CN110585456B - 生物材料的病毒灭活方法、处理方法和应用 - Google Patents

生物材料的病毒灭活方法、处理方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种生物材料的病毒灭活方法、处理方法和应用，涉及生物医药技术领域，生物材料的病毒灭活方法包括以下步骤：紫外照射吸收有光敏剂的生物材料，紫外使用剂量为1‑8J/cm2，再对紫外照射后的生物材料进行辐照，辐照剂量为8‑25kGy，得到病毒灭活后的生物材料。本发明解决了单纯辐照灭活病毒的方法剂量大，对材料活性造成影响，需要外送至辐照中心而不易于在实验室范围内进行验证的技术问题，达到了在较低的紫外和辐照剂量下取得较好的病毒灭活效果且不损害材料中生物活性成分、易于在实验室范围内完成验证的技术效果。

Description

生物材料的病毒灭活方法、处理方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种生物材料的病毒灭活方法、处理方法和应用。
背景技术
由于病毒检测时窗口期的存在，并非所有供体检测阴性的组织样本也一定没有携带病毒，因此，同种异体生物材料和动物源性的生物材料需要经过病毒灭活处理步骤。现有技术中，常用的有巴斯德消毒法(巴氏消毒法)、干热灭活法、γ射线/钴60辐照灭活法、过氧乙酸-乙醇灭活法、乙醇灭活法，另外还有有机溶剂/去污剂(S/D)处理法、低pH孵育法等。
对于羊膜等生物材料采用辐照的方法可以减少对于此类材料中生物活性成分的损害，但是辐照法需要较大剂量才能达到对于非脂包膜(或称无包膜)DNA病毒的灭活，而辐照剂量的增加也会对蛋白质成分产生不良影响。
而且，对于羊膜等生物材料的病毒灭活，往往需要将材料中加入病毒并按照实际工艺处理进行验证，而辐照法一般需要专用的设备和场地；对于一些比较危险的病毒验证，如HIV病毒的灭活验证，不能将生物材料样本染毒后运离特定安全级别的实验室并送至有辐照设备的第三方进行辐照剂量病毒灭活的验证。而其他常用的病毒灭活虽然在具有安全级别的实验室内能够采用，但这些方法可能导致蛋白质变性，不利于生物材料中活性蛋白质成分的保存，或者引入有机溶剂等外来污染物和不必要的物质。因此，亟待研发一种更好的灭活生物材料病毒的方法，以期以更低的剂量达到灭活要求，且方法易于完成，对于生物材料影响较小且不会带入污染物或引入外源有害物质，以避免进行病毒灭活验证时，将染上HIV等危险病毒的试验样本转移出实验室所可能带来的风险。
有鉴于此，提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种生物材料的病毒灭活方法，能够对于各种病毒灭活并且保证产品生物活性，且易于在实验室完成验证。
本发明的目的之二在于提供一种生物材料的处理方法。
本发明的目的之三在于提供一种生物材料的用途。
本发明的目的之四在于提供一种生物材料或生物医用产品。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种生物材料的病毒灭活方法，包括以下步骤：
紫外照射吸收有光敏剂的生物材料，紫外使用剂量为1-8J/cm2；再对紫外照射后的生物材料进行辐照，辐照剂量为8-25kGy，得到病毒灭活后的生物材料。
第二方面，本发明提供了一种生物材料的处理方法，包括可选的对生物材料进行预处理，然后按照上述生物材料的病毒灭活方法对生物材料进行病毒灭活。
第三方面，本发明提供了一种生物材料的病毒灭活方法或生物材料的处理方法在制备促进组织修复、替代组织功能或修补组织器官的生物医用产品中的应用。
第四方面，本发明提供了一种生物材料，所述生物材料经上述生物材料的病毒灭活方法或上述生物材料的处理方法获得；
或，一种生物医用产品，包括经上述生物材料的病毒灭活方法或上述生物材料的处理方法获得的生物材料。
本发明提供的生物材料的病毒灭活方法、处理方法和应用，至少具有以下有益效果：
(1)本发明采用紫外加光敏剂照射并联合辐照的方式可以在较低的紫外和辐照剂量下达到较好的病毒灭活效果，适用于各种病毒的灭活，能够降低四种指示病毒的滴度达6log以上。
