CN117820636A - 一种酶响应性细胞毒性聚氨基酸及其制备方法和应用 - Google Patents

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CN117820636A CN202410240698.8A CN202410240698A CN117820636A CN 117820636 A CN117820636 A CN 117820636A CN 202410240698 A CN202410240698 A CN 202410240698A CN 117820636 A CN117820636 A CN 117820636A
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陈学思
孙靖山
孙金凤
丁建勋
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Abstract

本专利提供了一种酶响应性细胞毒性聚氨基酸及其制备方法和应用。该聚氨基酸具有磷酸化修饰的侧基，其在碱性磷酸酶的催化作用下能够显现出正电荷并进行自组装，形成阳离子组装体。这种组装体具有破坏肿瘤细胞膜结构的能力，能够选择性地杀伤肿瘤细胞，同时有效抑制肿瘤的生长和转移。该方案提供了一种针对多种肿瘤类型具有潜在普遍适用性的新型治疗方法，能够有效减少耐药性和复发率，从而提高治疗的广泛性和有效性。

Description

一种酶响应性细胞毒性聚氨基酸及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及聚氨基酸材料技术领域，尤其是涉及一种酶响应性细胞毒性聚氨基酸及其制备方法和应用。
背景技术
在肿瘤治疗领域，利用正电荷聚合物直接杀伤肿瘤细胞的方法已成为一项新兴的研究方向。此方法相较于传统的肿瘤治疗手段，显示出抑制多种肿瘤细胞增值的优势，并且可能减少耐药性的风险。特别地，肿瘤细胞膜与正常细胞膜相比，呈现更多的负电荷。因此，使用带有正电荷并具有两亲性的聚合物可以直接与肿瘤细胞膜发生相互作用。这些阳离子聚合物首先通过正负电相互作用与细胞膜结合，然后通过其两亲性质插入并在肿瘤细胞膜上富集，进而破坏其完整性并杀死肿瘤细胞。
传统肿瘤治疗方法，如化学疗法和放射疗法，面临着耐药性的显著风险，这导致治疗效果随时间减弱并且复发率增加。此外，由于肿瘤类型的生物学差异性，目前缺乏一种普遍适用于所有类型肿瘤的疗法，这限制了治疗的广泛性和有效性。
因此，提供一种在碱性磷酸酶（ALP）催化下形貌及电荷转变的聚氨基酸纳米粒子用于选择性破坏肿瘤细胞膜并构建物理屏障用于肿瘤治疗的方法是非常必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种在碱性磷酸酶（ALP）催化下形貌及电荷转变的聚氨基酸纳米粒子用于选择性破坏肿瘤细胞膜并构建物理屏障用于肿瘤治疗。
本专利在阳离子聚合物直接杀伤肿瘤细胞的技术基础上，进一步结合了酶响应自组装技术。酶响应自组装技术的基本原理是，在特定酶的催化下，材料去除其强亲水基团，从而发生亲疏水性的转变，这一转变进而驱动材料自组装形成较大尺寸的组装体。结合上述两种技术，本专利提出了一种新的方法：在碱性磷酸酶的催化下，聚氨基酸材料去除磷酸根基团，暴露其正电荷。在这一过程中，材料同时发生亲疏水性的转变，进而驱动这些材料形成大尺寸的聚氨基酸网络。
本发明将正电荷聚合物直接杀伤肿瘤细胞与酶响应自组装相结合，在正电荷的基础上添加了对肿瘤细胞的机械刺激同时富集正电荷，进一步增强肿瘤细胞毒性。
本发明提供了一种式（I）结构的酶响应性细胞毒性聚氨基酸，所述酶为碱性磷酸酶；所述聚氨基酸为赖氨酸或酪氨酸磷酸化聚氨基酸；
式（I）
其中R1=H、 R2= />、OH式（I）
其中，m为5~15。优选地，x=10-100; m=1-100; n=1-100；l=1-100。
所述材料具有亲水部分聚乙二醇；可以和碱性磷酸酶反应的磷酸化的赖氨酸或酪氨酸；参与共组装的丙氨酸、酪氨酸；具有正电荷的赖氨酸部分。
本发明还提供了一种式（IV）结构的4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基(4-(2,5-二氧代噁唑烷-4-基)丁基)氨甲酸酯；
式（IV）。
本发明提供了一种式（IV）结构的4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基(4-(2,5-二氧代噁唑烷-4-基)丁基)氨甲酸酯的合成方法，包括如下步骤：
S1）羰基二咪唑和二乙基(4-(羟甲基)苯基)磷酸酯在溶剂的存在下反应，得到式（VII）的4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基1H-咪唑-1-羧酸酯；
