CN116496385A - 胶原蛋白制备过程中灭活病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胶原蛋白制备过程中灭活病毒的方法，包括取牛跟腱，并按照预定的标准进行切片，获得预定尺寸的牛腱片；制备第一处理溶液，并采用第一处理溶液对所述牛腱片进行处理，在处理后，采用清洗液对牛腱片进行清洗；制备检测病毒溶液和第二处理溶液，并依序采用待检病毒溶液和第二处理溶液处理所述清洗后的牛腱片，并取样测定，直到达到预设指标；对上一步骤获得的产物进行酶解处理，获得胶原蛋白。本技术方案提高了病毒灭活率、缩短了处理周期，在商业化时具有明显的技术优势。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白制备工艺技术，尤其是在提取胶原蛋白的过程中灭活病毒的方法。
背景技术
胶原蛋白是一种重要的护肤保健品和医疗用品，胶原蛋白也是细胞外间质的重要成分，对细胞的分化、结缔组织的修复等均其重要作用。
为了满足市场需求，技术人员采用柠檬酸、乙酸等方法对胶原蛋白进行去病毒处理。但是还存在周期长、成本高、副产物多、引入新的有害物质或产生新的废水等问题。
因此，需要进行研究创新，以解决上述问题。
发明内容
发明目的：提供一种胶原蛋白制备过程中灭活病毒的方法，以解决现有技术存在的上述问题之一。
技术方案：
提供一种胶原蛋白制备过程中灭活病毒的方法，其中灭火病毒验证过程包括如下步骤：
步骤S1、取牛跟腱，并按照预定的标准进行切片，获得预定尺寸的牛腱片；
步骤S2、制备第一处理溶液，并采用第一处理溶液对所述牛腱片进行处理，在处理后，采用清洗液对牛腱片进行清洗；
步骤S3、制备检测病毒溶液和第二处理溶液，并依序采用待检病毒溶液和第二处理溶液处理所述清洗后的牛腱片，并取样测定，直到达到预设指标；
步骤S4、对上一步骤获得的产物进行酶解处理，获得胶原蛋白。
根据本申请的一个方面，所述第一处理溶液为1M的氢氧化钠溶液，处理时间为1～2小时。
根据本申请的一个方面，所述第二处理溶液为乙酸溶液，浓度为0.5M，处理时间为18-30小时，处理温度25±1℃。
根据本申请的一个方面，所述步骤S3中，所述牛腱片的重量和乙酸溶液的体积之间比例为1:50。
根据本申请的一个方面，所述检测病毒采用指示病毒，所述指示病毒包括伪狂犬病毒、水疱性口炎病毒、猪细小病毒和脑心肌炎病毒。
根据本申请的一个方面，所述指示病毒孵放前细胞毒对照过程包括：取牛键片，加入生理盐水，剪碎并匀浆预定时间，吸出匀浆液并中和，剩余固体中加入生理盐水浸泡，吸出液体，再加入生理盐水浸泡，反复三次后合并匀浆液和浸泡液，用培养基稀释，接种至指示细胞，考察低pH孵放前样品对指示细胞的影响。
根据本申请的一个方面，所述指示病毒来源于国家兽医微生物菌种保藏中心中国普医药品监察所或中国典型培养物保藏中心。
有益效果：本技术方案提高了病毒灭活率、缩短了处理周期，在商业化时具有明显的技术优势。
附图说明
图1是本发明的灭活病毒的流程示意图。
图2是本发明的灭活病毒的验证过程和实际过程对比图。
图3是本发明的实验组和对照组的实施过程参数对比图。
具体实施方式
如图1所示，提供一种胶原蛋白制备过程中灭活病毒的方法，其中灭火病毒验证过程包括如下步骤：
步骤S1、取牛跟腱，并按照预定的标准进行切片，获得预定尺寸的牛腱片；
步骤S2、制备第一处理溶液，并采用第一处理溶液对所述牛腱片进行处理，在处理后，采用清洗液对牛腱片进行清洗；
步骤S3、制备检测病毒溶液和第二处理溶液，并依序采用待检病毒溶液和第二处理溶液处理所述清洗后的牛腱片，并取样测定，直到达到预设指标；