(2)由于本发明的辐照剂量小，能够避免对材料中生物活性成分的损害以及对蛋白质成分的影响，不会引入外来污染物或有害物质。
(3)先通过紫外加光敏剂照射就能够灭活部分病毒，避免了病毒灭活验证时，将染上HIV等危险病毒的试验样本转移出实验室所带来的风险，达到易于在实验室范围内完成验证的目的。
此外，通过紫外和光敏剂处理能造成生物材料中胶原纤维的一定程度的交联，加强了生物材料的强度。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的第一个方面，提供了一种生物材料的病毒灭活方法，包括以下步骤：紫外照射吸收有光敏剂的生物材料，紫外使用剂量为1-8J/cm2；再对紫外照射后的生物材料进行辐照，辐照剂量为8-25kGy，得到病毒灭活后的生物材料。
这里的生物材料优选包括植入类的生物膜类材料或用于创面愈合包括角膜愈合的生物材料。这些生物材料包括但不限于羊膜组织、各种筋膜组织、皮肤组织、肌腱组织、心包组织、肠系膜下肌层、角膜组织等生物材料组织，典型的例如为羊膜或绒毛膜。
根据《同种异体植入性医疗器械病毒灭活工艺验证技术审查指导原则》《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》和《动物源性医疗器械注册技术审查指导原则》等法规要求，对于生物组织提取制品应具有针对非脂包膜病毒的去除和/或灭活步骤，一般将病毒感染性滴度减少≥4log的处理步骤认可为有效的病毒去除/灭活工艺步骤。
在选择合适的方法时需要根据产品的特性选择合适的病毒灭活工艺。无论采用何种工艺，均应综合考虑以下问题，包括病毒灭活效果的验证；病毒灭活工艺对产品的影响；病毒灭活工艺本身的公认性、可靠性、重现性、易放大性及经济性。
辐照法需要较大剂量才能达到对于非脂包膜DNA病毒的灭活，而辐照剂量的增加也会对蛋白质成分产生不良影响。而且辐照法一般需要专用的设备和场地，对于一些比较危险的病毒验证，如HIV病毒的灭活验证，不能将生物材料样本染毒后运离特定安全级别的实验室并送至有辐照设备的第三方进行辐照剂量病毒灭活的验证。目前常用的病毒灭活方法可能会导致蛋白质变性，不利于生物材料中活性蛋白质成分的保存，或者引入有机溶剂等外来污染物和不必要的物质。因此，函待研发一种能够在实验室内能够完成的病毒灭活方法，不仅能够降低辐照法辐照剂量，而且对于生物材料影响较小且不引入污染物或有害物质，以避免进行病毒灭活验证时，将染上HIV等危险病毒的试验样本转移出实验室所可能带来的风险，达到能够易于在实验室范围内完成验证的目的。
发明人在经过广泛和深入的研究后发现，通过紫外照射吸收有光敏剂的生物材料可以有效的灭活生物材料中的病毒，特别是对于辐照难以灭活的非脂包膜病毒，如PPV，用很低的紫外照射剂量就能灭活，通过和辐照法联合使用可以使用更低剂量的紫外和更低剂量的辐照以达到对于各种病毒灭活并且保证产品生物活性的目的。
本发明中，紫外使用剂量为1-8J/cm2(J指焦耳，Joule)，典型但非限制性的实例例如为1J/cm2、2J/cm2、3J/cm2、4J/cm2、5J/cm2、6J/cm2、7J/cm2或8J/cm2；辐照剂量为8-25kGy(kGy指千戈瑞，kGray)，典型但非限制性的实例例如为8kGy、9kGy、10kGy、11kGy、12kGy、13kGy、14kGy、15kGy、16kGy、17kGy、18kGy、19kGy、20kGy、21kGy、22kGy、23kGy、24kGy或25kGy。
为了使生物材料充分吸收光敏剂，优选将生物材料浸泡在含有光敏剂的溶液中，然后再将生物材料平铺后暴露于紫外光下进行照射。
对光敏剂的种类不作限定，包括但不限于核黄素或者其衍生物、亚甲蓝、补骨脂或光敏剂S59等。
核黄素或者其衍生物是指核黄素(7，8-二甲基-10-[(2S，3S，4R)-2，3，4，5-四羟基戊基]-3，10-二氢苯并蝶啶-2，4-二酮，分子式为C17H20N4O6)，或，核黄素的衍生物，核黄素的衍生物例如可以为黄素单核苷酸(英文名flavin mononucleotide)，黄素腺嘌呤二核苷酸(英文名flavin adenine dinucleotide)。
