CN1565654A - 体外循环血液中病毒灭活方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种体外循环血液中病毒灭活方法,包括下述步骤:1)全血源中加入抗凝剂,建立全血源循环系统;2)将抗凝全血抽入血浆分离装置,分离后,红细胞直接泵回全血源,血浆进入混合输送泵;3)同时向混合输送泵中加入光敏剂亚甲蓝,亚甲蓝与血浆混合后泵入血浆盛载器;4)光照仪对血浆盛载器中混合的血浆进行光照灭活,灭活后血浆泵入光敏剂去除装置;5)光敏剂去除装置吸附亚甲蓝,灭活后血浆抽回全血源;6)重复步骤2)至步骤5),直至全血源中病毒含量降低99.99%。本发明可以批量地、流水性以及循环处理血液,运用无菌和与外界隔离的一次性密闭系统进行处理,处理后的血浆回到全血源,可以直接用于输送到生物体。本发明还可进一步用于乙肝、丙肝、爱滋、SARS等病毒疾病的治疗以及在器官移植中用于清除受体病毒。
Description
技术领域
本发明涉及血液净化处理方法,具体涉及一种对循环血液中的病毒进行灭活的方法。
背景技术
众所周知,血液本身很容易沾染病毒,如乙肝病毒、丙肝病毒和艾滋病病毒等,而输血具有传播病毒性疾病的危险,血液安全是影响生命健康与安全的首要问题。对血液及其成分的病毒灭活是保障血液安全的措施之一,亚甲基蓝(MB)/光化学法可以灭活人血浆病毒,在对临床用单袋血浆的处理上已取得显著效果。但是,这种对单袋血浆的处理步骤比较繁琐:在处理之前需另外在特定环境中向血浆中添加亚甲蓝,再封袋,之后搁置在灭活装置中处理;而处理后的血浆,仍然无法直接使用,还必须再拆袋去除残留的亚甲蓝后再与红细胞混合才能用于输血。由于多次开袋和封袋,并且还有与红细胞混合的步骤,不仅对操作环境要求很高,既增加投入,也增加了袋内血液受污染的机会。如果需要长时间、大量地提供洁净的血液,单袋血浆分别处理的方法显然不能满足要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种对在体外循环血液中的病毒进行灭活的方法,它对血液进行在线循环处理的方法,可以满足对脱离生物体的循环血液进行实时在线病毒灭活。
为实现上述目的,本发明采取以下设计方案:
一种体外循环血液中病毒灭活方法,包括下述步骤:
1)全血源中加入抗凝剂,建立全血源循环系统;
2)将抗凝全血抽入血浆分离装置,分离后,红细胞直接泵回全血源,血浆进入混合输送泵;
3)同时向混合输送泵中加入光敏剂亚甲蓝,亚甲蓝与血浆混合后泵入血浆盛载器;
4)光照仪对血浆盛载器中混合的血浆进行光照灭活,灭活后血浆泵入光敏剂去除装置;
5)光敏剂去除装置吸附亚甲蓝,灭活后血浆抽回全血源;
6)重复步骤2)至步骤5),直至全血源中病毒含量降低99.99%。
其中,供全血源为库血,来源于血站、血库、血袋或储血器,或者为脱离生物体的体外循环血液,来源于输血管道。
混合输送泵为蠕动泵,血浆输送速度为30-150毫升/分钟,光敏剂输入速度为血浆输送速度的1%。
光照仪中光源为发光二极管组,血浆流入血浆盛载器内后接受光照仪光源的光照时间为60秒。血浆盛载器为两端带管道的密封容器。
光敏剂去除装置中所用吸附剂为凹凸棒材料。
上述泵管、管道、血浆分离器和血浆盛载器全部无菌并为与外界隔离的一次性密闭系统。
本发明的另一目的,在于提供上述体外循环血液中病毒灭活方法在灭活体循环血液中病毒以及治疗病毒性疾病中的应用。
