobin,Hb）为原料制备生物制品时病毒灭活的方法。

背景技术

用人或者动物的血红蛋白制备生物制品，为防止病毒的交叉感染，其生产工艺须具备一定的去除/灭活部分病毒能力，将其可能含有的病毒部分或全部去除。

由于不同生物制品潜在的病毒种类不同，所选择病毒去除/灭活方法的侧重点也应有所不同，故而有多种去除/灭活的方法。根据生物我国生物制品《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》，常用的方法有：⑴巴斯德消毒法（巴氏消毒法）；⑵干热法（冻干制品）；⑶有机溶剂/去污剂（S/D）处理法；⑷膜过滤法；⑸低pH孵放法；⑹化学灭活方法。

无基质血红蛋白（stroma-freehemoglobin,SFH）具有携氧释氧的能力，一直以来被作为氧载体制剂进行研究代替红细胞的功能，具有潜在的临床应用价值，由人或动物血红蛋白开发出来的代替红细胞携氧释氧功能的制剂被称为血红蛋白氧载体（Hemoglobin-basedoxygencarriers,HBOCs）。这种制剂主要通过稳定血红蛋白四聚体并增加分子量或是分子半径的手段来克服天然血红蛋白的缺陷。目前开发的产品主要有四类：（1）聚合血红蛋白；（2）共轭血红蛋白；（3）分子内交联血红蛋白；（4）重组人血红蛋白。

在哺乳动物中，血红蛋白在天然状态下，它由两对亚基组成（2αβ），是一个四聚体的蛋白结构，分子量约为64,000道尔顿，每个亚基上有一个铁卟啉，当铁元素处于II价时，血红蛋白具有携氧释氧的能力，称为亚铁血红蛋白，结合了氧的血红蛋白称为氧合血红蛋白，未结合氧的亚铁血红蛋白称为脱氧血红蛋白；当铁元素处于III价时，铁元素被氧化，血红蛋白不具有携氧释氧的能力，称为高铁血红蛋白。血红蛋白氧载体必须使血红蛋白处于亚铁血红蛋白蛋白时才具有携氧释氧的功能。

亚铁血红蛋白非常容易被氧化成高铁血红蛋白，特别在氧合状态下会被紫外线快速氧化，因此，本领域技术人员从未考虑直接用紫外线照射的方式对血红蛋白及由其为原料的血红蛋白氧载体进行病毒灭活。

发明内容

本发明的目的是提供一种人源或动物源的血红蛋白及血红蛋白氧载体的病毒灭活方法，从而将其可能含有的病毒部分或全部去除。

本发明的基本解决方案如下：

待处理的血红蛋白或血红蛋白氧载体为溶液形态；该方法是先用性质较为惰性的气体（常温常压下不溶于水且不与血红蛋白反应的气体）将氧合血红蛋白进行脱氧，使之转化为脱氧血红蛋白，防止亚铁血红蛋白的氧化，再用紫外灯对脱氧血红蛋白溶液进行照射，设置照射至液面时的紫外线强度为50—110μw/cm²，并根据照射面积及溶液体积调整照射时间，照射完成后即完成了病毒灭活的过程。

具体的方案如下：

步骤1：取一密闭容器，在该容器中加入血红蛋白或者血红蛋白氧载体溶液并进行搅拌，将容器连接气体交换膜，液相一侧接通溶液，气相一侧连接惰性的气体，对血红蛋白或血红蛋白氧载体进行脱氧，在溶液上方同时也通入惰性的气体，将溶液上方的空气排出，或者仅在溶液上方连续通入惰性的气体以降低氧分压使血红蛋白脱氧；直至脱氧血红蛋白大于90%时，撤去气体交换膜，并在溶液上方继续通入惰性的气体，或停止通入惰性的气体但需封闭容器通气口以阻止与外界大气交换；上述惰性的气体可以是氮气、氦气、氖气、氩气、氙气、氡气、氢气等；

步骤2：该容器装有石英玻璃窗口，将紫外灯置于石英玻璃窗口前，打开紫外灯调整距离，使紫外线透过该石英玻璃窗口照射于液面时的强度为50—110μw/cm²，照射时间根据液体厚度调整，每1.0cm厚度增加大于1.4天照射时间，总厚度不超过20cm；照射完毕后收集得到的溶液即为灭活病毒后的血红蛋白或者血红蛋白氧载体溶液。

以上具体方案中，应当注意两点：

一、紫外线照射强度需在50—110μw/cm²的范围内，高于该强度即使是脱氧血红蛋白也会造成亚铁血红蛋白的氧化，低于该强度范围则对病毒灭活能力相对较小，难于达到理想的效果。