对紫外照射后的生物材料进行辐照，对辐照的方式不作限定，典型但非限制性的例如为γ射线辐照(钴60辐照)或电子束辐照。
本发明通过紫外照射吸收有光敏剂的生物材料可以有效地灭活羊膜、绒毛膜等生物材料中的病毒，并和辐照法联合使用可以使用更低剂量的紫外和更低剂量的辐照以达到病毒灭活的目的，避免对所处理生物材料的破坏。经紫外照射后光敏材料产生氧自由基，起到杀灭病原体的作用，另外，通过紫外和光敏剂处理能在一定程度上引起胶原纤维发生交联反应，起到增加羊膜、绒毛膜等生物材料胶原组织强度的作用。
在一些优选的实施方案中，紫外照射的紫外光可为320-380nm波长的UVA，紫外光波长例如为320nm、330nm、340nm、350nm、360nm、370nm或380nm。
在一些优选的实施方案中，紫外照射的紫外光可为280-320nm波长的UVB，紫外光波长例如为280nm、285nm、290nm、300nm、310nm、320nm。
在一些优选的实施方案中，紫外照射的紫外光优选波长峰值为312nm的紫外光。
在一些优选的实施方案中，紫外照射的紫外光优选波长峰值为302nm的紫外光。
通过对照射的紫外光波长范围的优选，能够提升病毒灭活效果。
在一些优选的实施方案中，生物材料的病毒灭活方法还包括对紫外照射后的生物材料先进行干燥成型，再进行辐照的步骤。
干燥成型是为了易于长期保存，另外辐照时如果材料含水量高，会在射线作用下产生氧自由基，造成生物材料的氧化和损害。
在一些优选的实施方案中，光敏剂为核黄素。
核黄素由核醇、异咯嗪核糖侧链组成，其核醇结构易穿透并可以结合到病毒DNA/RNA上，在紫外线照射下吸收光子能量，通过异咯嗪上的1、10位氮原子的可逆性氧化还原反应转移电子，氧化DNA/RNA上鸟嘌呤残基，使其断裂，病毒DNA/RNA丧失复制、转录和翻译能力，从而达到灭活病毒的效果。
根据本发明的第一个方面，提供了一种生物材料的处理方法，包括可选的对生物材料进行预处理，然后按照上述生物材料的病毒灭活方法对生物材料进行病毒灭活。
“对生物材料进行预处理”中的生物材料指未吸收有光敏剂的生物材料。
该处理方法不仅仅限于羊膜、绒毛膜材料的处理，也适用于其他膜类生物材料的处理，如羊膜组织、各种筋膜组织、皮肤组织、肌腱组织、心包组织、肠系膜下肌层、角膜组织等。当处理紫外光可透过的半透明组织时，预处理为可选步骤。
也就是说，生物材料的处理方法，包括：按照上述生物材料的病毒灭活方法对生物材料进行病毒灭活，或，
生物材料的处理方法，包括：对生物材料进行预处理；将与处理后的生物材料吸收光敏剂，然后再用紫外照射吸收有光敏剂的生物材料。
预处理目的是使紫外线更容易透过。包括但不限于以下方法：使用水、盐水或清洁剂洗涤；使用机械的方法压制处理让所处理的生物材料变薄以使紫外光能够透过；使用机械的方法刮除多层生物膜组织上的不透明层；使用化学的方法(使用酸、碱等化学试剂)使生物材料变透明或者变成溶液，可联合机械打碎方法进行；使用酶解的方法去除多层生物膜组织上的不透明层；使用透明剂处理，如甘油、二甲基亚砜、丙二醇、丙三醇、葡萄糖、聚乙二醇等，使组织变的更透明。使用上述使生物材料组织变透明的方法的任何一种或相互搭配的组合使组织变的易于紫外线通过。
在一些优选的实施方案中，生物材料的处理方法，包括以下步骤：
(a)将生物材料进行预处理，预处理包括洗涤和刮除不透明层；
(b)将预处理后的生物材料浸泡在含有光敏剂的溶液中，使生物材料充分吸收光敏剂；
(c)将生物材料平铺后暴露于紫外光下进行照射，紫外光包括波长320-380nm的UVA或波长280-320nm的UVB，使用剂量为1-8J/cm2；
(d)紫外照射后对生物材料进行清洗和干燥；
(e)对干燥后的生物材料进行辐照，辐照剂量为8-25kGy，得到病毒灭活后的生物材料。
生物材料的处理方法具体的步骤如下：
在洁净室中将一个胎盘的羊膜、绒毛膜组织用剪子将胎膜沿胎盘底部边缘处剪下，放置在含生理盐水的容器中(容器置于冰块上保冷)，运至有洁净级别的厂房或实验室。或者将胎盘放置在含生理盐水的容器中(容器置于冰块上保冷)，运至有洁净级别的厂房或实验室，在洁净室中将羊膜、绒毛膜组织剪下。