采用上述技术方案,本发明的优点是:处理后的血浆为洁净血浆,可以直接送回全血源,用于输送到生物体;简化了血浆灭活的繁琐工序,可以批量地、流水性以及循环处理血液,实现实时在线对血浆进行病毒灭活;运用无菌和与外界隔离的一次性密闭系统进行处理,保证了血液的安全性。
附图说明
图1为本发明方法流程示意图;
图2为本发明方法中所用光照仪结构示意图;
图3为本发明方法中所用光敏剂去除装置结构示意图。
具体实施方式
如图1所示,示出本发明体外循环血液中病毒灭活方法流程,包括下述步骤:
1)在全血源1中加入抗凝剂,建立全血源循环系统;
2)将抗凝全血抽入血浆分离装置3,分离后,红细胞经红细胞输送管32直接泵回全血源1,血浆经血浆输送管33进入混合输送泵4;
3)同时经光敏剂输送管41向混合输送泵4中加入光敏剂亚甲蓝,调节加入速度和比例,使亚甲蓝与血浆在混合输送泵4的出液管42中混合。
4)光照仪6对混合好的血浆进行光照灭活,灭活后血浆泵入光敏剂去除装置7;
5)光敏剂去除装置7吸附亚甲蓝,血浆经血浆输出管71抽回全血源1中;
至此,完成全血源1中血浆分离、病毒灭活和去除光敏剂的一次循环过程,此时,经过此次循环的血浆中病毒可被99.99%杀灭。重复步骤2)至步骤5),可对全血源进行多次循环处理,直至全血源中病毒含量水平不足以影响身体健康和血液功能。
在上述处理过程中,所用仪器设备及试剂、材料可以为:
1)全血源:为库血,来源于血站、血库、血袋或储血器,或者为脱离生物体的体外循环血液,来源于输血管道。
2)血浆分离装置:北京京精医疗设备有限公司生产的血浆分离机。
3)混合输送泵:保定兰格恒流泵有限公司生产的BT00-100M型蠕动泵
4)光照仪光源:采用1.5方形发光二极管(波长为600-700nm)。经加工制成发光板,本发明中使用两块此发光板,对血浆上下两面同时照射。
6)光照仪照度测定方法:采用照度计测定光照强度。测量点距离与处理样品距离一致。
7)光照仪血浆盛载器:透明型血袋(100ml、200ml规格,PVC材料制成)。
8)抗凝剂:CPDA保养液,ACD保养液,肝素。
9)光敏剂亚甲基蓝(MB),北京永康制药厂生产的静脉注射用药品,规格20mg/2ml。亚甲蓝的配制:在超净工作台中用0.9%的灭菌静注用生理盐水稀释267.5倍,配成100μmol/L(含亚甲蓝37.4μg/ml)为亚甲蓝储存液。灭活时再做100倍稀释,即100ml血浆用一次性注射器加1ml亚甲蓝储存液,终浓度为1μmol/L。
10)光敏剂吸附材料:凹凸棒(天然多孔的纳米材料),交联琼脂包嵌凹凸棒微囊(CAA),CAA的制备工艺:
(1)凹凸棒的预处理:粉状凹凸棒原料药由南京大学制药厂提供,用前经稀酸浸泡约2小时,然后用碱中和,经蒸馏水反复处理至近中性,105℃下烘干后,仔细碾碎、过筛、除去100目以下微粉各用。
(2)微囊制备及交联反应:取适量琼脂粉(青岛水产品厂生产)混悬于蒸馏水中,干沸水浴中加热至琼脂熔化,溶液呈半透明无胶状物为止,制成2-6%浓度的琼脂溶液。再将凹凸棒粉按重量比20~30%混入热琼脂溶液中,仔细搅拌均匀。用加压喷珠法将上述混合物喷射至预先冷却的医用石蜡油混合物中,尽可能控制微囊大小,防止结块及凝结。聚集在底部的琼脂凹凸棒微囊待冷却后固化成“软珠”。先将“软珠”与大量石蜡油分离,然后用蒸馏水等洗除残留的石蜡油及琼脂残屑,每100ml琼脂可得CAA微囊200~250mL。
将软珠置干三口烧瓶内,加入计算量的交联剂环氧氯丙烷(使用前重蒸),稀NaOH溶液及适量稳定剂,混合均匀后,于40℃~50℃水浴中加热交联2~4h,不断振摇,以防止软珠凝结,直至交联反应完成。此时,可取少量CAA用蒸馏水洗净,调其pH值至近中性后,于小烧杯中煮沸10min,若蒸馏水清澈透明、微囊光洁不散、无琼脂脱落等现象,即说明交联反应已完成,能耐消毒灭菌处理。
