CN103387613B - 一种血红蛋白及血红蛋白氧载体病毒灭活的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种人源或动物源的血红蛋白及血红蛋白氧载体的病毒灭活方法，并避免引起亚铁血红蛋白的氧化。该方法是先采用一氧化碳（CO）将溶液中的亚铁血红蛋白转化成碳氧血红蛋白（COHb），然后降低溶液至pH4.0±0.2，在此条件下维持足够时间充分将病毒灭活；再将pH调至7.0—9.0之间，应用透析或者超滤方法将溶液置换为生理溶液，最后用惰性气体将结合在血红蛋白上的CO除去，即完成了病毒灭活的过程。本发明实现了在低pH条件下对血红蛋白或血红蛋白氧载体进行病毒灭活，并可使血红蛋白维持最初的生理活性状态；对血红蛋白及血红蛋白氧载体都适用。

Description

一种血红蛋白及血红蛋白氧载体病毒灭活的方法

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及以血红蛋白（hemoglobin,Hb）为原料制备生物制品时病毒灭活的方法。

背景技术

用人或者动物的血红蛋白制备生物制品，为防止病毒的交叉感染，其生产工艺须具备一定的去除/灭活部分病毒能力，将其可能含有的病毒部分或全部去除。

由于不同生物制品潜在的病毒种类不同，所选择病毒去除/灭活方法的侧重点也应有所不同，故而有多种去除/灭活的方法。根据生物我国生物制品《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》，常用的方法有：⑴巴斯德消毒法（巴氏消毒法）；⑵干热法（冻干制品）；⑶有机溶剂/去污剂（S/D）处理法；⑷膜过滤法；⑸低pH孵放法；⑹化学灭活方法。其中低pH孵放法作为一种病毒灭活方法，常见用于生产人免疫球蛋白。

无基质血红蛋白（stroma-free hemoglobin,SFH）具有携氧释氧的能力，一直以来被作为氧载体制剂进行研究代替红细胞的功能，具有潜在的临床应用价值，由人或动物血红蛋白开发出来的代替红细胞携氧释氧功能的制剂被称为血红蛋白氧载体（Hemoglobin-based oxygen carriers,HBOCs）。这种制剂主要通过稳定血红蛋白四聚体并增加分子量或是分子半径的手段来克服天然血红蛋白的缺陷。目前开发的产品主要有四类：（1）聚合血红蛋白；（2）共轭血红蛋白；（3）分子内交联血红蛋白；（4）重组人血红蛋白。

在哺乳动物中，血红蛋白在天然状态下，它由两对亚基组成（2αβ），是一个四聚体的蛋白结构，分子量约为64,000道尔顿，每个亚基上有一个铁卟啉，当铁元素处于II价时，血红蛋白具有携氧释氧的能力，称为亚铁血红蛋白；当铁元素处于III价时，铁元素被氧化，血红蛋白不具有携氧释氧的能力，称为高铁血红蛋白。血红蛋白氧载体必须使血红蛋白处于亚铁血红蛋白时才具有携氧释氧的功能。

亚铁血红蛋白非常容易被氧化成高铁血红蛋白，特别是在低pH条件下，可被迅速氧化，因此，血红蛋白及由其为原料的血红蛋白氧载体都不能直接用低pH孵放法进行病毒灭活。

发明内容

本发明的目的是提供一种人源或动物源的血红蛋白及血红蛋白氧载体的病毒灭活方法，并避免引起亚铁血红蛋白的氧化。

本发明的基本方案是：

一种血红蛋白及血红蛋白氧载体病毒灭活的方法，待处理的血红蛋白或血红蛋白氧载体为溶液形态；该方法是先采用一氧化碳（CO）将溶液中的亚铁血红蛋白转化成碳氧血红蛋白（COHb），然后降低溶液至pH4.0±0.2，在此条件下维持足够时间充分将病毒灭活；再将pH调至7.0—9.0之间，应用透析或者超滤方法将溶液置换为生理溶液，最后用惰性气体将结合在血红蛋白上的CO除去，即完成了病毒灭活的过程。

基于上述基本方案，本发明确立了以下具体操作步骤：

步骤1：在密闭容器中加入血红蛋白或者血红蛋白氧载体溶液并进行搅拌，在溶液上方一侧通入CO气体，从另一侧排出，使亚铁血红蛋白转化成COHb，待转化率大于98%并且溶液中的氧分压低于2mmHg时进行步骤2；

