JP6049854B2 - 物質内包ベシクル及びその製造方法 - Google Patents

物質内包ベシクル及びその製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、新規な物質内包ベシクル及びその製造方法に関する。
一次構造が精密に制御された高分子を自己組織化させることにより、ベシクルを形成し得ることが知られている。斯かるベシクルは多様な分子設計が可能であるとともに、高分子が本来有する性質に加えて新たな機能を呈する可能性があることから、薬物送達システム（Drug Delivery System：ＤＤＳ）の担体や、バイオマテリアル・機能性材料等としての利用が検討されている。
特許文献１（特開平８−１８８５４１号公報）には、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとを有するブロック共重合体を自己組織化させてなる静電結合型高分子ミセル薬物担体が、本発明者らの一部によって開示されている。
非特許文献１（Schlaad H. et al., Macromolecules, 2003, 36 (5), 1417-1420）には、ポリ（１，２−ブタジエン）ブロック及びポリ（セシウムメタクリレート）ブロックからなるブロック共重合体と、ポリスチレンブロック及びポリ（１−メチル−４−ビニルピリジウムアイオダイド）ブロックからなるブロック共重合体とを自己組織化させてなる、ポリマーソームと称されるベシクルが開示されている。
特許文献２（国際公開第２００６／１１８２６０号パンフレット）には、非荷電親水性セグメントとカチオン性セグメントとを有する第１のブロック共重合体（例えばＰＥＧ−ポリカチオン等）と、非荷電親水性セグメントとアニオン性セグメントとを有する第２のブロック共重合体（例えばＰＥＧ−ポリアニオン等）とを自己組織化させてなるベシクルが、本発明者等の一部によって開示されている。
非特許文献２（Anraku Y. et al., J. Am. Chem. Soc., 2010, 132 (5), 1631-1636）には、非荷電親水性セグメントと荷電性セグメントとを有するブロック共重合体（例えばＰＥＧ−ポリカチオン等）と、前記荷電性セグメントとは逆の電荷に荷電した共重合体（例えばポリアニオン等）とを自己組織化させてなるベシクルが、本発明者等の一部によって開示されている。
高分子の自己組織化により得られる前記の各種ベシクルは、その空隙部に各種の物質を包含・担持させて利用することが考えられる（概説につき非特許文献３（H. Nyin et al. Soft Matter, 2006, 2, 940-949）及び非特許文献４（「リポソーム応用の新展開」、秋吉一成等監修、エヌ・ティー・エス、2005年）参照）。
空隙部に物質が内包されたベシクル（以降「物質内包ベシクル」と表示する場合がある）を製造する方法としては、内包させるべき物質（以降「被内包物質」と表示する場合がある）を、膜の構成要素となる高分子、或いは予め形成された高分子膜とともに混合し、自己組織化によるベシクルの形成と空隙部への物質の封入とを同時に行う方法が代表的である（以降「同時混合法」と表示する場合がある）。具体例としては、エマルション法（非特許文献５（F. Szoka, Jr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978 75 (9) 4194-4198）参照）や、脂質有機溶液滴下法（非特許文献６（Batzri, S. et al., Biochim. Biophys Acta 1973, 298, 1015-1019）参照）等が挙げられる。
しかし、同時混合法では、被内包物質の存在が自己組織化によるベシクルの形成に影響を与え、ベシクルの形成が阻害される場合や、ベシクルが形成されても物質が空隙部へ内包されない場合がある。また、成膜に有害な有機溶剤を用いる場合が多く、プロセスが煩雑になるとともに、有機溶剤により被内包物質が損傷を受け易いという課題もある。更に、均一な粒径・構造を持つベシクルの形成が困難であり、斯かる均一な粒径・構造を確保するためには別の工程を追加せざるを得ず、プロセスが煩雑になり易いという課題もある。よって本方法は汎用性に乏しく、種々の物質内包ベシクルを製造する手法としては実用的ではない。
一方、主に中空粒子への物質封入に用いられる手法として、既存中空粒子の空隙部に後から被内包物質を導入し、包含・担持させる方法（以降「後担持法」と表示する場合がある）があり（例えば非特許文献７（W. Tong et al. J. Phys. Chem. B, 2005, 109, 13159-13165）等参照）、斯かる手法をベシクルに応用することも考えられる。
しかし、後担持法をベシクルに応用する場合、空ベシクルの膜を越えて被内包物質を空隙部に導入するための工夫が必要となる。例えば、空ベシクルを膨潤させて膜を弛緩させ、生じた膜の間隙から被内包物質を浸透させて空隙部に導入した後、膜を収縮させて被内包物質の脱落を防止する手法や、空ベシクルの膜に孔を形成し、当該孔を通じて被内包物質を空隙部に導入した後、当該孔を封鎖して被内包物質の脱落を防止する手法等が考えられるが、何れも極めて煩雑であり、実用化には大きな不利益となる。また、被内包物質の封入・担持時に、既存の空ベシクルの粒径・構造が乱されてしまう可能性が高く、とても実用的ではないと考えられてきた。
また、リポソーム等の脂質二重膜ベシクルについては、脂質二重膜にチャネルタンパク質を埋め込む等の手法（非特許文献８（Ranquin A, Versees W, Miere W, Steyaert J, Gelder PV. Therapeutic Nanoreactors: Combining Chemistry and Biology in a Novel Triblock Copolymer Drug Delivery System. Nano Lett. 2005;5:2220-4）参照）も報告されているが、やはりプロセスが極めて煩雑である上に、汎用性が極めて低く、やはり実用的ではない。
以上の背景技術に対して、本発明者等は、非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体と、第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体とを含んでなる膜を有するとともに、膜によって包囲された空隙部を有する空ベシクルを、空ベシクルに内包すべき目的物質の存在下、水性媒体中で混合する方法（上記「後担持法」に相当）によっても、第１及び第２の重合体の自己組織化により、空隙部（内水相）に目的物質が内包された物質内包ベシクルを簡便かつ効率的に製造することができるという、極めて意外な知見を見出し、特許出願を行っている（特許文献３：国際公開第２０１１／１４５７４５号パンフレット）。
特開平８−１８８５４１号公報 国際公開第２００６／１１８２６０号パンフレット 国際公開第２０１１／１４５７４５号パンフレット
Schlaad H. et al., Macromolecules, 2003, 36 (5), 1417-1420 Anraku Y. et al., J. Am. Chem. Soc., 2010, 132 (5), 1631-1636 H. Nyin et al. Soft Matter, 2006, 2, 940-949 「リポソーム応用の新展開」、秋吉一成・辻井薫監修、エヌ・ティー・エス、2005年 F. Szoka, Jr. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978 75 (9) 4194-4198 Batzri, S. et al., Biochim. Biophys Acta 1973, 298, 1015-1019 W. Tong et al., J. Phys. Chem. B, 2005, 109, 13159-13165 Ranquin A et al., Nano Lett. 2005, 5:2220-4
しかしながら、後担持法等の従来法では、水性媒体中に存在する目的物質の濃度が一定濃度を超えると、空ベシクルの単分散集合体に、その単分散性を維持しつつ、目的物質を封入することができないため、形成される物質内包ベシクルは多分散集合体となる。
また、空ベシクルへの目的物質の封入は、水性媒体中に存在する目的物質の濃度に依存した確率的な事象として生じるため、後担持法等の従来法では、空ベシクルに２種以上の目的物質を、その封入量を制御して封入することが困難である。
また、従来の手法により製造される静電相互作用型ベシクルは、内包可能な物質のサイズに制限があった。具体的に被内包物質の径の上限は、最大でも２〜３０ｎｍ程度に限定されており、より大きなサイズ（例えば３０ｎｍ超）の粒子を内包するベシクルは得られていなかった。また、通常の静電相互作用型ベシクルは半透膜の性質をもつため、被内包物質の径の下限についても分子量数千程度までに限定されており、より小さな分子量を有する低分子化合物を内包させることは極めて困難であった。
また、従来の静電相互作用型ベシクルへの物質の内包率は、被内包物質の物理化学的特性にもよるが、ベシクルと被内包物質を混合する際の溶液中の濃度に応じた確率論的なレベルに限定されており、より高い効率でベシクルに物質を内包させることは極めて困難であった。特に、ベシクルに対する被内包物質のサイズの比が大きい場合（例えば径１００ｎｍ程度のベシクルに対して１０ｎｍ（十分の一）以上の径の粒子を内包させる場合）、内包効率が極めて低く、通常は多量の被内包物質が内包されずに余ってしまう上に、空のベシクルが多量に残ってしまうという課題があった。
また、従来の手法により製造される静電相互作用型ベシクルでは、ベシクル（又はその構成要素となる重合体）と被内包物質とを水性媒体中で混合することにより被内包物質をベシクルに内包させるので、水溶性媒体に対する溶解性の低い物質（低水溶性物質）をベシクルに効率よく内包させることは極めて困難であった。
そこで、本発明は、第一に、従来法よりも高濃度（例えば、後担持法において物質内包ベシクルの単分散集合体の形成が阻害される濃度）の目的物質が封入された物質内包ベシクルの単分散集合体、及び、水性媒体中に存在する目的物質の濃度が高濃度（例えば、後担持法において物質内包ベシクルの単分散集合体の形成が阻害される濃度）であっても、物質内包ベシクルの単分散集合体を形成することができる物質内包ベシクルの製造方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、第二に、２種以上の目的物質が、その封入量を制御して封入された物質内包ベシクル、及び、２種以上の目的物質を、その封入量を制御して封入することができる物質内包ベシクルの製造方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、第三に、高分子の自己組織化による静電相互作用型ベシクルにおいて、従来と比べてより大きな径の粒子やより小型の低分子化合物を効率的に内包させることや、従来よりも物質の内包効率を向上させることが可能な、物質内包ベシクルの製造方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、第四に、高分子の自己組織化による静電相互作用型ベシクルにおいて、水溶性媒体に不溶性又は低水溶性の物質をベシクルに効率よく内包させることが可能な、物質内包ベシクルの製造方法を提供することを目的とする。
本発明の主旨は、以下に存する。
［１］非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体と、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体とを含んでなり、前記第１及び／又は前記第２の重合体が架橋された架橋膜と、
前記架橋膜によって包囲された内水相と
を含んでなり、前記内水相に目的物質が内包された物質内包架橋ベシクルの単分散集合体であって、
前記内水相に含有される前記目的物質の濃度が、
前記第１及び／又は前記第２の重合体が架橋されていない点及び前記目的物質が内包されていない点で前記物質内包架橋ベシクルの単分散集合体と異なる空の非架橋ベシクルの単分散集合体を、前記物質内包架橋ベシクルの内水相と同一濃度の前記目的物質を水性媒体とともに含有する混合液中で混合した場合に、
前記目的物質が内包された物質内包非架橋ベシクルの単分散集合体の形成を阻害する濃度である、前記物質内包架橋ベシクルの単分散集合体。
［２］０．２以下の多分散指数を有する、上記［１］に記載の物質内包架橋ベシクルの単分散集合体。
［３］前記目的物質の重量平均分子量が１００００〜４００００であり、前記内水相に含有された前記目的物質の濃度が５ｍｇ／ｍＬを上回る、上記［１］又は［２］に記載の物質内包架橋ベシクルの単分散集合体。
［４］前記第１及び／又は前記第２の重合体が、カチオン基間に形成された架橋結合、アニオン基間に形成された架橋結合、及びカチオン基とアニオン基との間に形成された架橋結合からなる群より選択された１種又は２種以上の架橋結合によって架橋されており、前記架橋結合が形成された割合が、前記架橋膜に含まれるカチオン基及び／又はアニオン基の総モル数の３５％以上である、上記［３］に記載の物質内包架橋ベシクルの単分散集合体。
［５］非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体と、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体とを含んでなり、前記第１及び／又は前記第２の重合体が架橋された架橋膜と、前記架橋膜によって包囲された内水相とを含んでなり、前記内水相に第１の目的物質及び前記第１の目的物質よりも分子量の小さい第２の目的物質が内包された物質内包架橋ベシクルであって、
前記第１の目的物質が、前記第２の目的物質の不存在下で前記内水相に含有されている場合よりも安定化されている、前記物質内包架橋ベシクル。
［６］前記第２の目的物質がクラウディング剤である、上記［５］に記載の物質内包架橋ベシクル。
［７］物質内包ベシクルを製造する方法であって、
非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体と、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体とを含んでなり、前記第１及び／又は前記第２の重合体が架橋された架橋膜と、
前記架橋膜によって包囲された内水相と
を含んでなり、前記内水相に目的物質が内包されていない空の架橋ベシクルの単分散集合体を、
前記目的物質を水性媒体とともに含有する混合液中で混合し、
前記第１及び前記第２の重合体を含んでなり、前記第１及び／又は前記第２の重合体が架橋された架橋膜と、
前記架橋膜によって包囲された内水相と
を含んでなり、前記内水相に前記目的物質が内包された物質内包架橋ベシクルの単分散集合体を形成させる工程を含んでなる、前記方法。
［８］前記空の架橋ベシクルの単分散集合体、前記物質内包架橋ベシクルの単分散集合体、前記空の非架橋ベシクルの単分散集合体、及び前記物質内包非架橋ベシクルの単分散集合体が、０．２以下の多分散指数を有する、上記［７］に記載の方法。
［９］前記目的物質の重量平均分子量が１００００〜４００００であり、前記混合液に含有される前記目的物質の濃度が５ｍｇ／ｍＬを上回る、上記［７］又は［８］に記載の方法。
［１０］前記空の架橋ベシクル及び前記物質内包架橋ベシクルにおいて、前記第１及び／又は前記第２の重合体が、カチオン基間に形成された架橋結合、アニオン基間に形成された架橋結合、及びカチオン基とアニオン基との間に形成された架橋結合からなる群より選択された１種又は２種以上の架橋結合によって架橋されており、前記架橋結合が形成された割合が、前記架橋膜に含まれるカチオン基及び／又はアニオン基の総モル数の３５％以上である、上記［９］に記載の方法。
［１１］前記物質内包架橋ベシクルの単分散集合体を、前記第１及び／又は前記第２の重合体と反応し得る架橋剤と反応させる工程をさらに含む、上記［７］〜［１０］のいずれか１項に記載の方法。
［１２］物質内包ベシクルを製造する方法であって、
非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体と、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体とを含んでなり、前記第１及び／又は前記第２の重合体が架橋された架橋膜と、
前記架橋膜によって包囲された内水相と
を含んでなり、前記内水相に第１の目的物質が内包された第１の物質内包架橋ベシクルを、
前記第１の目的物質よりも分子量の小さい第２の目的物質を水性媒体とともに含有する混合液中で混合し、
前記第１及び前記第２の重合体を含んでなり、前記第１及び／又は前記第２の重合体が架橋された架橋膜と、
前記架橋膜によって包囲された内水相と
を含んでなり、前記内水相に前記第１及び前記第２の目的物質が内包された第２の物質内包架橋ベシクルを形成させる工程を含んでなる、前記方法。
［１３］前記第１の物質内包架橋ベシクルが、その単分散集合体であり、前記第２の物質内包架橋ベシクルが、その単分散集合体である、上記［１２］に記載の方法。
［１４］前記混合液に含有される前記第２の目的物質の濃度が、
前記第１及び／又は前記第２の重合体が架橋されていない点で前記第１の物質内包架橋ベシクルの単分散集合体と異なる第１の物質内包非架橋ベシクルの単分散集合体を前記混合液中で混合した場合に、
前記第１及び前記第２の目的物質が内包された物質内包非架橋ベシクルの単分散集合体の形成を阻害する濃度である、上記［１３］に記載の方法。
［１５］前記第１及び前記第２の重合体を含んでなり、前記第１及び／又は前記第２の重合体が架橋された架橋膜と、
前記架橋膜によって包囲された内水相と
を含んでなり、前記内水相に前記第１及び前記第２の目的物質のいずれも内包されていない空の架橋ベシクルを、
前記第１の目的物質を水性媒体とともに含有する混合液中で混合し、必要に応じて、前記第１及び／又は前記第２の重合体と反応し得る架橋剤と反応させ、
前記第１の物質内包架橋ベシクルを形成させる工程をさらに含んでなる、上記［１２］〜［１４］のいずれか１項に記載の方法。
［１６］前記空の架橋ベシクルが、その単分散集合体であり、前記第１の物質内包架橋ベシクルが、その単分散集合体である、上記［１５］に記載の方法。
［１７］前記混合液に含有される前記第１の目的物質の濃度が、
前記第１及び／又は前記第２の重合体が架橋されていない点で前記空の架橋ベシクルの単分散集合体と異なる空の非架橋ベシクルの単分散集合体を前記混合液中で混合した場合に、
前記第１の目的物質が内包された物質内包非架橋ベシクルの単分散集合体の形成を阻害する濃度である、上記［１６］に記載の方法。
［１８］前記第２の目的物質がクラウディング剤である、上記［１２］〜［１７］のいずれか１項に記載の方法。
［１９］非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体、及び、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体を含む膜からなるベシクルと、当該ベシクルに内包された吸着材粒子とを含み、前記第１及び第２の重合体の少なくとも一方が前記吸着材粒子に吸着されてなる吸着材内包ベシクル。
［２０］前記第１及び／又は第２の重合体が架橋されてなる、上記［１９］に記載の吸着材内包ベシクル。
［２１］前記吸着材粒子がシリカ粒子である、上記［１９］又は［２０］に記載の吸着材内包ベシクル。
［２２］前記吸着材粒子の平均粒径が４０ｎｍ〜１０μｍである、上記［１９］〜［２１］のいずれか１項に記載の吸着材内包ベシクル。
［２３］前記吸着材粒子が表面処理されてなる、上記［１９］〜［２２］のいずれか１項に記載の吸着材内包ベシクル。
［２４］前記吸着材粒子に低分子化合物が吸着されてなる、上記［１９］〜［２３］のいずれか１項に記載の吸着材内包ベシクル。
［２５］非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体、及び、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体を含む膜からなるベシクルに、吸着材粒子が内包されてなる吸着材内包ベシクルを製造する方法であって、
（ａ）前記第１及び第２の重合体のうち一方を前記吸着材粒子と混合し、前記吸着材粒子に吸着させる工程、並びに、
（ｂ）前記工程（ａ）の混合物を前記第１及び第２の重合体のうち他方と更に混合し、前記吸着材粒子の周囲に前記第１及び第２の重合体を含む膜からなるベシクルを形成させ、吸着材内包ベシクルとする工程
を含む方法。
［２６］（ｃ）前記工程（ｂ）のベシクル中の前記第１及び／又は前記第２の重合体を架橋する工程を更に含む、上記［２５］に記載の方法。
［２７］前記吸着材粒子がシリカ粒子である、上記［２５］又は［２６］に記載の方法。
［２８］前記吸着材粒子の平均粒径が４０ｎｍ〜１０μｍである、上記［２５］〜［２７］のいずれか１項に記載の方法。
［２９］前記吸着材粒子を表面処理する工程を更に含む、上記［２５］〜［２８］のいずれか１項に記載の方法。
［３０］前記吸着材粒子に低分子化合物が吸着されてなる、上記［２５］〜［２９］のいずれか１項に記載の方法。
［３１］非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体、及び、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体を含む膜からなるベシクルに、目的物質が内包されてなる物質内包ベシクルを製造する方法であって、
（ａ）前記目的物質よりも水溶性の高い前駆体を前記目的物質に転換し得る酵素が、前記第１及び第２の重合体を含む膜からなるベシクルに内包されてなる酵素内包ベシクルを用意する工程、及び、
（ｂ）前記前駆体よりも前記目的物質に対して低い溶解性を示す条件下で、前記酵素内包ベシクル内に前記前駆体を浸透させ、前記酵素によって前記前駆体を前記目的物質に転換することにより、前記目的物質を析出させて前記酵素内包ベシクルに内包させ、物質内包ベシクルとする工程
を含む方法。
［３２］前記工程（ｂ）において、前記酵素内包ベシクルを前記前駆体の水溶液と混合することにより、前記酵素内包ベシクル内に前記前駆体を浸透させる上記［３１］に記載の方法。
［３３］前記工程（ｂ）の前に、前記酵素内包ベシクルの前記第１及び／又は前記第２の重合体を架橋する工程を更に含む、上記［３２］に記載の方法。
［３４］上記［３１］〜［３３］のいずれか１項に記載の方法により製造される物質内包ベシクル。
［３５］非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体、及び、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体を含む膜からなるベシクルに、前記目的物質よりも水溶性の高い前駆体から転換され得る低水溶性物質が、前記前駆体を前記低水溶性物質に転換し得る酵素と共に内包されてなる、低水溶性物質内包ベシクル。
［３６］前記低水溶性物質が、内水相に対する前記低水溶性物質の溶解度を超える濃度で内包されてなる、上記［３４］又は［３５］に記載の低水溶性物質内包ベシクル。
［３７］前記第１及び／又は前記第２の重合体が架橋されてなる、上記［３４］〜［３６］のいずれか１項に記載の低水溶性物質内包ベシクル。
［３８］上記［１］〜［４］のいずれか１項に記載のベシクルの単分散集合体、及び／又は、上記［５］、［６］、［１９］〜［２２］及び［３４］〜［３７］のいずれか１項に記載のベシクルを含む薬物送達系。
［３９］対象に薬物を送達するための方法であって、
（ａ）非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体、及び、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体を含む膜からなるベシクルに、前記薬物の前駆体を前記薬物に転換し得る酵素が内包されてなる酵素内包ベシクルを用意する工程、及び、
（ｂ）対象の所定の部位で、前記酵素内包ベシクル内に前記前駆体を浸透させ、前記酵素によって前記前駆体を前記薬物に転換することにより、前記薬物を形成する工程
を含む方法。
［４０］前記前駆体の水溶性がが前記薬物よりも低いとともに、前記工程（ｂ）において、前記前駆体よりも前記薬物に対して低い溶解性を示す条件下で、前記酵素内包ベシクル内に前記前駆体を浸透させる、上記［３９］に記載の方法。
［４１］前記工程（ｂ）において、前記薬物を析出させて前記酵素内包ベシクルに内包させ、薬物内包ベシクルを形成することを更に含む、上記［３９］又は［４０］に記載の方法。
本発明によれば、第一に、従来法よりも高濃度（例えば、後担持法において物質内包ベシクルの単分散集合体の形成が阻害される濃度）の目的物質が封入された物質内包ベシクルの単分散集合体、及び、水性媒体中に存在する目的物質の濃度が高濃度（例えば、後担持法において物質内包ベシクルの単分散集合体の形成が阻害される濃度）であっても、物質内包ベシクルの単分散集合体を形成することができる物質内包ベシクルの製造方法が提供される。
本発明によれば、第二に、２種以上の目的物質が、その封入量を制御して封入された物質内包ベシクル、及び、２種以上の目的物質を、その封入量を制御して封入することができる物質内包ベシクルの製造方法が提供される。
本発明によれば、第三に、ベシクルの大きさに対して比較的大きな吸着材粒子を内包する、従来にはない新たな構造を有する物質内包ベシクル（吸着材内包ベシクル）が提供されるとともに、斯かる吸着材内包ベシクルを極めて効率的に製造することが可能な方法が提供される。
本発明によれば、第四に、従来法では困難であった水溶性の低い目的物質を内包するベシクルを、効率的に作製することができる。
図１（ａ）及び（ｂ）は、本発明の方法を説明するための図である。 図２は、空ベシクルの構造を説明するための図である。 図３（ａ）及び（ｂ）は、空ベシクルの膜構造の一態様を説明するための図である。 図４（ａ）及び（ｂ）は、空ベシクルの膜構造の別の態様を説明するための図である。 図５Ａは、実施例Ｉ−１で得られたＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ内包架橋ベシクルの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を示す図である。 図５Ｂは、比較例Ｉ−１（同時混合法）で得られたＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ内包非架橋ベシクルの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を示す図である。 図５Ｃは、比較例Ｉ−２（後担持法）で得られたＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ内包非架橋ベシクルの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を示す図である。 図６は、ベシクル内部に封入されたＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋの放出挙動を確認するために実施したＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー）の測定結果を示す図である。 図７（ａ）は、空ベシクルのＧＰＣ測定結果を示す図であり、図７（ｂ）は、実施例Ｉ−２で得られた精製後のシトクロムｃ内包架橋ベシクルのＧＰＣ測定結果を示す図である。 図８（ａ）は、実施例Ｉ−２で得られたシトクロムｃ内包架橋ベシクルの吸収スペクトルを示す図であり、図８（ｂ）は、実施例Ｉ−２で得られたシトクロムｃ及びＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋ内包架橋ベシクルの吸収スペクトルを示す図である。 図９は、円偏光二色性スペクトルの測定結果を示す図である。 図１０（Ａ）は、実施例Ｉ−３及び比較例Ｉ−３で得られたベシクルのＡｌＰｃＳ２ａの吸収色に基づく比色試験の結果を示す図である。 図１０（Ｂ）は、実施例Ｉ−３及び比較例Ｉ−３で得られたベシクルの吸光スペクトルを示す図である。 図１１は、５ｍＭ、１０ｍＭ又は２０ｍＭ ＮａＣｌ添加後のベシクルの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を示す図である。 図１２は、実施例Ｉ−４で得られたＣＤ封入架橋ベシクルの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を示す図である。 図１３は、実施例Ｉ−４で得られたＣＤ封入架橋ベシクルによる５−ＦＣから５−ＦＵへの変換速度を示すグラフである。 図１４は、実施例Ｉ−４で得られたＣＤ封入架橋ベシクルによる５−ＦＣから５−ＦＵへの変換酵素活性の安定性を示すグラフである。 図１５（ａ）〜（ｄ）は、実施例Ｉ−４で得られたＣＤ封入架橋ベシクルを用いた治療による腫瘍成長抑制効果を示すグラフである。 図１６（ａ）〜（ｄ）は、実施例Ｉ−４で得られたＣＤ封入架橋ベシクルを用いた治療による副作用（体重減少）を示すグラフである。 図１７（ａ）〜（ｄ）は、実施例Ｉ−４で得られたＣＤ封入架橋ベシクルを用いた治療による生存数を示すグラフである。 図１８は、実施例Ｉ−４で得られたＣＤ封入架橋ベシクルの血中滞留性を示すグラフである。 図１９は、実施例ＩＩ−１で得られた架橋ＭＳＮ内包ベシクル含有溶液の粒度分布を示すグラフである。 図２０は、実施例ＩＩ−１で得られた架橋ＭＳＮ内包ベシクルのＴＥＭ写真である。 図２１は、実施例ＩＩ−１で得られた架橋ＭＳＮ内包ベシクルのキャピラリー電気泳動によるクロマトグラムである。 図２２は、実施例ＩＩ−２で得られた架橋ＭＳＮ内包ベシクル含有溶液の粒度分布を示すグラフである。 図２３は、実施例ＩＩ−２で得られた架橋ＭＳＮ内包ベシクルのＴＥＭ写真である。 図２４は、実施例ＩＩ−２で得られた架橋ＭＳＮ内包ベシクルのキャピラリー電気泳動によるクロマトグラムである。 図２５は、参考例ＩＩ−１で得られた架橋ＭＳＮ内包ベシクル含有溶液の粒度分布を示すグラフである。 図２６は、参考例II−１で得られた架橋ＭＳＮ内包ベシクルのＴＥＭ写真である。 図２７は、参考例ＩＩ−１で得られた架橋ＭＳＮ内包ベシクルのキャピラリー電気泳動によるクロマトグラムである。 図２８（ａ）は、実施例ＩＩ−３Ａで使用した未処理ＭＳＮ内包ベシクルのＴＥＭ写真であり、図２８（ｂ）は、実施例ＩＩ−３Ａで得られたアミノ化ＭＳＮ内包ベシクルのＴＥＭ写真である。 図２９（ａ）は、実施例ＩＩ−３Ｂで使用した未処理ＭＳＮ内包ベシクルのＴＥＭ写真であり、図２９（ｂ）は、実施例ＩＩ−３Ｂで得られたスルホン化ＭＳＮ内包ベシクルのＴＥＭ写真である。 図３０は、実施例ＩＩ−３Ｂで使用した未処理ＭＳＮ内包ベシクル及び得られたスルホン化ＭＳＮ内包ベシクルのＸ線分析スペクトルである 図３１は、実施例ＩＩ−４Ａで得られたローズベンガル吸着アミノ化ＭＳＮ内包ベシクルによるローズベンガルの放出特性を示すグラフである。 図３２は、実施例ＩＩ−４Ｂで得られたゲムシタビン吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクルによるゲムシタビンの放出特性を示すグラフである。 図３３（ａ）及び（ｂ）は、実施例ＩＩ−４Ｂで得られたゲムシタビン吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクルによるＡ５４９細胞に対する細胞取り込み特性を示すグラフである。図３３（ａ）はトリパンブルー不在下における全細胞内のＣｙ３蛍光量の測定結果を表し、図３３（ｂ）はトリパンブルー染色下における生細胞内のＣｙ３蛍光量の測定結果を表す。 図３４（ａ）及び（ｂ）は、実施例ＩＩ−４Ｂで得られたゲムシタビン吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクルによるＡ５４９細胞に対する殺細胞効果を示すグラフである。図３４（ａ）は４８時間培養後の結果を表し、図３４（ｂ）は７２時間培養後の結果を表す。 図３５（ａ）及び（ｂ）は、実施例ＩＩ−４Ｂで得られたゲムシタビン吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクルによるＣ２６細胞に対する細胞取り込み特性を示すグラフである。図３５（ａ）はトリパンブルー不在下における全細胞内のＣｙ３蛍光量の測定結果を表し、図３５（ｂ）はトリパンブルー染色下における生細胞内のＣｙ３蛍光量の測定結果を表す。 図３６（ａ）及び（ｂ）は、実施例ＩＩ−４Ｂで得られたゲムシタビン吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクルによるＣ２６細胞に対する殺細胞効果を示すグラフである。図３６（ａ）は４８時間培養後の結果を表し、図３６（ｂ）は７２時間培養後の結果を表す。 図３７（ａ）及び（ｂ）は、実施例ＩＩ−４Ｂで得られたゲムシタビン吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクルを用いた腫瘍治療効果を示すグラフである。（ａ）は腫瘍増大抑制効果を、（ｂ）は副作用（体重減少）低減効果を示す。 図３８は、実施例ＩＩ−４Ｂで得られたゲムシタビン吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクルの血中滞留性を示すグラフである。 図３９は、実施例ＩＩ−４Ｂで得られたゲムシタビン吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクルの腫瘍集積性を示すグラフである。 図４０は、実施例III−１で得られたβ−ガラクトシダーゼ内包架橋ベシクル含有溶液の粒度分布を示すグラフである。 図４１は、実施例III−１で得られたインディゴ系染料内包ベシクル含有溶液の粒度分布を示すグラフである。 図４２は、実施例III−１で得られたインディゴ系染料内包ベシクルのＴＥＭ写真である。 図４３は、実施例III−１で得られたインディゴ系染料内包ベシクルの高解像度のＴＥＭ写真である。 図４４は、比較例III−１で得られた架橋空ベシクル含有溶液の粒度分布を示すグラフである。 図４５は、比較例III−１で得られたインディゴ系染料生成後の空ベシクル含有溶液の粒度分布を示すグラフである。 図４６は、比較例III−１で得られたインディゴ系染料生成後の空ベシクルのＴＥＭ写真である。
以下、具体的な実施態様に即して、本発明を詳細に説明する。但し、本発明は決して以下の実施態様に束縛されるものではなく、適宜変更を加えて実施することが可能である。
［Ａ］定義
本明細書において「ベシクル」とは、単ラメラ構造の膜と、前記膜により包囲された空隙部（内水相）とを有する基本構造体を意味する。