将羊膜和绒毛膜钝性分离。
将羊膜组织和绒毛膜组织在相对无菌条件下分别处理。
将羊膜组织放到500mL玻璃广口瓶中，各加入250mL的生理盐水，置于台式恒温振荡器上常温振荡洗涤1小时(约180rmp，60min，25℃左右)。羊膜和绒毛膜由海绵层相连。在分离羊膜和绒毛膜后，两层膜上分别存留有海绵层组织。用细胞刮铲或带无菌手套的手指刮除羊膜组织的海绵层，使羊膜组织变的更薄更透明。再用生理盐水振荡洗涤1小时后置于生理盐水中4-8℃冷藏暂存。用细胞刮铲刮除绒毛膜组织的蜕膜组织。蜕膜组织为绒毛膜母体面表层薄薄的一层红色组织。用细胞刮铲或带无菌手套的手指刮除绒毛膜的海绵层组织。或者使用酶解的方法去除绒毛膜的蜕膜组织。将蜕膜面朝下放置于2.4U/mL Dispase溶液中1-3小时后，用细胞刮铲去除蜕膜组织。可选用机械压制的方法使生物材料变的更薄。将材料使用碾压装置压薄。将所得绒毛膜组织置于生理盐水中再次常温震荡洗涤两次，各1小时(约180rmp，60min，室温25℃左右)。将绒毛膜置于250mL的0.5％Triton X-100溶液中再次洗涤2小时(约180rmp)。洗涤结束后，用大量的蒸馏水剧烈漂洗多次去除残余TritonX-100。可选用透明剂处理，如甘油、二甲基亚砜、丙二醇、丙三醇、聚乙二醇、葡萄糖等生物相容性好的溶剂以40-80％的浓度进行浸泡处理，使组织内部折射率均一化，降低组织内部发生的散射，提高组织的透明度。浸泡后使用蒸馏水漂洗。将漂洗后的绒毛膜浸泡于0.1％EDTA-2Na的1倍PBS溶液中4-8℃冷藏暂存。
将羊膜、绒毛膜取出，分别放入50μmol/L核黄素生理盐水溶液中浸泡1-4小时。
将羊膜和绒毛膜放入设置好波长和能量的紫外交联仪中进行照射，中间进行翻面。紫外光可为320-380nm波长的UVA或280-320nm波长的UVB，优选波长可为峰值为312nm的紫外光或峰值为302nm的紫外光。使用剂量为1-8J/cm2。
照射结束后将羊膜和绒毛膜用大量的蒸馏水剧烈漂洗。分别用尿目测试纸条测试洗涤后羊膜、绒毛膜沥出液体中隐血，羊膜隐血不大于10cell/μL，绒毛膜隐血不大于25cell/μL。
将羊膜覆盖到不锈钢多孔板上，绒毛膜用无尘布吸干大部分的水分后覆盖到羊膜上；在安全柜中常温风干4-6小时，然后放到37℃的鼓风干燥箱中烘干过夜，或者直接放到37℃的鼓风干燥箱中烘干过夜。或者根据应用范围不同，按上述方法将羊膜、绒毛膜分别进行干燥。
将干燥的羊膜、绒毛膜或复合在一起的产品裁切成所需要的规格，包于泡罩或特卫强纸袋中，外加铝塑袋。
包装后送至第三方钴60辐照公司，进行钴60辐照灭菌，辐照剂量为8-25kGy。
根据本发明的第三个方面，提供了一种生物材料的病毒灭活方法或生物材料的处理方法在制备促进组织修复、替代组织功能或修补组织器官的生物医用产品中的应用。
生物材料经过本发明处理后可以用于医疗目的如促进组织修复或者临时替代组织功能和修补组织器官。如将按照本发明处理后的羊膜、绒毛膜应用在角膜组织或皮肤组织破损部位的表面，可起到促进其愈合的作用。又如将按照本发明处理后的羊膜、绒毛膜组织包绕应用在肌腱、神经、韧带等组织的断端，起到固定断端，促进愈合的作用。又如，将本发明处理后的羊膜、绒毛膜材料打碎，制作成匀浆，并通过冻干、交联等方法塑形，制作出损伤组织填充或止血用的生物材料。
根据本发明的第四个方面，提供了一种生物材料，所述生物材料经上述生物材料的病毒灭活方法或上述生物材料的处理方法获得；
或，一种生物医用产品，包括经上述生物材料的病毒灭活方法或上述生物材料的处理方法获得的生物材料。
例如可用于需要一定机械强度的生物材料、生物医用产品，包括但不限于例如疝补片、乳房补片、人造角膜或人造韧带等。