S2）式（VII）结构的4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基1H-咪唑-1-羧酸酯和式（VIII）结构的叔丁基叔丁氧羰基赖氨酸酯在4-二甲氨基吡啶、三乙胺和溶剂的存在下反应，得到式（IX）结构的N 2-(叔丁氧羰基)-N 6-(((4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基)氧)羰基)赖氨酸酯；
S3）式（IX）结构的N 2-(叔丁氧羰基)-N 6-(((4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基)氧)羰基)赖氨酸酯采用溶剂溶解，与三氟乙酸反应，得到式（X）的N 6 -(((4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基)氧)羰基)赖氨酸；
S4）式（X）的N 6-(((4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基)氧)羰基)赖氨酸、四氢呋喃在惰性气体的保护下，与三光气反应，即得；
式（VII）；/>式（VIII）；
式（IX）；/>式（X）。
本发明提供的式（IV）结构的4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基(4-(2,5-二氧代噁唑烷-4-基)丁基)氨甲酸酯的合成方法首先将羰基二咪唑和二乙基(4-(羟甲基)苯基)磷酸酯在溶剂的存在下反应，得到式（VII）的4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基1H-咪唑-1-羧酸酯。上述溶剂优选为二氯甲烷。
一些实施例中，优选反应式如下：
羰基二咪唑在溶剂中溶解，称为溶液一；二乙基(4-(羟甲基)苯基)磷酸酯在溶剂中溶解，滴入溶液一，滴定过程中需冰浴，待滴定完成后，撤去冰浴，封口；搅拌反应12~36h；反应后水洗、干燥、过滤、即得。所述水洗的次数为3次；所述干燥优选为采用无水硫酸镁干燥。所述过滤优选为采用砂芯漏斗抽滤。
按照本发明，所述羰基二咪唑和二乙基(4-(羟甲基)苯基)磷酸酯的质量比为(3 ~4):3；
所述羰基二咪唑的质量g和溶剂的体积mL的比为1：10；
所述二乙基(4-(羟甲基)苯基)磷酸酯的质量g和溶剂的体积mL的比为1：（10~20）；
式（VII）结构的4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基1H-咪唑-1-羧酸酯和式（VIII）结构的叔丁基叔丁氧羰基赖氨酸酯在4-二甲氨基吡啶、三乙胺和溶剂的存在下反应，得到式（IX）结构的N 2-(叔丁氧羰基)-N 6-(((4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基)氧)羰基)赖氨酸酯。溶剂优选为二氯甲烷。
一些实施例中，优选反应式如下：
式（VII）结构的4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基1H-咪唑-1-羧酸酯、4-二甲氨基吡啶、三乙胺用溶剂溶解，冰浴条件下，用叔丁基叔丁氧羰基赖氨酸酯滴定，滴定完成后撤去冰浴，室温反应12~24h；更优选的，所述室温反应12~20h；最优选为所述室温反应12~18h；更优选为12h。
反应后旋蒸浓缩、二甲基亚砜溶解，去离子水沉降，离心，产物经乙酸乙酯溶解，盐酸水溶液洗涤，干燥，即得。其中盐酸溶液的浓度优选为0.1M；所述盐酸水溶液洗涤的次数优选为2次；所述干燥优选为采用无水硫酸镁干燥。
按照本发明，所述式（VI）结构的4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基1H-咪唑-1-羧酸酯和式（VII）结构的叔丁基叔丁氧羰基赖氨酸酯的质量比为1：（1.28~2）；
本发明一些实施例中，
式(VII) 结构的4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基1H-咪唑-1-羧酸酯、式(VIII)结构的叔丁基叔丁氧羰基赖氨酸酯、4-二甲氨基吡啶、三乙胺的质量比为1.000 : (1~2)：(0.325-0.5) : (0.5-2)。
式（IX）结构的N 2-(叔丁氧羰基)-N 6-(((4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基)氧)羰基)赖氨酸酯采用溶剂溶解，与三氟乙酸反应，得到式（X）的N 6 -(((4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基)氧)羰基)赖氨酸。所述溶剂优选为DCM。反应为室温反应5h。本发明所述反应温度为15~35℃。