上述包嵌完好的CAA微囊,冷却后滤出,经蒸馏水洗涤,稀酸中和,加入专门清除环氧交联剂的清洗液浸泡,取样分析无环氧氯丙烷残存后,按微囊直径大小,用分样筛分成<1mm、1~2mm、2~3mm、>3mm规格,分别装瓶,并用乙醇、蒸馏水最后清洗,以蒸馏水或生理盐水浸泡,密封供消毒灭菌用。
(3)灭菌:上述CAA密闭装瓶于121℃消毒30min,冷却后观察无琼脂脱落,上清液清澈透明,即得CAA成品,备用。
本发明中,最佳使用的光照仪6,可以采用图2所示结构:
光照仪6包括一个用于支撑血浆盛载器8的托板61,两块分置于托板61上下两面的作为光源的上发光板621和下发光板622,两块分别置于发光板外侧的上散热板631和下散热板632,以及风扇组64;托板61、发光板621和622、散热板631和632、以及风扇64均组装在光照仪机箱65中。光照仪机箱65两侧面具有穿孔651和652,血浆盛载器8置于所述托板61上,其进血管81通过光照仪6机箱65的穿孔651伸到光照仪机箱65之外,出血管82分别通过光照仪6机箱65的穿孔652伸到光照仪机箱65之外。
光照仪6中,发光板62的光源为发光二极管组,由很多发光二极管组装而成。发光二极管的数目和排列方式不限,以提供足够强度的光照为准。
托板61被安装在光照仪机箱65内,上面放置血浆盛载器8;为了使血浆盛载器8内的血浆和亚甲蓝可以进一步充分混合,在托板61的一端安装有步进电机66,当步进电机66工作时,带动托板61晃动或震动。
可用的血浆盛载器8可以为两端带管道的密封透明容器,也可为两端带软管的血浆袋。为保证灭毒性能,其形状最好为扁平状。
光照仪6的前面,管道连接混合输送泵4。泵4具有两个进口,一个用于连接血浆源输送管33,一个用于连接光敏剂源5输送管41;泵4的出液管42直接连通血浆盛载器8的进血管81。泵8可以将血浆和光敏剂按设定速度和比例泵入并在出液管42中混合后输送至血浆盛载器8。光敏剂可用亚甲蓝。
本发明中,最佳使用的光敏剂去除装置7,可以采用图3所示结构:光敏剂去除装置7为亚甲蓝过滤吸附器,参见图3,过滤吸附器7具有管状外壳,分为两端的管帽71和中间管72两部分,管帽71与中间管72螺接为可以连通的一体;其两端管帽71具有可与导管连接的突出连接端73,导管直径为2-5毫米,中间管42直径为2cm,两端由里向外依次设海绵层74、无纺布层75、带孔的挡板76和环形的密封垫圈77。中间管72内填充有吸附材料78,为天然多孔的纳米材料——凹凸棒;中间管72两端的多层结构允许液体渗过但可以隔离吸附材料78进入吸附过滤器7两端的导管73;挡板76外侧的密封垫圈77可以防止中间管72内液体从与管帽71之间的间隙渗出。
实施例一:
在室温下,向取自血袋中的全血源2000毫升中注入200毫升ACD保养液作为抗凝剂,将混合后的全血以100毫升/分钟速度抽入全血分离装置,分离后的红细胞泵回全血源,血浆以100毫升/分钟速度进入蠕动泵,同时,以1毫升/分钟速度将0.1mmol/l的亚甲蓝加入蠕动泵,从蠕动泵中流出混合后的血浆和亚甲蓝液并输入血浆盛载器中,混合液在光照仪中接受光照60秒灭活后,流入光敏剂去除装置,去除亚甲蓝后的纯净血浆再经管道流回全血源中;循环120分钟后关闭全血源输出管控制阀,待所有血液流回全血源,停止处理过程。
实施例二:
采用与实施例一相同的方法,改变全血源为1000毫升,抗凝剂为300单位的肝素,血液分离速度及血浆输入速度控制在30毫升/分钟,亚甲蓝加入速度为0.3毫升/分钟,循环时间控制在60分钟。
