CN114303462B - 一种红细胞代用品的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种红细胞代用品的制备方法，本发明的特征是取消了纯化红细胞内容物的步骤，用红细胞内容物直接聚合血红蛋白；与现有技术相比：本发明制备的红细胞代用品具有较强的抗氧化性能，故使保质期延长三倍以上；同时保留了红细胞较为完整的功能；由于减少了血红蛋白纯化的步骤，在制备中对温度条件的要求降低，使制备过程简单，缩短了生产周期，降低了生产成本；经动物对比实验观察，所制备的产品有降低不良反应的作用；本发明制备方法适用于采用聚合血红蛋白方式制备红细胞代用品。

Description

一种红细胞代用品的制备方法

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种以人或动物来源的血液制备红细胞代用品。

背景技术

输血在临床手术、抗灾、恐怖袭击和战地救护中都是非常重要的医疗手段，目前主要是靠人们献血来满足需求。由于人类的血型复杂，输血时必须进行配型，并且血液的储存期短、运输不便、来源有限，还存在有艾滋病、乙肝等病毒传染的潜在危险，这些都使得血液在突发事件的紧急救护受到限制，尤其是紧急状态的大量使用。近年来，随着血液需求量的不断增高，仅靠人类自身献血很难满足日益增长的需求，因此开发安全有效的血液代用品对于缓解上述问题有着重要的意义。

血红蛋白具有携氧释氧的能力，一直以来被作为氧载体制剂用于代替红细胞的功能研究，具有潜在的临床应用价值，由血红蛋白制备的代替红细胞功能的制剂被称为血红蛋白类氧载体(Hemoglobin-based oxygencarriers，HBOCs)，亦被称为红细胞代用品；其具有能够被消毒、容易储存、无需交叉配型的特点，特别适合于突发事件中的紧急使用。这种制剂主要通过稳定血红蛋白四聚体并增加分子量或是分子半径的手段来克服天然血红蛋白的缺陷。在稳定血红蛋白四聚体的试剂中，常用的是多醛基化合物(如戊二醛)；血红蛋白有40个左右的赖氨酸的氨基暴露在血红蛋白表面，多醛基分子可以与这些氨基反应，形成不均一的聚合物分子。

在现有的制备方法中，都是将红细胞溶胀，得到细胞内容物(即红细胞膜内的全部物质)，再将内容物纯化，去除其中除血红蛋白以外的蛋白，纯化的目的是尽可能地降低红细胞代用品的免疫原性。美国专利5,895,810记载了一种用戊二醛交联血红蛋白制备红细胞代用品的方法，其中所用的血红蛋白为被纯化的高纯度血红蛋白。据报道，采用这种血红蛋白制备的红细胞代用品，在临床实验中有血压升高、腹痛、恶心、头晕、心肌梗死、自由基导致的氧化应激损伤等多种不良反应；在制备过程中该制品也非常容易造成不具有载氧能力的高铁血红蛋白升高，也会使有效期缩短。

本申请人研究发现，这种红细胞代用品的使用，所出现的不良反应与血红蛋白的高纯度有关。原因在于红细胞中许多内容物间有一系列的平衡关系，在经过纯化后，这种平衡被全部破坏，功能较为单一；最为明显的例证就是抗氧化系统，超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)是抗氧化系统中最重要的酶，经测定，在血红蛋白纯化前SOD和CAT的活性分别为8,000～30,000U/g和30,000～150,000U/g；而纯化后，其活性分别在0～150U/g和0～300U/g之间，其抗氧化功能的丧失，导致后续生产需在低温条件下进行，条件较为苛刻，成本升高，有效期也相应缩短。

发明内容

针对现有技术所存在的问题，本发明的目的是提出一种红细胞代用品的制备方法，使所制备的红细胞代用品在临床应用中能够减轻和消除所出现的不良反应，并克服生产制备中所要求的苛刻条件。