本明細書において、基の名称又はその一部としての「アルキル」とは、一価の脂肪族飽和炭化水素基を表す。特に断らない限り、アルキルは鎖状でも環状でもよく、鎖状と環状とが結合したものでもよい。鎖状アルキルは直鎖状でも分枝鎖状でもよい。環状アルキルは単環式でも複環式でもよく、複環式の場合は連結環でも縮合環でもスピロ環でもよい。
本明細書において、基の名称又はその一部としての「アルコキシ」とは、二価の酸素原子の一方の結合手に前記のアルキルが結合してなる基を表す。
本明細書において、基の名称又はその一部としての「アリール」とは、一価の芳香族炭化水素基を表す。特に断らない限り、アリールは単環式でも複環式でもよく、複環式の場合は連結環でも縮合環でもスピロ環でもよい。
本明細書において、基の炭素数は、例えば「Ｃ1-12アルキル」のように表す。ここで「Ｃ1-12」とは、当該アルキルの炭素数が１〜１２個であることを意味する。
本明細書において「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子を意味する。
本明細書において、ある基が「置換されていてもよい」とは、当該基が有する１又は２以上の水素原子が１又は２以上の置換基（２以上の場合は同一でも異なっていてもよい）により置換され得ることを意味する。置換基の最大数は、当該基が有する構造及び置換可能な水素原子数に応じて、当業者であれば容易に決定し得る。
本明細書において「置換基」とは、特に断らない限り、ハロゲン原子、アリール基、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、シアノ基、ホルミル基、ジメチルアセタール化ホルミル基、ジエチルアセタール化ホルミル基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基、Ｃ2-7アシルアミド基、シロキシ基、トリ（Ｃ1-6アルキル）シロキシ基（ここでＣ1-6アルキルは同一でも異なっていてもよい）及びシリルアミノ基からなる群から選択される。
本明細書において各種ベシクルに関して使用される用語「単分散集合体」は、粒子径分布が狭いベシクル集合体を意味する。粒子径分布の広狭は、好ましくは、多分散指数（polydispersity index：ＰＤＩ）を基づいて判断され、単分散集合体は、好ましくは０．２以下、さらに好ましくは０．１５以下、さらに一層好ましくは０．１以下の多分散指数を有する。
本明細書において各種ベシクルに関して使用される用語「多分散指数」は、粒子径分布の広がりを示す無次元指標を意味し、用語「平均粒子径」は、散乱光強度基準による調和平均粒子径（直径）を意味する。多分散指数及び平均粒子径はともに、動的光散乱法（dynamic light scattering）によって測定される。動的光散乱法は、ＪＩＳ Ｚ ８８２６：２００５（粒子径解析−光子相関法（Particle size analysis-Photon correlation spectroscopy））に準拠して実施することができる。ＪＩＳ Ｚ ８８２６：２００５は、希薄な粒子濃度の分散液に対応する規格であるため、高濃度のサンプルにおいても、その多分散指数及び平均粒子径の測定が可能となるように、ＪＩＳ Ｚ ８８２６：２００５に適宜変更を加えることができる。例えば、側方散乱検出に代えて、後方散乱検出を採用することができる。後方散乱検出を採用することにより、多重散乱の影響を排除又は低減することができ、これにより、高濃度のサンプルにおいても、その多分散指数及び平均粒子径の測定が可能となる。動的光散乱法によって多分散指数及び平均粒子径を測定するための市販の機器としては、例えば、Malvern社製Zetasizer Nano-ZSが挙げられる。この機器は、後方散乱検出を採用しており、低濃度〜高濃度の幅広い濃度範囲のサンプルにおいて、その多分散指数及び平均粒子径の測定が可能である。
［Ｂ］物質内包ベシクル及びその製法
まず、本発明の基礎となる物質内包ベシクル及びその製法について説明する。本発明の各ベシクル及びその製法の特徴については、章を改めて［Ｃ］〜［Ｅ］において説明するが、これらの章に別途記載なき事項については、本章の記載が適用されることとする。
［Ｂ１：物質内包ベシクルの製造方法］
上述の通り、物質内包ベシクルの主な製法としては、（ｉ）被内包物質を、膜の構成要素となる高分子、或いは予め形成された高分子膜とともに混合し、自己組織化によるベシクルの形成と空隙部への物質の封入とを同時に行う方法（同時混合法）と、（ii）予め形成された空ベシクルを被内包物質と混合し、空ベシクルの空隙部に被内包物質を導入し、包含・担持させる方法（後担持法）とが挙げられる。
本願発明では、各ベシクルの製法条件について別途記載なき限り、同時混合法や後担持法を含む任意の手法を用いることが可能である。但し、本願発明者らが開発した手法である後担持法（詳細は上記特許文献３（国際公開第２０１１／１４５７４５号パンフレット）参照）は、簡便な手法で内包物質を効率的にベシクル内に導入することができ、導入前後でベシクルの構造も殆ど損なわれず、更には同時混合法では内包困難であった荷電性物質も内包可能である等、種々の利点を有するので好ましい。
以下、物質内包ベシクルの製法について、後担持法を前提として説明するが、本発明では、物質内包ベシクルの製法は後担持法に限定されるものではなく、後述の各物質内包ベシクルの特徴に反しない限りにおいて、同時混合法を含む他の任意の手法を用いることが可能である。また、後担持法以外の手法を用いてベシクルに物質を内包させる場合、その具体的な条件としては、後述の後担持法の条件を準用することができる。例えば、同時混合法の場合、後担持法のように空ベシクルを予め調製するのではなく、空ベシクルの材料となる重合体等を被内包物質と共に混合する他は、基本的に後担持法と同一の条件が使用できる。
（Ｂ１−１：後担持法の概要）
後担持法の概要について、以下、図１を用いて説明する。なお、図１は模式図であり、本発明は図１に限定されるものではない。
図１（ａ）に示すように、膜１ａで包囲された空隙部１ｂを有する所定の構造の空ベシクル１を用意し、これを被内包物質９とともに、水性媒体中で混合する。これにより、図１（ｂ）に示すように、被内包物質９が空ベシクル１の膜１ａを越えて空隙部１ｂに導入され、被内包物質９が空隙部１ｂに内包された物質内包ベシクル１’が得られる。
以下、後担持法について詳述するが、空ベシクル及び被内包物質の詳細については章を改めて後述し、ここではその他の条件及び手順について説明する。
（Ｂ１−２：空ベシクル及び被内包物質の混合）
後担持法は、空ベシクル及び被内包物質を水性媒体中で混合する工程を含む（なお、ここで混合の対象となる、空ベシクル及び被内包物質を水性媒体中に含有する液を、以降「混合対象液」という場合がある。）。
混合を行う手法は特に制限されないが、水性媒体に外力を加える手法で行う。すなわち、空ベシクル及び被内包物質を水性媒体に加えて静置し、自然に拡散させて混合する手法（以降「静置・拡散混合」という場合がある。）は除外される。水性媒体に外力を加える混合法の例としては、撹拌、振盪、衝撃等が挙げられる。
撹拌による手法の例としては、混合対象液を含む容器をボルテックスミキサー等により旋回させて撹拌する手法や、溶液を撹拌翼等により直接攪拌する手法等が挙げられる。
振盪による手法の例としては、混合対象液を含む容器を振盪機等により振盪する手法が挙げられる。
衝撃による手法の例としては、混合対象液に対して超音波照射等により振動を含む各種の衝撃を与える手法等が挙げられる。
斯かる混合によって、ベシクル空隙部に物質が内包され、物質内包ベシクルが製造される。
混合により物質内包ベシクルが形成される理由は定かではないが、水性媒体に外力を加えることによって、空ベシクルに剪断応力が作用する（よって、水性媒体に外力を加える混合を、剪断応力下での混合と言い換えることができる。）。斯かる剪断応力によって、空ベシクルの構造が撹乱されて概ね均一な小会合体に分解し、それが再度自己組織化してベシクルが均一に再生するとともに、水性媒体中に存在する被内包物質がベシクル再生時にベシクル内に封入されるものと考えられる（斯かるメカニズムは、後述する参考実験において、混合によるベシクルの小会合体への分解が確認されたことからも推測される。）。これは通常の状態のベシクルでは起こり難い現象であり、斯かる現象を利用した後担持法は、極めて斬新なものであるといえる。
混合の条件は制限されないが、上述のメカニズムを考慮すると、水性媒体中の空ベシクルの構造が十分に撹乱されるとともに、撹乱後にベシクルの構造が再生し得る程度の条件を選択することが好ましい。通常は混合対象液全体に力が作用する程度に混合すればよいが、好ましくは混合対象液全体が概ね均一になる程度に混合することが好ましい。
具体的な混合の条件は混合法によって異なるが、例えば攪拌の場合、通常５００ｒｐｍ以上、好ましくは１０００ｒｐｍ以上、また、通常１００００ｒｐｍ以下、好ましくは５０００ｒｐｍ以下の回転数で行うことが望ましい。回転数が低過ぎると、均質な物質内包ベシクルが形成され難くなる場合がある。回転数が高過ぎると、ベシクルや被内包物質が損傷・破壊されてしまう場合がある。
また、ボルテックスミキサーによる撹拌時間は、回転数によっても異なるが、通常６０秒以上、好ましくは１２０秒以上、また、通常１０分以内、好ましくは５分以内である。攪拌時間が短過ぎると、均質な物質内包ベシクルが形成され難くなる場合がある。攪拌時間が長過ぎると、ベシクルや被内包物質が損傷・破壊されてしまう場合がある。
その他の混合法（撹拌翼による撹拌、振盪機による振盪、超音波照射による衝撃等）を用いる場合の具体的な条件としては、ボルテックスミキサーによる撹拌を上述した回転数及び攪拌時間のもとで行って得られるのと同程度の力が混合対象液に作用するように、適宜条件を調整すればよい。
また、やはり上述のメカニズムを考慮すると、混合対象液の混合後、ある程度の時間に亘って混合対象液を静置し、ベシクルが均一に再生する時間を確保することが好ましい。斯かる静置時間は限定されるものではないが、例えば１分以上、好ましくは３分以上とする。
なお、ベシクルの空隙部に物質が内包されたことは、蛍光相関分光法（Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ）による拡散係数（diffusion coefficient）変化の検出、サイズ排除クロマトグラフィーによる分離、透過型電子顕微鏡による直接観察等の手法により確認することができる。蛍光相関分光法による拡散係数の測定の場合、被内包物質として蛍光材料を用い、蛍光材料の拡散係数の変化を測定することにより、被内包物質がベシクル内に偏在すること（即ち物質内包ベシクルが得られたこと）を確認できる。
（Ｂ１−３：混合に関する他の条件）
通常は、水性媒体中に空ベシクル及び被内包物質を含有する液（混合対象液）を調製し、前述の混合に供する。
水性媒体（水性溶媒）の種類は限定されない。好ましくは水であるが、空ベシクルの構造に好ましからぬ影響を及ぼしたり、被内包物質の内部への導入を妨げたりしない範囲で、水に他の成分を混合した溶媒（例えば生理食塩水、水性緩衝液、水と水溶性有機溶媒との混合溶媒等）も用いることができる。水性緩衝液としては１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液等が挙げられる。水溶性有機溶媒としては、メタノールやエタノール等のアルコール類、アセトン等のケトン類、クロロホルム等の塩素系有機溶媒、ジメチルエーテル等のエーテル系有機溶媒、酢酸エチル等のエステル系有機溶媒等が挙げられる。
被混合液の調製手順も任意であるが、後述のように通常、空ベシクルは水性媒体中に調製されるので、調製された空ベシクル含有液に対して被内包物質を加え、混合に供するのが好適である。被内包物質はそのまま空ベシクル含有液に加えてもよいが、水性媒体中の溶液や懸濁液等の形態で加えてもよい。
被混合液中の空ベシクル及び被内包物質の各濃度も特に制限されず、空ベシクルの構造、被内包物質の種類、空ベシクルに対する被内包物質の所望の内包比率等の条件を勘案して決定すればよい。
但し、空ベシクルへの被内包物質の内包効率を高める観点からは、水性媒体に対する空ベシクルの濃度を、通常０．１ｍｇ／ｍＬ以上、中でも１ｍｇ／ｍＬ以上、また、通常１００ｍｇ／ｍＬ以下、中でも１０ｍｇ／ｍＬ以下とすることが好ましい。特に空ベシクルの濃度が低過ぎると、物質内包ベシクルが形成されない場合がある。なお、得られる物質内包ベシクルの粒経は空ベシクルの濃度に依存すると考えられるため、空ベシクルの濃度は所望の物質内包ベシクルの粒経に応じて決定すべきである。
また、水性媒体に対する被内包物質の濃度は、被内包物質の性質によっても異なるが、通常０．１ｍｇ／ｍＬ以上、中でも１ｍｇ／ｍＬ以上、また、通常１００ｍｇ／ｍＬ以下、中でも５０ｍｇ／ｍＬ以下とすることが好ましい。特に被内包物質の濃度が低過ぎると、物質内包ベシクルが形成されない場合がある。
被混合液のｐＨも特に制限されず、空ベシクルの構造、被内包物質の種類、被混合液中の空ベシクル及び被内包物質の各濃度等の条件を勘案して適宜調整することが可能であるが、好ましくはｐＨ５以上、より好ましくはｐＨ６．５以上であり、また、好ましくはｐＨ９以下、より好ましくはｐＨ７．５以下である。ｐＨの調整は、溶媒として緩衝液を用いることにより、容易に行うことができる。被混合液のｐＨを調整して用いることは、空ベシクルの構造を保持し、効率的に被内包物質を空ベシクルに内包させる上で有利である。
被混合液のイオン強度は、空ベシクルの構造を破壊したり、被内包物質の空ベシクルへの内包を阻害したりしない範囲で適宜調整することが可能であるが、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上であり、また、好ましくは２００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。
被混合液の混合時の温度は、空ベシクルの構造を破壊したり、被内包物質の空ベシクルへの内包を阻害したりしない範囲であれば限定されないが、好ましくは１０℃以上、より好ましくは２０℃以上、また、好ましくは８０℃以下、より好ましくは５０℃以下である。
混合後、形成された物質内包ベシクルをすぐに所望の用途に供してもよいが、系を平衡化させるために、混合液を静置する時間を設けてもよい。混合液を静置する時間は、物質内包ベシクルの形成効率等の条件によって異なるが、好ましくは５０時間以下、より好ましくは３０時間以下である。但し、後述のように架橋剤を用いない場合、形成された物質内包ベシクルの径が経時的に増大する傾向があるので、ベシクルの均一再生に要する時間以上の静置時間を設けないことが好ましい場合もある。
架橋剤を用いる場合、形成された物質内包ベシクルを含有する被混合液に、架橋剤を加えて混合すればよい。架橋剤はそのまま加えてもよいが、架橋剤を含有する水性溶液を調製し、これを加えてもよい。架橋剤の水性溶液の調製における水性溶媒、ｐＨ、温度、イオン強度等の調製条件は、被混合液について前述した条件と同様である。
また、更に透析、希釈、濃縮、撹拌等の操作を適宜付加してもよい。
［Ｂ２：空ベシクル］
（Ｂ２−１：空ベシクルの構造）
後担持法では、非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体と、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体とから形成される膜を有するとともに、前記膜によって包囲された空隙部を有するベシクルを、空ベシクルとして用いる。
空ベシクルの構造の例について、図２〜４を参照しながら説明する。なお、図２〜４は何れも模式図であり、本発明はこれらの図に限定されるものではない。
図２は、ベシクル１の部分破断図である。図２に示すように、ベシクル１は膜１ａと、膜１ａにより包囲される空隙部１ｂとを有する。
図３（ａ）は、本発明の一態様に係るベシクル１の膜１ａの部分断面拡大図である。図３（ａ）に示す膜１ａは、外層１ａo、中間層１ａm及び内層１ａiからなる三層構造を有し、主に第１の重合体２と、第２の重合体３とから形成される。
図３（ｂ）は、図３（ａ）に示す第１の重合体２及び第２の重合体３の拡大図である。図３（ｂ）に示すように、第１の重合体２は、非荷電親水性セグメント２ａと第１の荷電性セグメント２ｂとを有するブロック共重合体であり、第２の重合体３は、第１の荷電性セグメント２ｂとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメント３からなる重合体である。そして好ましくは、図３（ａ）に示すように、非荷電親水性セグメント２ａが膜１ａの外層１ａoを形成し、第１の荷電性セグメント２ｂと第２の荷電性セグメント３とが静電結合して中間層１ａmを形成する。そして好ましくは、主に非荷電親水性セグメント２ａが膜１ａの内層１ａiを形成する。
図４（ａ）は、本発明の別の態様に係るベシクル１の膜１ａの部分断面拡大図である。図４（ａ）に示す膜１ａも、外層１ａo、中間層１ａm及び内層１ａiからなる三層構造を有し、主第１の重合体２と、第２の重合体３’とから形成される。
図４（ｂ）は、図４（ａ）に示す第１の重合体２及び第２の重合体３’の拡大図である。図４（ｂ）に示すように、第１の重合体２は、非荷電親水性セグメント２ａと第１の荷電性セグメント２ｂとを有するブロック共重合体であり、第２の重合体３’は、非荷電親水性セグメント３ａと、第１の荷電性セグメント２ｂとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメント３ｂからなる重合体である。そして好ましくは、図４（ａ）に示すように、非荷電親水性セグメント２ａ、３ａの一方又は両方が膜１ａの外層１ａoを形成し、第１の荷電性セグメント２ｂと第２の荷電性セグメント３ｂとが静電結合して中間層１ａmを形成する。そして好ましくは、主に非荷電親水性セグメント２ａ、３ａの一方又は両方が、膜１ａの内層１ａiを形成する。
理論に束縛されるものではないが、第１の重合体２及び第２の重合体３、３’からベシクル１が形成される機構は、以下のように考えられる。すなわち、図３（ｂ）、図４（ｂ）に示す第１の重合体２及び第２の重合体３、３’が、電荷の相互作用が生じ得る系（例えば水性媒体中）に置かれると、自己集合し、図３（ａ）、図４（ａ）に示すように、互いに反対に帯電する第１の荷電性セグメント２ｂ及び第２の荷電性セグメント３、３ｂとが静電結合して中間層１ａmを形成するとともに、その外側に非荷電親水性セグメント２ａ、３ａが配置されて外層１ａoを形成する。また、好ましくは、中間層１ａmの内側にも、主に非荷電親水性セグメント２ａ、３ａが配置されて内層１ａiを形成する。こうして図３（ａ）、図４（ａ）に示す三層構造の膜１ａが形成され、結果として、図２に示すベシクル１が形成されるものと考えられる。
なお、ベシクル１の膜１ａは、第１の重合体２及び第２の重合体３、３’のみからなっていてもよいが、以上の構造が概略保持される限りにおいて、その他の成分を含有していてもよい。その他の成分は限定されないが、例としては架橋剤、荷電性ポリマー、荷電性分子等が挙げられる。架橋剤については後に詳述する。
また、後述するようにベシクル１は通常は水性媒質中で調製され、また、膜１ａの内層１ａiは主に非荷電親水性セグメント２ａ、３ａから構成されるため、ベシクル１の空隙部１ｂには通常は水性媒体が存在する（よって本明細書では空隙部１ｂを「内水相」と表示する場合がある）。但し、空隙部１ｂに別の物質が存在していてもよい。
ベシクル１の形状は、限定されないが、通常は球状又は略球状である。
ベシクル１の粒径は、第１の重合体２及び第２の重合体３、３’の種類及び量比、架橋剤の有無、ベシクル１の周辺環境（水性媒体の種類）等に応じて異なるが、好ましくは１０ｎｍ以上、より好ましくは５０ｎｍ以上、また、好ましくは１０００ｎｍ以下、より好ましくは４００ｎｍ以下、更に好ましくは２００ｎｍ以下である。
ベシクル１の膜１ａの膜厚は、第１の重合体２及び第２の重合体３、３’の種類及び量比、架橋剤の有無、ベシクル１の周辺環境（水性媒体の種類）等に応じて異なるが、好ましくは５ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上、また、好ましくは３０ｎｍ以下、より好ましくは１５ｎｍ以下である。
（Ｂ２−２：第１及び第２の重合体）
後担持法に用いられる空ベシクルは、第１の重合体及び第２の重合体から構成される膜を有する。
第１の重合体は、非荷電親水性セグメントと第１の荷電性セグメントとを有するブロック共重合体である。第１の重合体は１種類のみでもよく、２種類以上を任意の組み合わせ及び比率を併用してもよい。
第２の重合体は、第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する重合体である。第２の荷電性セグメントのみからなる重合体でもよいが、第２の荷電性セグメントに加えて非荷電親水性セグメントを有するブロック共重合体であってもよい。第２の重合体は１種類のみでもよく、２種類以上を任意の組み合わせ及び比率を併用してもよい。２種類以上の場合には、第２の荷電性セグメントのみからなる第２の重合体と、第２の荷電性セグメントに加えて非荷電親水性セグメントを有する第２の重合体とを併用してもよい。
第１の重合体及び第２の重合体は、それぞれ前述したセグメントに加えて、更に別のセグメントを有していてもよい。
（Ｂ２−２ａ：非荷電親水性セグメント）
第１の重合体は、非荷電親水性セグメントを有する。また、第２の重合体も、非荷電親水性セグメントを有していてもよい。
非荷電親水性セグメントは、非荷電且つ親水性の性質を有するポリマーセグメントである。ここで「非荷電」とは、セグメントが全体として中性であることをいう。例としてはセグメントが正・負の電荷を有さない場合が挙げられる。また、セグメントが正・負の荷電を分子内に有する場合であっても、局所的な実効電荷密度が高くなく、自己組織化によるベシクルの形成を妨げない程度にセグメント全体の荷電が中和されていれば、やはり「非荷電」に該当する。また、「親水性」とは水性媒体に対して溶解性を示すことをいう。
非荷電親水性セグメントの種類は限定されない。単一の繰り返し単位からなるセグメントでもよく、二種以上の繰り返し単位を任意の組み合わせ及び比率で含有するセグメントでもよい。非荷電親水性セグメントの具体例としては、ポリアルキレングリコール、ポリ（２−オキサゾリン）、ポリサッカライド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリ（２−メタクロイルオキシエチルホスホリルコリン）、等電点が７付近のペプチド、タンパク質及びそれらの誘導体等が挙げられる。中でもポリアルキレングリコール、ポリ（２−オキサゾリン）等が好ましく、ポリアルキレングリコールが特に好ましい。ポリアルキレングリコールとしては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が挙げられるが、ポリエチレングリコールが好ましい。
非荷電親水性セグメントの分子量は、限定されるものではないが、第１の重合体と第２の重合体との自己組織化を促し、均質なベシクルを効率的に製造する観点からは、所定の範囲内の分子量を有することが好ましい。具体的な分子量の範囲は、非荷電親水性セグメントの種類や荷電性セグメントとの組み合わせ等によっても異なるが、非荷電親水性セグメントとしてポリエチレングリコールを用いる場合、その分子量（Ｍｗ）は、好ましくは５００以上、より好ましくは１０００以上、また、好ましくは１５０００以下、より好ましくは５０００以下の範囲である。非荷電親水性セグメントの繰り返し単位数も制限されないが、通常は非荷電親水性セグメントの分子量が前記の分子量範囲を満たすように、その繰り返し単位の種類に応じて決定される。
前記条件を満たす非荷電親水性セグメントを用いることにより、第１の重合体及び第２の重合体の水性溶液中での会合・沈殿を防止して安定化し、ベシクルを効率的に構築することが可能となる。
（Ｂ２−２ｂ：荷電性セグメント）
第１の重合体が有する第１の荷電性セグメントと、第２の重合体が有する第２の荷電性セグメントとは、互いに反対の電荷に帯電した荷電性セグメントである。即ち、第１の荷電性セグメントがカチオン性セグメントであれば、第２の荷電性セグメントはアニオン性セグメントとなり、第１の荷電性セグメントがアニオン性セグメントであれば、第２の荷電性セグメントはカチオン性セグメントとなる。
（Ｂ２−２ｂ−１：カチオン性セグメント）
カチオン性セグメントは、カチオン基を有し、カチオン性（陽イオン性）を示すポリマーセグメントである。但し、カチオン性セグメントは、第１の重合体と第２の重合体との自己組織化によるベシクルの形成を妨げない範囲で、多少のアニオン基を有していてもよい。
カチオン性セグメントの種類も限定されない。単一の繰り返し単位からなるセグメントでもよく、二種以上の繰り返し単位を任意の組み合わせ及び比率で含有するセグメントでもよい。カチオン性セグメントとしては、ポリアミン等が好ましく、側鎖にアミノ基を有するポリアミノ酸又はその誘導体が特に好ましい。側鎖にアミノ基を有するポリアミノ酸又はその誘導体としては、ポリアスパルタミド、ポリグルタミド、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、及びこれらの誘導体等が挙げられるが、特にポリアスパルタミド誘導体及びポリグルタミド誘導体が好ましい。
カチオン性セグメントの分子量は、限定されるものではないが、第１の重合体と第２の重合体との自己組織化を促し、均質なベシクルを効率的に製造する観点からは、所定の範囲内の分子量を有することが好ましい。カチオン性セグメントの繰り返し単位数も制限されないが、通常はカチオン性セグメントの分子量が所定の範囲を満たすように、その繰り返し単位の種類に応じて決定される。具体的には、カチオン性セグメントとしてポリアスパラギン酸誘導体を用いる場合、その繰り返し単位数は好ましくは１０以上、より好ましくは５０以上、また、好ましくは２００以下、より好ましくは１００以下の範囲である。
前記条件を満たすカチオン性セグメントを用いることにより、第１の重合体と第２の重合体との水性溶液中での会合・沈殿を防止して安定化し、ベシクルを効率的に構築することが可能となる。
（Ｂ２−２ｂ−２：アニオン性セグメント）
アニオン性セグメントは、アニオン基を有し、アニオン性（陰イオン性）を示すポリマーセグメントである。但し、アニオン性セグメントは、第１の重合体と第２の重合体との自己組織化によるベシクルの形成を妨げない範囲で、多少のカチオン基を有していてもよい。
アニオン性セグメントの種類も限定されない。単一の繰り返し単位からなるセグメントでもよく、二種以上の繰り返し単位を任意の組み合わせ及び比率で含有するセグメントでもよい。アニオン性セグメントとしては、ポリカルボン酸、ポリスルホン酸、ポリリン酸（核酸等）等が好ましく、側鎖にカルボキシル基を有するポリアミノ酸又はその誘導体、核酸が特に好ましい。
側鎖にカルボキシル基を有するポリアミノ酸又はその誘導体としては、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、前述のポリカチオンで側鎖にアミノ基を有するポリアミノ酸又はその誘導体のアミノ基にアコニチン酸無水物やシトラコン酸無水物を適当量作用させて得られるポリカルボン酸、及びこれらの誘導体等が挙げられるが、特にポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸が好ましい。
核酸としては、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡが挙げられる。核酸は、ベシクルの用途に応じた機能性核酸であってもよい。機能性核酸としては、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ酵素等が挙げられる。これらはベシクルの用途に応じて選択される。例えば、ベシクルをＲＮＡｉ用のＤＤＳに用いる場合、核酸としてはｓｉＲＮＡが用いられる。また、核酸は修飾されたものでもよい。修飾された核酸の例としては、ベシクル安定化等の用途に向けて、コレステロールやビタミンＥ等の疎水性官能基が結合された核酸が挙げられる。
アニオン性セグメントの分子量は、限定されるものではないが、第１の重合体と第２の重合体との自己組織化を促し、均質なベシクルを効率的に製造する観点からは、所定の範囲内の分子量を有することが好ましい。アニオン性セグメントの繰り返し単位数も制限されないが、通常はアニオン性セグメントの分子量が所定の範囲を満たすように、その繰り返し単位の種類に応じて決定される。具体的には、アニオン性セグメントとしてポリカルボン酸、ポリスルホン酸、又は核酸を用いる場合、その繰り返し単位数は好ましくは１０以上、より好ましくは５０以上、また、好ましくは２００以下、より好ましくは１００以下の範囲である。
前記条件を満たすアニオン性セグメントを用いることにより、第１の重合体と第２の重合体との水性溶液中での会合・沈殿を防止して安定化し、ベシクルを効率的に構築することが可能となる。
（Ｂ２−２ｃ：非荷電親水性セグメントと荷電性セグメントとの組み合わせ）
第１の重合体が有する非荷電親水性セグメントと第１の荷電性セグメントとの組み合わせ、また、第２の重合体が第２の荷電性セグメントに加えて非荷電親水性セグメントを有する場合における、非荷電親水性セグメントと第２の荷電性セグメントとの組み合わせはいずれも制限されず、任意の非荷電親水性セグメントと任意の荷電性セグメントとを組み合わせることが可能である（なお、以降の記載では、第１の荷電性セグメント及び第２の荷電性セグメントを纏めて「荷電性セグメント」と表示する場合がある）。
非荷電親水性セグメント及び荷電性セグメントの個数も任意であり、各々１つでも２つ以上でもよく、２つ以上の場合には互いに同一でも異なっていてもよい。
非荷電親水性セグメントと荷電性セグメントとの結合形態も制限されず、直接結合していてもよいが、連結基を介して結合していてもよい。
連結基の例としては、非荷電親水性セグメント及び荷電性セグメントの総個数に対応する価数を有する炭化水素基が挙げられる。連結基としての炭化水素基は脂肪族でも芳香族でもそれらが連結したものでもよく、脂肪族の場合には飽和でも不飽和でもよく、また、直鎖でも分岐でも環状でもよい。連結基としての炭化水素基の分子量は、制限されるものではないが、通常５０００以下、好ましくは１０００以下である。連結基としての炭化水素基の例としては、没食子酸誘導体、３，５−ジヒドロキシ安息香酸誘導体、グリセリン誘導体、シクロヘキサン誘導体、Ｌ−リシン等が挙げられるが、３，５−ジヒドロキシ安息香酸誘導体等が好ましい。
連結基の別の例としては、ジスルフィド基が挙げられる。ジスルフィド基は、非荷電親水性セグメント１つと荷電性セグメント１つを連結するのに用いられる。ジスルフィド基を介して非荷電親水性セグメントと荷電性セグメントとを連結することにより、ベシクルの置かれた環境や外部からの作用によってジスルフィド基を開裂させ、ベシクルの形態や性質を変化させることが可能になる。これを利用すれば、例えばベシクルに薬物を内包させ、得られた物質内包ベシクルを薬物送達用のＤＤＳに用いる場合、生体内でジスルフィド基を開裂させることによって、ベシクル内に内包された物質の放出を促すことも可能になると考えられる。
また、第１の荷電性セグメントと第２の荷電性セグメントとの比率（カチオン性セグメントとアニオン性セグメントとの比率）、及び、非荷電親水性セグメントと荷電性セグメントとの比率も任意であるが、第１の重合体と第２の重合体との自己組織化を促し、均質なベシクルを効率的に製造する観点からは、以下の基準で選択することが好ましい。
まず、カチオン性セグメントとアニオン性セグメントとの比率については、下記式（ｉ）に規定するＣ／Ａ比が、通常０．３、好ましくは０．５以上、より好ましくは０．６以上、また、通常３．０未満、好ましくは２．０以下、より好ましくは１．７以下となるように調整することが望ましい。
ここで、第１及び第２の重合体中におけるカチオン基及びアニオン基のモル数は、カチオン性セグメント及びアニオン性セグメントの構造に依存する値であるが、一般的な電位差（酸・塩基）滴定により求めることが可能である。
また、第１及び第２の重合体中における非荷電親水性セグメントと荷電性セグメントとの比率は、前記Ｃ／Ａ比の範囲を満たすカチオン性セグメント及びアニオン性セグメントの比率を勘案して決定することが好ましい。具体的には、以下の式（ii）で規定される非荷電親水性セグメントの分子量比率Ｘを、通常０．０１以上、好ましくは０．０５以上、また、通常０．３５以下、好ましくは０．１以下の範囲に収めることが望ましい。
カチオン性セグメント（モノマー１つ当たり１つの正電荷を有するとする）及びアニオン性セグメント（モノマー１つ当たり１つの負電荷を有するとする）を各々一種類ずつ用い、少なくとも一方に非荷電親水性セグメントを導入して用いた場合（即ち、第１の重合体がカチオン性若しくはアニオン性セグメントと非荷電親水性セグメントとからなるブロック共重合体であり、第２の重合体がアニオン性若しくはカチオン性セグメントの単独重合体、又はそれと非荷電親水性セグメントとからなるブロック共重合体である場合）、そのＸは次式で規定される。
（Ｂ２−２ｄ：第１及び第２の重合体の具体例）
第１及び第２の重合体の具体例としては、以下の［例１］、［例２］が挙げられる。
［例１］
第１の重合体として下記（Ａ１）を用い、第２の重合体として下記（Ｂ１）を用いる。
（Ａ１）非荷電性親水性のセグメントとアニオン性のセグメントとを含むブロックコポリマー。
（Ｂ１）下記(i)のブロックコポリマー及び／又は下記(ii)のポリマー。
(i) 非荷電性親水性のセグメントとカチオン性のセグメントとを含むブロックコポリマー。
(ii) カチオン性のセグメントを含むポリマー（但し非荷電性親水性のセグメントを含まない）。
［例２］
第１の重合体として下記（Ａ２）を用い、第２の重合体として下記（Ｂ２）を用いる。
（Ａ２）非荷電性親水性のセグメントとカチオン性のセグメントとを含むブロックコポリマー。
（Ｂ２）下記(iii)のブロックコポリマー及び／又は下記(iv)のポリマー。
(iii) 非荷電性親水性のセグメントとアニオン性のセグメントとを含むブロックコポリマー。
(iv) アニオン性のセグメントを含むポリマー（但し非荷電性親水性のセグメントを含まない）。
なお、本発明においては、前記（Ｂ１）(ii)及び（Ｂ２）(iｖ)のポリマーのように、非荷電性親水性のセグメントを含まないポリマーを、便宜上、ホモポリマーということがある。
前記（Ｂ１）(i)、(ii)及び（Ａ２）の各ポリマーにおけるカチオン性のセグメントとしては、限定はされないが、例えば、側鎖にカチオン性基を有するポリペプチドに由来するものが好ましく挙げられる。
同様に、前記（Ａ１）及び（Ｂ２）(iii)、(iv)の各ポリマーにおいて、アニオン性のセグメントとしては、限定はされないが、例えば、側鎖にアニオン性基を有するポリペプチドや核酸に由来するものが好ましく挙げられる。