实施例三:
在室温下,向取自血袋中的全血源3000毫升中注入900单位的肝素作为抗凝剂,将混合后的全血以150毫升/分钟速度抽入全血分离装置,分离后的红细胞流入红细胞存储袋,血浆以150毫升/分钟速度进入蠕动泵,同时,以1.5毫升/分钟速度将0.1mmol/l的亚甲蓝加入蠕动泵,从蠕动泵中流出混合后的血浆和亚甲蓝液并输入血浆盛载器中,混合液在光照仪中接受光照60秒灭活后,流入光敏剂去除装置,去除亚甲蓝后的纯净血浆再经管道流入中血浆存储袋;20分钟后关闭全血源输出管控制阀。红细胞存储袋中的红细胞和血浆存储袋中的血浆重新混合使用或分别使用。
对经上面处理后的全血取样,对全血源中的病毒数量和各项生化指标进行检测,对照灭活前的指标,对灭活效果和生物安全性进行评价。
1、病毒灭活效果检测
分别检测水泡性口炎病毒(VSV)和Sindbis病毒(SV)。分别用非洲绿猴肾(Vero)细胞和金黄地鼠肾(BHK21)细胞以微量细胞病变法测病毒滴度,按Karber法计算1gTCID50来检测病毒灭活效果。参见表1-1:
表1-1 本发明处理前后血浆的病毒灭活效果
全血源体积 循环时间 病毒残留滴度1gTCID50
(ml) (分) VSV Sindbis
1000 60 ≤-0.5 -0.5
2000 120 ≤-0.5 -0.5
病毒对照 5.75 5.75
从表1-1可以看到,采用本发明方法对全血源处理一段时间后,即可灭活其中病毒。
2、本发明处理过程对血浆成分的影响测试
材料与方法:
凝血因子VIII、IX检测试剂盒:购自成都输血所,使用按说明书上的方法。
生化指标的测定:用进口全自动生化分析仪检测。
凝血因子检测:用进口自动血凝分析仪检测。
血浆pH的测定:用进口pH计测定。
灭活后血浆中亚甲蓝残留量的测定:按中国药典亚甲蓝项目下的吸光度检测方法,用进口紫外/可见分光光度计测定。
补体C3的测定:用邦定公司的琼脂单扩散板测定。
2.1对凝血因子VIII活性的影响测定:使用成都输血所生产的VIII因子检测试剂盒,检测经60分钟循环处理的三批样品,每批二袋血浆。结果如表2-1所示,经循环处理60分钟可致血浆中凝血因子VIII的活性略有降低,降低幅度在20%以内。
表2-1 循环处理60分钟对血浆凝血因子VIII活性的影响
样品批号 I II III
处理样品
因子VIII活性(%) 101(90.4%) 131.1(85.1%) 117.6(83.7%)
对照样品
因子VIII活性(%) 111.7(100%) 154.1(100%) 140.5(100%)
2.2对凝血因子IX活性的影响:使用成都输血所生产的因子IX检测试剂盒,检测三批样品,每批二袋血浆。结果如表2-2所示,循环处理60分钟可致血浆中凝血因子IX的活性略有降低,降低幅度在10%左右。
表2-2 循环处理60分钟对血浆凝血因子IX活性的影响
样品批号 I II III
处理样品
因子IX活性(%) 106.1(88.3%) 125.2(93.9%) 89.4(94.7%)
对照样品
因子IX活性(%) 120.2(100%) 133.2(100%) 94.4(100%)
2.3用自动凝血仪对灭活前后血浆中多种凝血因子进行检测:
结果见表2-3。
表2-3 循环处理60分钟对血浆凝血因子活性的影响
凝血因子 对照血浆 处理血浆(降低)
PT 14.9″(100%) 19.6″(31.5%)
APTT 63.0″(100%) 74.0″(17.5%)
II 24.6″(100%) 25.0″(1.6%)