二、照射时最好采用石英玻璃作为照射窗口，因为石英玻璃能够透过紫外线进行照射，而普通玻璃不能透过紫外线。

本发明具有如下优点：

①在基本不引起亚铁血红蛋白氧化的条件下有效、简单地实现了对血红蛋白或血红蛋白氧载体进行病毒灭活。

②不引入外来物质，照射前后溶液组分未发生变化，不需要后续处理。

具体实施方式

以下给出三例病毒灭活验证实验，并相应限定了较佳的具体操作环节和参数；但以下示例不应理解为对本发明权利要求的限制。

实施例一：

步骤1：在一可密闭容器中加入10mg/mL的猪血红蛋白90mL，蛋白溶液厚度为6cm，容器上下两侧设两个面的石英玻璃窗口，再加入10ml猪细小病毒（PPV），搅拌，在溶液上方通入氮气，将亚铁血红蛋白转化成脱氧血红蛋白，待转化率大于90%时，停止通入氮气，但是密闭容器，阻止与外界大气交换；

步骤2：将两个紫外灯分别置于石英玻璃窗口前，打开紫外灯调整距离，使照射于液面时的强度为70μw/cm²，照射4.5天，照射完毕后收集得到的溶液即为灭活病毒后的溶液。

分别在灭活前、灭活后第1、2、3、4.5天取样，用细胞感染法检测灭活过程中病毒残余的滴度，细胞PK-15，检验结果病毒滴度降大于4log值，通过盲传三代实验，也未发现细胞异常，无病毒毒性。

实施例二：

步骤1：在一可密闭容器中加入8mg/mL的猪血红蛋白100mL，其中猪伪狂犬病毒（PRV）滴度大于6log值；搅拌，蛋白溶液厚度为5cm，容器上下两侧设两个面的石英玻璃窗口，在溶液上方通入氩气，将亚铁血红蛋白转化成脱氧血红蛋白，待转化率大于90%时，停止通入氩气，但是密闭容器，阻止与外界大气交换；

步骤2：将两个紫外灯分别置于石英玻璃窗口前，打开紫外灯调整距离，使照射于液面时的强度为80μw/cm²，照射4天，照射完毕后收集得到的溶液即为灭活病毒后的溶液。

分别在灭活前、灭活后第1、2、3、4天取样，用细胞感染法检测灭活过程中病毒残余的滴度，细胞PK-15，检验结果病毒滴度降大于4log值，通过盲传三代实验，也未发现细胞异常，无病毒毒性。

实施例三

步骤1：在一可密闭容器中加入4mg/mL的聚合猪血红蛋白溶液（血红蛋白氧载体）100mL，其中PPV病毒滴度大于6log值，搅拌，蛋白溶液厚度为8cm，容器上下两侧设两个面的石英玻璃窗口，在溶液上方通入氢气，将容器连接气体交换膜，液相一侧接通溶液，气相一侧连接氢气，对血红蛋白或血红蛋白氧载体进行脱氧，将亚铁血红蛋白转化成脱氧血红蛋白，待转化率大于90%时，撤去气体交换膜，但是在溶液上方继续通入氢气，阻止与外界大气交换；

步骤2：将两个紫外灯分别置于石英玻璃窗口前，打开紫外灯调整距离，使照射于液面时的强度为60μw/cm²，照射6天，照射完毕后收集得到的溶液即为灭活病毒后的溶液。

分别在灭活前、灭活后第1、2、4.5、6天取样，用细胞感染法检测灭活过程中病毒残余的滴度，细胞为PK-15细胞，检验结果病毒滴度降大于4log值，通过盲传三代实验，也未发现细胞异常，无病毒毒性。

Claims (1)

1.紫外辐照灭活血红蛋白及血红蛋白氧载体中病毒的方法，待处理的血红蛋白或血红蛋白氧载体为溶液形态；该方法是先用性质较为惰性的气体将氧合血红蛋白进行脱氧，使之转化为脱氧血红蛋白，防止亚铁血红蛋白的氧化，再用紫外灯对脱氧血红蛋白溶液进行照射，设置照射至液面时的紫外线强度为50—110μw/cm²，并根据照射面积及溶液体积调整照射时间，照射完成后即完成了病毒灭活的过程；具体步骤如下：

步骤(1)：取一密闭容器，在该容器中加入血红蛋白或者血红蛋白氧载体溶液并进行搅拌，将容器连接气体交换膜，液相一侧接通溶液，气相一侧连接惰性的气体，对血红蛋白或血红蛋白氧载体进行脱氧，在溶液上方同时也通入惰性的气体，将溶液上方的空气排出；直至脱氧血红蛋白大于90％时，撤去气体交换膜，并在溶液上方继续通入惰性的气体，或停止通入惰性的气体但需封闭容器通气口以阻止与外界大气交换；所述惰性的气体为氮气、氦气、氖气、氩气、氙气、氡气或氢气；

步骤(2)：该容器装有石英玻璃窗口，将紫外灯置于石英玻璃窗口前，打开紫外灯调整距离，使紫外线透过该石英玻璃窗口照射于液面时的强度为50—110μw/cm²，照射时间根据液体厚度调整，每1.0cm厚度增加大于1.4天照射时间，总厚度不超过20cm；照射完毕后收集得到的溶液即为灭活病毒后的血红蛋白或者血红蛋白氧载体溶液。