一些实施例中，优选反应式如下：
一些实施例中，式（IX）结构的N 2-(叔丁氧羰基)-N 6-(((4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基)氧)羰基)赖氨酸酯、DCM和三氟乙酸的质量体积比为：2g：20mL：2.0mL。
式（X）的N 6-(((4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基)氧)羰基)赖氨酸、四氢呋喃在惰性气体的保护下，与三光气反应，即得。所述惰性气体包括氮气。所述反应温度为55℃；反应时间为1.5~2h；优选的，所述反应时间为2h。反应后包括氮吹、冰正己烷沉降、EtOAc溶解、饱和氯化钠洗涤、去离子水洗涤、干燥即得。所述饱和氯化钠洗涤的次数为2次；所述去离子水的洗涤次数优选为1次；所述干燥优选为采用无水硫酸镁干燥。
一些实施例中，优选反应式如下：
一些实施例中，所述式（X）的N6-(((4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基)氧)羰基)赖氨酸和三光气的质量比为3.1:1；
聚乙二醇单甲醚-b-聚（磷酸化赖氨酸-b-（丙氨酸-co-酪氨酸））与聚乙二醇单甲醚-b-聚（赖氨酸-b-（丙氨酸-co-磷酸化酪氨酸））具有良好的肿瘤细胞毒性和组装性能。其在碱性磷酸酶催化下发生反应如式（II）与式（II）所示。
式（II）
式（III）
本发明提供的式（I）结构聚氨基酸的合成方法，包括如下步骤：
A）将式（IV）结构的4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基(4-(2,5-二氧代噁唑烷-4-基)丁基)氨甲酸酯或L/D-赖氨酸(Cbz)-NCA和式（V）结构的化合物在溶剂存在下反应；
B）向步骤A) 的反应体系中加入L/D-丙氨酸-NCA、L-酪氨酸-NCA或二乙基（4-（（2,5-二氧代噁唑烷-4-基）甲基）苯氧基甲基）膦酸酯反应，得到式（VI）结构的化合物；
C）式（VI）结构的化合物在溶剂的存在下，与三乙胺、三甲基溴硅烷反应，即得；
式（IV）/>式（V）
式（VI）
其中R1=、/> R2= />、OH。
本发明提供的式（I）结构的聚氨基酸的合成方法首先按照上述步骤制备式（IV）结构的4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基(4-(2,5-二氧代噁唑烷-4-基)丁基)氨甲酸酯。
而后将式（II）结构的4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基(4-(2,5-二氧代噁唑烷-4-基)丁基)氨甲酸酯和式（III）结构的化合物在溶剂存在下反应，得到式（IV）结构的化合物。
一些实施例中，反应式如下：
其中R1=或H
本发明式（V）结构的化合物在Schlenk瓶中通过甲苯共沸除水干燥；干燥后在原Schlenk瓶中采用N,N-二甲基甲酰胺溶解，所用溶剂体积与式（V）结构的化合物质量比为（40-50）ml：1g。溶解后优选转移至手套箱中。加入式（IV）结构的4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基(4-(2,5-二氧代噁唑烷-4-基)丁基)氨甲酸酯或L/D-赖氨酸(Cbz)-NCA，反应，所述反应温度为15~35℃；真空度为-0.1Mpa以下；时间为3天，该反应体系中的所有部分不需经提纯直接参与下一步反应。
按照本发明，式（IV）结构的4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基(4-(2,5-二氧代噁唑烷-4-基)丁基)氨甲酸酯或L/D-赖氨酸(Cbz)-NCA和式（V）结构的化合物的质量比为（1.145~3.435）：1.000或1.5315：1；
其中具体的，式（IV）结构的4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基(4-(2,5-二氧代噁唑烷-4-基)丁基)氨甲酸与式（V）结构的化合物的质量比可以为1.145：1或2.290：1或3.435：1；
向上述反应体系中加入L/D-丙氨酸-NCA和L-酪氨酸-NCA或二乙基（4-（（2,5-二氧代噁唑烷-4-基）甲基）苯氧基甲基）膦酸酯，得到式（VI）结构的化合物。反应包括：在手套箱中向上一步Schlenk瓶溶液加入L/D-丙氨酸-NCA和L-酪氨酸-NCA或二乙基（4-（（2,5-二氧代噁唑烷-4-基）甲基）苯氧基甲基）膦酸酯，在该Schlenk瓶移出手套箱后抽真空2h，室温反应3天；反应后透析、冻干；所述反应温度为15~35℃。
一些实施例中，反应式如下：
其中R1=/>或H；R2=OH或/>；