より具体的には、前記（Ａ１）及び（Ｂ２）(iii)の各ブロックコポリマーとしては、例えば、下記一般式(I)及び／又は(II)で示されるものが好ましく挙げられる。
ここで、一般式(I)及び(II)の構造式中、繰り返し単位数（重合度）が「ｍ」のセグメントがＰＥＧ由来の非荷電性親水性セグメント（以降「ＰＥＧセグメント」と表示する場合がある）であり、繰り返し単位数が「ｎ−ｙ」の部分と「ｙ」の部分とを合わせたセグメントがポリアニオン由来のアニオン性セグメント（以降「ポリアニオンセグメント」と表示する場合がある）である。
一般式(I)及び(II)中、Ｒ1a及びＲ1bは、それぞれ独立して水素原子又は未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ1-12アルキル基を表す。直鎖もしくは分枝のＣ1-12としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、iso−プロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、デシル、ウンデシル等を挙げることができる。また置換された場合の置換基としては、アセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基、Ｃ2-7アシルアミド基、同一もしくは異なるトリ−Ｃ1-6アルキルシロキシ基、シロキシ基又はシリルアミノ基を挙げることができる。ここで、アセタール化とは、ホルミルのカルボニルと、例えば、炭素数１〜６個のアルカノールの２分子又は炭素原子数２〜６個の分岐していてもよいアルキレンジオールとの反応によるアセタール部の形成を意味し、当該カルボニル基の保護方法でもある。例えば、置換基がアセタール化ホルミル基であるときは、酸性の温和な条件下で加水分解して、他の置換基であるホルミル基（−ＣＨＯ）（又はアルデヒド基）に転化できる。
一般式(I)及び(II)中、Ｌ1及びＬ2は、連結基を表す。具体的には、Ｌ1は−（ＣＨ2）b−ＮＨ−（ここでｂは１〜５の整数である）であることが好ましく、Ｌ2は−（ＣＨ2）c−ＣＯ−（ここでｃは１〜５の整数である）であることが好ましい。
一般式(I)及び(II)中、Ｒ2a、Ｒ2b、Ｒ2c及びＲ2dは、それぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表す。Ｒ2a及びＲ2bのいずれもがメチレン基の場合はポリ（アスパラギン酸誘導体）に相当し、エチレン基の場合はポリ（グルタミン酸誘導体）に相当し、また、Ｒ2c及びＲ2dのいずれもがメチレン基の場合はポリ（アスパラギン酸誘導体）に相当し、エチレン基の場合はポリ（グルタミン酸誘導体）に相当する。これらの一般式中、Ｒ2a及びＲ2b（Ｒ2b及びＲ2a）がメチレン基及びエチレン基の両者を表す場合、及びＲ2c及びＲ2d（Ｒ2d及びＲ2c）がメチレン基及びエチレン基の両者を表す場合、アスパラギン酸誘導体およびグルタミン酸誘導体の反復単位は、それぞれブロックを形成して存在するか、あるいはランダムに存在できる。
一般式(I)及び(II)中、Ｒ3は、水素原子、保護基、疎水性基又は重合性基を表す。具体的には、Ｒ3は、アセチル基、アクリロイル基又はメタクリロイル基であることが好ましい。
一般式(I)及び(II)中、Ｒ4は水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基又は開始剤残基を表す。ここで、ａは１〜５の整数であり、Ｘは、一級、二級、三級アミン又は四級アンモニウム塩の内の１種類又は２種類以上を含むアミン化合物残基、又は、アミンでない化合物残基であることが好ましい。さらには場合により、Ｒ4が−ＮＨ−Ｒ9（ここで、Ｒ9は未置換又は置換された直鎖又は分枝のＣ1-20アルキル基を表す）であることが好ましい。
一般式(I)及び(II)中、ｍは５〜２，０００の整数であり、５〜２７０の整数であることが好ましく、より好ましくは１０〜１００の整数である。また、ｎは２〜５，０００の整数であり、ｙは０〜５，０００の整数であり、ｎ及びｙは、５〜３００の整数であることが好ましく、より好ましくは１０〜１００の整数である。但し、ｙはｎより大きくないものとする。
一般式(I)及び(II)における各繰り返し単位は、記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムな順で存在することができる。特に、ポリアニオンセグメント中における各繰り返し単位についてのみ、上記の通りランダムな順で存在し得ることが好ましい。
一般式(I)及び(II)で示されるブロックコポリマーの分子量（Ｍｗ）は、限定はされないが、３，０００〜３０，０００であることが好ましく、より好ましくは５，０００〜２０，０００である。また、個々のセグメントについては、ＰＥＧセグメントの分子量（Ｍｗ）は、５００〜１５，０００であることが好ましく、より好ましくは１，０００〜５，０００であり、ポリアニオンセグメントの分子量（Ｍｗ）は、全体で５００〜５０，０００であることが好ましく、より好ましくは１，０００〜２０，０００である。
一般式(I)及び(II)で示されるブロックコポリマーの製造方法は、限定はされないが、例えば、Ｒ1aＯ−又はＲ1bＯ−とＰＥＧ鎖のブロック部分とを含むセグメント（ＰＥＧセグメント）を予め合成しておき、このＰＥＧセグメントの片末端（Ｒ1aＯ−又はＲ1bＯ−と反対の末端）に、所定のモノマーを順に重合し、その後必要に応じて側鎖をアニオン性基を含むように置換又は変換する方法、あるいは、上記ＰＥＧセグメントと、アニオン性基を含む側鎖を有するブロック部分とを予め合成しておき、これらを互いに連結する方法などが挙げられる。当該製法における各種反応の方法及び条件は、常法を考慮し適宜選択又は設定することができる。上記ＰＥＧセグメントは、例えば、ＷＯ９６／３２４３４号公報、ＷＯ９６／３３２３３号公報及びＷＯ９７／０６２０２号公報等に記載のブロック共重合体のＰＥＧセグメント部分の製法を用いて調製することができる。
一般式(I)及び(II)で示されるブロックコポリマーの、より具体的な製造方法としては、例えば、末端にアミノ基を有するＰＥＧセグメント誘導体を用いて、そのアミノ末端に、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート（ＢＬＡ）及びＮε−Ｚ−Ｌ−リシン等の保護アミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させてブロックコポリマーを合成し、その後、各セグメントの側鎖が前述したアニオン性基を有する側鎖となるように置換又は変換する方法が好ましく挙げられる。
本発明において、一般式(I)及び(II)で示されるブロックコポリマーの具体例としては、例えば、非荷電親水性セグメントであるポリエチレングリコール（以降「ＰＥＧ」と表示する場合がある）と、アニオン性セグメントであるポリアスパラギン酸（以降「Ｐ（Ａｓｐ）」と表示する場合がある）とからなる下記式のアニオン性ブロックコポリマー（以降「ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）」と表示する場合がある）等が好ましく挙げられる（なお、以降の式では対カチオンの例としてＮａ+を示す場合があるが、対カチオンはこれに限定されるものではない）。
上記式中、
ｍはＰＥＧの重合度を表す整数である。
ｎはＰ（Ａｓｐ）の重合度を表す整数である。
ａ、ｂは何れも０より大きく、１未満の数である。但しａ＋ｂ＝１である。
ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）としては、ＰＥＧセグメントの分子量（Ｍｗ）：２，０００、ポリアニオンセグメントを示すＰ（Ａｓｐ）のユニット数（上記式中ｎ）：７０又は７５であるものが特に好ましい。
前記（Ａ２）及び（Ｂ１）(i)の各ブロックコポリマーとしては、例えば、下記一般式(III)及び／又は(IV)で示されるものが好ましく挙げられる。
ここで、一般式(III)及び(IV)の構造式中、繰り返し単位数（重合度）が「ｍ」のセグメントがＰＥＧ由来の非荷電性親水性セグメント（ＰＥＧセグメント）であり、繰り返し単位数が「ｎ−ｙ−ｚ」の部分と「ｙ」の部分と「ｚ」の部分とを合わせたセグメントがポリカチオン由来のカチオン性セグメント（以下、ポリカチオンセグメント）である。
一般式(III)及び(IV)中、Ｒ1a及びＲ1bは、それぞれ独立して水素原子又は未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ1-12アルキル基を表す。直鎖もしくは分枝のＣ1-12としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、iso−プロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、デシル、ウンデシル等を挙げることができる。また置換された場合の置換基としては、アセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基、Ｃ2-7アシルアミド基、同一もしくは異なるトリ−Ｃ1-6アルキルシロキシ基、シロキシ基又はシリルアミノ基を挙げることができる。ここで、アセタール化とは、ホルミルのカルボニルと、例えば、炭素数１〜６個のアルカノールの２分子又は炭素原子数２〜６個の分岐していてもよいアルキレンジオールとの反応によるアセタール部の形成を意味し、当該カルボニル基の保護方法でもある。例えば、置換基がアセタール化ホルミル基であるときは、酸性の温和な条件下で加水分解して他の置換基であるホルミル基（−ＣＨＯ：又はアルデヒド基）に転化できる。
一般式(III)及び(IV)中、Ｌ1及びＬ2は、連結基を表す。具体的には、Ｌ1は−（ＣＨ2）b−ＮＨ−（ここで、ｂは１〜５の整数である）であることが好ましく、Ｌ2は−（ＣＨ2）c−ＣＯ−（ここで、ｃは１〜５の整数である）であることが好ましい。
一般式(III)及び(IV)中、Ｒ2a、Ｒ2b、Ｒ2c及びＲ2dは、それぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表す。Ｒ2a及びＲ2bのいずれもがメチレン基の場合はポリ（アスパラギン酸誘導体）に相当し、エチレン基の場合はポリ（グルタミン酸誘導体）に相当し、また、Ｒ2c及びＲ2dのいずれもがメチレン基の場合はポリ（アスパラギン酸誘導体）に相当し、エチレン基の場合はポリ（グルタミン酸誘導体）に相当する。これらの一般式中、Ｒ2a及びＲ2b（Ｒ2b及びＲ2a）がメチレン基及びエチレン基の両者を表す場合、及びＲ2c及びＲ2d（Ｒ2d及びＲ2c）がメチレン基及びエチレン基の両者を表す場合、アスパラギン酸誘導体およびグルタミン酸誘導体の反復単位は、それぞれブロックを形成して存在するか、あるいはランダムに存在できる。
一般式(III)及び(IV)中、Ｒ3は、水素原子、保護基、疎水性基又は重合性基を表す。具体的には、Ｒ3は、アセチル基、アクリロイル基又はメタクリロイル基であることが好ましい。
一般式(III)及び(IV)中、Ｒ4は水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基又は開始剤残基を表す。ここで、ａは１〜５の整数であり、Ｘは、一級、二級、三級アミン、四級アンモニウム塩又はグアニジノ基の内の１種類又は２種類以上を含むアミン化合物残基、又は、アミンでない化合物残基であることが好ましい。さらには場合により、Ｒ4が−ＮＨ−Ｒ9（ここで、Ｒ9は未置換又は置換された直鎖又は分枝のＣ1-20アルキル基を表す）であることが好ましい。
一般式(III)及び(IV)中、Ｒ5a、Ｒ5b、Ｒ5c及びＲ5dは、それぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基を表す。ここで、ａは１〜５の整数であり、Ｘは、一級、二級、三級アミン、四級アンモニウム塩又はグアニジノ基の内の１種類又は２種類以上を含むアミン化合物残基、又は、アミンでない化合物残基であることが好ましい。
Ｒ5aとＲ5bとの総数及びＲ5cとＲ5dとの総数のうち、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基（ここで、Ｘは（ＮＨ（ＣＨ2）2）e−ＮＨ2（但しｅは０〜５の整数）である）であるものが、少なくとも２つ以上存在することが好ましく、上記総数の５０％以上存在することがより好ましく、上記総数の８５％以上存在することがさらに好ましい。
また、Ｒ5a、Ｒ5b、Ｒ5c及びＲ5dのすべて又は一部が、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基（ここで、ａは２であり、Ｘは（ＮＨ（ＣＨ2）2）e−ＮＨ2（但しｅは１）である）ことが好ましい。
さらに、Ｒ4並びにＲ5a、Ｒ5b、Ｒ5c及びＲ5dの例示として上記した−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基において、Ｘが下記の各式で表される基から選ばれるものである場合が特に好ましい。
ここで、上記の各式中、Ｘ2は、水素原子又はＣ1-6アルキル基もしくはアミノＣ1-6アルキル基を表し、Ｒ7a、Ｒ7b及びＲ7cは、それぞれ独立して水素原子又はメチル基を表し、ｄ１、ｄ２及びｄ３は、それぞれ独立して１〜５の整数を表し、ｅ１、ｅ２及びｅ３は、それぞれ独立して１〜５の整数を表し、ｆは、０〜１５の整数を表し、ｇは０〜１５の整数を表し、Ｒ8a及びＲ8bは、それぞれ独立して水素原子又は保護基を表す。ここで、当該保護基は、通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれる基であることが好ましい。
一般式(III)及び(IV)中、Ｒ6a及びＲ6bは、それぞれ独立して水素原子、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2、又は保護基であり、ここで保護基は通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれる基であることが好ましい。また、一般式(III)及び(IV)中、ｔは２〜６の整数であることが好ましく、より好ましくは３又は４である。
一般式(III)及び(IV)中、ｍは５〜２，０００の整数であり、５〜２７０の整数であることが好ましく、より好ましくは１０〜１００の整数である。また、ｎは２〜５，０００の整数であり、ｙは０〜５，０００の整数であり、ｚは０〜５，０００の整数である。ｎは、５〜３００の整数であることが好ましく、より好ましくは０又は１０〜１００の整数である。ｙ及びｚは、０又は５〜３００の整数であることが好ましく、より好ましくは０又は１０〜１００の整数である。但し、ｙとｚとの合計（ｙ＋ｚ）は、ｎより大きくないものとする。
一般式(III)及び(IV)における各繰り返し単位は、記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムな順で存在することができる。特に、ポリカチオンセグメント中における各繰り返し単位についてのみ、上記の通りランダムな順で存在し得ることが好ましい。
一般式(III)及び(IV)で示されるブロックコポリマーの分子量（Ｍｗ）は、限定はされないが、２３，０００〜４５，０００であることが好ましく、より好ましくは２８，０００〜３４，０００である。また、個々のセグメントについては、ＰＥＧセグメントの分子量（Ｍｗ）は、５００〜１５，０００であることが好ましく、より好ましくは１，０００〜５，０００であり、ポリカチオンセグメントの分子量（Ｍｗ）は、全体で５００〜５０，０００であることが好ましく、より好ましくは１，０００〜３０，０００である。
一般式(III)及び(IV)で示されるブロックコポリマーの製造方法は、限定はされないが、例えば、Ｒ1aＯ−又はＲ1bＯ−とＰＥＧ鎖のブロック部分とを含むセグメント（ＰＥＧセグメント）を予め合成しておき、このＰＥＧセグメントの片末端（Ｒ1aＯ−又はＲ1bＯ−と反対の末端）に、所定のモノマーを順に重合し、その後必要に応じて側鎖をカチオン性基を含むように置換又は変換する方法、あるいは、上記ＰＥＧセグメントと、カチオン性基を含む側鎖を有するブロック部分とを予め合成しておき、これらを互いに連結する方法などが挙げられる。当該製法における各種反応の方法及び条件は、常法を考慮し適宜選択又は設定することができる。上記ＰＥＧセグメントは、例えば、ＷＯ９６／３２４３４号公報、ＷＯ９６／３３２３３号公報及びＷＯ９７／０６２０２号公報等に記載のブロック共重合体のＰＥＧセグメント部分の製法を用いて調製することができる。
一般式(III)及び(IV)で示されるブロックコポリマーの、より具体的な製造方法としては、例えば、末端にアミノ基を有するＰＥＧセグメント誘導体を用いて、そのアミノ末端に、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート（ＢＬＡ）及びＮε−Ｚ−Ｌ−リシン等の保護アミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させてブロックコポリマーを合成し、その後、各セグメントの側鎖が前述したカチオン性基を有する側鎖となるように、ジエチレントリアミン（ＤＥＴ）等で置換又は変換する方法が好ましく挙げられる。
一般式(III)及び(IV)で示されるブロックコポリマーの具体例としては、例えば、非荷電親水性セグメントであるポリエチレングリコール（以降「ＰＥＧ」と表示する場合がある）と、カチオン性セグメントであるポリ（ジアミノペンタン構造含有アスパラギン誘導体）（以降「Ｐ(Ａｓｐ−ＡＰ）」と表示する場合がある）からなる下記式のカチオン性ブロックコポリマー（以降「ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）」と表示する場合がある）等が好ましく挙げられる（なお、以降の式では対アニオンの例として、Ｃｌ-を示す場合があるが、対アニオンはこれに限定されるものではない）。
上記式中、
ｍはＰＥＧの重合度を表す整数である。
ｎはＰ（Ａｓｐ−ＡＰ）の重合度を表す整数である。
ａ、ｂは何れも０より大きく、１未満の数である。但しａ＋ｂ＝１である。
ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）としては、ＰＥＧセグメントの分子量（Ｍｗ）：２，０００，ポリカチオンセグメントを示すＰ（Ａｓｐ−ＡＰ）のユニット数（上記式中ｎ）：７０又は７５であるものが特に好ましい。
前記（Ｂ２）(iv)のポリマーとしては、例えば、下記一般式(V)及び／又は(VI)で示されるものが好ましく挙げられる。なお、一般式(V)及び(VI)に関する説明については、前述した一般式(I)及び(II)に関する説明（但しＰＥＧセグメントに関する説明は除く）が、適宜同様に適用できる。
本発明において、一般式(V)及び(VI)で示されるポリマーの具体例としては、例えば、アニオン性セグメントであるポリアスパラギン酸（Ｐ（Ａｓｐ））からなる下記式のアニオン性ホモポリマー（以降「Ｈｏｍｏ−Ｐ（Ａｓｐ）」と表示する場合がある）等が好ましく挙げられる。
上記式中、
ｎはＰ（Ａｓｐ）の重合度を表す整数である。
ａ、ｂは何れも０より大きく、１未満の数である。但しａ＋ｂ＝１である。
Ｈｏｍｏ−Ｐ（Ａｓｐ）としては、ポリアニオンセグメントを示すＰ（Ａｓｐ）のユニット数（上記式中ｎ）：７０又は８２であるものが特に好ましい。
前記（Ｂ１）(ii)のポリマーとしては、例えば、下記一般式(VII)及び／又は(VIII)で示されるものが好ましく挙げられる。なお、一般式(VII)及び(VIII)に関する説明については、前述した一般式(III)及び(IV)に関する説明が、適宜同様に適用できる。
本発明において、一般式(VII)及び(VIII)で示されるポリマーの具体例としては、例えば、カチオン性セグメントであるポリ（ジアミノペンタン構造含有アスパラギン誘導体）（Ｐ(Ａｓｐ−ＡＰ））からなる下記式のカチオン性ホモポリマー（以降「Ｈｏｍｏ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）」と表示する場合がある）等が好ましく挙げられる。
上記式中、
ｎはＰ（Ａｓｐ−ＡＰ）の重合度を表す整数である。
ａ、ｂは何れも０より大きく、１未満の数である。但しａ＋ｂ＝１である。
Ｈｏｍｏ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）としては、ポリカチオンセグメントを示すＰ（Ａｓｐ−ＡＰ）のユニット数（上記式中ｎ）：７０又は８２であるものが特に好ましい。
（Ｂ２−３：その他の膜成分）
空ベシクルの形成時には、第１の重合体及び第２の重合体に加えて、ベシクルの形成を妨げない、或いは安定性を下げない範囲で、その他の膜成分を添加することができる。その他の膜成分に特に制限はないが、具体例としては荷電性重合体、荷電性ナノ粒子等が挙げられる。
荷電性重合体としては、前述した荷電性セグメント（カチオン性セグメント又はアニオン性セグメント）を１又は２以上有する重合体であって、前記の第１の重合体及び第２の重合体に該当しない任意の荷電性重合体が挙げられる。
荷電性ナノ粒子としては、表面に荷電を有する金属系ナノ粒子等が挙げられる。
前記その他の膜成分は、一種を単独で使用してもよく、二種以上を任意の組み合わせ及び比率で併用してもよい。
前記その他の膜成分の使用量も制限されないが、第１の重合体と第２の重合体との自己組織化によるベシクル形成を妨げない程度に抑えることが好ましい。具体的には、ベシクルの総重量に対して通常３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下とすることが望ましい。
（Ｂ２−４：空ベシクルの製造方法）
物質を内包させる空ベシクルは、第１の重合体と第２の重合体との静電相互作用を利用して形成されることから、第１の重合体と第２の重合体とを水性溶液中で混合することにより簡便に製造される。斯かる製造方法によれば、有機溶媒を用いなくともベシクルを製造し得るから、ＤＤＳやバイオマテリアル等の分野において有利である。
具体的には、第１の重合体を含んでなる第１の水性溶液と、第２の重合体を含んでなる第２の水性溶液とを用意する。第１及び第２の水性溶液は、所望により濾過して精製してもよい。
第１の水性溶液における第１の重合体の濃度、及び、第２の水性溶液における第２の重合体の濃度は限定されず、第１の重合体と第２の重合体との総電荷数の比率、第１の重合体及び第２の重合体の水性溶液への溶解度、ベシクルの形成効率等の条件を勘案して、適宜決定される。
第１及び第２の水性溶液の溶媒は、水性溶媒であれば、その種類は限定されない。好ましくは水であるが、ベシクルの形成を妨げない範囲で、水に他の成分を混合した溶媒、例えば生理食塩水、水性緩衝液、水と水溶性有機溶媒との混合溶媒等も用いることができる。水性緩衝液としては１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液等が挙げられる。
第１及び第２の水性溶液のｐＨは、ベシクルの形成を妨げない範囲で適宜調整することが可能であるが、好ましくはｐＨ５以上、より好ましくはｐＨ６．５以上であり、また、好ましくはｐＨ９以下、より好ましくはｐＨ７．５以下である。ｐＨの調整は、溶媒として緩衝液を用いることにより、容易に行うことができる。第１及び第２の水性溶液のｐＨを調整して用いることは、第１の重合体及び第２の重合体の荷電状態を保持し、効率的にベシクルを形成する上で有利である。
第１及び第２の水性溶液の温度は、第１の重合体及び第２の重合体の溶媒に対する溶解度に応じて適宜決定されるが、好ましくは１０℃以上、より好ましくは２０℃以上であり、また、好ましくは８０℃以下、より好ましくは５０℃以下である。
第１及び第２の水性溶液のイオン強度は、ベシクルの形成を妨げない範囲で適宜調整することが可能であるが、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上であり、また、好ましくは２００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。
以上の第１及び第２の水性溶液を混合することにより、ベシクルを作成する。混合方法は限定されず、第１の水性溶液に第２の水性溶液を加えてもよく、第２の水性溶液に第１の水性溶液を加えてもよい。また、容器に第１及び第２の水性溶液を同時に入れて混合してもよい。得られた第１及び第２の水性溶液の混合液を、適宜攪拌してもよい。
第１及び第２の水性溶液の混合時の温度は、ベシクルの形成を妨げない範囲であれば限定されないが、第１の重合体及び第２の重合体の温度に応じた溶解度を勘案して設定することが好ましい。具体的には、好ましくは１０℃以上、より好ましくは２０℃以上、また、好ましくは６０℃以下、より好ましくは５０℃以下である。
混合後、形成された空ベシクルをすぐに後担持法に供してもよいが、系を平衡化させるために、混合液を静置する時間を設けてもよい。但し、形成されたベシクルの径は経時的に増大する傾向があるので、通常は静置時間を設けないで、形成された空ベシクルをすぐに後担持法に供することが好ましい。
その他の膜成分を用いる場合、上記の第１及び第２の水性溶液と、当該膜成分とを混合すればよい。このとき、混合前の第１又は第２の水性溶液に当該膜成分を加えて混合してもよいが、当該膜成分と第１又は第２の水性溶液との間にベシクル形成を妨げる会合や相互作用がないことが望ましい。また、第１及び第２の水性溶液の混合時に当該膜成分を一緒に加えて混合してもよく、第１及び第２の水性溶液の混合後に当該膜成分を加えて更に混合してもよい。また、他の膜成分をそのまま混合に用いてもよいが、当該膜成分を含有する水性溶液を調製し、これを混合に用いてもよい。膜成分の水性溶液の調製における水性溶媒、ｐＨ、温度、イオン強度等の調製条件は、第１及び第２の水性溶液について上述した条件と同様である。
また、更に透析、希釈、濃縮、撹拌等の操作を適宜付加してもよい。
［Ｂ３：被内包物質］
ベシクルに内包させる被内包物質は制限されず、物質内包ベシクルの用途や性質等に応じて適宜、任意に選択することができる。
特に、従来の製造方法の一つである同時混合法によれば、被内包物質として荷電性の物質を用いた場合、膜構成成分である重合体の自己組織化によるベシクルの形成が被内包物質の荷電によって阻害され、適切な物質内包ベシクルが得られないという問題があった。しかし、後担持法によれば、被内包物質の電気的性質に斯かる制限はなく、被内包物質として荷電性の物質を用いた場合でも非荷電性の物質を用いた場合でも、物質内包ベシクルを効率的に形成することが可能である。
具体的に、被内包物質の種類としては、生体分子、有機化合物、無機物質等が挙げられる。
生体分子としては、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、脂質（脂肪酸、グリセリド、ステロイド等）、炭水化物（単糖類、多糖類）、及びこれらの誘導体、並びにこれらの二種以上が結合したもの（糖タンパク質、糖脂質等）等が挙げられる。中でもタンパク質、炭水化物等が好ましい。
有機化合物としては、発光（蛍光、燐光等）分子、水溶性薬剤、水溶性高分子、平均粒径１００ｎｍ以下の水溶性分子集合体（ミセル、ベシクル、ナノゲルなど）、平均粒径１００ｎｍ以下のエマルション等が挙げられる。中でも平均粒径５０ｎｍ以下の高分子ミセル、分子量１０万以下の水溶性高分子が好ましい。
無機物質としては、水に分散可能な金属ナノ粒子、酸化物ナノ粒子（シリカナノ粒子、チタニアナノ粒子、酸化鉄ナノ粒子等）、半導体ナノ粒子（量子ドット等）、水溶性炭素クラスター、ホウ素クラスター、金属錯体等が挙げられる。中でも平均粒径２０ｎｍ以下の量子ドットが好ましい。
また、用途別に分類すると、被内包物質としては、抗がん剤（例えば、ドキソルビシンやパクリタキセル等の疎水性抗がん剤、シスプラチン等の金属錯体抗がん剤等及びそれらの高分子ミセル化体）、ＭＲＩ等の診断に用いられるガドリニウムや鉄化合物、有機発光（蛍光、燐光等）色素や量子ドット等が挙げられる。
被内包物質の分子量及び粒径も制限されないが、空ベシクル内に被内包物質を効率的に導入する観点からは、被内包物質の分子量は通常２０万以下、中でも１０万以下とすることが好ましく、被内包物質の粒径は通常１００ｎｍ以下、中でも５０ｎｍ以下とすることが好ましい。
空ベシクルに対する被内包物質の使用比率も、空ベシクルの構造を破壊したり、被内包物質の空ベシクルへの内包を阻害したりしない範囲で、所望の被内包物質の内包量に応じて調整すればよい。
被内包物質は１種を単独で使用しても、２種以上を任意の比率及び組み合わせで使用してもよい。
［Ｂ４：その他の工程］
後担持法は、少なくとも、所定の構造を有する空ベシクルを用意する工程と、前記空ベシクル及び被内包物質を水性媒体中で混合する工程とを有していればよいが、更にその他の工程を有していてもよい。例としては、架橋剤処理、ろ過操作、透析操作、凍結乾燥操作等が挙げられる。
中でも、物質内包ベシクルを生理環境下や生理食塩水中等の塩存在条件下で使用する場合（例えばＤＤＳとして使用する場合等）には、粒径の経時的な増大を防止する観点から、形成された物質内包ベシクルに対して、後処理として架橋剤処理を施すことが好ましい。すなわち、生理環境下や生理食塩水中等の塩存在条件下では、架橋剤を含有しないベシクルの粒径は経時的に増大する傾向があるが、架橋剤処理を施すことにより粒径の増大を防止することができる。
架橋剤の種類は制限されず、ベシクルの用途や第１の重合体及び第２の重合体の種類、他の膜成分の種類等に応じて適宜選択することができるが、効率的に架橋を行うとともに、物質内包ベシクルの安定性を高める観点からは、第１の重合体及び第２の重合体の荷電性セグメントが有する荷電性基（例えばアミノ基等のカチオン基やカルボキシル基等のアニオン基）と反応し、被内包物質とは反応しない架橋剤が好ましい。架橋剤の具体例としては、アミノ基を架橋する架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド、スベリンイミド酸ジメチルニ塩酸塩（dimethyl suberimidate dihydrochloride：ＤＭＳ）、３，３’−ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル（dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate：ＤＴＢＰ））、アミノ基とカルボキシル基を縮合することで架橋する架橋剤（例えば、１−エチル３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropy)carbodiimide：ＥＤＣ）等）、リン酸基を架橋する架橋剤（例えばカルシウムイオン等の金属イオン）等が挙げられるが、グルタルアルデヒド、ＥＤＣ等が好ましく、ＥＤＣが特に好ましい。また、１種の架橋剤を単独で使用してもよいが、２種以上の架橋剤を任意の組み合わせ及び比率で使用してもよい。
架橋剤の使用量も制限されず、架橋剤の種類及び架橋点の数、架橋対象成分の量等を考慮して適宜決定すればよいが、例えば、アミノ基とカルボキシル基とを架橋する架橋剤の場合、下記式（iii）に規定するＣＬ比が次に説明する条件を満たすように使用量を選択することが望ましい。
効率的に架橋を行うとともに、物質内包ベシクルの安定性を高める観点からは、ＣＬ比が通常０．１以上、好ましくは０．５以上となるように、架橋剤と第１及び第２の重合体との量比を調整することが望ましい。一方、物質内包ベシクルをＤＤＳとして薬物の送達に用いる場合（例えば用いる場合）、薬物を標的部位において効率よく放出させる観点からは、架橋剤の使用量はあまり多過ぎないことが好ましく、具体的には、ＣＬ比が通常１０以下、好ましくは５以下となるように、架橋剤と第１及び第２の重合体との量比を調整することが望ましい。但し、上記記載のＣＬ比の範囲はあくまでも目安であり、実際にはベシクルの用途や第１の重合体及び第２の重合体の種類、他の膜成分の種類等に応じて、ＣＬ比を適宜調整することが好ましい。
［Ｂ５：物質内包ベシクル］
後担持法を含む各種の任意の手法で空ベシクルに物質を内包させることにより、前述の空ベシクルの空隙部内に前述の被内包物質が内包された、物質内包ベシクルが得られる。
斯かる物質内包ベシクルは、非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体と、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体とから形成される膜と、前記膜によって包囲された空隙部と、前記空隙部内に内包された物質とを含んでなる。
物質内包ベシクルの膜の構造は、上述した空ベシクルの膜の構造と基本的に同等である。即ち、物質内包ベシクルは、図２〜４を用いて説明した空ベシクルの構造膜と同様の三層構造膜を有することが好ましく、その形状は通常は球状又は略球状である。
後担持法で得られる物質内包ベシクルの粒径は、空ベシクルの構造、被内包物質の種類、ベシクルの周辺環境（水性媒体の種類）、混合の条件等に応じて異なるが、通常は空ベシクルの粒径とほぼ同等である。また、後担持法かその他の製法かによらず、得られる物質内包ベシクルの粒径は、好ましくは１０ｎｍ以上、より好ましくは５０ｎｍ以上、また、好ましくは１０００ｎｍ以下、より好ましくは４００ｎｍ以下、より好ましくは２００ｎｍ以下である。後述する本発明の各物質内包ベシクルの粒径も、別途記載なき限り同程度となる。
後担持法で得られる物質内包ベシクルの膜厚も、空ベシクルの構造、被内包物質の種類、ベシクルの周辺環境（水性媒体の種類）、混合の条件等に応じて異なるが、通常は空ベシクルの粒径及び膜厚とほぼ同等である。また、後担持法かその他の製法かによらず、得られる物質内包ベシクルの膜厚は、好ましくは５ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上、また、好ましくは３０ｎｍ以下、より好ましくは１５ｎｍ以下である。後述する本発明の各物質内包ベシクルの膜厚も、別途記載なき限り同程度となる。
従来の手法では、静電相互作用型ベシクル（ＰＩＣｓｏｍｅ）に物質を内包させることは一部可能であるものの、適用範囲に制限があった。また、空のベシクルに後から物質を内包させることは困難、又は不可能であった。後担持法によれば、静電相互作用型ベシクル（ＰＩＣｓｏｍｅ）に広汎な物質を内包させた物質内包静電相互作用型ベシクル（物質内包ＰＩＣｓｏｍｅ）の製造が可能となる。
物質内包ベシクルは、高分子の自己組織化により形成されたベシクルの空隙部内に、各種の物質が安定に保持されているため、薬物を送達するＤＤＳや、有効成分を担持する機能性材料等の各種用途に有効に用いることができる。例えば、被内包物質やベシクル膜の構成成分としてｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）を用いることにより、得られる物質内包ベシクルをＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）用のＤＤＳ等に用いることができる。また、複数の薬剤を被内包物質として内包させたり、被内包物質及び膜材料として併用したりすることにより、薬剤の併用療法にも使用可能である。