目前，红细胞代用品的制备方法为：①在血液中加入抗凝剂进行抗凝，离心或超滤去除血浆蛋白和白细胞，进行红细胞的纯化；②用低渗盐对红细胞进行低渗，使红细胞的内容物释放出来；③用层析或巴氏灭活的方法对红细胞的内容物进行纯化，得到高纯度血红蛋白；④用交联剂将血红蛋白聚合，得到血红蛋白聚合体的混合物；⑤用凝胶过滤或超滤方法去除未聚合的血红蛋白，并置换载体溶液，得到红细胞代用品。本发明的特征在于，取消现有技术中纯化红细胞内容物的步骤，用红细胞内容物直接聚合血红蛋白。所制备的红细胞代用品拥有红细胞内容物的大部分理化功能；为了增加和增强红细胞代用品的其它功能，还可以向红细胞内容物中加入相应的蛋白质。

本发明所提出红细胞代用品制备方法的具体步骤包括：

步骤一、取经过抗凝剂抗凝的血液，离心后弃上清，并将悬浮于细胞上层的白细胞去除，用四倍体积的生理盐水将细胞重新悬浮；

为了进一步去除血浆蛋白，可将红细胞用生理盐水稀释到10mg/ml～70mg/ml(以血红蛋白计)之间，采用中空纤维柱进一步洗涤红细胞，直到血浆蛋白浓度小于0.5μg/ml。

步骤二、配制pH为7.2～9.0的磷酸盐缓冲液；按照磷酸盐缓冲液与红细胞溶液的体积比为0.8～1比1比例，在搅拌条件下缓慢加入磷酸盐缓冲液，搅拌3～10小时，使红细胞中的内容物释放出来；用中空纤维柱以生理盐水进行洗涤，滤出物即为红细胞内容物；为提高红细胞内容物中SOD和CAT的活性，可另外加入SOD和CAT，使其酶活性分别在0.8万～20万U/ml和3万～150万U/ml；

步骤三、调整血红蛋白的浓度至10～60mg/ml，调pH值至7.8～8.5；用浓度为0.02～0.15mol/L(合适值为0.05～0.1mol/L)的多醛基化合物溶液(如：戊二醛、甲基乙二醛、丙二醛、己二醛、开环棉籽糖的任一种)，按照血红蛋白与多醛基化合物的摩尔比为1比20～40的量，在搅拌条件下将多醛基化合物溶液加至血红蛋白溶液中，搅拌反应0.5～2小时；按照多醛基化合物与终止剂摩尔比为1比10～80的量加入终止剂，搅拌反应3～20小时；终止剂是具有还原作用的硼化物，如二甲胺基硼烷、或三甲胺基硼烷、或三乙胺基硼烷、或硼氢化钠的任一种；

步骤四、采用超滤或是凝胶过滤的方法对终止的反应溶液进行换液，将缓冲液置换成生理液，同时去除小于100kDa的血红蛋白，得到红细胞代用品；所述的生理液为林格液、或乳酸林格液、或生理盐水的任一种。

由上述方案可以看出，本发明采用红细胞全部内容物制备红细胞代用品，与现有技术相比具有以下优点：①由于减少了血红蛋白纯化的步骤，维持了红细胞内容物抗氧化系统的活性，使制备的红细胞代用品具有较强的抗氧化性能，保留了红细胞较为完整的功能，如载氧/释氧、抗氧化功能；②同时，在加入某些蛋白后，还可增加和增强某些特性；③减少了血红蛋白纯化的步骤，使制备过程简单，缩短了生产周期，降低了生产成本；④由于红细胞内容物较为全面，使易氧化的血红蛋白的抗氧化性能增强，故使红细胞代用品的保质期延长三倍以上；⑤由于红细胞内容物的抗氧化性能较强，在制备中对温度条件的要求降低；⑥由于SOD和CAT仍保持较高的活性，使得红细胞代用品在使用时，具有抗自由基损伤的作用；⑦本发明所制备的红细胞代用品经动物对比实验观察，实验组的动物精神状态良好，对照组有状态不安的动物出现；另发现，实验组在使用三天后，高铁血红蛋白低于10％，而对照组在同样条件下高铁血红蛋白上升至20～30％；据报道，过高的高铁血红蛋白会产生一定的毒性；因此，本发明所制备的产品有降低不良反应的作用。本发明制备方法适用于采用聚合血红蛋白方式制备红细胞代用品。