步骤S4、对上一步骤获得的产物进行酶解处理，获得胶原蛋白。
在进一步的实施例中，低pH孵放前细胞毒对照(C1)：取1g腱片，加入100ml生理盐水。剪碎并匀浆约15秒，吸出匀浆液并中和。剩余固体中加入2ml生理盐水浸泡3min，吸出液体，再加入2ml生理盐水浸泡3min。反复三次后合并匀浆液和浸泡液，用培养基稀释10倍，接种至指示细胞，考察低pH孵放前样品对指示细胞的影响。
低pH孵放后细胞毒对照(C2)：取1g腱片，按照1:50(W:V)加入0.5乙酸溶液50ml，搅拌5min后25℃静置24h。剩余腱片中加入0.5M NaOH溶液50ml中和。剪碎并匀浆约15秒，吸出匀浆液并继续中和。剩余固体中加入2ml生理盐水浸泡3min，吸出液体，再加入2ml生理盐水浸泡3min。反复三次后合并匀浆液和浸泡液，用培养基稀释10倍，接种至指示细胞，考察低pH孵放24h的样品对指示细胞的影响。
低pH孵放前病毒影响对照(C3)：酸处理前的腱片匀浆液用培养基10倍稀释后，加入指示病毒，考察低pH孵放前样品对指示病毒的影响。
低pH孵放后病毒影响对照(C4)：酸处理后的腱片匀浆液中和并用培养基10倍稀释后，加入指示病毒，考察低pH孵放后样品对指示病毒的影响。
根据本申请的一个方面，所述第一处理溶液为1M的氢氧化钠溶液，处理时间为1～2小时。
根据本申请的一个方面，所述第二处理溶液为乙酸溶液，浓度为0.5M，处理时间为18-30小时，处理温度25±1℃。
根据本申请的一个方面，所述步骤S3中，所述牛腱片的重量和乙酸溶液的体积之间比例为1:50。
根据本申请的一个方面，所述检测病毒采用指示病毒，所述指示病毒包括伪狂犬病毒、水疱性口炎病毒、猪细小病毒和脑心肌炎病毒。
根据本申请的一个方面，所述指示病毒孵放前细胞毒对照过程包括：取牛键片，加入生理盐水，剪碎并匀浆预定时间，吸出匀浆液并中和，剩余固体中加入生理盐水浸泡，吸出液体，再加入生理盐水浸泡，反复三次后合并匀浆液和浸泡液，用培养基稀释，接种至指示细胞，考察低pH孵放前样品对指示细胞的影响。
根据本申请的一个方面，所述指示病毒来源于国家兽医微生物菌种保藏中心中国普医药品监察所或中国典型培养物保藏中心。
病毒对照(C5)：考察病毒在培养基中的滴度。
起始滴度(C6)：按1:3(W:V)的比例向1g腱片中加入病毒液，使腱片完全浸泡在病毒液中，2～8℃浸泡吸收过夜，然后吸去腱片中未吸收的病毒液。加入100l生理盐水，剪碎并匀浆约15秒，吸出匀浆液。剩余固体中加入2ml生理盐水浸泡3min，吸出液体，再加入2ml生理盐水浸泡3min。反复三次后合并匀浆液和浸泡液，用培养基稀释10倍，接种至指示细胞，测定低pH孵放前样品中的病毒起始滴度。
中性对照(C7)：加入病毒的腱片，按照1:50(W:V)加入生理盐水中，25℃静置24h，考察未加乙酸的牛腱片在工艺时间内滴度变化。
零时取样(E0)：加入病毒的牛腱片，按照1:50(W:V)加入0.5M乙酸溶液～50ml，混匀。立即加入0.5M NaOH溶液50ml中和。剪碎并匀浆约15秒，吸出匀浆液并继续中和。剩余固体中加入2ml生理盐水浸泡3min，吸出液体，再加入2ml生理盐水漫泡3min。反复三次后合并匀浆液和浸泡液，用培养基稀释10倍，接种至指示细胞考察低pH解放零时胜片中的病毒滴度。
过程取样(E0.5-E24)：加入病毒的健片，按照1:50(W:V)加入0.5M乙酸溶液50ml，25℃静置24h，不同时间加入0.5M NaOH溶液～50ml中和，测定胜片中的病毒滴度，考察病毒灭活动力学。
参照消毒技术规范(2002版)2.1.1.10病毒灭活试验(以及《动物病毒学》(第二版)(四)病毒感染力的滴定的标准，应用终点稀释法测定处理前后各批次样品中的病毒滴度。