步骤2：逐滴加入酸，使溶液pH逐渐降低至4.0±0.2，保持容器内部与外部大气的阻隔（可以继续通入CO，也可以停止通入CO但密封容器进气口、出气口）；

步骤3：低于20℃条件下，搅拌21天；

步骤4：逐滴加入碱，使溶液pH升至7.0以上（此时允许溶液接触大气）；

步骤5：应用透析或者超滤的方法将蛋白溶液系统置换为生理溶液系统；

步骤6：采用气体交换膜，液相一侧为所述生理溶液系统，气相一侧为惰性气体，将COHb中的CO解离出来（即：将结合于血红蛋白上的CO解离下来），待COHb含量下降至目标范围时，停止通入惰性气体，收集得到的溶液即为灭活病毒后的血红蛋白或者血红蛋白氧载体溶液。

本发明具有以下优点：

①实现了在低pH条件下对血红蛋白或血红蛋白氧载体进行病毒灭活；②不会引起亚铁血红蛋白的氧化，可使血红蛋白维持最初的生理活性状态；③对血红蛋白及血红蛋白氧载体都适用，特别是血红蛋白氧载体，血红蛋白氧载体可以被制备成氧亲和力较低的形式（即氧亲和力接近或低于天然红细胞），其对CO的结合力也相对较弱，因此去除更容易。

具体实施方式

本发明的基本思想是：采用一氧化碳（CO）将亚铁血红蛋白转化成碳氧血红蛋白（COHb），CO结合于铁卟啉上的亚铁上，保护亚铁而避免亚铁被氧化，降低溶液至pH4.0左右，在此条件下维持足够时间充分将病毒灭活（参考低pH孵放法，维持21天为宜），再将pH调至7.0—9.0之间，用透析或者超滤方法将溶液置换为生理溶液，并且用惰性气体将结合在血红蛋白上的CO除去，即完成了病毒灭活的过程。

具体实现可采用如下方案：

步骤1：在密闭容器中加入血红蛋白或者血红蛋白氧载体溶液并进行搅拌，在溶液上方一侧通入CO气体，从另一侧排出，使亚铁血红蛋白转化成COHb，待转化率大于98%（可使用血气分析仪对转化率进行监测）、并且溶液中的氧分压低于2mmHg时进行步骤2；

步骤2：逐滴加入酸，使溶液pH逐渐降低至4.0±0.2，阻止容器内部与大气交换（可以继续通入CO，或者停止通入CO但密封容器）；

步骤3：低于20℃条件下，搅拌21天；

步骤4：逐滴加入碱，使溶液pH升至7.0以上，此时溶液可接触大气；

步骤5：用透析或者超滤的方法将含有连二亚硫酸钠的溶液系统更换为生理溶液系统；

步骤6：用气体交换膜，液相一侧为蛋白溶液，气相一侧为惰性气体，将结合于血红蛋白上的CO解离下来，待COHb含量下降至可接受范围时，停止通入惰性气体，收集得到的蛋白溶液即为灭活病毒后的蛋白溶液。

以下给出三例病毒灭活验证实验，并相应限定了较佳的具体操作环节和参数；但以下示例不应理解为对本发明权利要求的限制。

例一：

步骤1：在一可密闭容器中加入10mg/mL的猪血红蛋白80mL，再加入10ml猪伪狂犬病毒（PRV），搅拌，在溶液上方通入CO气体，将亚铁血红蛋白转化成COHb，待转化率大于98%并且溶液中的氧分压低于2mmHg时进行步骤2；

步骤2：逐滴加入0.5mol/L盐酸，使溶液pH逐渐降低至3.9，停止通入CO，密封容器，阻止容器内部与大气交换；

步骤3：在10℃条件下，搅拌21天；

步骤4：逐滴加入0.5mol/L氢氧化钠，使溶液pH升至7.5，打开容器；

步骤5：以氯化钠为透析液，充分透析上述溶液；

步骤6：用气体交换膜，液相一侧为蛋白溶液，气相一侧为氮气，将结合于血红蛋白上的CO解离下来，待COHb含量下降至2%时，停止通入氮气，收集得到的蛋白溶液即为灭活病毒后的蛋白溶液。

分别在灭活前、灭活后第2、7、12、17、21天取样，生理盐水透析后，用细胞感染法检测灭活过程中病毒残余的滴度，细胞为叙利亚仓鼠肾细胞系（BHK-21），21天后检验结果病毒滴度降大于4log值，通过盲传三代实验，也未发现细胞异常，无病毒毒性。