为了进一步了解本发明，下面结合具体实施例和对比例对本发明方法和效果做进一步详细的说明。下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明采用公认的病毒灭活验证方法验证工艺的病毒灭活效果。采用四种指示病毒PRV(伪狂犬病毒)、Sindbis(新德毕斯病毒)、EMCV(脑心肌炎病毒)和PPV(猪细小病毒)进行验证，分别为脂包膜(或称有包膜)DNA病毒，脂包膜RNA病毒，非脂包膜RNA病毒和非脂包膜DNA病毒，覆盖了四种病毒类型。此外还使用HIV病毒验证了紫外结合光敏剂的病毒灭活效果。以微量滴定法将病毒加入指示细胞，采用半数细胞感染几率TCID50(50％tissueculture infective dose)表示病毒滴度。
试验例1
将羊膜、绒毛膜按照上述生物材料的处理方法具体步骤中的振荡清洗和用细胞刮铲等机械处理将其变薄、透明处理后，将样本分为1.起始滴度对照组、2.未紫外处理对照组、3.紫外加核黄素试验组进行紫外线照射联合核黄素光敏剂方法的病毒灭活验证。
对于病毒滴度的测定采用参照消毒技术规范(2002版)2.1.1.10病毒灭活试验以及《动物病毒学》(第二版)(四)病毒感染力的滴定的标准，应用微量滴定法测定样品中PRV、Sindbis、EMCV和PPV等病毒的滴度，并计算工艺处理前后各批次样品中病毒滴度下降值。检测病毒滴度的指示细胞系为Vero和ST。将样本梯度稀释并加入已接种指示细胞的96孔板中，每孔加入0.1mL样本，于5％二氧化碳培养箱中，37℃孵育3-5天，在倒置显微镜下观察指示细胞的病变情况。以半数细胞感染几率TCID50表示病毒滴度。以Spearman-Karber法计算TCID50(Ramakrishnan et al.,World J Virol,2016)。结果以IgTCID50/0.1mL表示。即如果IgTCID50/0.1mL为n，表示将样本稀释至10的n次方倍时，接种0.1mL的样本可使50％的细胞发生病变。
对于起始滴度对照组，取羊膜、绒毛膜样本浸没于指示病毒液中，离心管封口后置于2-8℃冰箱内静置浸泡过夜染病毒。次日，取出染病毒羊膜，悬空沥干至无液滴滴下，按照1:19(羊膜：培养基，W:V)比例加入培养基，剪碎并匀浆30秒后取匀浆液用于测定羊膜中病毒起始滴度。取出染病毒绒毛膜，悬空沥干至无液滴滴下，按照1:9(绒毛膜：培养基，W:V)比例加入培养基，剪碎并匀浆30秒后取匀浆液用于测定绒毛膜中病毒起始滴度。
对于未紫外处理对照组，取500μmol/L核黄素溶液5mL，用生理盐水稀释至50mL。取上述染病毒过夜羊膜，浸泡于该溶液中约2小时。取出核黄素溶液浸泡后染毒羊膜，悬空沥干至无液滴滴下，按照1:19(羊膜：培养基，W:V)比例加入培养基，剪碎并匀浆30秒后取匀浆液用于测定经核黄素溶液浸泡后羊膜中病毒滴度。
取500μmol/L核黄素溶液5mL，用生理盐水稀释至50mL。取上述染病毒过夜绒毛膜，浸泡于该溶液中约2小时。取出核黄素溶液浸泡后染毒绒毛膜，悬空沥干至无液滴滴下，按照1:9(绒毛膜：培养基，W:V)比例加入培养基，剪碎并匀浆30秒后取匀浆液用于测定经核黄素溶液浸泡后绒毛膜中病毒滴度。
对于紫外加核黄素试验组，验证3J/cm2、5J/cm2或者7J/cm2不同紫外照射剂量的病毒灭活效果。取上述核黄素溶液按照上述方法浸泡后并染病毒过夜羊膜，悬空沥干至无液滴滴下，平铺于培养皿内，置于紫外交联仪中。按需设置紫外照射剂量，照射过程中将羊膜翻面一次。照射结束，将羊膜取出，按照1:19(羊膜：培养基，W:V)比例加入培养基，剪碎并匀浆30秒后取匀浆液用于测定紫外照射剂量对羊膜中指示病毒的影响。取上述核黄素溶液浸泡后染毒绒毛膜，悬空沥干至无液滴滴下，平铺于培养皿内，置于紫外交联仪中。按需设置紫外照射剂量，照射过程中将绒毛膜翻面一次。照射结束，将绒毛膜取出，按照1:9(绒毛膜：培养基，W:V)比例加入培养基，剪碎并匀浆30秒后取匀浆液用于测定不同紫外照射剂量对绒毛膜中指示病毒的影响。
结果如下：
指示病毒Sindbis、EMCV采用Vero细胞培养，PRV、PPV采用ST细胞培养，因此需考察紫外照射步骤羊膜和绒毛膜对上述两种指示细胞的影响。将羊膜匀浆后20～200倍稀释，绒毛膜匀浆后10～100倍稀释，接种于Vero细胞或ST细胞进行细胞毒性试验。结果表明：羊膜匀浆液20倍稀释对Vero、ST细胞生长均无影响,绒毛膜匀浆液10倍稀释对Vero、ST细胞生长均无影响；因此紫外照射步骤羊膜中PRV、Sindbis、EMCV、PPV滴度最低检测限均为1.3log，绒毛膜中PRV、Sindbis、EMCV、PPV滴度最低检测限均为1.0log。