［Ｃ］物質内包架橋ベシクル及びその製法
＜Ｃ−１：第１の態様／物質内包架橋ベシクルの単分散集合体及びその製法＞
［概要］
第１の態様に係る方法は、空の架橋ベシクルの単分散集合体を、目的物質を水性媒体とともに含有する混合液中で混合し、内水相に目的物質が内包された物質内包架橋ベシクルの単分散集合体を形成させる工程を含んでなる、物質内包架橋ベシクルの製造方法である。
第１の態様に係る方法において、混合液に含有される目的物質の濃度は、非架橋である点で空の架橋ベシクルの単分散集合体と異なる空の非架橋ベシクルの単分散集合体を同混合液中で混合した場合に、内水相に目的物質が内包された物質内包非架橋ベシクルの単分散集合体の形成を阻害する濃度である。
空の非架橋ベシクルの単分散集合体を、目的物質の存在下、水性媒体中で混合する場合、目的物質の濃度が一定濃度を超えると、物質内包非架橋ベシクルの単分散集合体の形成が阻害される（すなわち、多分散集合体が形成される）場合がある。これに対して、空の架橋ベシクルの単分散集合体を、目的物質の存在下、水性媒体中で混合する場合には、この一定濃度を超えても、物質内包架橋ベシクルの単分散集合体の形成が阻害されない。したがって、第１の態様に係る方法によれば、水性媒体中に存在する目的物質の濃度が、従来法よりも高濃度（例えば、後担持法において物質内包ベシクルの単分散集合体の形成が阻害される濃度）であっても、空の架橋ベシクルに、その単分散性を維持しつつ、目的物質を封入することができ、これにより、従来法よりも高濃度の目的物質が内包された物質内包ベシクルの単分散集合体を製造することができる。
［空の架橋ベシクルの単分散集合体］
空の架橋ベシクルの単分散集合体の平均粒子径は、通常３０ｎｍ以上、好ましくは５０ｎｍ以上、さらに好ましくは７０ｎｍ以上であり、通常１００００ｎｍ以下、好ましくは１０００ｎｍ以下、さらに好ましくは４００ｎｍ以下である。
空の架橋ベシクルの単分散集合体を構成する各ベシクルは、第１及び第２の重合体を含んでなり、第１及び／又は第２の重合体が架橋された架橋膜と、架橋膜によって包囲された内水相とを含んでなり、内水相に目的物質が内包されていないベシクルである。
空の架橋ベシクルにおける第１及び第２の重合体は、上記［Ｂ２−２：第１及び第２の重合体］に記載した通りである。
空の架橋ベシクルにおけるその他の膜成分は、上記［Ｂ２−３：その他の膜成分］に記載した通りである。
空の架橋ベシクルの架橋膜に含まれる第１及び／又は第２の重合体は架橋されている。すなわち、空の架橋ベシクルの架橋膜は、第１の重合体間の架橋結合、第２の重合体間の架橋結合、及び第１の重合体と第２の重合体との間の架橋結合からなる群より選択される１種又は２種以上の架橋結合を含む。空の架橋ベシクルの架橋膜は、形成される物質内包架橋ベシクルの単分散性を向上させる点から、第１の重合体と第２の重合体との間に形成された架橋結合を含むことが好ましい。
空の架橋ベシクルの架橋膜に含まれる第１及び／又は第２の重合体は、カチオン基間に形成された架橋結合、アニオン基間に形成された架橋結合、及びカチオン基とアニオン基との間に形成された架橋結合からなる群より選択された１種又は２種以上の架橋結合によって架橋されていることが好ましく、カチオン基とアニオン基との間に形成された架橋結合によって架橋されていることがさらに好ましい。カチオン基及びアニオン基は、第１の重合体（第１の荷電性セグメント）及び第２の重合体（第２の荷電性セグメント）が有する荷電性基である。
架橋率は、目的物質の封入時に空の架橋ベシクルの単分散性が維持される範囲内において、目的物質の種類、目的物質の封入時に使用される混合方法の種類等に応じて適宜調節することができる。ここで、「架橋率」は、架橋膜に含まれるカチオン基及び／又はアニオン基の総モル数のうち、架橋結合が形成された割合、すなわち、カチオン基間が架橋される場合には、架橋膜に含まれるカチオン基の総モル数のうち、カチオン基間の架橋結合が形成された割合であり、アニオン基間が架橋される場合には、架橋膜に含まれるアニオン基の総モル数のうち、アニオン基間の架橋結合が形成された割合であり、カチオン基とアニオン基との間が架橋される場合には、架橋膜に含まれるカチオン基及びアニオン基の総モル数のうち、カチオン基−アニオン基間の架橋結合が形成された割合である。
空の架橋ベシクルの架橋率が高いほど、空の架橋ベシクルに封入可能な目的物質の最大分子サイズ（最大分子量）は小さくなる一方、空の架橋ベシクルの架橋率が低いほど、空の架橋ベシクルに封入可能な目的物質の最大分子サイズ（最大分子量）は大きくなる。したがって、目的物質の分子サイズ（分子量）が小さいほど、架橋率の上限は高くなる一方、目的物質の分子サイズ（分子量）が大きいほど、架橋率の上限は低くなる。封入可能な目的物質の分子サイズ（分子量）の範囲を広げ、第１の態様に係る方法の汎用性を向上させる点からは、空の架橋ベシクルの架橋率を低くすることが好ましい。
空の架橋ベシクルの架橋率が高いほど、空の架橋ベシクルの単分散性を維持可能な最大印加外力が大きくなる一方、空の架橋ベシクルの架橋率が低いほど、空の架橋ベシクルの単分散性を維持可能な最大印加外力が小さくなる。したがって、空の架橋ベシクルに印加される外力が大きいほど、架橋率の下限は高くなる一方、空の架橋ベシクルに印加される外力が小さいほど、架橋率の下限は低くなる。例えば、撹拌による混合よりも超音波照射による混合の方が、空の架橋ベシクルに印加される外力が大きいので、架橋率の下限は高くなる。空の架橋ベシクルへの目的物質の封入時に使用可能な混合方法の範囲が広げ、第１の態様に係る方法の汎用性を向上させる点からは、空の架橋ベシクルの架橋率を高くすることが好ましい。
重量平均分子量１００００〜４００００の目的物質を空の架橋ベシクルへ封入する際、混合方法として撹拌を使用する場合には、架橋率の下限は、好ましくは３５％、さらに好ましくは３７％、さらに一層好ましくは３８％であり、混合方法として超音波照射を使用する場合には、架橋率の下限は、好ましくは５０％、さらに好ましくは５５％である。いずれの場合も、架橋率の上限は、好ましくは８０％、さらに好ましくは７５％である。
架橋率の測定方法は、架橋剤の種類に応じて適宜選択することができる。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等のアミド縮合タイプの架橋剤の場合、架橋率の算出方法の一例として、赤外吸収スペクトルから求められるカルボキシル基（−ＣＯＯ-）の消費量に基づいて、架橋率を測定する方法が挙げられる。また、別法として、アミド結合（−ＣＯＮＨ−）の増加量に基づいて、架橋率を測定する方法が挙げられる。但し、第１及び第２の荷電性セグメントがポリアミノ酸又はその誘導体である場合、第１及び第２の荷電性セグメントがアミド結合を大量に含むため、架橋率の測定精度が低下するおそれがある。したがって、この場合には、他の測定方法（例えば、カルボキシル基の消費量に基づく測定方法）と組み合わせて使用することが好ましい。さらに、別法として、アミノ基発色試薬によって定量されたアミノ基の残存量に基づいて、架橋率を算出する方法が挙げられる。アミノ基発色試薬としては、例えば、トリニトロベンゼンスルホン酸、フルオレスカミン等が挙げられる。
架橋膜によって包囲された空間（空隙部）には、通常、空の架橋ベシクルの単分散集合体の製造時に使用される水性媒体が内水相として含まれる。
［空の架橋ベシクルの単分散集合体の製造方法］
空の架橋ベシクルの単分散集合体の製造方法としては、例えば、空の非架橋ベシクルの単分散集合体を、第１及び／又は第２の重合体と反応し得る架橋剤と反応させる方法が挙げられる。
空の非架橋ベシクルの単分散集合体を構成する各ベシクルは、第１及び第２の重合体を含んでなり、第１及び第２の重合体のいずれも架橋されていない非架橋膜と、非架橋膜によって包囲された内水相とを含んでなり、内水相に目的物質が内包されていないベシクルである。
空の非架橋ベシクルの単分散集合体を構成する各ベシクルの構造は、上記［Ｂ２−１：空ベシクルの構造］に記載した通りである。
空の非架橋ベシクルの単分散集合体の平均粒子径は、通常３０ｎｍ以上、好ましくは５０ｎｍ以上、さらに好ましくは７０ｎｍ以上であり、通常１００００ｎｍ以下、好ましくは１０００ｎｍ以下、さらに好ましくは４００ｎｍ以下である。
空の非架橋ベシクルの単分散集合体の製造方法は、上記［Ｂ２−４：空ベシクルの製造方法］に記載した通りである。
架橋剤は、第１及び／又は第２の重合体と反応し得る限り特に限定されない。架橋剤は、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよく、使用される架橋剤の種類に応じて、第１の重合体間の架橋結合、第２の重合体間の架橋結合、及び第１の重合体と第２の重合体との間の架橋結合からなる群より選択される１種又は２種以上の架橋結合が形成される。なお、架橋結合中には、架橋反応に関与した架橋剤が残存してもよいし、残存しなくてもよい。例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）は、後述するように、架橋結合中に残存しない。
第１及び／又は第２の重合体と反応し得る架橋剤には、第１の重合体が有する官能基と反応し得る２以上の官能基を有し、第１の重合体間を架橋し得る架橋剤（以下「第１の架橋剤」という。）、第２の重合体が有する官能基と反応し得る２以上の官能基を有し、第２の重合体間を架橋し得る架橋剤（以下「第２の架橋剤」という。）、及び、第１の重合体が有する官能基と反応し得る１以上の官能基と、第２の重合体が有する官能基と反応し得る１以上の官能基とを有し、第１の重合体と第２の重合体との間を架橋し得る架橋剤（以下「第３の架橋剤」という。）が含まれるが、形成される物質内包架橋ベシクルの単分散性を向上させる点から、第３の架橋剤を単独で又はその他の架橋剤と組み合わせて使用することが好ましい。
第１〜第３の架橋剤は、第１及び／又は第２の重合体が有する官能基のうち、荷電性セグメントの荷電性基と反応し得ることが好ましい。すなわち、第１の架橋剤は、第１の荷電性セグメントが有する荷電性基間を架橋し得ることが好ましく、第２の架橋剤は、第２の荷電性セグメントが有する荷電性基間を架橋し得ることが好ましく、第３の架橋剤は、第１の荷電性セグメントが有する荷電性基と、第２の荷電性セグメントが有する荷電性基との間を架橋し得ることが好ましい。
第１〜第３の架橋剤と反応し得るカチオン基は、好ましくはアミノ基である。第１〜第３の架橋剤と反応し得るアニオン基は、例えば、カルボキシル基、リン酸基等、好ましくはカルボキシル基である。
第１〜第３の架橋剤と反応し得る官能基は、中性条件下では荷電を有しないが、所定の条件下では荷電を有する官能基であってもよく、このような官能基としては、例えば、フェノール誘導体、ピリジン誘導体、イミダゾール誘導体、チオール誘導体等が挙げられる。これらの官能基は、中性条件下で荷電を有するように分子設計することも可能である。
アミノ基を架橋する架橋剤としては、例えば、グルタルアルデヒド、スベリンイミド酸ジメチル二塩酸塩（ＤＭＳ）、３，３’−ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル（ＤＴＢＰ）、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）等のジスクシンイミド誘導体、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）等のジフルオロベンゼン誘導体、３−［トリス（ヒドロキシメチル）ホスホニオ］プロピオネート（ＴＨＰＰ）、ビスマレイミド誘導体等が挙げられる。
アミノ基及びカルボキシル基を縮合して架橋する（したがって架橋剤は架橋結合に残存しない）架橋剤としては、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ‘−ジシクロヘキサンカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）等のカルボジイミド系縮合剤、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリドｎ水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）等が挙げられる。
アミノ基及びリン酸を架橋する架橋剤としては、ＥＤＣとイミダゾール複合系架橋剤等が挙げられる。
リン酸基を架橋する架橋剤としては、例えば、カルシウムイオン等の金属イオン等が挙げられる。
好ましい架橋剤は、ＥＤＣである。ＥＤＣは、架橋結合中に残存しない。したがって、ベシクルを生体内に投与する場合（例えば、薬物送達用ベシクルとして生体内に投与する場合）、ベシクルが生体内で分解されても、架橋剤が遊離して細胞毒性を示すことがない。
架橋剤の使用量は、所望の架橋率が達成されるように、架橋剤の種類、架橋対象成分の量、目的物質の種類、空の架橋ベシクルへの目的物質の封入時に使用される混合方法の種類等に応じて適宜調節することができる。
重量平均分子量１００００〜４００００の目的物質を空の架橋ベシクルへ封入する際、架橋剤としてアミノ基とカルボキシル基とを架橋する架橋剤（ＥＤＣ等）を使用する場合を想定すると、架橋剤の使用量は、好ましくは次の範囲である。すなわち、封入時に撹拌による混合を使用する場合には、上記式（iii）で規定されるＣＬ比が、好ましくは０．３以上、さらに好ましくは０．５以上でなるように、そして、好ましくは１．２以下、さらに好ましくは１．０以下となるように、架橋剤の使用量を調節する。封入時に超音波による混合を使用する場合には、上記式（iii）で規定されるＣＬ比が、好ましくは０．８以上、さらに好ましくは１．０以上となるように、そして、好ましくは４．０以下、さらに好ましくは３．０以下となるように、架橋剤の使用量を調節する。
［混合液］
混合液は、目的物質を水性媒体とともに含有する。
目的物質は、ベシクルに内包すべき物質であり、ベシクルの用途等に応じて適宜選択することができる。
目的物質は、上記［Ｂ３：被内包物質］に記載した通りであり、水性媒体は、上記［Ｂ１−３：混合に関する他の条件］に記載した通りである。
混合液に含有される目的物質の濃度は、第１及び／又は第２の重合体が架橋されていない点で空の架橋ベシクルの単分散集合体と異なる空の非架橋ベシクルの単分散集合体を同混合液中で混合した場合に、内水相に目的物質が内包された物質内包非架橋ベシクルの単分散集合体の形成を阻害する濃度である。
空の非架橋ベシクルの単分散集合体を構成する各ベシクルは、第１及び第２の重合体を含んでなり、第１及び第２の重合体のいずれも架橋されていない非架橋膜と、非架橋膜によって包囲された内水相とを含んでなり、内水相に目的物質が内包されていないベシクルである。
物質内包非架橋ベシクルの単分散集合体を構成する各ベシクルは、第１及び第２の重合体を含んでなり、第１及び第２の重合体のいずれも架橋されていない非架橋膜と、非架橋膜によって包囲された内水相とを含んでなり、内水相に目的物質が内包されたベシクルである。
空の非架橋ベシクルの単分散集合体は、第１及び／又は第２の重合体が架橋されていない点で空の架橋ベシクルと異なる。物質内包ベシクルの単分散集合体の形成の可否が、架橋の有無のみに依存するように、空の非架橋ベシクルの単分散集合体は、架橋以外の点において、空の架橋ベシクルの単分散集合体と実質的に同一であることが好ましい。また、物質内包ベシクルの単分散集合体の形成の可否が、架橋の有無のみに依存するように、空の非架橋ベシクルの単分散集合体を混合液中で混合する際の条件（混合液の組成、混合方法等）は、空の架橋ベシクルの単分散集合体を混合液中で混合する際の条件と実質的に同一であることが好ましい。
空の非架橋ベシクルの単分散集合体を、目的物質の存在下、水性媒体中で混合する場合には、混合液に含有される目的物質の濃度が一定濃度を超えると、物質内包ベシクルの単分散集合体の形成が阻害される（すなわち、多分散集合体が形成される）場合がある。この一定濃度は、目的物質の種類に応じて異なる。例えば、目的物質の分子量が１００００〜４００００である場合には、通常５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１５ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは４０ｍｇ／ｍＬを上回る濃度である。
目的物質が難水溶性物質である場合、混合液に含有される難水溶性物質の濃度が増加するほど、第１の態様に係る方法の効果は顕著となる。すなわち、空の非架橋ベシクルの単分散集合体を混合液中で混合する場合には、混合液に含有される難水溶性物質の濃度が一定濃度を超えると、物質内包非架橋ベシクルの単分散集合体の形成が阻害される（すなわち、多分散集合体が形成される）場合がある。これに対して、空の架橋ベシクルの単分散集合体を混合液中で混合する場合には、この一定濃度を超えても、物質内包架橋ベシクルの単分散集合体の形成が阻害されない。したがって、混合液に含有される難水溶性物質の濃度は、空の非架橋ベシクルを同混合液中で混合した場合に、物質内包非架橋ベシクルの単分散集合体の形成が阻害される濃度であることが好ましい。そのような濃度は、通常、難水溶性物質の溶解度よりも高い（この場合、難水溶性物質は、混合液中に分散・懸濁する）。なお、「難水溶性」とは、水性媒体に対して難溶又は不溶であることを意味し、例えば、水性媒体が水である場合には、２５℃の水に対する溶解度が通常１．０ｍｇ／ｍＬ以下、好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは０．０２ｍｇ／ｍＬ以下であることを意味する。
混合液中で混合される空の架橋ベシクルの濃度は、ベシクルが凝集しない範囲内において適宜調節することができる。空の架橋ベシクルの濃度が低過ぎると、混合後に物質内包ベシクルが形成されない場合があるので、空の架橋ベシクルの濃度は、ベシクルが凝集しない範囲内において高濃度であるほど好ましい。空の架橋ベシクルの濃度は、通常０．１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以上であり、通常１００ｍｇ／ｍＬ以下、好ましくは７０ｍｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは５０ｍｇ／ｍＬ以下である。なお、得られる物質内包ベシクルの粒子径は、空の架橋ベシクルの濃度に依存すると考えられるため、空の架橋ベシクルの濃度は、製造すべき物質内包ベシクルの粒子径に応じて決定すべきである。
混合液のｐＨは、特に制限されず、空の架橋ベシクルの構造、目的物質の種類、混合液中の空の架橋ベシクル及び目的物質の濃度等に応じて適宜調整することができるが、好ましくはｐＨ５以上、より好ましくはｐＨ６．５以上であり、また、好ましくはｐＨ９以下、より好ましくはｐＨ７．５以下である。ｐＨの調整は、溶媒として緩衝液を使用しることにより、容易に行うことができる。混合液のｐＨを調整して使用しることは、空の架橋ベシクルの構造を保持し、効率的に目的物質を空の架橋ベシクルに内包させる上でも有利である。
混合液の塩濃度（イオン強度）は、空の架橋ベシクルの構造を破壊したり、空の架橋ベシクルへの目的物質の内包を阻害したりしない範囲で適宜調整することができる。但し、第１の態様に係る方法は、混合液の塩濃度（イオン強度）が増加するほど、その効果が顕著となる。すなわち、空の非架橋ベシクルの単分散集合体を混合液中で混合する場合には、混合液の塩濃度が一定値を超えると、物質内包非架橋ベシクルの単分散集合体の形成が阻害される（すなわち、多分散集合体が形成される）場合がある。これに対して、空の架橋ベシクルの単分散集合体を混合液中で混合する場合には、この一定値を超えても、物質内包架橋ベシクルの単分散集合体の形成が阻害されない。したがって、混合液の塩濃度は、空の非架橋ベシクルを同混合液中で混合した場合に、物質内包非架橋ベシクルの単分散集合体の形成が阻害される濃度であることが好ましい。混合液の塩濃度は、塩化ナトリウム濃度換算で、好ましくは２０ｍＭ以上、さらに好ましくは７５ｍＭ以上、さらに一層好ましくは１５０ｍＭ以上である。なお、混合液の塩濃度の上限は、通常１．０Ｍ、好ましくは０．５Ｍである。
混合液の粘度は、空の架橋ベシクルの構造を破壊したり、空の架橋ベシクルへの目的物質の内包を阻害したりしない範囲で適宜調整することができる。但し、第１の態様に係る方法は、混合液の粘度が増加するほど、その効果が顕著となる。すなわち、空の非架橋ベシクルの単分散集合体を混合液中で混合する場合には、混合液の粘度が一定値を超えると、物質内包非架橋ベシクルの単分散集合体の形成が阻害される（すなわち、多分散集合体が形成される）場合がある。これに対して、空の架橋ベシクルの単分散集合体を混合液中で混合する場合には、この一定値を超えても、物質内包架橋ベシクルの単分散集合体の形成が阻害されない。したがって、混合液の粘度は、空の非架橋ベシクルを同混合液中で混合した場合に、物質内包非架橋ベシクルの単分散集合体の形成が阻害される粘度であることが好ましい。混合液の粘度は、好ましくは０．０５Ｐａ・ｓ以上、さらに好ましくは０．１Ｐａ・ｓ以上、さらに一層好ましくは０．５Ｐａ・ｓ以上である。なお、混合液の粘度の上限は、通常１．０Ｐａ・ｓ、好ましくは０．７Ｐａ・ｓである。
混合液の温度は、空の架橋ベシクルの構造を破壊したり、目的物質の空の架橋ベシクルへの内包を阻害したりしない範囲であれば限定されないが、好ましくは４℃以上、より好ましくは２０℃以上、また、好ましくは８０℃以下、より好ましくは５０℃以下である。
［混合方法］
混合方法は、上記［Ｂ１−２：空ベシクル及び被内包物質の混合］に記載した通りである。
目的物質が難水溶性物質である場合、混合方法として超音波処理を使用することが好ましい。
［その他の工程］
第１の態様に係る方法は、空の架橋ベシクルの単分散集合体を、目的物質を水性媒体とともに含有する混合液中で混合し、内水相に目的物質が内包された物質内包架橋ベシクルの単分散集合体を形成させる工程以外に、その他の工程を含むことができる。例えば、後工程として、空の架橋ベシクルを混合液中で混合して得られる物質内包架橋ベシクルに対する架橋工程を含むことができる。架橋工程で使用される架橋剤は、第１及び／又は第２の重合体と反応し得る架橋剤であり、その詳細は上記と同様である。
［物質内包架橋ベシクルの単分散集合体］
第１の態様に係る方法によって、第１及び第２の重合体を含んでなり、第１及び／又は第２の重合体が架橋された架橋膜と、架橋膜によって包囲された内水相とを含んでなり、内水相に目的物質が内包された物質内包架橋ベシクルの単分散集合体が製造される。
物質内包架橋ベシクルの単分散集合体において、内水相に含有される目的物質の濃度は、第１及び／又は第２の重合体が架橋されていない点及び目的物質が内包されていない点で物質内包架橋ベシクルの単分散集合体と異なる空の非架橋ベシクルの単分散集合体を、物質内包架橋ベシクルの内水相と同一濃度の目的物質を水性媒体とともに含有する混合液中で混合した場合に、内水相に目的物質が内包された物質内包非架橋ベシクルの単分散集合体の形成を阻害する濃度である。
言い換えれば、第１の態様に係る方法によって製造される物質内包架橋ベシクルは、空の非架橋ベシクルの単分散集合体を、物質内包架橋ベシクルの内水相と同一濃度の目的物質を水性媒体とともに含有する混合液中で混合して得られる物質内包非架橋ベシクルよりも高い単分散性を有する。
物質内包架橋ベシクルの内水相は、第１の態様に係る方法で使用する混合液に応じて変化する。例えば、混合液の塩濃度が塩化ナトリウム濃度換算で２０ｍＭ以上である場合、内水相の塩濃度も同様となる。また、混合液の粘度が０．０５Ｐａ・ｓ以上である場合、内水相の粘度も同様となる。また、混合液が、重量平均分子量１００００〜４００００の目的物質を５ｍｇ／ｍＬを上回る濃度で含有する場合、内水相も同様となる。また、混合液が、難水溶性物質をその溶解度よりも高い濃度で含有する場合、内水相も同様となる。
物質内包架橋ベシクルの架橋率は、第１の態様に係る方法で使用する空の架橋ベシクルの架橋率、及び、後工程として実施される架橋工程の有無に応じて変化する。例えば、空の架橋ベシクルにおいて、第１及び／又は第２の重合体が、カチオン基間に形成された架橋結合、アニオン基間に形成された架橋結合、及びカチオン基とアニオン基との間に形成された架橋結合からなる群より選択された１種又は２種以上の架橋結合によって架橋されており、架橋結合が形成された割合が、架橋膜に含まれるカチオン基及び／又はアニオン基の総モル数の３５％以上である場合、空の架橋ベシクルを混合液中で混合して得られる物質内包架橋ベシクルの架橋率は、空の架橋ベシクルと同様となり、後工程として架橋工程が実施される場合には、空の架橋ベシクルよりも架橋率が増加する。
＜Ｃ−２：第２の態様／複数物質内包架橋ベシクル及びその製法＞
［概要］
第２の態様に係る方法は、第１の目的物質が内包された第１の物質内包架橋ベシクルを、第１の目的物質よりも分子量の小さい第２の目的物質を水性媒体とともに含有する混合液中で混合し、第１及び第２の目的物質が内包された第２の物質内包架橋ベシクルを形成させる工程を含んでなる、複数物質内包架橋ベシクルを製造する方法である。
第１の目的物質が内包された第１の物質内包架橋ベシクルを、第２の目的物質の存在下、水性媒体中で混合すると、第１の目的物質の封入が維持されつつ、第１の物質内包架橋ベシクルに第２の目的物質を封入される。したがって、第２の態様に係る方法によれば、第１及び第２の目的物質を、その封入量を制御して封入することができ、これにより、第１及び第２の目的物質の封入量が制御された物質内包ベシクルを製造することができる。
［第１の物質内包架橋ベシクル］
第１の物質内包架橋ベシクルは、第１及び第２の重合体を含んでなり、第１及び／又は第２の重合体が架橋された架橋膜と、架橋膜によって包囲された内水相とを含んでなり、内水相に第１の目的物質が内包されたベシクルである。
第１の物質内包架橋ベシクルの構成は、目的物質が第１の目的物質である点を除き、第１の態様に係る方法における物質内包架橋ベシクルの構成と同様である。
第１の物質内包架橋ベシクルは、その単分散集合体であることが好ましい。第１の物質内包架橋ベシクルとしてその単分散集合体を使用することにより、第２の物質封入架橋ベシクルをその単分散集合体として製造することができる。
第１の物質内包架橋ベシクルの単分散集合体の平均粒子径は、通常３０ｎｍ以上、好ましくは５０ｎｍ以上、さらに好ましくは７０ｎｍ以上であり、通常１００００ｎｍ以下、好ましくは１０００ｎｍ以下、さらに好ましくは４００ｎｍ以下である。
［第１の物質内包架橋ベシクルの製造方法］
第１の物質内包架橋ベシクルの製造方法としては、例えば、第１及び第２の重合体を含んでなり、第１及び／又は第２の重合体が架橋された架橋膜と、架橋膜によって包囲された内水相とを含んでなり、内水相に第１及び第２の目的物質のいずれも内包されていない空の架橋ベシクルを、第１の目的物質を水性媒体とともに含有する混合液中で混合し、必要に応じて、混合後、第１及び／又は第２の重合体と反応し得る架橋剤と反応させる方法（以下「方法１」という。）、第１及び第２の重合体を含んでなり、第１及び／又は第２の重合体のいずれも架橋されていない非架橋膜と、非架橋膜によって包囲された内水相とを含んでなり、内水相に第１の目的物質が内包された物質内包非架橋ベシクルを、第１及び／又は第２の重合体と反応し得る架橋剤と反応させる方法（以下「方法２」という。）等が挙げられる。
方法１は、目的物質として第１の目的物質を使用する点を除き、第１の態様に係る方法と同様に実施することができる。
方法２で使用される物質内包非架橋ベシクルは、例えば、同時混合法、後担持法等により製造することができる。同時混合法は、第１の重合体、第２の重合体及び目的物質を水性媒体中で混合する方法であり、後担持法は、空ベシクルを、第１の物質を水性媒体とともに含有する混合液中で混合する方法である。
方法２で使用される架橋剤は、第１の態様に係る方法で使用される架橋剤と同様である。
方法１及び方法２のいずれによっても、第１の物質内包架橋ベシクルを、その単分散集合体として製造することができる。
第１の物質内包架橋ベシクルの製造方法として、方法１を使用する場合、空の架橋ベシクルが、その単分散集合体であり、第１の物質内包架橋ベシクルが、その単分散集合体であることが好ましい。空の架橋ベシクルとしてその単分散集合体を使用する場合、混合液に含有される第１の目的物質の濃度が、第１及び／又は第２の重合体が架橋されていない点で空の架橋ベシクルの単分散集合体と異なる空の非架橋ベシクルの単分散集合体を同混合液中で混合した場合に、内水相に第１の目的物質が内包された物質内包非架橋ベシクルの単分散集合体の形成を阻害する濃度であると、第１の態様に係る方法と同様の効果が得られる。
［混合液］
混合液は、第１の目的物質よりも分子量が小さい第２の目的物質を水性媒体とともに含有する。
第２の目的物質は、第１の目的物質よりも分子量が小さい限り特に限定されず、ベシクルの用途等に応じて適宜選択することができる。第１及び第２の目的物質の具体例としては、第１の態様に係る方法で使用される目的物質と同様の具体例が挙げられる。
第２の目的物質の好ましい例としては、クラウディング剤が挙げられる。クラウディング剤は、分子クラウディング環境（分子が混み合った環境）をもたらす。クラウディング剤は、第１の目的物質と相互作用せず、分子クラウンディング環境をもたらすのに十分な溶解度を有する水溶性の分子であり、その具体例としては、ポリエチレングリコール、糖の重合体（デキストラン、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標））、アルブミンタンパク質等の親水性高分子、グリセロール、エチレングリコール、ジエチレングリコール等の親水性低分子等が挙げられる。
水性溶媒は、第１の態様に係る方法で使用される水性媒体と同様である。
混合液の組成、ｐＨ、塩濃度（イオン強度）、粘度等は、第１の態様に係る方法で使用される混合液と同様である。
空の架橋ベシクルとしてその単分散集合体を使用する場合、混合液に含有される第２の目的物質の濃度が、第１及び／又は第２の重合体が架橋されていない点で第１の物質内包架橋ベシクルの単分散集合体と異なる第１の物質内包非架橋ベシクルの単分散集合体を混合液中で混合した場合に、内水相に第１及び第２の目的物質が内包された第２の物質内包非架橋ベシクルの単分散集合体の形成を阻害する濃度であると、第１の態様に係る方法と同様の効果が得られる。
［混合方法］
混合方法は、第１の態様に係る方法と同様である。
［物質内包架橋ベシクル］
第２の態様に係る方法によって、第１及び第２の重合体を含んでなり、第１及び／又は第２の重合体が架橋された架橋膜と、架橋膜によって包囲された内水相とを含んでなり、内水相に第１及び第２の目的物質が内包された物質内包架橋ベシクルが製造される。
第１及び第２の目的物質が内包された物質内包架橋ベシクルの応用として、第２の目的物質を使用して分子クラウディング環境等を達成することにより、第１の目的物質を安定化することが挙げられる。すなわち、物質内包架橋ベシクルの一態様では、第１の目的物質が、第２の目的物質の不存在下で内水相に含有されている場合よりも安定化されている。このような第１の目的物質の安定化は、第２の目的物質の封入量を制御することにより実現することができる。その際、第２の目的物質としてクラウディング剤を使用することが好ましい。第２の目的物質としてクラウディング剤を使用することにより、例えば、第１の目的物質のｐＨ安定性を向上させることができる。
［Ｄ］吸着材内包ベシクル及びその製法
本発明の別の態様は、吸着材粒子を内包するベシクル（適宜「吸着材内包ベシクル」という。）及びその製法に関する。
本発明者等は鋭意検討の結果、反対の荷電を有する２種の重合体の自己組織化による静電相互作用型ベシクルに、物質吸着能を有する粒子（吸着材粒子）を内包させることにより、ベシクルの大きさに対して比較的大きな粒子を内包する新たな物質内包ベシクル（吸着材内包ベシクル）が得られることを見出した。更に、２種の重合体の一方を吸着材粒子と混合し、その後に他方の重合体と混合することにより、斯かる吸着材内包ベシクルを極めて効率的に得ることができることを見出した。本態様は斯かる知見に基づくものである。
本発明の吸着材内包ベシクルは、非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体、及び、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体を含む膜からなるベシクルと、当該ベシクルに内包された吸着材粒子とを含み、前記第１及び第２の重合体の少なくとも一方が前記吸着材粒子に吸着されてなる。
ここで、第１及び第２の重合体については、上記［Ｂ］欄で説明した通りである。
本明細書において吸着材粒子とは、物質を吸着する作用を有する粒子をいう。ここで吸着とは、二相（ここでは固体粒子とその周囲の液相）の界面において、物質の濃度が周囲よりも高くなる現象をいう。吸着材粒子が有する吸着作用の種類は制限されず、物理吸着（物理的相互作用による吸着）でも化学吸着（化学結合を伴う吸着）でもよく、これらの組み合わせであってもよい。物理吸着の場合、その基となる物理的相互作用としては、イオン間相互作用、双極子相互作用、ファンデルワールス（Van der Waals）等、更にはこれらの２種以上の組み合わせが挙げられるが、何れであってもよい。化学吸着の場合、その基となる化学結合としては、水素結合、共有結合、配位結合、イオン結合等、更にはこれらの２種以上の組み合わせが挙げられるが、何れであってもよい。
但し、吸着材粒子としては、表面に荷電を有し、水性媒体に対して分散性を示す粒子であることが好ましい。吸着材粒子がこれらの性質を有することにより、ベシクルの構成要素となる第１及び／又は第２の重合体が、静電相互作用によって吸着材粒子に吸着され易くなり、吸着材粒子表面付近でのベシクルの形成が促進されると考えられる。具体的には、粒子表面のゼータ電位の絶対値が、通常１０ｍＶ以上、中でも２０ｍＶ以上、更には３０ｍＶ以上であることが好ましい。なお、粒子表面のゼータ電位は、例えば光散乱電気泳動法等の電気泳動法を用いて測定することができる。
また、吸着能を向上させる観点からは、吸着材粒子は、比表面積が大きい粒子であることが好ましい。比表面積が大きい粒子としては、各種の多孔性粒子が挙げられる。また、多孔性粒子の場合、粒子の細孔容積が０．１ｃｍ３／ｇ以上、中でも０．５ｃｍ３／ｇ以上であることが好ましい。なお、粒子表面の比表面積や多孔性粒子の細孔容積等の細孔特性は、例えばＢＥＴ法等を用いて測定することができる。