按照本发明，式（V）结构的化合物、L/D-丙氨酸-NCA和L-酪氨酸-NCA的质量比为1.000：1.2134：0.3495; 式（V）结构的化合物、L/D-丙氨酸-NCA和二乙基（4-（（2,5-二氧代噁唑烷-4-基）甲基）苯氧基甲基）膦酸酯的质量比为1.000：1.2134：0.6860;
式（V）结构的化合物在溶剂的存在下，与三乙胺、三甲基溴硅烷反应，即得；反应为40℃回流20 h；反应后还包括采用冷阱抽干溶剂，加入EDTA的去离子水溶解，然后调节溶液的pH至近7~9透析冻干。
按照本发明，式（V）结构的化合物、三乙胺、三甲基溴硅烷的质量1.0：（5.6~10.5）：（6.8-12.5）
其中具体的，可以为1：5.6：6.8或1：8.6：10.3或1：10.5：12.5
一些实施例中，反应式如下：
本发明一种正电荷聚氨基酸网络的纳米粒子，由包括上述技术方案所述的聚合物或上述技术方案所述的制备方法制备得到的聚合物在碱性磷酸酶的催化下，得到。
本发明专利提供了一种在碱性磷酸酶（ALP）催化下形貌及电荷转变的聚氨基酸纳米粒子用于选择性破坏肿瘤细胞膜并构建物理屏障用于肿瘤治疗的方法。该纳米粒子相比于临床使用的其他纳米粒子具有肿瘤原位形成带有正电荷的聚氨基酸网络的功能，从而解决了肿瘤治疗中缺乏普适地抑制肿瘤增殖的问题以及减少耐药性风险。
本发明提供了上述的正电荷聚氨基酸网络的纳米粒子在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明所述治疗包括诱导肿瘤细胞死亡、抑制肿瘤生长。
通过正电荷聚合物直接杀伤肿瘤细胞原理为，肿瘤细胞膜相比正常细胞其具有负电荷，使用具有两亲性的正电荷聚合物直接与肿瘤细胞膜相互作用，再通过两亲性插入肿瘤细胞膜并富集，破坏肿瘤细胞膜完整进而杀伤肿瘤细胞，该技术也可通过特定结构使材料仅在肿瘤微环境暴露正电荷。
正电荷聚合物通过直接破坏肿瘤细胞膜来杀伤肿瘤细胞，这一机制在治疗多种类型的肿瘤中显示出了显著的广泛性优势。由于其作用方式与传统的化疗药物不同，这类聚合物能有效减少或延缓肿瘤细胞对治疗的耐药性发展，从而提高治疗的长期有效性。
附图说明
图1 4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基1H-咪唑-1-羧酸酯的核磁共振氢谱；
图2 叔丁基N2-(叔丁氧羰基)-N6-(((4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基)氧)羰基)赖氨酸酯的核磁共振氢谱；
图3 N6-(((4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基)氧)羰基)赖氨酸的核磁共振氢谱；
图4 4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基(4-(2,5-二氧代噁唑烷-4-基)丁基)氨甲酸酯的核磁共振氢谱；
图5聚乙二醇单甲醚-b-聚（磷酸化赖氨酸5/10/15-b-（丙氨酸25-co-酪氨酸4））脱乙基保护前后的核磁图；
图6 ALP催化聚乙二醇单甲醚-b-聚（磷酸化赖氨酸5/10/15-b-（丙氨酸25-co-酪氨酸4））不同时间下的核磁共振磷谱图；
图7左：ALP催化单甲醚-b-聚（磷酸化赖氨酸5/10/15-b-（丙氨酸25-co-酪氨酸4））不同时间下材料的粒径；右：ALP催化聚乙二醇单甲醚-b-聚（磷酸化赖氨酸10-（丙氨酸25-co-酪氨酸4））不同时间下材料的粒径；
图8 ALP催化聚乙二醇单甲醚-b-聚（磷酸化赖氨酸15-丙氨酸25-co-酪氨酸4）不同时间下材料的粒径；
图9 ALP催化聚乙二醇单甲醚-b-聚（磷酸化赖氨酸5/10/15氨酸25-co-酪氨酸4）不同时间下材料的Zeta电位变化；
图10左：梯度浓度聚乙二醇单甲醚-b-聚（磷酸化赖氨酸5-丙氨酸25-co-酪氨酸4）24h4T1细胞毒性； 中：梯度浓度聚乙二醇单甲醚-b-聚（磷酸化赖氨酸10-丙氨酸25-co-酪氨酸4）24h4T1细胞毒性；右：梯度浓度聚乙二醇单甲醚-b-聚（磷酸化赖氨酸15-丙氨酸25-co-酪氨酸4）24h4T1细胞毒性；
图11左：梯度浓度聚乙二醇单甲醚-b-聚（磷酸化赖氨酸5-丙氨酸25-co-酪氨酸4）24h293T细胞毒性；中：梯度浓度聚乙二醇单甲醚-b-聚（磷酸化赖氨酸10-丙氨酸25-co-酪氨酸4）24h293T细胞毒性；右：梯度浓度聚乙二醇单甲醚-b-聚（磷酸化赖氨酸15-丙氨酸25-co-酪氨酸4）24h293T细胞毒性；
图12 左：正常培养的4T1细胞扫描电镜；右：聚乙二醇单甲醚-b-聚（赖氨酸10-b-（丙氨酸25-co-磷酸化酪氨酸5））4T1细胞的扫描电镜；
图13 聚乙二醇单甲醚-b-聚（赖氨酸10-b-（丙氨酸25-co-磷酸化酪氨酸5））与肿瘤大小的关系图；