染病毒羊膜和染病毒绒毛膜分别经核黄素溶液浸泡2小时后，羊膜和绒毛膜中PRV、Sindbis、EMCV和PPV滴度变化值均在±0.5log以内(起始滴度对照组测定值减去未紫外处理对照组测定值)，说明单纯经核黄素溶液浸泡不能灭活羊膜和绒毛膜中的指示病毒。
染病毒羊膜和染病毒绒毛膜分别经核黄素溶液浸泡2小时后，沥干至无多余液滴滴下，在紫外箱中进行紫外光峰值为312nm的UVB紫外光照射，紫外强度为4400-5000μW/cm2，当照射剂量达到3J/cm2，5J/cm2和7J/cm2时取样，检测样品中病毒滴度，并与病毒起始滴度进行比较，即病毒起始滴度测定值的平均值(处理前)与各试验组取样点滴度测定值(处理后)之差为病毒滴度下降值。
表1紫外联合核黄素对羊膜的病毒滴度的降低效果(平均值±SD，n＝5)
Figure GDA0002980668430000131
表2紫外联合核黄素对绒毛膜的病毒滴度的降低效果(平均值±SD，n＝5)
Figure GDA0002980668430000141
根据上述结果，单独使用紫外线照射联合核黄素光敏剂的病毒灭活方法，5J/cm2的紫外照射剂量，可达到在生产过程中灭活病毒的总降低系数4log以上(即病毒数量下降到进行灭活前数量的万分之一以下)的病毒灭活效果。而该方法对于采用钴60或电子束辐照法难以灭活的PPV病毒的灭活效果较好，3J/cm2的紫外照射剂量即可达到在生产过程中灭活PPV病毒的总降低系数4log以上的病毒灭活效果。而采用钴60或电子束辐照法对于PPV病毒灭活效果不好。因此，该紫外加光敏剂的病毒灭活方法可用与钴60或电子束辐照法联合使用以分别降低两种方法的使用剂量和避免剂量过大对材料的损害。
试验例2
按照具体实施方式中所述生物材料的处理方法的具体步骤处理、干燥和包装后，得到羊膜和绒毛膜复合在一起的样本(以下简称羊膜/绒毛膜)。将生物羊膜/绒毛膜样本分为1.起始滴度对照组、2.未经钴60辐照处理对照组、3.辐照试验组进行钴60辐照方法的病毒灭活验证。
对于病毒滴度的测定采用试验例1中的方法，并计算工艺处理前后各批次样品中病毒滴度下降值。
对于起始滴度对照组，取干燥羊膜/绒毛膜样本称重并标记重量后分别置于培养皿，每片加入1mL指示病毒，封口后置于2-8℃冰箱中浸泡过夜染毒。次日，取出染病毒羊膜/绒毛膜，平铺在平皿内，冻干。冻干后羊膜/绒毛膜样本再次称重并标记重量。取样本每片加入5mL培养基，剪碎并匀浆30秒后取匀浆液0.5mL，培养基10倍稀释后测定羊膜/绒毛膜样本病毒起始滴度。
对于未辐照处理对照组，取上述染病毒过夜羊膜/绒毛膜，用泡罩和铝塑袋等封口包装后随试验组一起送至第三方钴60辐照公司，但不进行辐照。寄回后，取出生物羊膜/绒毛膜，每片加入5mL培养基，剪碎并匀浆30秒，取匀浆液0.5mL，培养基10倍稀释后测定羊膜/绒毛膜样本病毒起始浓度，用于测定样品中病毒滴度在寄送过程中的变化。
对于辐照试验组，验证10kGy、17.5kGy或者25kGy不同钴60辐照剂量的病毒灭活效果。取上述染病毒过夜羊膜/绒毛膜，包装后送至第三方钴60辐照公司，进行钴60辐照，辐照剂量对应为10kGy、17.5kGy和25kGy。辐照寄回后，取出生物羊膜/绒毛膜，每片加入5mL培养基，剪碎并匀浆30秒，取匀浆液0.5mL，培养基10倍稀释后测定辐照后样品中病毒滴度。
结果如下：
指示病毒Sindbis、EMCV采用Vero细胞培养，PRV、PPV采用ST细胞培养，因此需考察辐照步骤所处理样品-干燥羊膜/绒毛膜对上述两种指示细胞的影响。将钴辐照处理后生物羊膜/绒毛膜匀浆后10～100倍稀释，接种于Vero细胞或ST细胞进行细胞毒性试验。结果表明：辐照后生物羊膜/绒毛膜匀浆液10倍稀释对Vero、ST细胞生长均无影响，因此辐照步骤PRV、Sindbis、EMCV、PPV滴度最低检测限均为1.0log。