吸着材粒子の種類は制限されないが、例としては、シリカ、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルミナ、ゼオライト、酸化鉄等の各種の金属酸化物；金、白金、パラジウム等の単体金属；ポリスチレン樹脂、スチレン−ジビニルベンゼン樹脂、イオン交換樹脂、ポリアクリル酸微粒子、ポリ乳酸微粒子、乳酸−グリコール酸共重合体微粒子等の合成又は天然樹脂等の材料からなる粒子が挙げられる。中でもシリカ、リン酸カルシウム、金、ポリアクリル酸微粒子等が好ましい。
また、吸着材粒子の性状も制限されず、固体粒子でもよいが、水性媒体中でコロイドやゲル等を形成していてもよい。更には、当初は吸着材や粒子状物質でなくとも、ベシクルに内包させた後に吸着材粒子となり得る物質であってもよい。斯かる態様の例については後述する。
吸着材粒子のサイズにも制限はないが、本願発明では、従来の静電相互作用型ベシクルでは内包困難であった大粒径（例えば３０ｎｍ超）の粒子も内包可能であることから、斯かる大粒径の吸着材粒子を用いることが好ましい。中でも、通常４０ｎｍ以上、中でも５０ｎｍ以上、更には６０ｎｍ以上の径を有する吸着材粒子が好ましい。平均粒径の上限にも制限はないが、通常は１０μｍ以下程度である。なお、吸着材粒子の平均粒径は、吸着材の種類にもよるが、通常は動的光散乱（dynamic light scattering：ＤＬＳ）、透過型電子顕微鏡（transmission electron microscope：ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（scanning electron microscope：ＳＥＭ）、レーザー回折法、コールターカウンター法等の手法によって測定することができる。
本発明の吸着材内包ベシクルによれば、ベシクルの大きさに対して比較的大きい吸着材粒子を内包することが可能である。例えば、後述の実施例１によれば、内包対象となる吸着材粒子（メソポーラスシリカナノ粒子：ＭＳＮ）の平均粒径は約８０ｎｍであるのに対し、得られる吸着材内包ベシクルの平均粒径は約１００ｎｍと、ベシクル粒径に対する吸着材粒子の粒径が極めて大きいにもかかわらず、高い内包率でこれを内包する吸着材内包ベシクルが得られている。その理由は明らかではないが、第１及び／又は第２の重合体が吸着材粒子に吸着された状態で自己組織化し、吸着材粒子の周囲に効率的にベシクルを形成するためではないかと考えられる。
本発明の吸着材内包ベシクルは、第１及び第２の重合体を、吸着材粒子と共に、通常は水性媒体中で、任意の順序で混合することにより製造することが可能である。
但し、吸着材粒子のベシクルへの内包率を向上させる観点からは、（ａ）水性媒体中で第１及び第２の重合体の何れか一方を先に吸着材粒子と混合し、吸着材粒子に吸着させる工程、及び、（ｂ）水性媒体を含む当該混合物に更に他方の重合体を加えて混合し、吸着材粒子の周囲に第１及び第２の重合体を含む膜からなるベシクルを形成させる工程を少なくとも含む方法（本発明の吸着材内包ベシクルの製造方法）によって製造することが好ましい。斯かる製造方法により、吸着材粒子の内包率を大幅に向上させ、所望の吸着材内包ベシクルを効率よく作製することが可能である。
ここで、工程（ａ）において吸着材粒子に先に吸着させる重合体（第１又は第２の重合体）は、何れであってもよい。しかし、吸着材内包ベシクルの製造効率等の観点からは、吸着材粒子の表面電荷と逆の電荷を有する重合体を、先に吸着材粒子に接触させることが好ましい。例えば、吸着材粒子の表面電荷が正である場合には、負の電荷を有する重合体（即ち、アニオン性セグメントを有する重合体）であることが好ましく、吸着材粒子の表面電荷が負である場合には、正の電荷を有する重合体（即ち、カチオン性セグメントを有する重合体）であることが好ましい。なお、吸着剤粒子の表面に正負の電荷が混在している場合には、吸着剤粒子全体の表面電荷を総合的に勘案して正負を判断すればよい。但し繰り返すが、いずれの重合体を先に吸着材粒子と接触させても、本発明の吸着材内包ベシクルを得ることは可能である。
水性媒体の種類や、第１及び第２の重合体並びに吸着材粒子の各濃度、混合の手法、その他の製法上の各種条件については、上記［Ｂ］欄で説明した条件をそのまま、或いは適宜変更を加えて用いることが可能である。
以上の製法によって、吸着材粒子の周囲に前記第１及び第２の重合体を含む膜からなるベシクルが形成され、吸着材内包ベシクルが得られる。ここで、吸着材粒子として荷電性粒子を用いる場合には、吸着材内包ベシクルと、ベシクルに内包されない吸着材粒子とを、例えば表面ゼータ電位等によって識別することが可能である。即ち、荷電性の吸着材粒子は表面ゼータ電位の絶対値が大きいのに対し、吸着材粒子がベシクルによって内包された吸着材内包ベシクルでは、第１及び第２の重合体の静電相互作用によって荷電が打ち消され、表面ゼータ電位の絶対値が小さくなる。よって、表面ゼータ電位の絶対値が低下したことを確認し、更にはＤＬＳ測定による粒子物性やＴＥＭ観察等の結果を勘案して、吸着材内包ベシクルの形成を確認することができる。
上記製法によって吸着材粒子の内包率が向上する理由は定かではないが、以下のように推測される。即ち、本製法では、吸着材粒子を自己組織化後のベシクルに内包させるのではなく、内包対象となる吸着材粒子に第１及び第２の重合体の一方を吸着させてから他方を加えることによって、吸着材粒子の表面近傍でベシクルの膜が形成される。言い換えれば、ベシクルの形成時に吸着材粒子をテンプレートとして用いることで、吸着材粒子近傍の微小環境中における荷電ポリマー（第１及び第２の重合体のうち一方）の濃度を選択的に高めることにより（吸着の一種と思われる）、反対の荷電を有するポリマー（第１及び第２の重合体のうち他方）を加えた際に、吸着材粒子の表面近傍で選択的に自己組織化が生じるものと考えられる。その結果、通常では溶液中の数密度に対応した確率でしか封入できない物質を、極めて高い内包効率で内包することができる。また、比較的サイズの大きい吸着材粒子を内包させる場合でも、同様の理由によって、各重合体が吸着材粒子の表面に吸着された状態で自己組織化し、吸着材粒子の周囲に効率的にベシクルを形成するため、内包が可能になるものと考えられる。
なお、本発明の吸着材内包ベシクルの製法では、上記以外の他の工程を加えて実施してもよい。例としては、吸着材内包ベシクルの形成後に、ベシクル中の第１及び／又は第２の重合体を架橋することが好ましい。架橋によって、ベシクルの安定性を高めることが可能となる。重合体を架橋することにより、例えば、吸着材内包ベシクルをＤＤＳ等に使用する場合に、生理的条件下でもベシクルを安定に維持することが可能となる。なお、第１及び／又は第２の重合体を架橋する手法については別途説明する。
また、吸着材内包ベシクルの形成前、形成時、又は形成後に、吸着剤を表面処理する工程を実施してもよい。表面処理を行うことにより、吸着剤表面に各種の官能基を付与したり、吸着剤表面の各種特性を改変したりすることが可能となる。表面処理の種類は特に制限されないが、例えば吸着材としてシリカ粒子を用いる場合、各種のシランカップリング剤による処理等が挙げられる。シランカップリング剤の種類も特に制限されないが、例として、表面にカチオン性基を付与する場合には、例えば３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン等のアミノ化シランカップリング剤による処理を行えばよい。また、例えば表面にアニオン性基を付与する場合には、例えば３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、３−メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン等のメルカプト化シランカップリング剤による処理の後、メルカプト基を酸化してスルホニル基に変換すればよい。その他、芳香環の疎水性やπ電子相互作用などが期待できるｐ−スチリルトリメトキシシラン、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、３−アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン等による表面処理が挙げられる。もちろん、表面処理はこれらの処理に限定されるものではなく、所望の特性や用途、使用する吸着材の種類、吸着材に吸着させる物質（後述）の種類等に応じて、任意の表面処理を適宜選択することができる。
また、本発明では、ベシクルに内包された吸着材粒子に、別の物質を吸着させることも可能である。特に、従来の静電相互作用型ベシクルでは安定した内包が困難であった、低分子量（例えば５０００Ｄａ以下等）の化合物についても、本発明によれば、吸着材粒子に吸着・担持させた状態で、安定にベシクルに内包させることが可能である。これにより、本発明の吸着材内包ベシクルは、各種薬剤等の低分子化合物を担持させて徐放させる等の用途に好適に用いることが可能である。特に、上述のように吸着材粒子として表面に荷電を有し、水性媒体に対して分散性を示す粒子を用いることにより、生理条件下で安定に存在し得るとともに、吸着材粒子に担持させた各種薬剤等の低分子化合物を生理条件下で徐放し得る、優れたＤＤＳを実現することが可能となる。また、担持させる薬剤等の低分子化合物の種類に応じて、上述のように吸着材に表面処理を施すことにより、その吸着・担持特性を向上させることも可能である。
低分子化合物の吸着材粒子への吸着・担持は、吸着材粒子をベシクルに内包させる前でも後でも可能であるが、吸着させる低分子化合物の物理化学的性質により吸着材粒子の物理化学的性質も影響を受けるため、吸着材粒子をベシクルに内包させた後の方が望ましいと考えられる。
なお、本態様の変形例として、吸着材を形成し得る物質（吸着材前駆体）を導入した物質内包ベシクルを調製し、その後に吸着材前駆体を吸着材に変換することにより、吸着材内包ベシクルを形成することも可能である。吸着材前駆体の例としては、ゲル等のマトリックスや沈殿・ミセル等を形成し得る荷電性ポリマー等が挙げられる。この場合、荷電性ポリマーを導入した物質内包ベシクルを調製し、その後に反対荷電の薬剤等を当該ベシクル内に導入する。これにより、静電相互作用が適度にキャンセルされて荷電性ポリマーが疎水化し、ベシクル内部でゲル等のマトリックスや沈殿、ミセル等の吸着材が生じるとともに、当該マトリックス、沈殿、ミセル等の吸着材に薬剤がトラップされた薬物担持吸着材内包ベシクルが形成される。斯かる薬物担持吸着材内包ベシクルも、当該薬剤を徐放し得る徐放剤として有用である。
［Ｅ］低水溶性物質内包ベシクル及びその製法
本発明の更に別の態様は、低水溶性物質を内包するベシクル（適宜「低水溶性物質内包ベシクル」という。）を製造することが可能な物質内包ベシクルの製造方法と、それにより製造される新規な低水溶性物質内包ベシクルに関する。
本発明者等は鋭意検討の結果、目的物質よりも水溶性の高い前駆体を目的物質に転換し得る酵素をベシクルに内包させた酵素内包ベシクルを用意した上で、前駆体を酵素内包ベシクル内に浸透させ、ベシクル内の酵素によって目的物質に転換し、目的物質を析出させてベシクルに内包させることにより、効率的な内包が可能となるのを見出した。本態様は斯かる知見に基づくものである。
本態様の物質内包ベシクルの製造方法は、非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体、及び、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体を含む膜からなるベシクルに、目的物質が内包されてなる物質内包ベシクルを製造する方法であって、以下の工程を含む。
（ａ）前記目的物質よりも水溶性の高い前駆体を前記目的物質に転換し得る酵素が、前記第１及び第２の重合体を含む膜からなるベシクルに内包されてなる酵素内包ベシクルを用意する工程。
（ｂ）前記前駆体よりも前記目的物質に対して低い溶解性を示す条件下で、前記酵素内包ベシクル内に前記前駆体を浸透させ、前記酵素によって前記前駆体を前記目的物質に転換することにより、前記目的物質を析出させて前記酵素内包ベシクルに内包させ、低水溶性物質内包ベシクルとする工程。
本態様においてベシクルに内包させる目的物質は、水溶性の高い前駆体から酵素によって転換され得るような物質である。目的物質よりも水溶性の高い前駆体が存在し、且つ、前駆体から目的物質への転換を可能とする酵素が存在する限りにおいて、任意の種類の物質を目的物質として利用することができる。
言い換えれば、本態様においてベシクルに内包させる目的物質は、酵素作用によって水に対する溶解度が低下するような物質である。この場合、酵素作用を受ける前の水に対する溶解度が相対的に高い状態の物質が前駆体となり、酵素作用を受けた後の水に対する溶解度が相対的に低い状態の物質が目的物質となる。よって、前駆体と目的物質との組み合わせとしては、化学式や化学組成が異なる物質の組み合わせのみならず、化学式や化学組成が同一であっても、立体構造等の変化によって水に対する溶解度が変化する物質も対象となり得る。
本態様では、前駆体の溶解度に対する目的物質の溶解度の比率が小さいことが好ましい。具体的には、限定されるものではないが、２５℃での水に対する溶解度を比較した場合に、前駆体の溶解度に対する目的物質の溶解度の比率が、通常９０％以下、中でも８０％以下、更には７０％以下であることが好ましい。
また、前駆体及び目的物質それぞれの水溶性や用途にもよるが、前駆体と目的物質との水溶性の差が大きいことも好ましい。具体的には、２５℃での水に対する溶解度を比較した場合に、目的物質と比べて前駆体の方が、例えば通常１０ｍｇ／ｍＬ以上、中でも２０ｍｇ／ｍＬ以上、更には３０ｍｇ／ｍＬ以上高い溶解度を有していることが好ましい場合もある。
また、目的物質は低水溶性であることが好ましい。具体的には、２５℃での水に対する溶解度が、通常１．０ｍｇ／ｍＬ以下、好ましくは０．３ｍｇ／ｍＬ以下、更に好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ以下であることが好ましい。
上記定義による目的物質及び前駆体、並びにその転換を媒介する酵素の組み合わせとしては、種々の組み合わせが知られており、本発明ではその何れを用いてもよい。一例として、製造されたベシクルをＤＤＳ等に使用することを考慮すると、例えば種々の酵素によって活性薬物に転換される各種の酵素プロドラッグ系等が挙げられる。
本態様では、まず、第１及び第２の重合体を含む膜からなるベシクルに酵素が内包された酵素内包ベシクルを用意する。斯かる酵素内包ベシクルは、上記［Ｂ］欄で説明した各種の物質内包ベシクルの製造方法（後担持法、同時混合法等）や、上記［Ｃ］欄で説明した物質内包ベシクルの製造方法等、任意の手法を用いて、ベシクル内に酵素を内包させることにより調製される。
次に、前駆体よりも目的物質に対して低い溶解性を示す条件下で、酵素内包ベシクル内に前駆体を浸透させる。酵素内包ベシクル内に前駆体を浸透させる方法は任意であるが、通常は、酵素内包ベシクルと前駆体とを溶媒中で混合することにより実施される。この場合、酵素内包ベシクル及び前駆体を各々溶媒中に含有する液を個別に調製した上でこれらを混合してもよく、酵素内包ベシクル及び前駆体の一方を溶媒中に含有する液に他方を直接加えてもよい。更には、液体等の連続相中で酵素内包ベシクルと前駆体とを接触させてもよい（例えば後述のインビボ（in vivo）での使用がこの態様に該当する。）。
ここで、前駆体よりも目的物質に対して低い溶解性を示す条件とは、好ましくは、前駆体は概ね溶媒中に溶解した状態で存在し得るが、目的物質はその一部又は全部が溶媒から析出してしまうような条件である。前駆体及び目的物質の各々の水溶性を考慮して適切な溶媒を選択することにより、達成することができる。例えば、目的物質が上記定義の低水溶性の物質であり、前駆体が上記定義の水溶性の物質である場合には、一般的な水性媒体によって斯かる条件を達成することができる。また、溶媒に各種の有機又は無機の電解質を溶解させて溶解度を調節したり、温度等の各種環境要因を調節したりすることによって、溶媒の溶解度を制御し、当該条件を達成してもよい。
上記条件下で酵素内包ベシクル内に前駆体を浸透させることにより、酵素によって前駆体が目的物質に転換される。ここで、酵素による前駆体から目的物質への転換反応が適切に進行するよう、目的物質／前駆体／酵素の組み合わせに応じた適切な条件を選択することが好ましい。こうして酵素によって前駆体が目的物質に転換されることにより、目的物質が溶媒から析出して酵素内包ベシクルに内包され、物質内包ベシクルが形成される。
その他の製法上の各種条件については、上記［Ｂ］欄で説明した条件をそのまま、或いは適宜変更を加えて用いることが可能である。
なお、本態様の物質内包ベシクルの製法では、上記以外の他の工程を加えて実施してもよい。例としては、酵素内包ベシクル内に前駆体を浸透させる前及び／又は後に、第１及び／又は第２の重合体を架橋する工程を加えることが挙げられる。特に、酵素内包ベシクルからの酵素の脱落を防ぎ、ベシクルを安定化させる観点からは、酵素内包ベシクル内に水溶性前駆体を浸透させる前に、酵素内包ベシクル内の第１及び／又は第２の重合体を架橋することが好ましい。重合体を架橋することにより、例えば、本態様をＤＤＳ等に使用する場合に、生理的条件下でもベシクルを安定に維持することが可能となる。なお、第１及び／又は第２の重合体を架橋する手法については、上記［Ｃ］欄で説明した条件をそのまま、或いは適宜変更を加えて用いることが可能である。
本態様の物質内包ベシクルの製法によれば、予め酵素をベシクル内に封入した酵素内包ベシクルを用いることで、目的物質の生成の場をベシクルの内部のみに限定することができ、これによって効率的に目的物質をベシクルに内包させることが可能となると考えられる。その結果、通常では溶液中の数密度に対応した確率でしか封入できない物質を、極めて高い内包効率で内包することができる。更には、酵素内包ベシクルに添加する前駆体の量を変化させることで、目的物質のベシクルへの内包量もコントロールすることができる。加えて、ベシクルは半透膜の性質を有しているため、ベシクルに内包させた目的物質をベシクルから徐放させることが可能であると考えられる。
また、本態様の物質内包ベシクルの製法によれば、従来はベシクルへの内包がきわめて困難又は不可能であった低水溶性の物質についても、これを内包するベシクルを形成することが可能となる。即ち、本態様によれば、前記の第１及び第２の重合体を含む膜からなるベシクルに、低水溶性物質が（酵素と共に）内包された、低水溶性物質内包ベシクルが得られる。斯かる低水溶性物質内包ベシクルも、本発明の要旨となる。斯かるベシクルでは、低水溶性物質が、内水相に対する低水溶性物質の溶解度を超える濃度で内包されていることが好ましい。また、斯かるベシクルでは、前記第１及び／又は前記第２の重合体が架橋されてなることが好ましい。
また、本態様の製法による物質内包ベシクルの形成を、インビトロ（in vitro）で人為的に達成してもよいが、目的物質／前駆体／酵素の組み合わせ等を適切に選択することにより、インビボ（in vivo）で達成されるように設計することも可能である。この態様については後述する。
［Ｆ］その他
以上、本発明を各種の態様に即して説明したが、本発明は以上の態様に限定されるものではなく、任意の種々の変形を加えて実施することが可能である。例えば、上記＜Ｃ−１＞で説明した物質内包架橋ベシクルの単分散集合体、上記＜Ｃ−２＞で説明した複数物質内包架橋ベシクル、上記［Ｄ］で説明した吸着材内包架橋ベシクル、上記［Ｅ］で説明した低水溶性物質内包ベシクルは、薬剤を担持させることによって、医薬組成物や薬物送達系として用いることが可能である。斯かる本発明の各種の物質内包ベシクルを含む医薬組成物や薬物送達系も、本発明の対象となる。斯かる医薬組成物や薬物送達系を適用する対象（生物であれば任意であるが、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物、更に好ましくはヒト）、疾患、薬物等は、適宜選択することができる。また、斯かる医薬組成物や薬物送達系の投与経路、用法、用量等の各種条件は、対象、疾患、薬物等に応じて適宜選択することが可能である。
また、上記［Ｅ］で説明した製法による物質内包ベシクルの形成を、インビトロ（in vitro）で人為的に達成してもよいが、目的物質／前駆体／酵素の組み合わせ等を適切に選択することにより、インビボ（in vivo）で達成されるように設計することも可能である。即ち、血液や体液等の生理溶液に対して溶解性（水溶性）を示す前駆体を体内に導入するとともに、酵素内包ベシクルを別途体内に導入して、体内の所望の部位で酵素内包ベシクルを前駆体と接触させ、酵素内包ベシクルに前駆体を浸透させる。こうして前駆体を、生理溶液に対して低溶解性（低水溶性）を示す目的物質に転換することにより、体内で当該目的物質を含有する物質内包ベシクルを形成することができる。ここで、目的物質及び前駆体の組み合わせとして、上述したような薬物とその酵素プロドラッグの組み合わせを採用すれば、体内の所望の器官や組織等の部位でプロドラッグが薬物に転換されてベシクルに内包され、形成された薬物内包ベシクルから薬物が徐放される、優れたＤＤＳを達成することが可能となる。
更には、薬物の前駆体（プロドラッグ）を薬剤に変換する作用を有する酵素を、上記［Ｃ］の物質内包架橋ベシクルの被内包物質として内包させた物質内包ベシクル（酵素内包架橋ベシクル）や、当該酵素を上記［Ｄ］の吸着材内包ベシクルの吸着材に吸着・担持させた物質内包ベシクル（酵素担持吸着材内包ベシクル）を調製し、これを用いてもよい。この場合、プロドラッグを体内に導入するとともに、これらの酵素内包架橋ベシクルや酵素担持吸着材内包ベシクルを別途体内に導入して、体内の所望の部位で酵素内包架橋ベシクルや酵素担持吸着材内包ベシクルをプロドラッグと接触させ、ベシクルにプロドラッグを浸透させる。こうしてプロドラッグに酵素を作用させ、薬物に転換することにより、体内でプロドラッグから薬物を生成することができる。
なお、斯かる態様は、本発明の各種の物質内包ベシクルのみならず、任意の物質内包ベシクルを用いて達成することが可能である。即ち、酵素を内包・担持させた任意の物質内包ベシクル（酵素担持ベシクル）を調製して用いる。この場合、プロドラッグを体内に導入するとともに、前記酵素担持ベシクルを別途体内に導入して、体内の所望の部位で酵素担持ベシクルをプロドラッグと接触させ、ベシクルにプロドラッグを浸透させる。こうしてプロドラッグに酵素を作用させ、薬物に転換することにより、体内でプロドラッグから薬物を生成することができる。
これらの態様では、薬物とそのプロドラッグとの溶解度の関係は制限されず、任意の薬物／プロドラッグ／酵素の組み合わせを用いることが可能である。
斯かる薬物／プロドラッグ／酵素の具体例としては、以下の表に示す組み合わせが挙げられるが、これらはあくまでも例示であり、本発明の対象となる薬物／プロドラッグ／酵素の組み合わせは、これらの組み合わせに限定されるものではない。
即ち、本発明によれば更に、対象に薬物を送達するための方法であって、以下の工程を含む方法が提供される。
（ａ）非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体、及び、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体を含む膜からなるベシクルに、前記薬物の前駆体（プロドラッグ）を前記薬物に転換し得る酵素が内包されてなる酵素内包ベシクルを用意する工程。
（ｂ）対象の所定の部位で、前記酵素内包ベシクル内に前記前駆体を浸透させ、前記酵素によって前記前駆体を前記薬物に転換することにより、前記薬物を形成する工程。
上記方法の工程（ｂ）は、対象の所定の部位において、酵素内包ベシクルと前駆体とを共存させることにより達成される。対象の所定の部位は任意であり、薬物を送達する対象、薬物の種類、治療対象となる疾患等に応じて決定すればよいが、通常は対象の所定の器官、組織又は細胞である。対象の所定の部位に酵素内包ベシクルを存在させる手法は任意であるが、通常は従来公知の各種の投与法で酵素内包ベシクルを対象に投与し、対象の所定の部位に到達させればよい。投与法は経口でも非経口でもよく、非経口投与の場合には、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、経鼻、経肺等の何れの経路で投与してもよい。
上記方法の工程（ｂ）では、酵素内包ベシクルに内包される酵素によって前駆体を薬物に転換すればよい。これにより転換された薬物がベシクルから放出され、対象の所定の部位に送達されることになる。しかし、薬物を長期に安定に送達する観点からは、薬物を析出させて酵素内包ベシクルに内包させ、薬物内包ベシクルを形成することも好ましい。
その他の用量や用法等の各種条件は、薬物を送達する対象、薬物の種類、治療対象となる疾患等に応じて、適宜決定することができる。
また、以上の方法に用いられる（酵素内包ベシクル等を含む）薬物送達系や医薬組成物も本発明の対象となる。
次に、実施例を参照しながら、本発明をより具体的に説明する。なお、以下の実施例は、あくまでも例示を目的とするものであり、本発明を何ら限定するものではない。
なお、以下の記載において「溶液」又は「分散液」とは、特に別途記載しない限り、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を溶媒又は分散媒とする溶液又は「分散液」を指すものとする。
また、以下の記載において「ボルテックスミキサー」としては、別途記載しない限り、Eppendorf社製MixMateを使用した。
また、以下の記載において「平均粒径」、「多分散指数（polydispersity index：ＰＤＩ）」及び「ゼータ電位」は、別途記載しない限り、Malvern社製Zetasizer Nano-ZSにより測定した。
また、以下の記載において「透過型電子顕微鏡画像」は、別途記載しない限り、日本電子製JEM−1400を用いて取得した。
［実施例群Ｉ］物質内包ベシクル及びその製法
［実施例Ｉ−１］空の架橋ベシクルへのＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ封入
（１）空ベシクルの調製
第１の重合体として、非荷電親水性セグメントであるポリエチレングリコール（重量平均分子量約２０００）（以降「ＰＥＧ」と表示する場合がある）と、アニオン性セグメントであるポリアスパラギン酸（重合度約７５）とからなるアニオン性ブロックコポリマーＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）を使用した。一部のポリアスパラギン酸のＮ末端をＣｙ３により蛍光標識した。
第２の重合体として、ポリ（ジアミノペンタン構造含有アスパラギン誘導体）（重合度約８２）（以降「Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）」と表示する場合がある）からなるカチオン性ホモポリマーＨｏｍｏ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）を使用した。
第１及び第２の重合体を各々、ポリマー濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるように１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（水性媒体）に溶解させた。得られた第１の重合体の溶液及び第２の重合体の溶液を、電荷比が等しくなる（すなわちＣ／Ａ比＝１．０となる）ようにエッペンドルフチューブに入れて混合し、ボルテックスミキサーを使用して２０００ｒｐｍで２分間攪拌し、第１及び第２の重合体の自己組織化により形成されたベシクル（空ベシクル）を含有する溶液を得た。
得られた空ベシクル含有溶液について、動的光散乱法（dynamic light scattering）による測定を行い、粒度分布、平均粒径及び多分散指数（ＰＤＩ）を求めた。その結果、平均粒径が１０１．４ｎｍであり、ＰＤＩが０．０７０である単分散性ベシクル粒子の形成が認められた。
（２）空ベシクルの架橋
上記で得られた空ベシクル含有溶液０．５ｍＬを、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）に含まれるカルボキシル基に対して０．５等量のＥＤＣ（同仁化学研究所製）を含む溶液（ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（０ｍＭ ＮａＣｌ）中）に加え、室温で１２時間静置し、空ベシクルを架橋して空の架橋ベシクル含有溶液を得た。
（３）空の架橋ベシクルへのＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ封入
被内包物質として、フルオレセインイソチオシアナート−デキストラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製，以下「ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ」と表記する場合がある）（重量平均分子量４０，０００）を使用した。
上記で得られた空の架橋ベシクル含有溶液０．５ｍＬに、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ溶液（混合後のＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ濃度５〜５０ｍｇ／ｍＬ、荷電ポリマー（第１及び第２の重合体）濃度１．０ｍｇ／ｍＬとなる量）を加え、ボルテックスミキサーを使用して２０００ｒｐｍで２分間攪拌し、空の架橋ベシクルにＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋを封入し、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ内包架橋ベシクル含有溶液を得た。得られた溶液は、透明であった。
十分な外力印加条件（２０００ｒｐｍで２分間の撹拌）で混合して得られた溶液１．０ｍＬに、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）に含まれるカルボキシル基に対して１０等量のＥＤＣを含む溶液（ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（０ｍＭ ＮａＣｌ）中）を加え、室温で１２時間静置し、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ内包架橋ベシクルを十分に架橋した。
ベシクルに内包されずに溶液中に遊離状態で残存するＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋを遠心限外濾過（VIVASPIN20, Sartorius Stedium Biotech社製，分画分子量３０万を使用）（遠心限外濾過条件：３００ｒｐｍ，４℃）により除去して精製を行った後、動的光散乱（dynamic light scattering）法による測定を行い、粒度分布、平均粒径、多分散指数（ＰＤＩ）を求めた。その結果、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ内包架橋ベシクルの粒度分布、平均粒径及び多分散指数（ＰＤＩ）は、空ベシクルのそれとほとんど変わっておらず、空ベシクルに、その単分散性が維持されつつ、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋが封入されたことが確認された。例えば、５０ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ溶液と撹拌混合して得られたＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ内包架橋ベシクルの平均粒径は９７．２ｎｍ，ＰＤＩは０．０８７であり（空ベシクルの平均粒径は１０１．４ｎｍ，ＰＤＩは０．０７０）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像は図５Ａに示す通りであった。
続いて、室温下にてカールツァイス社製の共焦点蛍光顕微鏡（ＬＳＭ５１０）により蛍光相関分光（ＦＣＳ）測定を行った。蛍光デキストランの励起はアルゴンレーザー（４８８ｎｍ）、対物レンズは４０倍の水浸レンズを使用し、解析はＣｏｎｆｏｃｏｒ３ソフトウェアにより自己相関関数Ｇ（τ）を求めた。Ｇ（τ）の値から、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ内包ベシクル１個あたりのＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋの個数を見積もった。なお、自己相関関数Ｇ（τ）は時間τ後の蛍光強度のゆらぎを評価する関数であり、経時的に減衰して十分な時間の経過後に集束する。集束までの経過時間が長い（減衰が遅い）ほど、ゆらぎが緩やかであること、すなわち、測定対照の蛍光物体の動きが鈍いことを示す。また、観察視野内に含まれる分子数が増えるほどゆらぎが小さくなることから、相関関数の値から分子数を見積もることができる。
ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ内包ベシクル１個あたりのＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋの個数を表２に示す。
表２に示す通り、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ内包ベシクル１個あたりのＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋの個数は、空の架橋ベシクルと混合するＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ溶液の濃度の上昇ととともに増加した。
以上の結果から、空ベシクルの単分散集合体を架橋した後、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ溶液中、十分な外力印加条件で混合することにより、空ベシクルに、その単分散性が維持されつつ、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋが封入され、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ内包ベシクルの単分散集合体が製造されることが判明した。
また、実施例Ｉ−１と比較例Ｉ−１，Ｉ−２（後述）との比較から、水性媒体中に存在するＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋの濃度が５ｍｇ／ｍＬを超えても、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ内包ベシクルの単分散集合体を形成されるのは、実施例Ｉ−１だけであることが判明した。