图14 聚乙二醇单甲醚-b-聚（赖氨酸10-b-（丙氨酸25-co-磷酸化酪氨酸5））与肿瘤肺切片H&E染色图。
具体实施方式
本发明提供了一种酶响应性细胞毒性聚氨基酸及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
本发明中涉及的数值范围与参数已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有数值范围或具体数据在一定范围内皆可存在一定合理的偏差，例如：1%或0.5%之内。
本发明实施例和对比例中记载了一些案例，其中实施例展示了本发明的某些实现方式。然而，这并不意味着只有在这些案例中才能实现本发明的效果。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种酶响应性细胞毒性聚氨基酸及其制备方法和应用进行详细描述。
本发明所述的氨基酸未经明确指明皆为左旋氨基酸。
实施例1 4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基1H-咪唑-1-羧酸酯的合成
将3.72 g羰基二咪唑（CDI）加入单口烧瓶并用37.2毫升（mL）二氯甲烷（Dichloromethane，DCM）溶解，称其为溶液一。将3 g 二乙基(4-(羟甲基)苯基)磷酸酯（diethyl (4-(hydroxymethyl)phenyl) phosphate）用60.0 mL DCM溶解，加入恒压滴定漏斗并滴入溶液一，滴定过程中需冰浴，待滴定完成后，撤去冰浴，磨口塞封口，搅拌反应12h。反应12 h后加入30.0 mL去离子水搅拌20.0 mL，丢去水层并水洗3次（20 ml x 3），所得DCM溶液用无水硫酸镁干燥过夜。待干燥过夜后，将干燥后的DCM溶液用砂芯漏斗抽滤，收集DCM溶液并通过旋转蒸发仪除去DCM，得到微黄色粘稠状透明液体，此液体即为4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基1H-咪唑-1-羧酸酯酯（4-((diethoxyphosphoryl)oxy)benzyl 1H
-imidazole-1-carboxylate）。4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基1H-咪唑-1-羧酸酯酯的核磁共振氢谱见图1。
实施例2
叔丁基N 2 -(叔丁氧羰基)-N 6 -(((4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基)氧)羰基)赖氨酸酯的合成
将2.74 g 4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基1H-咪唑-1-羧酸酯、0.89 g 4-二甲氨基吡啶（4-Dimethylaminopyridine，DMAP）、三乙胺（Triethylamine，TEA）用50.0 mL DCM溶解并加入单口烧瓶，在冰浴下用30.0 mL含有3.52g叔丁基叔丁氧羰基赖氨酸酯（tert-butyl(tert-butoxycarbonyl)lysinate）DCM的溶液滴定，滴定完成后撤去冰浴，室温反应12 h。反应12 h后，用旋转蒸发仪除去DCM，后加入80 mL二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）搅拌溶解产物。将溶解后的DMSO溶液用400 mL去离子水沉降，得到产物。用50.0 mL乙酸乙酯（ethyl acetate，EtOAc）溶解产物，再用0.1M的盐酸水溶液水洗2次（20 mL x 2），收集有机层并无水硫酸镁干燥过夜。干燥后抽后旋干，得到黄色粘稠液体，次即为叔丁基N 2 -(叔丁氧羰基)-N 6 -(((4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基)氧)羰基)赖氨酸酯(tert-butylN 2 -(tert-butoxycarbonyl)-N 6 -(((4-(diethoxyphosphoryl) oxy)benzyl)oxy)carbonyl)lysinate)。 叔丁基N 2 -(叔丁氧羰基)-N 6 -(((4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基)氧)羰基)赖氨酸酯的核磁共振氢谱见图2。
实施例3
N 6 -(((4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基)氧)羰基)赖氨酸的合成