V 29.2″(100%) 31.8″(8.9%)
VII 25.0″(100%) 26.8″(7.2%)
VIII 78.0″(100%) 83.6″(7.2%)
IX 63.6″(100%) 66.7″(4.9%)
X 29.6″(100%) 32.6″(10.1%)
XI 77.4″(100%) 82.6″(6.7%)
XII 67.7″(100%) 70.2″(3.7%)
2.4对补体C3含量的影响:用邦定生物公司生产的单扩散板,按使用说明操作,扩散48小时,用游标卡尺测扩散环的直径,查含量表。结果如表2-4所示,经循环处理60分钟的全血源中血浆补体C3含量与对照相比有5%左右的降低。
表2-4 循环处理60分钟对全血源中血浆补体C3含量的影响
样品批号 I II III
处理样品(mg/ml) 5.64(95.1%) 5.43(93.7%) 5.61(95.9%)
对照样品(mg/ml) 5.93(100%) 5.82(100%) 5.85(100%)
2.5对血浆蛋白等生化成分的影响:用自动生化分析仪检测结果见表2-5、2-6、2-7。
表2-5 循环处理60分钟对全血源中血浆生化酶类活性的影响
指标名称 单位 对照血浆 处理血浆
谷草转氨酶 iu/l 19(100%) 16(84.2%)
乳酸脱氢酶 iu/l 109(100%) 119(109.2%)
肌酸激酶 iu/l 108(100%) 55(50.9%)
碱性磷酸酶 iu/l 55(100%) 60(109.1%)
谷氨酰转酞酶 iu/l 16(100%) 17(106.2%)
谷丙转氨酶 iu/l 15(100%) 19(126.6%)
表2-6 循环处理60分钟对全血源中血浆蛋白含量的影响
指标名称 单位 对照血浆 处理血浆
葡萄糖 mM/l 22.6(100%) 21.2(93.8%)
总蛋白 g/l 58.8(100%) 58.8(100%)
白蛋白 g/l 36.8(100%) 36.1(98.1%)
甘油三酯 mM/l 1.54(100%) 1.62(105.2%)
表2-7 循环处理60分钟对全血源中血浆无机盐含量的影响
指标名称 单位 对照血浆 处理血浆
Ca mM/l 1.40(100%) 1.57(121.1%)
P mM/l 1.18(100%) 1.19(100.8%)
Mg mM/l 0.66(100%) 0.67(101.5%)
Na mM/l 135.7(100%) 135.1(99.8%)
K mM/l 3.24(100%) 3.22(99.3%)
Cl mM/l 58.9(100%) 58.7(99.7%)
Cho mM/l 3.86(100%) 3.82(98.9%)
2.6对全血pH值的影响:将全血用生理盐水做5倍稀释用Hanan pH计检测处理前后的变化,结果表明(表2-8)本发明处理方法不引起全血本身的pH值改变。
表2-8 循环处理60分钟对全血pH值的影响
样品批号 I II III
处理样品 7.35 7.38 7.36
对照样品 7.34 7.38 7.36
2.7电泳检测:将处理前后的全血经免疫电泳、交叉免疫电泳、凝胶电泳、SDS-凝胶电泳以及醋酸纤维素膜电泳检测未见新的抗原产生以及电泳区带和迁移率的变化。
以上实验表明,用本发明方法对全血进行循环处理60分钟后,在保证完全灭活血浆病毒的条件下,对血浆中各种生理活性成分未见明显的影响。
3、光敏剂去除装置对亚甲蓝吸附效果的实验