［比較例Ｉ−１］同時混合法によるＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ封入
実施例Ｉ−１と同様に、第１及び第２の重合体を各々、ポリマー濃度が２．０ｍｇ／ｍＬとなるように１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（水性媒体）に溶解させた。この際、第１の重合体の溶液には、第２の重合体の溶液と混合後のＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ最終濃度が５〜５０ｍｇ／ｍＬ、荷電ポリマー（第１及び第２の重合体）最終濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるように、所定のＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋを加えた。
得られた第１の重合体／ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ混合溶液と第２の重合体の溶液とを、第１の重合体と第２の重合体の電荷比が等しくなる（すなわちＣ／Ａ比＝１．０となる）ようにエッペンドルフチューブに入れて混合し、ボルテックスミキサーを使用して２０００ｒｐｍで２分間攪拌することにより、第１及び第２の重合体の自己組織化集合体を含有する溶液を得た。
得られた溶液０．５ｍＬに、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）に含まれるカルボキシル基に対して１０等量のＥＤＣを含む溶液（ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（０ｍＭ ＮａＣｌ）中）を加え、室温で１２時間静置した。溶液中に遊離状態で残存するＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋを実施例Ｉ−１と同様に遠心限外濾過により除去し、ＤＬＳ法とＴＥＭにより、得られた自己組織化集合体を評価した。
図５Ｂに示す通り、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ最終濃度が５０ｍｇ／ｍＬの場合に得られた自己組織化集合体はユニラメラベシクルであったが、粒径は著しく増大する傾向が見られた。ＤＬＳの結果からも、サイズの増大、単峰性の消失、及びＰＤＩの著しい増大が認められた（平均粒径：約６３０ｎｍ，ＰＤＩ：約０．６２）。これは、ベシクル形成プロセス（特に撹拌混合状況）が溶液粘度の影響を受けたため、広い粒度分布を与えたものと考えられる。一方、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ最終濃度が５ｍｇ／ｍＬの場合に得られた自己組織化集合体では、粒径１００ｎｍ程度の単分散ベシクル粒子が形成されており、ＦＣＳによりＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ封入量を見積もることができた（表２）。
［比較例Ｉ−２］後担持法によるＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ封入
実施例Ｉ−１と同様に、第１及び第２の重合体を各々、ポリマー濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるように１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（水性媒体）に溶解させた。得られた第１の重合体の溶液と第２の重合体の溶液とを、第１の重合体と第２の重合体の電荷比が等しくなる（すなわちＣ／Ａ比＝１．０となる）ようにエッペンドルフチューブに入れて混合し、ボルテックスミキサーを使用して２０００ｒｐｍで２分間攪拌することにより、第１及び第２の重合体の自己組織化集合体を含有する溶液を得た。ＤＬＳの結果から、平均粒径は１０１．８ｎｍ、ＰＤＩ０．０８１であった。
得られた溶液０．５ｍＬに、混合後のＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ最終濃度が５〜５０ｍｇ／ｍＬ、荷電ポリマー（第１及び第２の重合体）濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるように所定のＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ溶液を加え、再びボルテックスミキサーを使用して２０００ｒｐｍで２分間攪拌した。続いて、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）に含まれるカルボキシル基に対して１０等量のＥＤＣを含む溶液（ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（０ｍＭ ＮａＣｌ）中）を加え、室温で１２時間静置した。溶液中に遊離状態で残存するデキストランを実施例Ｉ−１と同様に遠心限外濾過により除去し、ＤＬＳ法とＴＥＭにより、得られた自己組織化集合体を評価した。
図５Ｃに示す通り、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ最終濃度が５０ｍｇ／ｍＬの場合に得られた自己組織化集合体はユニラメラベシクルであったが、粒径は著しく増大する傾向が見られた。ＤＬＳの結果からも、サイズの増大、単峰性の消失、及びＰＤＩの著しい増大が認められた（平均粒径：約５６０ｎｍ、ＰＤＩ：約０．５７）。一方、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ最終濃度が５ｍｇ／ｍＬの場合に得られた自己組織化集合体では、粒径１００ｎｍ程度の単分散ベシクル粒子が形成されており、ＦＣＳにより封入量を見積もることができた（表２）。
［参考例Ｉ−１］ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ内包ベシクルからのＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ放出
実施例Ｉ−１と同様に、第１及び第２の重合体を各々、ポリマー濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるように１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（水性媒体）に溶解させた。得られた第１の重合体の溶液と第２の重合体の溶液とを、第１の重合体と第２の重合体の電荷比が等しくなる（すなわちＣ／Ａ比＝１．０となる）ようにエッペンドルフチューブに入れて混合し、ボルテックスミキサーを使用して２０００ｒｐｍで２分間攪拌することにより、第１及び第２の重合体の自己組織化集合体を含有する溶液を得た。
得られた溶液０．５ｍＬに、混合後のＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ最終濃度が４ｍｇ／ｍＬ、荷電ポリマー（第１及び第２の重合体）濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるように所定のＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋを加え、再びボルテックスミキサーで２０００ｒｐｍ、２分間攪拌した。続いて、１０等量のＥＤＣを含む溶液（ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（０ｍＭ ＮａＣｌ）中）を加え、１２時間室温で静置した。ベシクルに内包されず溶液中に遊離状態で残存するデキストランを実施例Ｉ−１と同様に遠心限外濾過により除去した。精製したＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋ内包ベシクルは、３７℃，１５０ｍＭ ＮａＣｌ条件で静置した。
ベシクル内部に封入されたＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋの放出挙動を、ＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー，日本分光製）を使用して確認した。図６に示す通り、精製直後と３日後ではクロマトグラムに有意な差は見られず、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋの放出は確認されなかった。この結果から、混合などで外力を与えない場合には、ベシクルに対するＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４０ｋの出入りが起こらないものと推測される。
［参考例Ｉ−２］ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ濃度と粘度との関係
比較例Ｉ−１において、ベシクル形成プロセス（特に撹拌混合状況）が溶液粘度の影響を受けることが示唆されたので、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ（重量平均分子量４０００，１００００，４００００）の濃度と粘度との関係を調べた。
粘度の測定には、回転式レオメータ（Anton Paar社製Physica MCR302）を使用した。
粘度（Ｐａ・ｓ）の測定結果を表３に示す。
［実施例Ｉ−２］シトクロムｃ内包架橋ベシクルへのＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋの封入
（１）シトクロムｃ内包架橋ベシクルの調製
比較例Ｉ−２と同様にして、空ベシクルへのシトクロムｃ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製，分子量１２，３２７Ｄａ）の封入を行った。その具体的な方法は、以下の通りである。
第１及び第２の重合体を各々、ポリマー濃度が２．０ｍｇ／ｍＬとなるように１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（水性媒体）に溶解させた。得られた第１の重合体の溶液と第２の重合体の溶液とを、第１の重合体と第２の重合体の電荷比が等しくなる（すなわちＣ／Ａ比＝１．０となる）ようにエッペンドルフチューブに入れて混合し、ボルテックスミキサーを使用して２０００ｒｐｍで２分間攪拌することにより、第１及び第２の重合体の自己組織化により形成されたベシクル（空ベシクル）を含有する溶液を得た。ＤＬＳの結果から、平均粒径は１０２ｎｍ、ＰＤＩは０．０４５であった。
得られた空ベシクル含有溶液０．９６ｍＬに、１ｍｇ／ｍＬシトクロムｃ溶液０．５ｍＬを加え、再びボルテックスミキサーを使用して２０００ｒｐｍで２分間攪拌し、シトクロムｃ内包ベシクル含有溶液を得た。
得られたシトクロムｃ内包ベシクル含有溶液０．５ｍＬに、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）に含まれるカルボキシル基に対して０．５等量のＥＤＣを含む溶液（ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（０ｍＭＮａＣｌ）中）を加え、室温で１２時間静置し、シトクロムｃ内包ベシクルを架橋し、シトクロムｃ内包架橋ベシクル含有溶液を得た。
ベシクルに内包されず溶液中に遊離状態で残存するシトクロムｃを実施例Ｉ−１と同様に遠心限外濾過（分画分子量３０万）により除去し、ベシクルを精製した。この時、平均粒径は９９．５ｎｍ，ＰＤＩは０．０３２であった。ＧＰＣ測定から、ベシクル内にシトクロムｃ（吸収極大波長４０９ｎｍ）が封入されていることを確認した（図７）。なお、図７中、（ａ）は空ベシクルのＧＰＣ測定結果を示し、（ｂ）は、精製後のシトクロムｃ内包架橋ベシクルのＧＰＣ測定結果を示す。
（２）シトクロムｃ内包架橋ベシクルへのＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋの封入
得られたシトクロムｃ内包架橋ベシクル含有溶液０．５ｍＬに、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋ溶液（重量平均分子量：４０００，濃度：５０ｍｇ／ｍＬ，容量：０．５ｍＬ）を加え、ボルテックスミキサーを使用して２０００ｒｐｍで２分間攪拌し、シトクロムｃ内包架橋ベシクルにＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋを封入し、シトクロムｃ及びＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋ内包架橋ベシクル含有溶液を調製した。
シトクロムｃ及びＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋ内包架橋ベシクル含有溶液に、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）に含まれるカルボキシル基に対して１０等量のＥＤＣを含む溶液（ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（０ｍＭ ＮａＣｌ）中）を加え、１２時間室温で静置し、シトクロムｃ及びＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋ内包架橋ベシクルを十分に架橋した。
ベシクルに内包されず溶液中に遊離状態で残存するＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋを実施例Ｉ−１と同様に遠心限外濾過により除去した。ＤＬＳ測定の結果から、平均粒径は１０１ｎｍ，ＰＤＩは０．０７８であった。得られたベシクルの吸収スペクトルから、ベシクルにシトクロムｃ及びＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋが封入された、すなわち、シトクロムｃ内包架橋ベシクルにＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋが封入される際、シトクロムｃが放出されることなくＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋが封入されたことを確認した（図８）。なお、図８中、（ａ）は、シトクロムｃ内包架橋ベシクルの吸収スペクトルを示し、（ｂ）は、シトクロムｃ及びＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋ内包架橋ベシクルの吸収スペクトルを示す。
ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋ溶液の濃度を１〜１００ｍｇ／ｍＬに変化させて、上記と同様に、シトクロムｃ及びＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋ内包架橋ベシクルを調製し、実施例Ｉ−１と同様にＦＣＳ測定を行って、ベシクル１個あたりのＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋの個数を見積もった。その結果を表４に示す。表４に示す通り、ベシクル１個あたりのＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋの個数は、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋ溶液の濃度の上昇ととともに増加した。
次に、参考文献［K. Sasahara, et al. J. Mol. Biol. (2003) 326, 1227-1237］に基づいて、シトクロムｃの酸性環境における立体構造の安定性を円偏光二色性スペクトルにより評価した。参考文献によれば、シトクロムｃの立体構造はｐＨ２．０により失われ、特徴的なα−ヘリックス構造が失われる。一方、高濃度デキストラン存在下では、その構造の消失を防ぐことができる。円偏光二色性スペクトル（図９）から、Ｄｅｘをベシクル内に共存させない場合は、ｐＨを２．０まで下げた際に２２２ｎｍ付近の吸収が失われたのに対し、Ｄｅｘをベシクル内に共存させた場合には、顕著な変化が認められなかった。この結果は、Ｄｅｘを高濃度で共存させる分子クラウディング環境をベシクル内に創出したことにより得られたものと考えられる。なお、図９中、「（Ａ）ＣｙｔＣ＠ＰＩＣｓｏｍｅ（ｐＨ７．４）」は、ｐＨ７．４におけるシトクロムｃ内包架橋ベシクルの円偏光二色性スペクトルを示し、「（Ｂ）ＣｙｔＣ＠ＰＩＣｓｏｍｅ（ｐＨ２．０）」は、ｐＨ２．０におけるシトクロムｃ内包架橋ベシクルの円偏光二色性スペクトルを示し、「（Ｃ）（ＣｙｔＣ＋ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ）＠ＰＩＣｓｏｍｅ（ｐＨ７．４）」は、ｐＨ７．４におけるシトクロムｃ及びＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋ内包架橋ベシクルの円偏光二色性スペクトルを示し、「（Ｄ）（ＣｙｔＣ＋ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ）＠ＰＩＣｓｏｍｅ（ｐＨ７．４）」は、ｐＨ７．４におけるシトクロムｃ及びＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋ内包架橋ベシクルの円偏光二色性スペクトルを示す。
［実施例Ｉ−３］空の架橋ベシクルへのＡｌＰｃＳ２ａ封入
実施例Ｉ−１と同様に調製した空ベシクルに、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）に含まれるカルボキシル基に対して１．０等量のＥＤＣを加えて空の架橋ベシクルを作製した。この時、平均粒径は１０１ｎｍ、ＰＤＩは０．０８４であった。スルホン化フタロシアニン（ＡｌＰｃＳ２ａ）（Frontier Scientific社製）の分散液を種々の濃度（０、１、２、１０、２０、５０ｍｇ／ｍＬ）で調製し、空の架橋ベシクルに、ベシクル濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように混合し、２分間の超音波照射を行った。なお、ベシクル濃度は、蛍光標識Ｃｙ３により定量した。
ＡｌＰｃＳ２ａは、光線力学療法で利用される薬剤（光増感剤）であり、次の構造を有する。
超音波処理後、溶液中に遊離状態で残存するＡｌＰｃＳ２ａを除去するために、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）及び遠心限外濾過（VIVASPIN20, Sartorius Stedium Biotech社製、分画分子量３０万を使用）による精製を行った。精製後のベシクルは、ＤＬＳ測定から、ＡｌＰｃＳ２ａ濃度によらず、その平均粒径は１１０ｎｍ程度、ＰＤＩは０．０５〜０．０８程度と粒径、単分散性ともに維持していた。また、精製後のベシクルについてＡｌＰｃＳ２ａの吸収色に基づく比色試験を行った。図１０（Ａ）に示す通り、接触させるＡｌＰｃＳ２ａ濃度が高まるにつれて、ＡｌＰｃＳ２ａ由来の青色が強くなることが判った。
［比較例Ｉ−３］
比較例Ｉ−２と同様に、第１及び第２の重合体を各々、ポリマー濃度が２．０ｍｇ／ｍＬとなるように１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（水性媒体）に溶解させた。得られた第１の重合体の溶液と第２の重合体の溶液とを、第１の重合体と第２の重合体の電荷比が等しくなる（すなわちＣ／Ａ比＝１．０となる）ようにエッペンドルフチューブに入れて混合し、ボルテックスミキサーを使用して２０００ｒｐｍで２分間攪拌することにより、第１及び第２の重合体の自己組織化集合体を含有する溶液を得た。得られた溶液０．５ｍＬに、混合後のＡｌＰｃＳ２ａ濃度が２．０ｍｇ／ｍＬ、荷電ポリマー濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるように、所定のＡｌＰｃＳ２ａ溶液を加え、再びボルテックスミキサーで２０００ｒｐｍ、２分間攪拌した。続いて、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）に含まれるカルボキシル基に対して１０等量のＥＤＣを含む溶液（ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（０ｍＭ ＮａＣｌ）中）を加え、室温で１２時間静置した。ベシクルに内包されず溶液中に遊離状態で残存するＡｌＰｃＳ２ａを実施例Ｉ−１と同様に遠心限外濾過により除去した。ＤＬＳ測定から、平均粒径は１０４ｎｍ、ＰＤＩは０．０６２であった。封入されたＡｌＰｃＳ２ａの量を図１０（Ａ）に示す比色試験により、実施例Ｉ−３の結果と比べると、実施例Ｉ−３の方が、同一濃度のＡｌＰｃＳ２ａを接触した場合においてもより多くの量が封入されていることが判った。また、混合後のＡｌＰｃＳ２ａ濃度が２．０ｍｇ／ｍＬより大きい場合、粒径とＰＤＩの維持が困難であった。
また、実施例Ｉ−３及び比較例Ｉ−３のベシクル溶液（何れもＡｌＰｃＳ２ａ濃度２０ｍｇ／ｍＬ）を、荷電ポリマー濃度０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈し、分光光度計で吸光スペクトルを測定した。その結果を図１０（Ｂ）に示す。やはり実施例Ｉ−３の方が、比較例Ｉ−３と比べて、同一濃度のＡｌＰｃＳ２ａを接触した場合においても、より多くの量が封入されていることが判った。
［参考例Ｉ−３］空ベシクルに対するＮａＣｌ濃度の影響
第１の重合体として、非荷電親水性セグメントであるポリエチレングリコール（重量平均分子量約２３００）（以降「ＰＥＧ」と表示する場合がある）と、アニオン性セグメントであるポリアスパラギン酸（重合度約７９）とからなるアニオン性ブロックコポリマーＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）を使用した。第２の重合体として、ポリ（ジアミノペンタン構造含有アスパラギン誘導体）（重合度約７１）（以降「Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）」と表示する場合がある）からなるカチオン性ホモポリマーＨｏｍｏ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）を使用した。第１及び第２の重合体を各々、ポリマー濃度が1．０ｍｇ／ｍＬとなるように１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４；水性媒体）に溶解させた。得られた第１の重合体の溶液３５．５μＬと第２の重合体の溶液５０μＬを、電荷比が等しくなる（すなわちＣ／Ａ比＝１．０となる）ようにエッペンドルフチューブに入れて混合し、ボルテックスミキサーを使用して２０００ｒｐｍで２分間攪拌し、第１及び第２の重合体の自己組織化により形成されたベシクル（空ベシクル）を含有する溶液を得た。ここに、最終濃度が５，１０，２０，１５０ｍＭとなるように所定量のＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、一晩静置した。
得られた空ベシクル含有溶液について、動的光散乱法（dynamic light scattering）による測定を行い、粒度分布、平均粒径、多分散指数（ＰＤＩ）及びゼータ電位を求めた。ＮａＣｌ添加前には平均粒径が１２６ｎｍであり、ＰＤＩが０．０４９であった空ベシクルが、それぞれＮａＣｌ添加後には、表５の値を示した。特に、２０ｍＭ ＮａＣｌ存在下ではＰＤＩが約０．２と大きな値を示し、ＴＥＭ像でも直径２００ｎｍを越える粒径を示す成分を多数含む、多分散性ベシクルの形成が認められた（図１１）。また、１５０ｍＭ ＮａＣｌ添加した場合、空ベシクル溶液は直ちに白濁し、サイズ、及び、多分散性の増大が示唆された。
次に、第１の重合体として、非荷電親水性セグメントであるポリエチレングリコール（重量平均分子量 約２３００）（以降「ＰＥＧ」と表示する場合がある）と、アニオン性セグメントであるポリアスパラギン酸（重合度約７９）とからなるアニオン性ブロックコポリマーＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）を使用した。第２の重合体として、ポリ（ジアミノペンタン構造含有アスパラギン誘導体）（重合度約７１）（以降「Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）」と表示する場合がある）からなるカチオン性ホモポリマーＨｏｍｏ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）を使用した。第１及び第２の重合体を各々、ポリマー濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるように１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４；ＮａＣｌなし，１０，２０ｍＭ ＮａＣｌを含む場合の３種類を作製；水性媒体）に溶解させた。得られた第１の重合体の溶液及び第２の重合体の溶液を、前項と同様に電荷比が等しくなる（すなわちＣ／Ａ比＝１．０となる）ようにエッペンドルフチューブに入れて混合し、ボルテックスミキサーを使用して２０００ｒｐｍで２分間攪拌し、第１及び第２の重合体の自己組織化により粒子を得た。粒径とその分布を動的光散乱により評価したところ、前項と同様の傾向の結果が得られ（表６）、２０ｍＭ ＮａＣｌ存在下では、ＰＤＩが０．２を与え、多分散性が高まったことが示唆された。
［参考例Ｉ−４］架橋率の決定
第１の重合体として、非荷電親水性セグメントであるポリエチレングリコール（重量平均分子量約２０００）（以降「ＰＥＧ」と表示する場合がある）と、アニオン性セグメントであるポリアスパラギン酸（重合度約７５）とからなるアニオン性ブロックコポリマーＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）を使用した。アニオン性ポリマーの末端をＣｙ３で標識した（アニオン性ポリマー数の１０％を標識）。第２の重合体として、ポリ（ジアミノペンタン構造含有アスパラギン誘導体）（重合度約８２）（以降「Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）」と表示する場合がある）からなるカチオン性ホモポリマーＨｏｍｏ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）を使用した。それぞれを１ｍｇ／ｍＬとなるようにｐＤ＝７．４のＤ2Ｏに溶解した。
両溶液を電荷比が等しくなるように混合し、Ｖｏｒｔｅｘ混合（２０００ｒｐｍ，２分間)し、空ベシクル含有溶液を調製した。
系中に含まれるＣｙ３−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）のカルボキシル基に対して１０，５，１，０．５，０．１等量分のＥＤＣ溶液（Ｄ2Ｏ，ｐＤ＝７．４）を添加し、空の架橋ベシクル含有溶液を調製した。
分画分子量３０万の遠心限外ろ過膜（Ｖｉｖａｓｐｉｎ，ＧＥヘルスケア製）を使用して精製を行った。遠心条件は２０００ｒｐｍ，２５℃×１０回で、新たにＤ2Ｏを添加して精製した。
１０ｍｇ／ｍＬの空の架橋ベシクル含有溶液（溶媒Ｄ2Ｏ）１００μＬを使用して、全反射赤外分光法（日本分光製，ＦＴＩＲ−６３００）を実施した。
全反射赤外分光法によって得られた１５５０−１６００ｃｍ-1のピークを、解析ソフトウェア（IGOR Pro）を使用して分離し、ＣＯＯ−に対応する面積の減少を定量することで架橋率を算出した（表７）。
［参考例Ｉ−５］空の非架橋ベシクルへのＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋ封入
実施例Ｉ−１と同様にして調製した空ベシクルに、実施例Ｉ−１と同様にしてフルオレセインイソチオシアナート−デキストラン（重量平均分子量４０００）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製，以下「ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋ」と表記する場合がある）を封入し、得られたＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋ内包非架橋ベシクルについて、動的光散乱法により粒度分布、平均粒径、多分散指数（ＰＤＩ）を測定した。その結果、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋの濃度が１０ｍｇ／ｍＬのときの平均粒径は１０７．４ｎｍ、ＰＤＩは０．０６７、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋの濃度が１５ｍｇ／ｍＬのときの平均粒径は１０９．２ｎｍ、ＰＤＩは０．０７８であり（空ベシクルの平均粒径は１０１．４ｎｍ，ＰＤＩは０．０７０）、空ベシクルに、その単分散性が維持されつつ、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ４ｋが封入されたことが確認された。
［参考例Ｉ−６］空の非架橋ベシクルに対する超音波処理
実施例Ｉ−１と同様にして調製した空ベシクルを超音波処理（２分）し、超音波処理後のベシクルについて、動的光散乱法により粒度分布、平均粒径、多分散指数（ＰＤＩ）を測定した。その結果、超音波処理を氷浴中で実施した場合、平均粒径は１１２．８ｎｍ、ＰＤＩは０．０９８であり、ベシクル溶液に異変は見られなかったが、超音波処理を氷浴中で実施しなかった場合、平均粒径は３６０６ｎｍ、ＰＤＩは０．３０１であり、ベシクル溶液は白濁した。この結果から、ベシクルに対する超音波処理は、ベシクルが過度に加熱されないように実施すること（例えば、超音波処理を非連続的に実施すること、超音波処理を連続的に実施する場合にはベシクルを冷却すること）が望ましいと考えられる。
［実施例Ｉ−４］シトシンデアミナーゼ封入架橋ベシクルの製造
・シトシンデアミナーゼ封入架橋ベシクルの調製及び評価：
シトシンデアミナーゼ（cytosine deaminase：ＣＤ）（シトシンデアミナーゼ硫酸アンモニウム懸濁物（Cytosine deaminase ammonium sulfate suspension）、CALZYME製）を封入した架橋ベシクルを、以下の手順で作成した。なお、ＣＤは５−フルオロシトシン（以下適宜「５−ＦＣ」と略す。）を５−フルオロウラシル（以下適宜「５−ＦＵ」と略す。）に変換する酵素である。
実施例Ｉ−１と同様に調製した空ベシクルに、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）に含まれるカルボキシル基に対して１．０等量のＥＤＣを加えて架橋し、空の架橋ベシクルを作製した。空の架橋ベシクルの約３ｍｇ／ｍＬ（ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）換算）分散液５００μＬと、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）１ｍｇの分散液５００μＬとを混合し、ボルテックスミキサー（２０００ｒｐｍ）で２分間撹拌することにより、ＣＤを架橋ベシクル内に担持させた。その後、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）に含まれるカルボキシル基に対して９．０等量のＥＤＣを加え、４℃で一晩かけて更に架橋し、４℃、２０００ｒｐｍの遠心下で限外濾過（分画分子量３０万、ＰＢＳ中）により精製し、ＣＤ封入架橋ベシクルの分散液１ｍＬを得た。
空架橋ベシクル及びＣＤ封入架橋ベシクルについて、動的光散乱（ＤＬＳ）法による測定を行い、平均粒径及び多分散指数（ＰＤＩ）を求めた。その結果を以下の表８に示す。また、ＣＤ封入架橋ベシクルの透過型電子顕微鏡写真を図１２に示す。
・シトシンデアミナーゼ封入架橋ベシクルによる５−ＦＣから５−ＦＵへの変換：
ＣＤ封入架橋ベシクルによる５−ＦＣから５−ＦＵへの変換効率を以下の手順で評価した。上記手順で調製したＣＤ封入架橋ベシクルの分散液０．１５ｍＬを、０．０１ｍｇ／ｍＬの５−ＦＣ溶液０．１５ｍｌと混合し、混合液中の５−ＦＵ濃度を液体クロマトグラフィー法により継時的に測定した。結果を図１３のグラフに示す。架橋ベシクルに封入されたＣＤにより５−ＦＣが５−ＦＵに変換された。その変換速度（酵素活性）は０．０３Ｕ／ｍＬであった。
・シトシンデアミナーゼ封入架橋ベシクルによる酵素活性の安定性：
ＣＤ封入架橋ベシクルによる酵素活性の安定性を以下の手順で評価した。上記手順で調製したＣＤ封入架橋ベシクルを、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中、４℃で保存した。調製から０日、５日、７日及び１４日の時点で、上記と同様の条件で５−ＦＣ溶液と混合し、４０分間後の混合液中の５−ＦＵ濃度を上記手法で測定した。結果を図１４のグラフに示す。調製後少なくとも７日間は酵素活性が維持された。
・シトシンデアミナーゼ封入架橋ベシクルによる腫瘍治療効果：
マウス大腸がん細胞株Ｃ２６を移植したＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢）を５匹ずつ８群（グループ１〜８）用意し、各グループに対し、上記手順で調製したＣＤ封入架橋ベシクル（０．５Ｕ／ｍＬ）、５−ＦＣ、５−ＦＵ、又はＰＢＳ各２００μＬを、以下の表９に示すタイミングで静脈内投与した。５−ＦＣ及び５−ＦＵは、マウス体重に対し１０ｍｇ／ｋｇ（体重）又は８０ｍｇ／ｋｇ（体重）となるように調整した。投与後、各マウスの生存期間中、最長２８日間に亘って、腫瘍体積を測定すると共に、各マウスの体重を測定した。腫瘍体積は、ノギスを用いて腫瘍の長径及び短径を測定し、以下の計算式により算出した。
Ｖ＝（ａ２×ｂ）／２
Ｖ：腫瘍体積、ａ：長径、ｂ：短径
腫瘍体積の測定結果を図１５に示す。ＣＤ封入架橋ベシクル及び５−ＦＣ投与群（グループ１：１０ｍｇ／ｋｇ；グループ２：８０ｍｇ／ｋｇ）は、無処置群（グループ８）と比較して、５−ＦＣ用量によらず、何れも有意な抗腫瘍効果が認められた（図１５（ａ））。ＣＤ封入架橋ベシクル及び５−ＦＣ投与群（グループ１：１０ｍｇ／ｋｇ；グループ２：８０ｍｇ／ｋｇ）と５−ＦＵ投与群（グループ３：１０ｍｇ／ｋｇ；グループ４：８０ｍｇ／ｋｇ）とを用量毎に比較すると、用量１０ｍｇ／ｋｇでは、５−ＦＵ投与群（グループ３）が非常に弱い抗腫瘍効果しか示さなかったのに対し、ＣＤ封入架橋ベシクル及び５−ＦＣ投与群（グループ１）では有意に優れた抗腫瘍効果が認められた（図１５（ｂ））。用量８０ｍｇ／ｋｇでは、５−ＦＵ投与群（グループ４）は腫瘍を縮小させるほどの抗腫瘍効果がみられたものの、その副作用により初回投与後１７日で全数が死亡したのに対し、ＣＤ封入架橋ベシクル及び５−ＦＣ投与群（グループ２）では抗腫瘍効果を発揮しつつも副作用を生じることなく、投与２８日後でも１匹を除いて全匹が生存していた（図１５（ｃ））。ＣＤ封入架橋ベシクル単体投与群（グループ５）及び５−ＦＣ単体投与群（グループ６：１０ｍｇ／ｋｇ投与群；グループ７：８０ｍｇ／ｋｇ投与群）では、無処置群（グループ８）と比較して有意な抗腫瘍効果及び毒性は見られなかった（図１５（ｄ））。