将2 g叔丁基N 2 -(叔丁氧羰基)-N 6 -(((4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基)氧)羰基)赖氨酸酯用20.0 mL DCM溶解，向溶液中加入2.0 mL三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA），室温反应5 h，冷阱抽干DCM与TFA,得到N 6 -(((4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基)氧)羰基)赖氨酸（N 6 -(((4-((diethoxyphosphoryl)oxy)benzyl)oxy)carbonyl)lysine）,产物性状为黄色粘稠液体。N 6 -(((4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基)氧)羰基)赖氨酸的核磁共振氢谱见图3。
实施例4
将3.72 gN 6 -(((4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基)氧)羰基)赖氨酸与30.0 ml四氢呋喃（tetrahydrofura，THF）加入三口烧瓶，在55℃氮气保护下与1.2 g三光气（Triphosgene，BTC）反应2 h，反应2 h后用氮气吹剩约10.0 mL THF并用80.0 mL冰正己烷沉降，得到少量胶体与微黄色透明液体，收集胶体。将该胶体用10ml EtOAc溶解，用饱和氯化钠水洗2次（10.0 mL x 2），再用去离子水水洗一次（10.0 mL），收集有机层并用无水硫酸镁干燥过夜。干燥后用砂芯漏斗滤去硫酸镁并用冷阱抽干EtOAc，得到黄褐色粘稠液体，即为4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基(4-(2,5-二氧代噁唑烷-4-基)丁基)氨甲酸酯（4-((diethoxyphosphoryl)oxy)benzyl (4-(2,5-dioxooxazolidin-4-yl)butyl)carbamate），其核磁共振氢见图4。
实施例5
聚乙二醇单甲醚-b-聚（磷酸化赖氨酸5/10/15-b-（丙氨酸25-co-酪氨酸4））的合成
向Schlenk瓶中加入0.4g mPEG2K-NH2并通过甲苯共沸除水干燥，干燥后加入20.0mL无水N,N-二甲基甲酰胺（N,N-Dimethylacetamide，DMF）溶解mPEG2K-NH2并转移至手套箱，在手套箱中加入0.916g 4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基(4-(2,5-二氧代噁唑烷-4-基)丁基)氨甲酸酯,移出手套箱抽真空2 h，室温反应3天。反应三天后在手套箱中加入0.575g L/D-丙氨酸-NCA(4-甲基噁唑烷-2,5-二酮，4-methyloxazolidine-2,5-dione，L-Ala-NCA)和0.166gL-酪氨酸-NCA（4-(4-羟基苄基)噁唑烷-2,5-二酮，4-(4-Hydroxybenzyl)oxazolidine-2,5-dione，L-Tyr-NCA），移出手套箱抽真空2h，室温再反应3天。再反应三天后透析并冻干，得到深黄色粉。将0.5 g产物在氮气保护下加入10 mL DCM、4.3 mL TEA、5.2mlL三甲基溴硅烷（Bromo(trimethyl)silane，TMSBr）的混合溶液中，40℃回流20 h后冷阱抽干溶剂，剩余的固体用加入EDTA的去离子水溶解，然后调节溶液的pH至近中性透析冻干，得到聚乙二醇单甲醚-b-聚（磷酸化赖氨酸10-b-（丙氨酸25-co-酪氨酸4）），另制备了其它链段聚合度不变，磷酸化赖氨酸聚合度为5与15的材料，将4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基(4-(2,5-二氧代噁唑烷-4-基)丁基)氨甲酸酯用量分别减为50%与增加至150%即可。4.5中的产物结构式以及核磁共振氢谱见图5。
实施例6
聚乙二醇单甲醚-b-聚（磷酸化赖氨酸5/10/15-b-（丙氨酸25-co-酪氨酸4））的材料表征
将材料制为纳米粒子并用核磁共振磷谱表征聚乙二醇单甲醚-b-聚（磷酸化赖氨酸5/10/15-b-（丙氨酸25-co-酪氨酸4））的ALP催化磷酸根脱落动力学，测试溶剂为氘代水配置的pH为6.8的Tris缓冲液，测试谱图如图6所示。核磁共振磷谱结果显示，聚乙二醇单甲醚-b-聚（磷酸化赖氨酸5/10/15-b-（丙氨酸25-co-酪氨酸4））能在ALP催化下脱去磷酸根，且磷酸化赖氨酸链段长度为5与10的聚合物在ALP催化24h后完全脱去磷酸跟基团，而磷酸化赖氨酸链段聚合物为15的聚合物在ALP催化24h后仅能脱去86％的磷酸跟基团。