钴60辐照处理试验中，未辐照处理样品和对照组样品随实验组一起寄送至钴60辐照中心，但不作处理。在寄送来回途中染毒生物羊膜/绒毛膜中PRV滴度下降了1.6log，Sindbis滴度下降了1.4log，EMCV滴度下降了0.7log，PPV滴度下降了0.2log(起始滴度对照组测定值减去未辐照处理对照组测定值)。
染病毒生物羊膜/绒毛膜经10kGy、17.5kGy和25kGy钴60辐照处理后，检测样品中病毒滴度，并与病毒起始滴度进行比较，即病毒起始滴度测定值与各试验组取样点滴度测定值之差为滴度下降值。
表3钴60对羊膜/绒毛膜的病毒滴度的降低效果(平均值±SD，n＝5)
Figure GDA0002980668430000161
Figure GDA0002980668430000171
根据上述试验结果，使用低至钴辐照剂量10kGy的辐照剂量，可以降低PRV、Sindbis、EMCV三种病毒的滴度超过4log，但是不能降低PPV病毒滴度达到4log。依据试验例2的试验结果，结合试验例1的结果判断，使用10kGy钴60辐照羊膜/绒毛膜进行病毒灭活，结合紫外线照射联合核黄素光敏剂的病毒灭活方法，使用低至3J/cm2的紫外照射剂量分别照射羊膜和绒毛膜，即可达到生产过程中灭活病毒的总降低系数达到6log以上(即病毒数量下降到进行灭活前数量的百万分之一以下)，并且至少有一个病毒灭活步骤的降低倍数达到4log以上的要求。
试验例3
按照试验例1中所述的方法，将羊膜、绒毛膜分别使用核黄素溶液浸泡、染病毒(分别为PRV、Sindbis、EMCV、PPV)和紫外照射。照射后用泡罩和铝塑袋等封口包装后至第三方钴60辐照公司，进行钴60辐照灭菌。病毒起始滴度测定按照试验例1中所述。对于试验组，将羊膜、绒毛膜分别用1-3J/cm2的紫外(峰值为312nm的UVB)照射剂量进行照射后，再分别包装送第三方钴60辐照公司进行辐照，辐照剂量为10kGy。使用核黄素预先浸泡和2J/cm2紫外照射羊膜或绒毛膜，联合10kGy钴60辐照处理羊膜、绒毛膜或叠加在一起的羊膜、绒毛膜后，PRV、Sindbis、EMCV、PPV病毒滴度的降低倍数分别均超过6log以上。
试验例4
按照试验例1中所述的方法，将染病毒羊膜和染病毒绒毛膜分别经核黄素溶液浸泡2小时后，沥干至无多余液滴滴下，在紫外箱中进行紫外光峰值为302nm的UVB紫外光照射，当照射剂量达到3J/cm2，5J/cm2和7J/cm2时取样，检测样品中病毒滴度，并与病毒起始滴度进行比较，即病毒起始滴度测定值与各试验组取样点滴度测定值之差为滴度下降值。病毒滴度计算方法如试验例1中所述。对于指示病毒PRV、Sindbis、EMCV、PPV，5J/cm2的紫外照射剂量，可达到在处理羊膜或绒毛膜过程中灭活病毒的总降低系数4log以上(即病毒数量下降到进行灭活前数量的万分之一以下)的病毒灭活效果。3J/cm2的紫外照射剂量即可达到在生产羊膜或绒毛膜过程中灭活PPV病毒的总降低倍数4log以上的病毒灭活效果。
试验例5
按照试验例1中所述的方法，将染病毒羊膜和染病毒绒毛膜分别经核黄素溶液浸泡2小时后，沥干至无多余液滴滴下，在紫外箱中进行紫外光峰值为365nm的UVA紫外光照射，紫外强度为3800-4400μW/cm2，当照射剂量达到3J/cm2，5J/cm2和7J/cm2时取样，检测样品中病毒滴度，并与病毒起始滴度进行比较，即病毒起始滴度测定值与各试验组取样点滴度测定值之差为滴度下降值。病毒滴度计算方法如试验例1中所述。对于指示病毒PRV、Sindbis、EMCV、PPV，5J/cm2的紫外照射剂量，可达到在生产羊膜或绒毛膜过程中灭活病毒的总降低系数4log以上(即病毒数量下降到进行灭活前数量的万分之一以下)的病毒灭活效果。3J/cm2的紫外照射剂量即可达到在生产羊膜或绒毛膜过程中灭活PPV病毒的总降低倍数4log以上的病毒灭活效果。
试验例6