例二：

步骤1：在一可密闭容器中加入60mg/mL的猪血红蛋白90mL，蛋白溶液中经测定PRV病毒为阳性，搅拌，在溶液上方通入CO气体，将亚铁血红蛋白转化成COHb，待转化率大于98%并且溶液中的氧分压低于2mmHg时进行步骤2；

步骤2：逐滴加入0.4mol/L盐酸，使溶液pH逐渐降低至4.1，停止通入CO，密封容器，阻止容器内部与大气交换；

步骤3：在8℃条件下，搅拌21天；

步骤4：逐滴加入1mol/L氢氧化钠，使溶液pH升至7.5，打开容器；

步骤5：以氯化钠为透析液，以20倍的体积透析蛋白溶液，每6小时一次，共透析4次；

步骤6：用气体交换膜，液相一侧为蛋白溶液，气相一侧为氮气，将结合于血红蛋白上的CO解离下来，待COHb含量下降至2%时，停止通入氮气，收集得到的蛋白溶液即为灭活病毒后的蛋白溶液。

对灭活病毒后的蛋白溶液进行验证，用细胞感染法检测灭活过程中病毒残余的滴度，细胞为叙利亚仓鼠肾细胞系（BHK-21），检验结果未检测到PRV病毒活性。通过盲传三代实验，也未发现细胞异常，无病毒活性。

例三：

步骤1：在一可密闭容器中加入4mg/mL的聚合猪血红蛋（一种典型的血红蛋白氧载体）80mL，蛋白溶液中经测定PRV病毒为阳性，搅拌，在溶液上方通入CO气体，将亚铁血红蛋白转化成COHb，待转化率大于98%并且溶液中的氧分压低于2mmHg时进行步骤2；

步骤2：逐滴加入0.4mol/L硫酸，使溶液pH逐渐降低至4.0，停止通入CO，密封容器，阻止容器内部与大气交换；

步骤3：在15℃条件下，搅拌21天；

步骤4：逐滴加入0.7mol/L氢氧化钾，使溶液pH升至7.7，打开容器；

步骤5：以0.9%氯化钠为透析液，用30kDa的超滤膜对溶液进行置换，使溶液转化为0.9%氯化钠溶液；

步骤6：用气体交换膜，液相一侧为蛋白溶液，气相一侧为氩气，将结合于血红蛋白上的CO解离下来，待COHb含量下降至2%时，停止通入氩气，收集得到的蛋白溶液即为灭活病毒后的聚合猪血红蛋溶液。

对灭活病毒后的蛋白溶液进行验证，用细胞感染法检测灭活过程中病毒残余的滴度，细胞为叙利亚仓鼠肾细胞系（BHK-21），检验结果未检测到PRV病毒活性。通过盲传三代实验，也未发现细胞异常，无病毒活性。

Claims (2)

1.一种血红蛋白及血红蛋白氧载体病毒灭活的方法，待处理的血红蛋白或血红蛋白氧载体为溶液形态；该方法是先采用一氧化碳（CO）将溶液中的亚铁血红蛋白转化成碳氧血红蛋白（COHb），然后降低溶液至pH4.0±0.2，在此条件下维持足够时间充分将病毒灭活；再将pH调至7.0—9.0之间，应用透析或者超滤方法将溶液置换为生理溶液，最后用惰性气体将结合在血红蛋白上的CO除去，即完成了病毒灭活的过程。

2.根据权利要求1所述的血红蛋白及血红蛋白氧载体病毒灭活的方法，其特征在于，包括以下主要步骤：

步骤（1）：在密闭容器中加入血红蛋白或者血红蛋白氧载体溶液并进行搅拌，在溶液上方一侧通入CO气体，从另一侧排出，使亚铁血红蛋白转化成COHb，待转化率大于98%并且溶液中的氧分压低于2mmHg时进行步骤（2）；

步骤（2）：逐滴加入酸，使溶液pH逐渐降低至4.0±0.2，保持容器内部与外部大气的阻隔；

步骤（3）：低于20℃条件下，搅拌21天；

步骤（4）：逐滴加入碱，使溶液pH升至7.0以上；

步骤（5）：应用透析或者超滤的方法将蛋白溶液系统置换为生理溶液系统；

步骤（6）：采用气体交换膜，液相一侧为所述生理溶液系统，气相一侧为惰性气体，将COHb中的CO解离出来，待COHb含量下降至目标范围时，停止通入惰性气体，收集得到的溶液即为灭活病毒后的血红蛋白或者血红蛋白氧载体溶液。