在本发明中,采用的是交联琼脂包嵌凹凸棒微囊(CAA)作为亚甲蓝的吸附材料。CAA对血浆中不同浓度的亚甲蓝吸附作用实验:吸附器过滤直径2厘米,CAA装载高度7厘米。在血浆中加不同量的亚甲蓝,使亚甲蓝的终浓度分别为1,2,3,4,6,8,10,15,20μmol/l,分别测滤前与滤后的吸光度。测定结果参见表3-1
表3-1 CAA对血浆中不同浓度MB的吸附
血浆中MB浓度 滤前OD 滤后OD 吸附率
(μmol/l) (%)
1 0.063 0.001 98.4
2 0.114 0.003 97.4
3 0.173 0.009 94.8
4 0.227 0.020 91.2
6 0.340 0.027 92.1
8 0.447 0.038 91.5
10 0.560 0.044 92.2
15 0.805 0.054 93.3
20 1.043 0.069 93.4
对本发明循环处理60分钟后全血源中CAA进行测定,浓度为0.002μmol/l,说明经光敏剂去除装置后,血浆中加入的亚甲蓝已被吸附。
经上述实验可以验证,本发明方法处理后的血液为洁净血液,病毒灭活效果明显,而对血液其它生物指标影响较小;增加的光敏剂去除装置,可以吸附添加的光敏剂,最大降低光敏剂对生物体可能产生的副作用;本发明采用与外界隔离的一次性密闭系统进行全血处理,降低了对血液二次污染的发生,同时简化操作工序,可以批量地、流水性以及循环处理全血,实现实时在线对血液病毒的灭活,保证了血液的安全性。
本发明方法在保证生物体安全的前提下,还进一步可用于灭活体循环血液中的病毒,并进一步应用在病毒性疾病的治疗中,如对乙肝、丙肝、爱滋等病毒疾病的治疗;以及在器官移植中用于清除受体病毒。
Claims (9)
1、一种体外循环血液中病毒灭活方法,其特征在于,包括下述步骤:
1)全血源中加入抗凝剂,建立全血源循环系统;
2)将抗凝全血抽入血浆分离装置,分离后,红细胞直接泵回全血源,血浆进入混合输送泵;
3)同时向混合输送泵中加入光敏剂亚甲蓝,亚甲蓝与血浆混合后泵入血浆盛载器;
4)光照仪对血浆盛载器中混合的血浆进行光照灭活,灭活后血浆泵入光敏剂去除装置;
5)光敏剂去除装置吸附亚甲蓝,灭活后血浆抽回全血源;
6)重复步骤2)至步骤5),直至全血源中病毒含量降低99.99%。
2、根据权利要求1所述的体外循环血液中病毒灭活方法,其特征在于:所述全血源为库血,来源于血站、血库、血袋或储血器,或者为脱离生物体的体外循环血液,来源于输血管道。
3、根据权利要求1所述的体外循环血液中病毒灭活方法,其特征在于:所述的混合输送泵为蠕动泵,血浆输送速度为30-150毫升/分钟,光敏剂输入速度为血浆输送速度的1%。
4、根据权利要求1所述的体外循环血液中病毒灭活方法,其特征在于:所述的光照仪中光源为发光二极管组,血浆流入血浆盛载器内后接受光照仪光源的光照时间为60秒。
5、根据权利要求4所述的体外循环血液中病毒灭活方法,其特征在于:血浆盛载器为两端带管道的密封容器,其置于光照仪中。
6、根据权利要求1所述的体外循环血液中病毒灭活方法,其特征在于:所述的光敏剂去除装置中所用吸附剂为凹凸棒材料。
7、根据权利要求1至6任一所述的体外循环血液中病毒灭活方法,其特征在于:所述步骤1)至步骤5)所用的泵、管道、血浆分离装置和血浆盛载器全部无菌并为与外界隔离的一次性密闭系统。
8、权利要求1至7任一所述体外循环血液中病毒灭活方法在灭活体循环血液中病毒的应用。
9、权利要求1至7任一所述体外循环血液中病毒灭活方法在病毒性疾病治疗中的应用。
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