按照试验例1中所述的方法，将染病毒羊膜和染病毒绒毛膜分别经核黄素溶液浸泡2小时后，沥干至无多余液滴滴下，在紫外箱中进行紫外光峰值为312nm的UVB紫外光照射，当照射剂量达到2J/cm2，4J/cm2和6J/cm2时取样，检测样品中病毒滴度，并与病毒起始滴度进行比较，即病毒起始滴度测定值与各试验组取样点滴度测定值之差为滴度下降值。其中，羊膜、绒毛膜所染指示病毒与试验例1中不同，为HIV病毒(人类免疫缺陷病毒)。指示细胞系为MT-2细胞系，其余测定方法如试验例1中所述。对于HIV病毒，4J/cm2的紫外照射剂量，可达到在生产羊膜或绒毛膜过程中灭活病毒的总降低倍数4log以上(即病毒数量下降到进行灭活前数量的万分之一以下)的病毒灭活效果。
试验例7
将羊膜浸泡在含500μmol/L核黄素的溶液2小时后，沥干至无多余液滴滴下，峰值波长为312nm，紫外强度为4400-5000μW/cm2的紫外光源照射5J/cm2的能量后，测试羊膜的破断拉力，平均增加了5％的破断拉力，因此判断羊膜的经照射后强度增加。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (14)

1.一种羊膜或绒毛膜材料的处理方法，其特征在于，包括对羊膜或绒毛膜材料进行预处理，然后按照羊膜或绒毛膜材料的病毒灭活方法对羊膜或绒毛膜材料进行病毒灭活；
所述羊膜或绒毛膜材料的病毒灭活方法包括以下步骤：
紫外照射吸收有光敏剂的羊膜或绒毛膜材料，紫外使用剂量为1-8J/cm2；再对紫外照射后的羊膜或绒毛膜材料进行辐照，辐照剂量为8-25kGy，得到病毒灭活后的羊膜或绒毛膜材料；辐照包括γ射线辐照或电子束辐照。
2.根据权利要求1所述的羊膜或绒毛膜材料的处理方法，其特征在于，所述紫外照射的紫外光包括波长320-380nm的UVA或波长280-320nm的UVB。
3.根据权利要求2所述的羊膜或绒毛膜材料的处理方法，其特征在于，所述紫外照射的紫外光为波长峰值为312nm的紫外光或波长峰值为302nm的紫外光。
4.根据权利要求1所述的羊膜或绒毛膜材料的处理方法，其特征在于，所述辐照为钴60辐照。
5.根据权利要求1所述的羊膜或绒毛膜材料的处理方法，其特征在于，所述方法还包括对紫外照射后的羊膜或绒毛膜材料先进行干燥成型，再进行辐照的步骤。
6.根据权利要求1-3任一项所述的羊膜或绒毛膜材料的处理方法，其特征在于，所述光敏剂包括核黄素或者其衍生物、亚甲蓝、补骨脂素或其衍生物S59中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的羊膜或绒毛膜材料的处理方法，其特征在于，所述光敏剂为核黄素。
8.根据权利要求1所述的羊膜或绒毛膜材料的处理方法，其特征在于，预处理的方式包括洗涤和机械刮除。
9.根据权利要求8所述的羊膜或绒毛膜材料的处理方法，其特征在于，所述机械刮除包括刮除生物膜组织上的不透明层。
10.根据权利要求8所述的羊膜或绒毛膜材料的处理方法，其特征在于，预处理的方式还包括化学处理或酶解。
11.根据权利要求10所述的羊膜或绒毛膜材料的处理方法，其特征在于，所述化学处理包括使用化学试剂处理。
12.根据权利要求1所述的羊膜或绒毛膜材料的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)将羊膜或绒毛膜材料进行预处理，预处理包括洗涤和刮除不透明层；
(b)将预处理后的羊膜或绒毛膜材料浸泡在含有光敏剂的溶液中，使羊膜或绒毛膜材料充分吸收光敏剂；
(c)将羊膜或绒毛膜材料暴露于紫外光下进行照射，紫外光包括波长320-380nm的UVA或波长280-320nm的UVB，使用剂量为1-8J/cm2；
(d)紫外照射后对羊膜或绒毛膜材料进行清洗和干燥；
(e)对干燥后的羊膜或绒毛膜材料进行辐照，辐照剂量为8-25kGy，得到病毒灭活后的羊膜或绒毛膜材料。
13.一种权利要求1-12任一项所述的羊膜或绒毛膜材料的处理方法在制备促进组织修复、替代组织功能或修补组织器官的生物医用产品中的应用。
14.一种羊膜或绒毛膜材料，其特征在于，所述羊膜或绒毛膜材料经权利要求1-12任一项所述的羊膜或绒毛膜材料的处理方法获得。
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