体重変化の測定結果を図１６に示す。ＣＤ封入架橋ベシクル及び５−ＦＣ投与群（グループ１：１０ｍｇ／ｋｇ；グループ２：８０ｍｇ／ｋｇ）では、投与２８日後でも相対体重が０．８を下回ることはなかったが（図１６（ａ））、その他の群は何れも０．８を下回るか死亡した（図１６（ｂ）〜（ｄ））。
生存数の集計結果を図１７に示す。ＣＤ封入架橋ベシクル及び５−ＦＣ投与群（グループ１：１０ｍｇ／ｋｇ；グループ２：８０ｍｇ／ｋｇ）では、投与２８日後でもグループ２（８０ｍｇ／ｋｇ）の１匹を除いて全匹が生存していたのに対し（図１７（ａ））、５−ＦＵ１０ｍｇ／ｋｇ投与群（グループ３）では３匹が、その他の群では全匹が投与２８日後までに死亡した（図１７（ｂ）〜（ｄ））。
・シトシンデアミナーゼ封入架橋ベシクルの血中滞留性評価：
マウス大腸がん細胞株Ｃ２６を移植したＢＡＬＢ／ｃマウス（７週齢）３匹を用意し、Ｃｙ５で標識した上記のＣＤ封入架橋ベシクル（０．５Ｕ／ｍＬ）２００μＬを静脈内投与した。投与後２４時間及び７２時間の時点で、Ｃｙ５標識に基づき、血中ＣＤ量を測定した。
血中ＣＤ量の測定結果を図１８のグラフに示す。ＣＤ封入架橋ベシクルによれば、投与から２４時間後及び７２時間後の何れにおいても、血中に高い濃度のＣＤ量が残存していた。よってＣＤ封入架橋ベシクルは血中滞留性に優れていることが分かる。
［比較例Ｉ−４］後担持法による非架橋ベシクルへのＣＤの導入
実施例Ｉ−１と同様に調製した架橋前の空ベシクル分散液に、ＣＤ分散液を加え、ボルテックスミキサーを使用して２０００ｒｐｍで２分間攪拌混合することにより、荷電ポリマー（第１及び第２の重合体）濃度が約０．９ｍｇ／ｍＬ、混合後のＣＤ最終濃度が１ｍｇ／ｍＬのベシクル分散液を調製した。この分散液について動的光散乱（ＤＬＳ）法による測定を行い、平均粒径及び多分散指数（ＰＤＩ）を求めたが、均一な粒子形成は確認できず、白濁した状態であった。
［実施例群II］吸着材内包ベシクル及びその製法
［実施例II−１］ＭＳＮ内包ベシクル１
・材料：
第１の重合体として、非荷電親水性セグメントであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ；分子量約２０００）と、アニオン性セグメントであるポリアスパラギン酸（Ｐ（Ａｓｐ）；重合度約７５）とからなるアニオン性ブロックコポリマー（ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）；ゼータ電位−３０．６ｍＶ）を用いた。
第２の重合体として、カチオン性セグメントであるポリ（ジアミノペンタン構造含有アスパラギン誘導体）（Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）；重合度約８２）からなるカチオン性ホモポリマー（Ｈｏｍｏ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）；ゼータ電位＋１６．３ｍＶ）を用いた。
被内包物質たる吸着材粒子として、Kim et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 8438-8441に記載の方法に従って製造したメソポーラスシリカナノ粒子（Mesoporous Silica Nanoparticles：ＭＳＮ）を用いた。本文献によれば、得られたメソポーラスシリカナノ粒子の総細孔容積は１．０７ｃｍ３／ｇである。また、平均粒径は約５０ｎｍ、ゼータ電位は−３７ｍＶであった。
・ＭＳＮ内包ベシクルの調製及び評価：
上記の第１及び第２の重合体を各々１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（水性媒体）に溶解させ、各重合体濃度１．０ｍｇ／ｍＬの溶液を調製した。また、上記のＭＳＮを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（水性媒体）に超音波照射により分散させ、ＭＳＮ濃度１．０ｍｇ／ｍＬの分散液を調製した。エッペンドルフチューブ中で、上記の第２の重合体の溶液に、上記のＭＳＮの分散液を、ＭＳＮ濃度が総ポリマー濃度（第１及び第２の重合体の総濃度）の２０ｗ／ｗ％となるように添加し、ボルテックスミキサーで約２０００ｒｐｍ、２分間撹拌し、その後８分間静置した。得られたエッペンドルフチューブ中の分散液に、上記の第１の重合体の溶液を、第２の重合体と電荷比が等しくなる（即ちＣ／Ａ比＝１．０となる）ように入れて混合し、ボルテックスミキサーで約２０００ｒｐｍ、２分間攪拌することにより、第１及び第２の重合体の自己組織化により形成されたＭＳＮ内包ベシクル（吸着材内包ベシクル）を含有する溶液を得た。
得られたＭＳＮ内包ベシクル含有溶液について、ＤＬＳ測定を行い、粒度分布、平均粒径及びＰＤＩを求めた。平均粒径１１１ｎｍで単分散な粒子の形成が認められた。ＰＤＩは０．０９２であった。
・架橋ＭＳＮ内包ベシクルの調製及び評価：
上記のＭＳＮ内包ベシクル含有溶液を、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）に含まれるカルボキシル基に対して１０等量のＥＤＣ（同仁化学研究所製、ＷＳＣ）を含む溶液に加え、一晩静置してＥＤＣ反応による架橋を行った。反応の副生成物を遠心限外濾過（VIVASPIN 20、sartorius stedium biotech社製、分画分子量３０万；２０００ｒｐｍ、２５℃）により除去して精製することにより、架橋されたＭＳＮ内包ベシクルを含有する溶液を得た。
得られた架橋ＭＳＮ内包ベシクル含有溶液について、ＤＬＳ測定を行い、粒度分布、平均粒径及びＰＤＩを求めた。粒度分布のグラフを図１９に示す。平均粒径１０２ｎｍで単分散な粒子の形成が認められた。ＰＤＩは０．０７７、ゼータ電位は−１７ｍＶであった。
また、上記の架橋ＭＳＮ内包ベシクル含有溶液について、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、日本電子製JEM-1400、以下同様）による形態観察も併せて行い、ＤＬＳ測定結果の妥当性を確認した。得られたＴＥＭ写真を図２０に示す。ＭＳＮ内包ベシクル（図中のコントラストの高い粒子）の粒径は６０〜７０ｎｍであり、同時に形成される空ベシクル（ＭＳＮを内包しないベシクル）の粒径は約１００ｎｍであった。ベシクルに封入されていないＭＳＮは観察されなかった。
・ＭＳＮ内包率の測定：
また、ＭＳＮ内包ベシクルのＭＳＮ内包率を調べるため、以下の実験を行った。ＭＳＮにフルオレセインイソチオシアネート（Fluorescein isothiocyanate：ＦＩＴＣ）を吸着させたＦＩＴＣ標識ＭＳＮを用い、上述と同様の手法にて、架橋ＭＳＮ内包ベシクルを含有する溶液を調製した。得られた架橋ＭＳＮ内包ベシクル含有溶液について、キャピラリー電気泳動（Beckman coulter Inc.製P/ACE MDQ）による測定を行った。検出器としては蛍光検出器を用い、キャピラリーとしては内径７５μｍのもの（polymicro Technology製TSP075375）を使用し、泳動液としては２００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を用いた。ＭＳＮ内包ベシクルと、ベシクルに内包されていないＭＳＮとは、表面電荷の違いに応じて、キャピラリー電気泳動により分離される。得られたクロマトグラムを図２１に示す。本結果によればベシクルに内包されているＭＳＮは８５％であった。
・血中滞留性の評価：
ＭＳＮ内包ベシクルの血中滞留性を、以下の手順により評価した。
まず、以下のサンプル（ｉ）〜（iv）を調製した。
（ｉ）Ｃｙ５標識ＭＳＮのサンプル：蛍光色素Ｃｙ５を吸着させたＭＳＮ（ＭＳＮに対するＣｙ５の比率０．４％）を含有する溶液。
（ii）Ｃｙ５標識ＭＳＮ内包ベシクルのサンプル：ＭＳＮの代わりに、上記（ｉ）で使用したＣｙ５標識ＭＳＮを用いた他は、上述と同様の手順により調製されたＭＳＮ内包ベシクル含有溶液。
（iii）ＭＳＮ内包Ｃｙ５標識ベシクルのサンプル：ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）の代わりに、Ｃｙ５で標識したＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）（ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）に対するＣｙ５の比率１０ｍｏｌ％）を用いた他は、上述と同様の手順により調製された、ＭＳＮ内包ベシクル含有溶液。
上記（ｉ）〜（iv）のサンプルを各々、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、６週齢、各サンプルにつき３匹）に尾静脈注射した（ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）換算濃度０．２ｍｇ／体重ｇ）。１時間後に採血を行い、得られた血中の蛍光色素濃度を蛍光分光器（日本分光製ＦＰ−７７００）を用いて測定した。得られた結果（各サンプルを投与した個体３匹の平均値）を以下の表１０に示す。
［実施例II−２］ＭＳＮ内包ベシクル２
上述の実施例II−１の手順において、上記の第１及び第２の重合体の各溶液並びにＭＳＮの分散液の混合順を変更し、先に第１の重合体の溶液をＭＳＮの分散液と混合し、得られた混合液に第２の重合体の溶液を混合した他は、実施例II−１と同様の手順に従うことにより、ＭＳＮを内包するベシクル（ＭＳＮ内包ベシクル：吸着材内包ベシクル）を含有する溶液を得た。
得られたＭＳＮ内包ベシクル含有溶液について、ＤＬＳ測定を行い、粒度分布、平均粒径及びＰＤＩを求めた。平均粒径１０３ｎｍで単分散な粒子の形成が認められた。ＰＤＩは０．０５９であった。
得られたＭＳＮ内包ベシクル含有溶液を用い、実施例II−１と同様の手順に従って架橋を行うことにより、架橋されたＭＳＮ内包ベシクルを含有する溶液を得た。
得られた架橋ＭＳＮ内包ベシクル含有溶液について、ＤＬＳ測定を行い、粒度分布、平均粒径及びＰＤＩを求めた。粒度分布のグラフを図２２に示す。平均粒径１０１ｎｍの粒子の形成が認められた。ＰＤＩは０．１５２であった。
また、上記の架橋ＭＳＮ内包ベシクル含有溶液について、ＴＥＭによる形態観察も併せて行い、ＤＬＳ測定結果の妥当性を確認した。得られたＴＥＭ写真を図２３に示す。ＭＳＮ内包ベシクル（図中のコントラストの高い粒子）の粒径は６０〜７０ｎｍであり、同時に形成される空ベシクル（ＭＳＮを内包しないベシクル）の粒径は約１００ｎｍであった。また、ベシクルに封入されていないＭＳＮがわずかに観察された。
また、ＭＳＮ内包率を調べるため、実施例II−１と同様の手順にて、キャピラリー電気泳動による測定を行った。得られたクロマトグラムを図２４に示す。本結果によれば、ベシクルに内包されているＭＳＮは７２％であった。
［参考例II−１］ＭＳＮ内包ベシクル３
上述の実施例II−１の手順において、上記の第１及び第２の重合体の各溶液並びにＭＳＮの分散液の混合順を変更し、先に第１の重合体の溶液と第２の重合体の溶液とを混合し、得られた混合液にＭＳＮの分散液を混合した他は、実施例II−１と同様の手順に従うことにより、ＭＳＮを内包するベシクル（ＭＳＮ内包ベシクル：吸着材内包ベシクル）を含有する溶液を得た。
得られたＭＳＮ内包ベシクル含有溶液について、ＤＬＳ測定を行い、粒度分布、平均粒径及びＰＤＩを求めた。平均粒径１０４ｎｍで単分散な粒子の形成が認められた。ＰＤＩは０．０４９であった。
得られたＭＳＮ内包ベシクル含有溶液を用い、実施例II−１と同様の手順に従って架橋を行うことにより、架橋されたＭＳＮ内包ベシクルを含有する溶液を得た。
得られた架橋ＭＳＮ内包ベシクル含有溶液について、ＤＬＳ測定を行い、粒度分布、平均粒径及びＰＤＩを求めた。粒度分布のグラフを図２５に示す。平均粒径１００ｎｍの粒子の形成が認められた。ＰＤＩは０．０５７であった。
また、上記の架橋ＭＳＮ内包ベシクル含有溶液について、ＴＥＭによる形態観察も併せて行い、ＤＬＳ測定結果の妥当性を確認した。得られたＴＥＭ写真を図２６に示す。ＭＳＮ内包ベシクル（図中のコントラストの高い粒子）の粒径は６０〜７０ｎｍであり、同時に形成される空ベシクル（ＭＳＮを内包しないベシクル）の粒径は約１００ｎｍであった。また、ベシクルに封入されていないＭＳＮが一部に観察された。
また、ＭＳＮ内包率を調べるため、実施例１と同様の手順にて、キャピラリー電気泳動による測定を行った。得られたクロマトグラムを図２７に示す。本結果によれば、ベシクルに内包されているＭＳＮは２１％であった。
［実施例II−３Ａ］アミノ化ＭＳＮ内包ベシクル
・アミノ化ＭＳＮ内包ベシクルの調製：
（３−アミノプロピル）トリメトキシシラン（(3-Aminopropyl)trimethoxysilane：ＡＰＴＳ）５０μＬを、蒸留水４ｍＬと共に常温で１時間撹拌して溶解させた。続いて、上述の実施例II−１と同様の手順で得られたＭＳＮ内包ベシクル（吸着材内包ベシクル）の１０ｍｇ／ｍＬ分散液１ｍＬを加えて更に２４時間撹拌し、内封されているＭＳＮにＡＰＴＳによる表面処理を施した。その後、限外濾過（分画分子量３０万、２０％エタノールで３回、その後１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５回）で精製し、アミノ化ＭＳＮ内包ベシクルを得た。
・アミノ化ＭＳＮ内包ベシクルの評価〜平均粒径及びＰＤＩ：
表面処理前の未処理ＭＳＮ内包ベシクル及びアミノ化ＭＳＮ内包ベシクルについて、動的光散乱（ＤＬＳ）法による測定を行い、平均粒径及び多分散指数（ＰＤＩ）を求めた。その結果を以下の表１１に示す。また、未処理ＭＳＮ内包ベシクル及びアミノ化ＭＳＮ内包ベシクルの透過型電子顕微鏡写真をそれぞれ図２８（ａ）及び（ｂ）に示す。
・アミノ化ＭＳＮ内包ベシクルの評価〜表面アミノ基：
また、未処理ＭＳＮ内包ベシクル及びアミノ化ＭＳＮ内包ベシクルについて、ＴＮＢＳアッセイによりアミノ基の量を測定した。具体的には、０．１５Ｍホウ酸ナトリウム及び０．０１Ｍ亜硫酸ナトリウム水溶液からなるバッファー２００μＬと、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid：ＴＮＢＳ）の０．１％水溶液５０μＬと、未処理ＭＳＮ内包ベシクル又はアミノ化ＭＳＮ内包ベシクルの２ｍｇ／ｍＬ分散液５０μＬとを混合し、３７℃で一晩放置した後、波長４２０ｎｍの紫外線（ＵＶ）吸光度を測定した。得られた吸光度から、各ＭＳＮ内包ベシクル中に存在するアミノ基数を求めた。その結果、アミノ化ＭＳＮ内包ベシクルでは未処理ＭＳＮ内包ベシクルよりもＭＳＮ１ｍｇあたり８．１４×１０１９個多くのアミノ基が検出された。
［実施例ＩＩ−３Ｂ］メルカプト化及びスルホン化ＭＳＮ内包ベシクル・メルカプト化及びスルホン化ＭＳＮ内包ベシクルの調製：
（３−メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（（３−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ：ＭＰＴＳ）５０μＬを、１％酢酸水溶液４ｍＬと共に常温で１時間撹拌して溶解させた。続いて、上述の実施例ＩＩ−１と同様の手順で得られたＭＳＮ内包ベシクル（吸着材内包ベシクル）の１０ｍｇ／ｍＬ分散液１ｍＬを加えて更に２４時間撹拌することにより、内封されているＭＳＮにＭＰＴＳによる表面処理を施した。その後、限外濾過（分画分子量３０万、１％酢酸水溶液で３回、その後水で５回）で精製し、メルカプト化ＭＳＮ内包ベシクルを得た。続いて、このメルカプト化ＭＳＮ内包ベシクルの分散液に３０％過酸化水素水溶液１ｍＬ及び濃硫酸１０μＬを加え、１２時間撹拌することによりメルカプト基を酸化してスルホニル基へと変換した。５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で中和し、水で希釈した後、限外濾過（分画分子量３０万、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５回）で精製し、スルホン化ＭＳＮ内包ベシクルを得た。
・メルカプト化及びスルホン化ＭＳＮ内包ベシクルの評価 〜 平均粒径及びＰＤＩ：
表面処理前の未処理ＭＳＮ内包ベシクル、メルカプト化ＭＳＮ内包ベシクル、及びスルホン化ＭＳＮ内包ベシクルについて、動的光散乱（ＤＬＳ）法による測定を行い、平均粒径及び多分散指数（ＰＤＩ）を求めた。結果を以下の表１２に示す。また、未処理ＭＳＮ内包ベシクル及びスルホン化ＭＳＮ内包ベシクルの透過型電子顕微鏡写真をそれぞれ図２９（ａ）及び（ｂ）に示す。
・スルホン化ＭＳＮ内包ベシクルの評価 〜 ＭＳＮの表面硫酸基：
また、未処理ＭＳＮ内包ベシクル及びスルホン化ＭＳＮ内包ベシクルについて、Ｘ線分析顕微鏡（ＸＧＴ−５２００ＷＲ、（株）堀場製作所）により硫酸基の有無を確認した。得られたＸ線分析スペクトルを図３０に示す。スルホン化ＭＳＮ内包ベシクルでは硫酸基に対応するＳのピークが確認されたのに対して、未処理ＭＳＮ内包ベシクルではＳのピークは確認されなかった。
［実施例ＩＩ−４Ａ］ローズベンガル吸着アミノ化ＭＳＮ内包ベシクル
・ローズベンガル吸着アミノ化ＭＳＮ内包ベシクルの調製：
実施例ＩＩ−３Ａで得られたアミノ化ＭＳＮ内包ベシクルの分散液にローズベンガル（ｒｏｓｅ ｂｅｎｇａｌ：以下適宜「ＲＢ」と略す。）を加えて混合し、アミノ化ＭＳＮ内包ベシクルにローズベンガルを吸着させた。未吸着ローズベンガルは限外濾過（分画分子量３０万）で除去した。得られたＲＢ吸着アミノ化ＭＳＮ内包ベシクルのＲＢ含有率は３．２ｗ／ｗ％であった。ローズベンガルの化学式を以下に示す。
・ローズベンガル吸着アミノ化ＭＳＮ内包ベシクルの評価 〜 放出特性：
このＲＢ吸着アミノ化ＭＳＮ内包ベシクルについて、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中３７℃でのローズベンガルの放出特性を測定した。得られた結果を図３１のグラフに示す。２４時間で約９５％のローズベンガルが放出された。
［実施例ＩＩ−４Ｂ］ゲムシタビン吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル
・ゲムシタビン吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクルの調製：
実施例ＩＩ−３Ｂで得られたスルホン化ＭＳＮ内包ベシクルの分散液にゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ：以下適宜「ＧＥＭ」と略す。）を加えて混合し、スルホン化ＭＳＮ内包ベシクルにゲムシタビンを吸着させた。未吸着のゲムシタビンは限外濾過（分画分子量３０万）で除去した。得られたＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクルのＧＥＭ含有率は７．９ｗ／ｗ％（１０ｍＭ ＰＢＳ用サンプル）及び８．１ｗ／ｗ％（疑似体液用サンプル）であった。
・ゲムシタビン吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクルの評価 〜 放出特性：
得られたＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクルについて、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）又は疑似体液（Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｂｏｄｙ Ｆｌｕｉｄ：ＳＢＦ）中での３７℃でのゲムシタビンの放出特性を測定した。なお、疑似体液は、Ｔ．Ｋｏｋｕｂｏ，Ｈ．Ｋｕｓｈｉｔａｎｉ，Ｓ．Ｓａｋｋａ，Ｔ．Ｋｉｔｓｕｇｉ ａｎｄ Ｔ．Ｙａｍａｍｕｒｏ，″Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ａｂｌｅ ｔｏ ｒｅｐｒｏｄｕｃｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｕｒｆａｃｅ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｇｌａｓｓ−ｃｅｒａｍｉｃ Ａ−Ｗ″，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，２４，７２１−７３４（１９９０）の記載に従って作成した。得られた結果を図３２のグラフに示す。１０ｍＭ ＰＢＳ中と疑似体液中とでは大きく異なるゲムシタビン放出特性が得られた。これはイオン強度やイオン種の違いによる影響と考えられる。
・ゲムシタビン吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクルの評価 〜 Ａ５４９細胞に対する細胞取り込み特性及び殺細胞効果：
また、ＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクルのＡ５４９細胞（ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞）に対する細胞取り込み特性及び殺細胞効果を、次のサンプルを使用し、以下の手順で評価した。
サンプル番号１：ＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル
サンプル番号２：スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル
サンプル番号３：ＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ
サンプル番号４：スルホン化ＭＳＮ
サンプル番号５：空ベシクル
サンプル番号６：ＧＥＭ単独
即ち、上記手順で得られたＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル（サンプル番号１）、その材料として用いたスルホン化ＭＳＮ内包ベシクル（実施例ＩＩ−３Ａ）（サンプル番号２）及び、及びその材料として用いた空ベシクル（実施例ＩＩ−１）（サンプル番号５）を、それぞれＣｙ３で標識（アニオン性ポリマー数の２５％を標識）した上で、Ａ５４９細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地中２．２×１０３細胞／ウェルの密度で有するプレートの各ウェルにそれぞれ添加し、３７℃で培養した。ＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル（サンプル番号１）の添加量は、ゲムシタビンが培地中０．５μｇ／ｍＬの濃度となる量とし、スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル（サンプル番号２）及び空ベシクル（サンプル番号５）の添加量は、ＭＳＮ内包ベシクル換算量でＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル（サンプル番号１）と同量となるように調整した。
また、比較用として、各ＭＳＮ内包ベシクルの材料として用いたＭＳＮを実施例ＩＩ−３Ａと同様の手順でスルホン化（ＭＰＴＳ表面処理によるメルカプト化後に酸化）したスルホン化ＭＳＮ（サンプル番号４）、及びこのＭＳＮにゲムシタビンを吸着させたＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ（ＧＥＭ含有量８．１ｗ／ｗ％）（サンプル番号３）、並びにゲムシタビン単独（サンプル番号６）を、各々細胞に添加して培養した。ＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ（サンプル番号３）及びゲムシタビン単独（サンプル番号６）は、ゲムシタビンが培地中０．５μｇ／ｍＬの濃度となるように添加し、スルホン化ＭＳＮ（サンプル番号４）の添加量は、ＭＳＮ換算量でＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ（サンプル番号３）と同量となるように調整した。
培養開始から４８時間及び７２時間経過した時点における各ＭＳＮ内包ベシクルサンプル（サンプル番号１、２、５）の細胞取り込み量を以下の手順で評価した。即ち、培養細胞の細胞質をカルセイン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製Ｃａｌｃｅｉｎ，ＡＭ）で、細胞核をヘキスト（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）でそれぞれ染色し、細胞内に存在する各ＭＳＮ内包ベシクル由来のＣｙ３蛍光量を、ＩｎＣｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い、励起波長５５０ｎｍで観察した。得られた結果を図３３（ａ）に示す。また、トリパンブルー（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎ、０．４％）を用いて細胞に取り込まれていない蛍光物質を識別し、細胞内に取り込まれた各ＭＳＮ内包ベシクル由来のＣｙ３蛍光量を同様に観察した。得られた結果を図３３（ｂ）に示す。空ベシクル（サンプル番号５）は殆ど細胞に取り込まれなかったのに対し、ＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル（サンプル番号１）及びスルホン化ＭＳＮ内包ベシクル（サンプル番号２）は何れも細胞に取り込まれたことが分かる。
また、培養開始から４８時間及び７２時間経過した時点における各サンプル（サンプル番号１〜６）による殺細胞効果を、以下の手順で評価した。即ち、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学社製）を用い、製造者の指示に従って、各ウェルに試薬を加え、更に１時間培養した上で、生細胞数を計測した。４８時間培養後の結果を図３４（ａ）に、７２時間培養後の結果を図３４（ｂ）に示す。ＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル（サンプル番号１）には、ＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ（サンプル番号３）及びゲムシタビン単独（サンプル番号６）と同程度の強い殺細胞効果が認められた。また、スルホン化ＭＳＮ（サンプル番号４）には弱い殺細胞効果が認められたが、スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル（サンプル番号２）及び空ベシクル（サンプル番号５）には殺細胞効果は認められなかった。
・ゲムシタビン吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクルの評価 〜 Ｃ２６細胞に対する細胞取り込み特性及び殺細胞効果：
また、Ａ５４９細胞の代わりにＣ２６細胞（ラット骨芽細胞様細胞）を用いて、以下に説明する点以外は、上記と同様の手順で細胞取り込み特性及び殺細胞効果を評価した。ＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル（サンプル番号１）、ＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ（サンプル番号３）及びゲムシタビン単独（サンプル番号６）の添加量は、ゲムシタビンが培地中０．１μｇ／ｍＬの濃度となる量とし、スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル（サンプル番号２）及び空ベシクル（サンプル番号５）の添加量は、ＭＳＮ内包ベシクル換算量でＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル（サンプル番号１）と同量となるように調整し、スルホン化ＭＳＮ（サンプル番号４）の添加量は、ＭＳＮ換算量でＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ（サンプル番号３）と同量となるように調整した。
細胞取り込みの評価結果として、トリパンブルー不在下における全細胞内のＣｙ３蛍光量の測定結果を図３５（ａ）に、トリパンブルー染色下における生細胞内のＣｙ３蛍光量の測定結果を図３５（ｂ）に示す。何れのＭＳＮ内包ベシクルサンプルについても、Ａ５４９細胞の場合と比較して、Ｃ２６細胞では細胞取り込み量が少なかった。よって、細胞取り込み量については、細胞種により差があるものと考えられる。
また、殺細胞作用の評価結果として、４８時間培養後の結果を図３６（ａ）に、７２時間培養後の結果を図３６（ｂ）に示す。Ａ５４９細胞の場合と同様、Ｃ２６細胞についても、ＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル（サンプル番号１）には、ＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ（サンプル番号３）及びゲムシタビン単独（サンプル番号６）と同程度の強い殺細胞効果が認められた。また、スルホン化ＭＳＮ（サンプル番号４）には弱い殺細胞効果が認められたが、スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル（サンプル番号２）及び空ベシクル（サンプル番号５）には殺細胞効果は認められなかった。
・ゲムシタビン吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクルの評価 〜 マウスを用いた腫瘍治療効果：
ヒト肺がん細胞株Ａ５４９を移植したＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（７週齢、各サンプル）を５匹ずつ７群用意し、うち６群にはそれぞれ上記サンプル１〜６を静脈内投与した（グループ１〜６）。各サンプルの投与量は２００μＬとし、各サンプルの濃度は、ＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル（サンプル番号１）、ＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ（サンプル番号３）及びゲムシタビン単独（サンプル番号６）については、マウス体重に対してゲムシタビンが５ｍｇ／ｋｇ（体重）となるように調整し、スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル（サンプル番号２）及び空ベシクル（サンプル番号５）の添加量は、ＭＳＮ内包ベシクル換算量でＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル（サンプル番号１）と同量となるように調整し、スルホン化ＭＳＮ（サンプル番号４）の添加量は、ＭＳＮ換算量でＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ（サンプル番号３）と同量となるように調整した。また、残る１群にはＰＢＳ２００μＬを投与した（グループ７）。投与後２８日間にわたって、腫瘍体積を測定した。腫瘍体積は、ノギスを用いて腫瘍の長径及び短径を測定し、以下の計算式により算出した。
Ｖ＝（ａ２×ｂ）／２
Ｖ：腫瘍体積、ａ：長径、ｂ：短径
腫瘍体積の測定結果を図３７のグラフに示す。スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル投与群（グループ２）、ＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ投与群（グループ３）、スルホン化ＭＳＮ投与群（グループ４）、及び空ベシクル投与群（グループ５）の何れについても、ＰＢＳ投与群（グループ７）との間に有意差はなく、有意な抗腫瘍効果は見られなかった。また、ＧＥＭ単独投与群（グループ６）では腫瘍成長が幾分抑制されたものの、やはりＰＢＳ投与群（グループ７）との間に有意差はなく、有意な抗腫瘍効果は見られなかった。一方、ＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル投与群（グループ１）では、ＰＢＳ投与群（グループ７）に対してはもちろんのこと、ＧＥＭ単独投与群（グループ６）と比較しても、腫瘍成長が有意に抑制されており、有意な抗腫瘍効果を認めた。このことから、本発明に係るＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル（サンプル１）によれば、ＧＥＭが効果的に腫瘍部に送達され、ＧＥＭ単剤と比較しても低投与量で高い抗腫瘍効果を発揮することが可能であることが分かる。
・ゲムシタビン吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクルの評価 〜 マウスを用いた血中滞留性及び腫瘍分布評価：
ヒト肺がん細胞株Ａ５４９を移植したＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（７週齢、各サンプル）を３匹ずつ４群用意した。うち２群にはＭＳＮをＣｙ５で標識したＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル（サンプル番号１）を静脈内投与し（グループＡ１及びＡ２）、残る２群にはＣｙ５で標識したＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ（サンプル番号３）を静脈内投与した（グループＢ１及びＢ２）。各サンプルの投与量は２００μＬとし、各サンプルの濃度は、マウス体重に対してゲムシタビンが５ｍｇ／ｋｇ（体重）となるように調整した。投与後２４時間（グループＡ１及びＢ１）及び７２時間（グループＡ２及びＢ２）の時点で動物を屠殺し、上記と同様の手法により、Ｃｙ５蛍光量に基づいて、ＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル及びＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮの血中濃度及び腫瘍における濃度を測定した。
ＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル及びＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮの血中濃度の測定結果を図３８のグラフに示す。ＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル投与群（グループＡ１及びＡ２）では、ＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ投与群（グループＢ１及びＢ２）と比較して、投与後２４時間及び７２時間の何れの時点でも血中濃度が遥かに高く、血中滞留性に優れていることが分かる。
また、ＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル及びＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮの腫瘍における濃度の測定結果を図３９のグラフに示す。ＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ内包ベシクル投与群（グループＡ１及びＡ２）では、ＧＥＭ吸着スルホン化ＭＳＮ投与群（グループＢ１及びＢ２）と比較して、投与後２４時間及び７２時間の何れの時点でも腫瘍における濃度が遥かに高く、腫瘍集積性に優れていることが分かる。
［実施例群ＩＩＩ］低水溶性物質内包ベシクル及びその製法
［実施例ＩＩＩ−１］β−ガラクトシダーゼ内包架橋ベシクルによるインディゴ系染料内包ベシクルの製造
・材料：
第１の重合体として、非荷電親水性セグメントであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ：分子量約２０００）と、アニオン性セグメントであるポリアスパラギン酸（Ｐ（Ａｓｐ）；重合度約７５）とからなるアニオン性ブロックコポリマー（ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）；ゼータ電位−３０．６ｍＶ）を用いた。
第２の重合体として、カチオン性セグメントであるポリ（ジアミノペンタン構造含有アスパラギン誘導体）（Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）；重合度約８２）からなるカチオン性ホモポリマー（Ｈｏｍｏ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）；ゼータ電位＋１６．３ｍＶ）を用いた。
被内包物質たる酵素として、β−ガラクトシダーゼを用いた。
・酵素内包ベシクルの調製及び評価：
第１及び第２の重合体を各々、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（水性媒体）に溶解させ、各ポリマー濃度１．０ｍｇ／ｍＬの溶液を調製した。また、β−ガラクトシダーゼ（酵素）を濃度１ｍｇ／ｍＬとなるように、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有）に溶解させ、溶液を調製した。得られた第１の重合体の溶液及び第２の重合体の溶液を、電荷比が等しくなる（即ちＣ／Ａ比＝１．０となる）ようにエッペンドルフチューブに入れて混合し、ボルテックスミキサーで約２０００ｒｐｍ、２分間攪拌することにより、第１及び第２の重合体の自己組織化により形成されたベシクル（空ベシクル）を含有する溶液を得た。
上記で得られたベシクル含有溶液に、使用した第２の重合体の溶液と同じ体積の上述のβ−ガラクトシダーゼ溶液を添加し、ボルテックスミキサーで約２０００ｒｐｍ、２分間攪拌することにより、β−ガラクトシダーゼをベシクルに内包させ、β−ガラクトシダーゼ内包ベシクル（酵素内包ベシクル）を含有する溶液を得た。
得られたβ−ガラクトシダーゼ内包ベシクル含有溶液を、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）に含まれるカルボキシル基に対して１０等量のＥＤＣ（同仁化学研究所製、ＷＳＣ）を含む溶液に加え、一晩静置してＥＤＣ反応による架橋を行った。反応の副生成物を遠心限外濾過（VIVASPIN 20、sartorius stedium biotech社製、分画分子量３０万；２０００ｒｐｍ、２５℃）により除去して精製することにより、架橋されたβ−ガラクトシダーゼ内包ベシクルを含有する溶液を得た。
得られたβ−ガラクトシダーゼ内包架橋ベシクル含有溶液について、ＤＬＳ測定を行い、粒度分布、平均粒径及びＰＤＩを求めた。粒度分布のグラフを図４０に示す。平均粒径１１２ｎｍで単分散な粒子の形成が認められた。ＰＤＩは０．０６７であった。
・低水溶性物質内包ベシクルの調製及び評価：
Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド：水溶性前駆体）を、濃度５ｍｇ／ｍＬとなるように、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有）／ジメチルホルムアミド混液（４：１）に溶解させ、溶液を調製した（なお、Ｘ−ｇａｌは、β−ガラクトシダーゼの酵素作用によって、インディゴ系染料（５，５’−ジブロモ−４，４’−ジクロロ−インディゴ）に転換される。）。総ポリマー濃度０．５ｍｇ／ｍＬの上記の架橋β−ガラクトシダーゼ内包ベシクル含有溶液５０μＬに、上記のＸ−ｇａｌ溶液１０μＬを添加し、さらに１０ｍＭリン酸緩衝液１９０μＬ加えて３７℃で２４時間放置し、β−ガラクトシダーゼ（酵素）によるＸ−ｇａｌ（水溶性前駆体）からインディゴ系染料（５，５’−ジブロモ−４，４’−ジクロロ−インディゴ：低水溶性物質）への転換反応を進行させた。その後、０．４５μｍのＰＥＳフィルターで濾過し、更に遠心限外濾過（VIVASPIN 20、sartorius stedium biotech社製、分画分子量３０万を使用；２０００ｒｐｍ、２５℃）により精製を行い、インディゴ系染料内包ベシクル（実施例III−１の低水溶性物質内包ベシクル）を含有する溶液を得た。
得られたインディゴ系染料内包ベシクル含有溶液について、ＤＬＳ測定を行い、粒度分布、平均粒径及びＰＤＩを求めた。粒度分布のグラフを図４１に示す。平均粒径１４０ｎｍで単分散な粒子が認められた。ＰＤＩは０．０９１であった。
また、このインディゴ系染料内包ベシクル含有溶液について、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による形態観察を行った。ＴＥＭ（日本電子製JEM-1400）により得られたＴＥＭ写真を図４２に示す。図４２によれば、β−ガラクトシダーゼ（酵素）によりＸ−ｇａｌ（水溶性前駆体）から転換されたインディゴ系染料（低水溶性物質）が、ベシクルの内部又は膜に局在していることが確認された。また、高解像度のＴＥＭ（日本電子製JEM-2100F）により得られたＴＥＭ写真を図４３に示す。図４３によれば、インディゴ系染料由来と考えられる回折線が認められた。よって、ベシクルに内包されたインディゴ系染料は、結晶性であることが確認された。
また、このインディゴ系染料内包ベシクルを、９０％ジメチルスルホキシド含有水溶液中で一晩放置し、吸光光度法により生成したインディゴ系染料の内包量を算出した。その結果、総ポリマー（第１及び第２の重合体）の重量に対して６６．９％のインディゴ系染料がベシクルに内包されていることが確認できた。
［比較例III−１］遊離β−ガラクトシダーゼによるインディゴ系染料内包ベシクルの製造
実施例III−１と同様の手順に従って調製された空ベシクル含有溶液に対して、β−ガラクトシダーゼ溶液を加えて混合することなく、そのまま実施例III−１と同様の手順に従ってＥＤＣ反応による架橋を行い、架橋された空ベシクル含有溶液を得た。
得られた架橋空ベシクル含有溶液について、ＤＬＳ測定を行い、粒度分布、平均粒径及びＰＤＩを求めた。粒度分布のグラフを図４４に示す。平均粒径９８ｎｍで単分散な粒子の形成が認められた。ＰＤＩは０．０７６であった。
総ポリマー濃度０．５ｍｇ／ｍＬの上記架橋空ベシクル含有溶液５０μＬに対して、実施例III−１と同様に調製した濃度１ｍｇ／ｍＬのβ−ガラクトシダーゼ溶液１２．５μＬ、及び、実施例III−１と同様に調製した濃度１ｍｇ／ｍＬのＸ−ｇａｌ溶液１０μＬを添加し、さらに１０ｍＭリン酸緩衝液１７７．５μＬを加えて、３７℃で２４時間放置した。その後、０．４５μｍのＰＥＳフィルターで濾過し、遠心限外濾過（VIVASPIN 20、sartorius stedium biotech社製、分画分子量３０万；２０００ｒｐｍ、２５℃）で精製することにより、インディゴ系染料生成後の空ベシクル（比較例III−１で当初、空だったベシクル）を含有する溶液を得た。
得られたインディゴ系染料生成後の空ベシクル含有溶液について、ＤＬＳ測定を行い、粒度分布、平均粒径及びＰＤＩを求めた。粒度分布のグラフを図４５に示す。平均粒径１０４ｎｍの粒子が認められた。ＰＤＩは０．１３１であった。
また、このインディゴ系染料生成後の空ベシクル含有溶液について、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による形態観察を行った。ＴＥＭ（日本電子製JEM-1400）により得られたＴＥＭ写真を図４６に示す。図４６によれば、β−ガラクトシダーゼとＸ−ｇａｌの反応により低水溶性のインディゴ系染料が生成したものの、ベシクルに内包されているインディゴ系染料は殆ど認められなかった。
また、このインディゴ系染料生成後の空ベシクルを、９０％ジメチルスルホキシド含有水溶液中で一晩放置し、吸光光度法により生成したインディゴ系染料の内包量を算出した。その結果、総ポリマー（第１及び第２の重合体）の重量に対して３１．０％のインディゴ系染料がベシクルに付着していることが確認できた。図４６の結果と考え合わせると、ベシクルに付着しているインディゴ系染料は、ベシクルに内包されているのではなく、主に空ベシクルの外部に付着しているものと考えられる。
本発明により得られる物質内包ベシクルは、薬物を送達するためのＤＤＳや、バイオマテリアル・機能性材料等の分野において、その有用性は極めて高い。

Claims (37)

  1. 非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体と、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体とを含んでなり、前記第１及び／又は前記第２の重合体が架橋された架橋膜と、
    前記架橋膜によって包囲された内水相と
    を含んでなり、前記内水相に目的物質が内包された物質内包架橋ベシクルの単分散集合体であって、
    前記内水相に含有される前記目的物質の濃度が５ｍｇ／ｍＬを上回る、かつ
    前記第１及び／又は前記第２の重合体が架橋されていない点及び前記目的物質が内包されていない点で前記物質内包架橋ベシクルの単分散集合体と異なる空の非架橋ベシクルの単分散集合体を、前記物質内包架橋ベシクルの内水相と同一濃度の前記目的物質を水性媒体とともに含有する混合液中で混合した場合に、
    前記目的物質が内包された物質内包非架橋ベシクルの単分散集合体の形成を阻害する濃度である、前記物質内包架橋ベシクルの単分散集合体。
  2. ０．２以下の多分散指数を有する、請求項１に記載の物質内包架橋ベシクルの単分散集合体。
  3. 前記目的物質の重量平均分子量が１００００〜４００００である、請求項１又は２に記載の物質内包架橋ベシクルの単分散集合体。
  4. 前記第１及び／又は前記第２の重合体が、カチオン基間に形成された架橋結合、アニオン基間に形成された架橋結合、及びカチオン基とアニオン基との間に形成された架橋結合からなる群より選択された１種又は２種以上の架橋結合によって架橋されており、前記架橋結合が形成された割合が、前記架橋膜に含まれるカチオン基及び／又はアニオン基の総モル数の３５％以上である、請求項３に記載の物質内包架橋ベシクルの単分散集合体。
  5. 非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体と、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体とを含んでなり、前記第１及び／又は前記第２の重合体が架橋された架橋膜と、前記架橋膜によって包囲された内水相とを含んでなり、前記内水相に第１の目的物質及び前記第１の目的物質よりも分子量の小さい親水性高分子である第２の目的物質が内包された物質内包架橋ベシクルであって、
    第２の目的物質が、第１の目的物質分子に対しクラウディング環境をもたらすような量で封入されており、
    前記第１の目的物質の立体構造が、前記第２の目的物質の不存在下で前記内水相に含有されている場合よりも安定化されている、前記物質内包架橋ベシクル。
  6. 前記第２の目的物質がクラウディング剤である、請求項５に記載の物質内包架橋ベシクル。
  7. 物質内包ベシクルを製造する方法であって、
    非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体と、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体とを含んでなり、前記第１及び／又は前記第２の重合体が架橋された架橋膜と、
    前記架橋膜によって包囲された内水相と
    を含んでなり、前記内水相に目的物質が内包されていない空の架橋ベシクルの単分散集合体を、
    前記目的物質を水性媒体とともに含有する混合液中で混合し、
    前記第１及び前記第２の重合体を含んでなり、前記第１及び／又は前記第２の重合体が架橋された架橋膜と、
    前記架橋膜によって包囲された内水相と
    を含んでなり、前記内水相に前記目的物質が内包された物質内包架橋ベシクルの単分散集合体を形成させる工程を含んでなる、前記方法。
  8. 前記空の架橋ベシクルの単分散集合体、前記物質内包架橋ベシクルの単分散集合体、前記空の非架橋ベシクルの単分散集合体、及び前記物質内包非架橋ベシクルの単分散集合体が、０．２以下の多分散指数を有する、請求項７に記載の方法。
  9. 前記目的物質の重量平均分子量が１００００〜４００００であり、前記混合液に含有される前記目的物質の濃度が５ｍｇ／ｍＬを上回る、請求項７又は８に記載の方法。
  10. 前記空の架橋ベシクル及び前記物質内包架橋ベシクルにおいて、前記第１及び／又は前記第２の重合体が、カチオン基間に形成された架橋結合、アニオン基間に形成された架橋結合、及びカチオン基とアニオン基との間に形成された架橋結合からなる群より選択された１種又は２種以上の架橋結合によって架橋されており、前記架橋結合が形成された割合が、前記架橋膜に含まれるカチオン基及び／又はアニオン基の総モル数の３５％以上である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記物質内包架橋ベシクルの単分散集合体を、前記第１及び／又は前記第２の重合体と反応し得る架橋剤と反応させる工程をさらに含む、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 物質内包ベシクルを製造する方法であって、
    非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体と、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体とを含んでなり、前記第１及び／又は前記第２の重合体が架橋された架橋膜と、
    前記架橋膜によって包囲された内水相と
    を含んでなり、前記内水相に第１の目的物質が内包された第１の物質内包架橋ベシクルを、
    前記第１の目的物質よりも分子量の小さい第２の目的物質を水性媒体とともに含有する混合液中で混合し、
    前記第１及び前記第２の重合体を含んでなり、前記第１及び／又は前記第２の重合体が架橋された架橋膜と、
    前記架橋膜によって包囲された内水相と
    を含んでなり、前記内水相に前記第１及び前記第２の目的物質が内包された第２の物質内包架橋ベシクルを形成させる工程を含んでなる、前記方法。
  13. 前記第１の物質内包架橋ベシクルが、その単分散集合体であり、前記第２の物質内包架橋ベシクルが、その単分散集合体である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記混合液に含有される前記第２の目的物質の濃度が、
    前記第１及び／又は前記第２の重合体が架橋されていない点で前記第１の物質内包架橋ベシクルの単分散集合体と異なる第１の物質内包非架橋ベシクルの単分散集合体を前記混合液中で混合した場合に、
    前記第１及び前記第２の目的物質が内包された物質内包非架橋ベシクルの単分散集合体の形成を阻害する濃度である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記第１及び前記第２の重合体を含んでなり、前記第１及び／又は前記第２の重合体が架橋された架橋膜と、
    前記架橋膜によって包囲された内水相と
    を含んでなり、前記内水相に前記第１及び前記第２の目的物質のいずれも内包されていない空の架橋ベシクルを、
    前記第１の目的物質を水性媒体とともに含有する混合液中で混合し、必要に応じて、前記第１及び／又は前記第２の重合体と反応し得る架橋剤と反応させ、
    前記第１の物質内包架橋ベシクルを形成させる工程をさらに含んでなる、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記空の架橋ベシクルが、その単分散集合体であり、前記第１の物質内包架橋ベシクルが、その単分散集合体である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記混合液に含有される前記第１の目的物質の濃度が、
    前記第１及び／又は前記第２の重合体が架橋されていない点で前記空の架橋ベシクルの単分散集合体と異なる空の非架橋ベシクルの単分散集合体を前記混合液中で混合した場合に、
    前記第１の目的物質が内包された物質内包非架橋ベシクルの単分散集合体の形成を阻害する濃度である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記第２の目的物質がクラウディング剤である、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体、及び、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体を含む膜からなるベシクルと、当該ベシクルに内包された吸着材粒子とを含み、前記第１及び第２の重合体の少なくとも一方が前記吸着材粒子に吸着されてなり、吸着剤粒子の粒径が４０ｎｍ以上である、吸着材内包ベシクル。
  20. 前記第１及び／又は第２の重合体が架橋されてなる、請求項１９に記載の吸着材内包ベシクル。
  21. 前記吸着材粒子がシリカ粒子である、請求項１９又は２０に記載の吸着材内包ベシクル。
  22. 前記吸着材粒子の平均粒径が４０ｎｍ〜１０μｍである、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の吸着材内包ベシクル。
  23. 前記吸着材粒子が表面処理されてなる、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の吸着材内包ベシクル。
  24. 前記吸着材粒子に低分子化合物が吸着されてなる、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の吸着材内包ベシクル。
  25. 非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体、及び、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体を含む膜からなるベシクルに、吸着材粒子が内包されてなる吸着材内包ベシクルを製造する方法であって、
    （ａ）前記第１及び第２の重合体のうち一方を前記吸着材粒子と混合し、前記吸着材粒子に吸着させる工程、並びに、
    （ｂ）前記工程（ａ）の混合物を前記第１及び第２の重合体のうち他方と更に混合し、前記吸着材粒子の周囲に前記第１及び第２の重合体を含む膜からなるベシクルを形成させ、吸着材内包ベシクルとする工程
    を含む方法。
  26. （ｃ）前記工程（ｂ）のベシクル中の前記第１及び／又は前記第２の重合体を架橋する工程を更に含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記吸着材粒子がシリカ粒子である、請求項２５又は２６に記載の方法。
  28. 前記吸着材粒子の平均粒径が４０ｎｍ〜１０μｍである、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記吸着材粒子を表面処理する工程を更に含む、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記吸着材粒子に低分子化合物が吸着されてなる、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体、及び、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体を含んでなり、前記第一及び／又は前記第二の重合体が架橋された架橋膜からなるベシクルに、低水溶性の目的物質が内包されてなる物質内包ベシクルを製造する方法であって、
    （ａ）前記目的物質よりも水溶性の高い前駆体を前記目的物質に転換し得る酵素が、前記第１及び第２の重合体を含む架橋膜からなるベシクルに内包されてなる酵素内包ベシクルを用意する工程、及び、
    （ｂ）前記前駆体よりも前記目的物質に対して低い溶解性を示す条件下で、前記酵素内包ベシクル内に前記前駆体を浸透させ、前記酵素によって前記前駆体を前記目的物質に転換することにより、前記目的物質を析出させて前記酵素内包ベシクルに内包させ、物質内包ベシクルとする工程
    を含む方法であって、
    ここで前記工程（ｂ）の前に、前記酵素内包ベシクルの前記第１及び／又は前記第２の重合体を架橋する工程を更に含み、
    前記低水溶性の目的物質が、内水相に対する前記低水溶性の目的物質の溶解度を超える濃度で内包されてなる、方法。
  32. 前記工程（ｂ）において、前記酵素内包ベシクルを前記前駆体の水溶液と混合することにより、前記酵素内包ベシクル内に前記前駆体を浸透させる請求項３１に記載の方法。
  33. 非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体、及び、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体を含んで成り、前記第一及び／又は前記第二の重合体が架橋された架橋膜からなるベシクルに、前記目的物質よりも水溶性の高い前駆体から転換され得る低水溶性物質が、前記前駆体を前記低水溶性物質に転換し得る酵素と共に内包されてなり、前記低水溶性物質が、内水相に対する前記低水溶性物質の溶解度を超える濃度で内包されてなる、低水溶性物質内包ベシクル。
  34. 請求項１〜４のいずれか１項に記載のベシクルの単分散集合体、及び／又は、請求項５、６、及び１９〜２２のいずれか１項に記載のベシクルを含む薬物送達系。
  35. 対象の所定の部位に薬物の前駆体を送達すると共に、前記前駆体を前記薬物に転換し得る酵素により、前記前駆体を前記薬物に転換することを含む薬物送達方法に使用される医薬組成物であって、
    当該医薬組成物は、非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体、及び、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体を含んでなり、前記第１及び／又は前記第２の重合体が架橋された架橋膜からなるベシクルに、前記酵素が内包されてなる酵素内包ベシクルを含み、且つ、
    前記薬物送達方法は、当該医薬組成物を前記対象の所定の部位に送達すると共に、該部位に別途送達した前記前駆体を前記酵素内包ベシクル内に浸透させることを更に含む、医薬組成物。
  36. 前記前駆体の水溶性が前記薬物よりも高いとともに、前記薬物送達方法において、当該医薬組成物を対象の所定の部位に送達した際に、前記前駆体よりも前記薬物に対して低い溶解性を示す条件下で、前記酵素内包ベシクル内に前記前駆体を浸透させる、請求項３５に記載の医薬組成物。
  37. 前記薬物送達方法において、当該医薬組成物を対象の所定の部位に送達した際に、前記薬物を析出させて前記酵素内包ベシクルに内包させることにより、薬物内包ベシクルを形成することを含む、請求項３５又は３６に記載の医薬組成物。
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5843763B2 (ja) 2010-05-21 2016-01-13 国立研究開発法人科学技術振興機構 物質内包ベシクル及びその製造方法
JP6049854B2 (ja) 2013-03-01 2016-12-27 国立研究開発法人科学技術振興機構 物質内包ベシクル及びその製造方法
WO2015200054A2 (en) 2014-06-24 2015-12-30 The Trustees Of Princeton University Process for encapsulating soluble biologics, therapeutics, and imaging agents
WO2016178431A1 (ja) * 2015-05-07 2016-11-10 国立大学法人 東京大学 ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームを用いたナノリアクタとその製造方法
AU2016378743A1 (en) * 2015-12-22 2018-08-02 The Trustees Of Princeton University Process for encapsulating soluble biologics, therapeutics, and imaging agents
EP3437660A4 (en) * 2016-03-28 2019-05-01 Fujifilm Corporation PREPARATION, MATERIAL FOR PREPARATION AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF
WO2019055539A1 (en) 2017-09-12 2019-03-21 Prudhomme Robert K CELLULOSIC POLYMER NANOPARTICLES AND METHODS OF FORMING THE SAME
JP2019069933A (ja) * 2017-10-05 2019-05-09 公益財団法人川崎市産業振興財団 体内における薬物動態を制御する組成物
US11541105B2 (en) 2018-06-01 2023-01-03 The Research Foundation For The State University Of New York Compositions and methods for disrupting biofilm formation and maintenance
US11731099B2 (en) 2018-07-20 2023-08-22 The Trustees Of Princeton University Method for controlling encapsulation efficiency and burst release of water soluble molecules from nanoparticles and microparticles produced by inverse flash nanoprecipitation
US20210386869A1 (en) 2018-12-07 2021-12-16 The University Of Tokyo Delivery of cyclic compound by using carrier
WO2024055284A1 (zh) * 2022-09-16 2024-03-21 深圳华大生命科学研究院 一种离子交联的仿生膜、其制备方法及应用
CN117820636A (zh) * 2024-03-04 2024-04-05 中国科学院长春应用化学研究所 一种酶响应性细胞毒性聚氨基酸及其制备方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001146556A (ja) * 1999-11-19 2001-05-29 Nano Career Kk コア−シェル構造のポリイオンコンプレックスミセル
WO2006118260A1 (ja) * 2005-05-02 2006-11-09 The University Of Tokyo 静電結合型高分子ベシクル
WO2011145745A1 (ja) * 2010-05-21 2011-11-24 独立行政法人科学技術振興機構 物質内包ベシクル及びその製造方法
WO2012014942A1 (ja) * 2010-07-28 2012-02-02 国立大学法人東京大学 静電結合型ベシクル
WO2014058079A1 (ja) * 2012-10-12 2014-04-17 帝人株式会社 金属微粒子を含む静電結合型ベシクル

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2690276B2 (ja) 1995-01-10 1997-12-10 科学技術振興事業団 静電結合型高分子ミセル薬物担体とその薬剤
DE69624581T2 (de) 1995-04-14 2003-05-15 Kazunori Kataoka Polyethylenoxide mit einer saccharidgruppe an einem ende und einer anderen funktionellen gruppe am anderem ende sowie verfahren zu deren herstellung
WO1996033233A1 (fr) 1995-04-19 1996-10-24 Kazunori Kataoka Copolymeres en blocs heterotelecheliques et procede de production
WO1997006202A1 (fr) 1995-08-10 1997-02-20 Kazunori Kataoka Polymere sequence pourvu de groupes fonctionnels aux deux extremites
US20050003016A1 (en) 1999-12-14 2005-01-06 Discher Dennis E. Controlled release polymersomes
US7498045B2 (en) 2001-08-31 2009-03-03 Thomas M. S. Chang Biodegradable polymeric nanocapsules and uses thereof
US7276254B2 (en) * 2002-05-07 2007-10-02 Xerox Corporation Emulsion/aggregation polymeric microspheres for biomedical applications and methods of making same
US20050118718A1 (en) * 2003-09-22 2005-06-02 University Of Utah Research Foundation Stabilization and controlled delivery of ionic biopharmaceuticals
CN100566708C (zh) * 2007-07-31 2009-12-09 浙江大学 一种肝靶向性药物微胶囊的制备方法
KR101564796B1 (ko) * 2008-03-10 2015-10-30 고쿠리츠다이가쿠호우진 도쿄다이가쿠 비하전성 친수성 블록 및 측사슬의 일부에 소수성 기가 도입된 카티온성 폴리아미노산 블록을 포함하여 이루어지는 공중합체, 그 사용
US20110081420A1 (en) * 2009-10-07 2011-04-07 Zyga Technology, Inc. Method of forming prolonged-release injectable steroids
CN101724162B (zh) * 2009-11-25 2012-05-09 西北大学 仿细胞外层膜结构聚合物纳米胶束溶液的制备方法
CN101829046B (zh) * 2010-05-21 2011-11-09 中国医学科学院生物医学工程研究所 一种两亲性嵌段聚合物胶束纳米载药系统及制备方法
WO2012005376A1 (ja) 2010-07-09 2012-01-12 国立大学法人 東京大学 核酸送達用組成物及び担体組成物、それを用いた医薬組成物、並びに核酸送達方法
CN102641246B (zh) * 2012-03-19 2014-09-10 南京维赛医药科技有限公司 一种抗肿瘤的双药纳米载药微球及其制备方法
US9808480B2 (en) 2012-04-27 2017-11-07 Nanocarrier Co., Ltd. Unit structure-type pharmaceutical composition for nucleic acid delivery
JP6049854B2 (ja) 2013-03-01 2016-12-27 国立研究開発法人科学技術振興機構 物質内包ベシクル及びその製造方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001146556A (ja) * 1999-11-19 2001-05-29 Nano Career Kk コア−シェル構造のポリイオンコンプレックスミセル
WO2006118260A1 (ja) * 2005-05-02 2006-11-09 The University Of Tokyo 静電結合型高分子ベシクル
WO2011145745A1 (ja) * 2010-05-21 2011-11-24 独立行政法人科学技術振興機構 物質内包ベシクル及びその製造方法
WO2012014942A1 (ja) * 2010-07-28 2012-02-02 国立大学法人東京大学 静電結合型ベシクル
WO2014058079A1 (ja) * 2012-10-12 2014-04-17 帝人株式会社 金属微粒子を含む静電結合型ベシクル

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