用动态力学光散射表征聚乙二醇单甲醚-b-聚（磷酸化赖氨酸5/10/15-b-（丙氨酸25-co-酪氨酸4））纳米粒子的形貌转变，所用溶剂为pH是6.8的PBS缓冲液，分别表征材料在ALP化0、0.5、1、5、7、24h时的粒径，结果如图7与图8所示，磷酸化赖氨酸链段为5与10的聚合物可以在碱性磷酸酶催化下尺寸变大达到1300与3900纳米，而磷酸化赖氨酸聚合度为15的聚合物则在ALP催化下尺寸略微变小仅为150纳米。
用Zeta电位表征聚乙二醇单甲醚-b-聚（磷酸化赖氨酸5/10/15-b-（丙氨酸25-co-酪氨酸4））纳米粒子在ALP催化下的电位变化，所用溶剂为pH是6.8的PBS缓冲液，其结果如图9所示, 各个磷酸化赖氨酸聚合度的材料均能在ALP催化下暴露正电荷。
将聚乙二醇单甲醚-b-聚（磷酸化赖氨酸5/10/15-b-（丙氨酸25-co-酪氨酸4））纳米粒子以不同浓度梯度与4T1细胞共孵育24h后用CCK-8法检测细胞的存活率，其结果见图10，聚乙二醇单甲醚-b-聚（磷酸化赖氨酸5/10/15-b-（丙氨酸25-co-酪氨酸4））IC50
分别为56.40 μM，IC50 = 7.51 μM，IC50 = 18.28 μM，筛选得到对肿瘤细胞毒性最大的聚乙二醇单甲醚-b-聚（磷酸化赖氨酸10-b-（丙氨酸25-co-酪氨酸4））材料。聚乙二醇单甲醚-b-聚（磷酸化赖氨酸5/10/15-b-（丙氨酸25-co-酪氨酸4））纳米粒子以不同浓度梯度与293T细胞共孵育24h后用CCK-8法检测细胞的存活率，其结果见图11，由此表征可以得出，聚乙二醇单甲醚-b-聚（磷酸化赖氨酸5/10/15-b-（丙氨酸25-co-酪氨酸4））材料具有选择性杀伤肿瘤的特性。
实施例7
聚乙二醇单甲醚-b-聚（赖氨酸10-b-（丙氨酸25-co-磷酸化酪氨酸5））的破膜验证
首先将准备好的玻璃片放入12孔板底部，然后将1105细胞接种在培养板底部，每孔加入1 mL完全培养基“8”字摇匀后放入培养箱中12小时。随后，弃去培养基，加入聚乙二醇单甲醚-b-聚（D-赖氨酸10-b-（D-丙氨酸25-co-D-磷酸化酪氨酸5）），24 h后，去除培养基，用PBS清洗3遍，随后每孔加入1 mL2.5%的戊二醛固定12 h, 4%多聚甲醛固定20分钟。固定完成后，通过单宁酸对细胞进行染色，以增强在电镜下的对比度减少样品电子损伤。接着，细胞需经过30%， 50%，70%，90%，100%一系列梯度浓度递增的乙醇溶液脱水，干燥以彻底去除水分。最终将细胞表面镀上金层，增加其导电性，然后通过扫描电镜进行观察。细胞的扫描电镜（图12）显示材料从处理后，细胞膜的完整性受损。
实施例8
聚乙二醇单甲醚-b-聚（赖氨酸10-b-（丙氨酸25-co-磷酸化酪氨酸5））的动物治疗效果评价
通过4T1原位乳腺癌模型评估聚乙二醇单甲醚-b-聚赖氨酸10-b-（丙氨酸25-co-磷酸化酪氨酸5））的体内抗肿瘤活性。首先，将 1106个 4T1 细胞皮下注射到雌性 BALB/c小鼠的乳房垫下，建立了 4T1 乳腺癌异种移植模型。当平均肿瘤大小达到~50 mm3时，将小鼠随机分为4组(每组n = 6)，并分别在 0、2、4、6、8、10、12、14 天接受瘤旁注射生理盐水，mPEG2k-D-Lys10-D-Ala25-D-pTyr5, mPEG2k-L-Lys10-L-Ala25-L-pTyr5, mPEG2k-D-Ala25-D-pTyr5。每两天进行肿瘤体积测量。图13结果显示mPEG2k-D-Lys10-D-Ala25-D-pTyr5材料能显著抑制肿瘤生长。16天治疗周期结束后取肿瘤组织和主要器官，对其进行H&E染色分析。图14结果证实材料可以显著减少肺转移。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种聚氨基酸，其具有式（I）的结构
式（I）；
其中R1=H、 R2= OH、/> x=10-100; m=1-100; n=1-100；l=1-100。
2.一种酶响应性细胞毒性聚氨基酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A）将式（IV）结构的4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基(4-(2,5-二氧代噁唑烷-4-基)丁基)氨甲酸酯或L/D-赖氨酸(Cbz)-NCA和式（V）结构的化合物在溶剂存在下反应；
式（IV）/>式（V）
B）向A）中的反应体系中加入 L-酪氨酸-NCA和二乙基（4-（（2,5-二氧代噁唑烷-4-基）甲基）苯氧基甲基）膦酸酯中的任意一种与L/D-丙氨酸-NCA的混合物反应，得到式（VI）结构的化合物；
式（VI）
其中R1= 、/> R2= />、OH；