将不同时间所取的样品用0.22um一次性滤器过滤，然后用细胞维持液(含2％FBS的MEM培养液)对样品做10倍梯度稀释，立即加入已接种Vero细胞(EMCV，VSV指示细胞)或ST细胞(PRV，PPV指示细胞)的96孔板中，置于5％COz培养箱，37℃孵育1h后更换细胞维持液，再孵育72h(ST细胞孵育120h，每48h换液1次)，倒置显微镜下观察细胞病变。按Reed-Muench法计算病毒滴度(以半数细胞感染剂量TCID50表示，TCID50对数值＝病变率高于50％组稀释度的对数值+距离比例)，计算处理前后病毒滴度的下降值。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种等同变换，这些等同变换均属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.胶原蛋白制备过程中灭活病毒的方法，其特征在于，其中灭火病毒验证过程包括如下步骤：
步骤S1、取牛跟腱，并按照预定的标准进行切片，获得预定尺寸的牛腱片；
步骤S2、制备第一处理溶液，并采用第一处理溶液对所述牛腱片进行处理，在处理后，采用清洗液对牛腱片进行清洗；
步骤S3、制备检测病毒溶液和第二处理溶液，并依序采用待检病毒溶液和第二处理溶液处理所述清洗后的牛腱片，并取样测定，直到达到预设指标；
步骤S4、对上一步骤获得的产物进行酶解处理，获得胶原蛋白。
2.如权利要求1所述的胶原蛋白制备过程中灭活病毒的方法，其特征在于，所述第一处理溶液为1M的氢氧化钠溶液，处理时间为1~2小时。
3.如权利要求1所述的胶原蛋白制备过程中灭活病毒的方法，其特征在于，所述第二处理溶液为乙酸溶液，浓度为0.5M，处理时间为18-30小时，处理温度25±1℃。
4.如权利要求1所述的胶原蛋白制备过程中灭活病毒的方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述牛腱片的重量和乙酸溶液的体积之间比例为1:50。
5.如权利要求1所述的胶原蛋白制备过程中灭活病毒的方法，其特征在于，所述检测病毒采用指示病毒，所述指示病毒包括伪狂犬病毒、水疱性口炎病毒、猪细小病毒和脑心肌炎病毒。
6.如权利要求5所述的胶原蛋白制备过程中灭活病毒的方法，其特征在于，所述指示病毒孵放前细胞毒对照过程包括：取牛键片，加入生理盐水，剪碎并匀浆预定时间，吸出匀浆液并中和，剩余固体中加入生理盐水浸泡，吸出液体，再加入生理盐水浸泡，反复三次后合并匀浆液和浸泡液，用培养基稀释，接种至指示细胞，考察低pH孵放前样品对指示细胞的影响。
7.如权利要求5所述的胶原蛋白制备过程中灭活病毒的方法，其特征在于，所述指示病毒来源于国家兽医微生物菌种保藏中心中国普医药品监察所或中国典型培养物保藏中心。
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| CN202310187910.4A CN116496385A (zh) | 2023-03-02 | 2023-03-02 | 胶原蛋白制备过程中灭活病毒的方法 |
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2023
- 2023-03-02 CN CN202310187910.4A patent/CN116496385A/zh active Pending
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