具体实施方式

以下结合实例详细说明本发明技术方案的具体实施方式。

实例1、

步骤1、将经过抗凝的血液300ml，以3000转/分钟离心20min，弃上清，以100ml红细胞用400ml生理盐水将细胞重新悬浮；重复上述步骤5遍；

步骤2、用生理盐水将红细胞稀释到30mg/ml(以血红蛋白计，以下同)，采用0.45μm中空纤维柱洗涤红细胞，直到血浆蛋白浓度小于0.5μg/ml；

步骤3、配制浓度为20mM的磷酸盐缓冲液(pH7.5)；按1比1的体积比，在搅拌条件下向红细胞溶液中缓慢加入磷酸盐缓冲液，搅拌5小时使红细胞中的内容物释放出来；

步骤4、用孔径0.1μm的中空纤维柱以生理盐水进行洗涤，滤出物即为红细胞内容物；

步骤5、调整血红蛋白的浓度至30mg/ml(pH7.8)，按照血红蛋白与戊二醛为1比20的摩尔比，搅拌加入0.075mol/L浓度的戊二醛溶液，搅拌反应1小时后，按照戊二醛与二甲胺基硼烷的摩尔比为1比25的量，搅拌加入w/v浓度为10％的二甲胺基硼烷溶液，搅拌反应20小时；

步骤6、采用100kDa的中空纤维柱以生理盐水去除100kDa以下的蛋白质，使其含量低于5％；调整蛋白质浓度至10％(pH7.4)，得到红细胞代用品。

实例2、

步骤1、将经过抗凝的血液300ml，以4000转/分钟离心15min弃上清，取100ml红细胞用400ml生理盐水将细胞重新悬浮；重复上述步骤10遍；

步骤2、配制浓度为20mM的磷酸盐缓冲液(pH8.0)；按0.85比1的体积比，在搅拌条件下向红细胞溶液中缓慢加入磷酸盐缓冲液，搅拌10小时使红细胞中的内容物释放出来；

步骤3、用孔径0.1μm的中空纤维柱以生理盐水进行洗涤，滤出物即为红细胞内容物；

步骤4、调整血红蛋白的浓度至50mg/ml(pH8.5)，加入超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，使溶液中两种酶的活性分别为3万U/ml和10万U/ml；

步骤5、按照血红蛋白与丙二醛为1比40的摩尔比，搅拌加入0.1mol/L浓度的丙二醛溶液，搅拌反应1小时后，按照丙二醛与三甲胺基硼烷的摩尔比为1比50的量，搅拌加入w/v浓度为10％的三甲胺基硼烷溶液，搅拌反应10小时；

步骤6、采用100kDa超滤膜以林格液去除100kDa以下的蛋白质，使其含量低于5％；调整蛋白质浓度至11％(pH7.4)，得到红细胞代用品。

Claims (3)

1.一种红细胞代用品的制备方法，其特征在于，取消纯化红细胞内容物的步骤，用红细胞内容物直接聚合血红蛋白，具体步骤包括：

步骤一、取经过抗凝的血液离心后弃上清，并将悬浮于细胞上层的白细胞去除，用四倍体积的生理盐水将红细胞重新悬浮；

步骤二、配制pH为7.2～9.0的磷酸盐缓冲液；按照磷酸盐缓冲液与红细胞溶液体积比为0.8～1比1的比例，在搅拌条件下缓慢加入磷酸盐缓冲液，搅拌3～10小时后，用中空纤维柱以生理盐水进行洗涤，滤出物即为红细胞内容物；

步骤三、调整血红蛋白的浓度至10～60mg/ml，调pH值至7.8～8.5；用浓度为0.02～0.15mol/L的多醛基化合物溶液，按照血红蛋白与多醛基化合物的摩尔比为1比20～40的量，在搅拌条件下将多醛基化合物溶液加至血红蛋白溶液中，搅拌反应0.5～2小时；按照多醛基化合物与终止剂的摩尔比为1比10～80的量加入终止剂，搅拌反应3～20小时；

步骤四、采用超滤或是凝胶过滤的方法对终止的反应液进行换液，将缓冲液置换成生理液，去除小于100kDa的血红蛋白，得到红细胞代用品。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述的步骤一中，将重新悬浮的红细胞用生理盐水稀释到10mg/ml～70mg/ml之间，采用中空纤维柱进一步洗涤红细胞，直到血浆蛋白浓度小于0.5μg/ml。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤三中，在血红蛋白溶液中加有SOD和CAT，使酶活分别为0.8万～20万U/ml和3万～150万U/ml。