C）式（VI）结构的化合物在溶剂的存在下，与三乙胺、三甲基溴硅烷反应，即得。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A）溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；所述反应温度为15~35℃；真空度为-0.1Mpa以下；时间为3天。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B）反应包括：向步骤A）反应体系内加入 L-酪氨酸-NCA和二乙基（4-（（2,5-二氧代噁唑烷-4-基）甲基）苯氧基甲基）膦酸酯中的任意一种与L/D-丙氨酸-NCA的混合物，抽真空2h，15~35℃反应3天；反应后透析、冻干。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤C）反应为40℃回流20 h；反应后还包括采用冷阱抽干溶剂，加入EDTA的去离子水溶解，然后调节溶液的pH至7~9透析冻干。
6.一种权利要求2中所用的式（IV）结构的4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基(4-(2,5-二氧代噁唑烷-4-基)丁基)氨甲酸酯的合成方法，包括如下步骤：
S1）羰基二咪唑和二乙基(4-(羟甲基)苯基)磷酸酯在溶剂的存在下反应，得到式（VII）的4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基1H-咪唑-1-羧酸酯；
S2）式（VII）结构的4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基1H-咪唑-1-羧酸酯和式（VIII）结构的叔丁基叔丁氧羰基赖氨酸酯在4-二甲氨基吡啶、三乙胺和溶剂的存在下反应，得到式（IX）结构的N 2-(叔丁氧羰基)-N 6-(((4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基)氧)羰基)赖氨酸酯；
S3）式（IX）结构的N 2-(叔丁氧羰基)-N 6-(((4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基)氧)羰基)赖氨酸酯采用溶剂溶解，与三氟乙酸反应，得到式（X）的N 6 -(((4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基)氧)羰基)赖氨酸；
S4）式（X）的N 6-(((4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基)氧)羰基)赖氨酸四氢呋喃溶液在惰性气体的保护下，与三光气反应，即得；
式（VII）；/>式（VIII）；
式（IX）；/>式（X）。
7.根据权利要求6所述的合成方法，其特征在于，
所述步骤S1）中：溶剂为二氯甲烷；所述羰基二咪唑和二乙基(4-(羟甲基)苯基)磷酸酯的质量比为3.72~4:3；所述羰基二咪唑的质量g和溶剂的体积mL的比为3~4：（30~40）；所述二乙基(4-(羟甲基)苯基)磷酸酯的质量g和溶剂的体积mL的比为1：（10~20）；所述反应包括：二乙基(4-(羟甲基)苯基)磷酸酯在冰浴条件下滴入羰基二咪唑，滴加完成，撤去冰浴，搅拌反应12~36h；反应后水洗、干燥、过滤、即得；
所述步骤S2）中：溶剂为二氯甲烷；所述式（VII）结构的4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基1H-咪唑-1-羧酸酯和式（VIII）结构的叔丁基叔丁氧羰基赖氨酸酯的质量比为1：（1.28~3）；所述反应包括：式（VIII）结构的叔丁基叔丁氧羰基赖氨酸酯冰浴下滴入式（VII）结构的4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基1H-咪唑-1-羧酸酯溶液中，室温反应12~24h；反应后旋蒸浓缩、二甲基亚砜溶解，去离子水沉降，离心，产物经乙酸乙酯溶解，盐酸水溶液洗涤，干燥，即得。
8.根据权利要求6所述的合成方法， 其特征在于，
所述步骤S3）中：反应为15~35℃反应5h；
所述步骤S4）中：所述惰性气体包括氮气；所述反应温度为55℃；反应时间为1.5~2h；所述式（X）的N 6 -(((4-((二乙氧基磷酰)氧)苄基)氧)羰基)赖氨酸和三光气的质量比为3.72:1.2；反应后包括氮吹、冰正己烷沉降、EtOAc溶解、饱和氯化钠洗涤、去离子水洗涤、干燥即得。
9.一种酶响应性纳米粒子的制备方法，其特征在于，将式（VI）中的聚合物用N,N-二甲基甲酰胺溶解后滴加入搅拌的去离子水中。
10.权利要求9所述的酶响应性细胞毒性聚氨基酸在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
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