CN114621432B - 一种具有诱导细胞钙化能力的聚氨基酸及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明具有式(I)结构的聚氨基酸为十二胺‑聚(γ‑十二烷基谷氨酸‑嵌段‑组氨酸)‑共‑聚谷氨酸接枝阿仑膦酸(DDA‑P(DLG‑co‑LH)‑P(LG‑g‑ALN)),其中,十二烷基的长碳链部分能够插入到细胞膜上,组氨酸组分使聚合物具备pH响应性,ALN部分的双膦酸基团能够吸附钙离子形成钙沉积,该方法不但能抑制原发病灶的生长,而且可以抑制转移灶的形成。作为一种渗透非依赖的治疗方式,避开了限制传统化疗药物疗效的肿瘤渗透压的影响,同时避免耐药性的产生。此外,双磷酸盐限制了破骨细胞的形成和活性,因此抑制了侵袭性骨肉瘤中的骨破坏,而且治疗几乎没有不良反应。
Description
技术领域
本发明涉及高分子药物领域,尤其是涉及一种具有诱导细胞钙化能力的聚氨基酸、以及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤已经成为威胁人类健康的最严重疾病之一。临床上常用的癌症治疗手段包括化学治疗、放射治疗和手术治疗等。其中,化学治疗是其中最常用和重要的治疗途径。但临床上所用的抗肿瘤药物在应用中有诸多的缺陷,如:水溶性及稳定性差,药物毒副作用大。
在过去的几十年里,各种聚合物递送系统,如胶束、纳米凝胶、微球等被开发出来,以提高小分子化疗药物的治疗效果,同时降低副作用。然而,纳米颗粒渗透到实体肿瘤中比预期的要困难得多。由于肿瘤组织复杂的病理生理环境,包括血管组织紊乱、淋巴管功能失调、细胞外基质致密等,导致间质流体压力明显升高,高IFP显著抑制纳米颗粒的血管外渗和组织渗透。此外,肿瘤内的血管往往分布不均匀,导致灌注不良的区域。除上述生物屏障外,肿瘤组织中胶原纤维与蛋白多糖、糖胺多糖等分子高度交联形成的细胞外基质,对纳米颗粒的运动构成物理屏障,这大大损害了其抗癌效果。因此,使用纳米药物直接杀死癌细胞充满障碍。
在这种情况下,研究者们提出了一种渗透非依赖的癌症治疗策略,它不需要纳米颗粒深入穿透肿瘤组织就可以达到抑制肿瘤进展的目的。在自然界中,生物利用有机基质精确地调节离子的沉积过程生成无机矿物,这个过程被称为生物矿化。有机-无机掺杂的生物矿物是生物有机体与无机矿物之间的桥梁,它们在生物体中起着重要的作用。一方面,它是生物体的重要组成部分,为它们提供保护(外壳)、支撑(骨骼)和工具(牙齿)。另一方面,关节软骨、心血管组织、肾脏等软组织的异常病理矿化会导致机体生病甚至死亡。临床治疗发现,在经过放疗或化疗后的特定肿瘤病灶中,也会产生异位矿化,这与肿瘤的良性预后有一定的关系。因此,利用化学工具以一种可控的方式诱导肿瘤组织发生病理性矿化沉积,以延缓肿瘤的生长是一种潜在的抗肿瘤策略。
发明内容
有鉴于此,本发明要解决的技术问题在于提供一种具有诱导细胞钙化能力的聚合物,避开了细胞靶向的化疗药物的渗透性不足的问题,本发明提供的聚合物能够诱导细胞钙化,从而抑制肿瘤细胞的生长。
本发明提供了一种具有诱导细胞钙化能力的化合物,具有式(I)结构:
其中,10≤x≤16,0≤m≤1,1≤n≤10,1≤i≤5,10≤p≤j,20≤j≤50。
本发明提供了一种具有诱导细胞钙化能力的化合物的制备方法,包括:
由阿仑膦酸与具有式(II)结构的聚氨基酸在水性介质中发生反应得到;
式(II)中,10≤x≤16,0≤m≤1,1≤n≤10,1≤i≤5,20≤j≤50。
优选的,包括以下步骤:
A)将具有式(II)结构的聚氨基酸溶解于水中,与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺混合,反应,得到第一反应溶液;
B)在第一反应溶液中加入阿仑膦酸,搅拌,进行反应,得到第二反应溶液;
C)第二反应溶液经透析、冻干,得到具有式(I)结构的聚合物。
优选的,步骤A)中,第一反应溶液的pH值为4.5~6;所述反应的温度为20℃~40℃,所述反应的时间为20min~60min;
所述具有式(II)结构的聚氨基酸与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:2~5。
优选的,步骤B)中,第二反应溶液的pH值为7.5~9;所述反应的温度为20℃~40℃,所述反应的时间为12h~72h;
所述具有式(II)结构的聚氨基酸与阿仑膦酸的摩尔比为1:2~5;
步骤C)中,所述反应后还包括用截流分子量为3500的透析袋进行透析除去未反应的EDC、NHS和阿仑膦酸;
所述冻干的温度为-18℃~-20℃;所述冻干的时间为60h~72h。
优选的,所述具有式(II)结构的pH响应性聚氨基酸的制备方法包括以下步骤:
a)将十二胺、γ-十二烷基谷氨酸-N-环内羧酸酐、N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸-N-环内羧酸酐溶解于第一有机溶液中,搅拌反应,得到第三反应溶液;
b)在第三反应溶液中加入γ苄基谷氨酸-N-环内羧酸酐,搅拌反应,得到第四反应溶液;
c)将第四反应溶液于第二有机溶剂中沉降,过滤,得到第一固体;
d)将第一固体再次溶解于第一有机溶剂,于去离子水中透析除去有机溶剂和杂质,冻干得到第二固体;
e)将第二固体溶于第三有机溶剂中,得到第三反应溶液;
f)将第三反应溶液于第二有机溶剂中沉降,过滤,得到第三固体;
g)将第三固体溶于第一有机溶剂中,于去离子水中透析,冻干得到具有式(II)结构的聚合物。
优选的,所述步骤a)中,所述反应的温度为15℃~50℃,所述反应的时间为2~7天;
步骤a)中,所述第一有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺;
步骤b)中,所述反应的温度为15℃~50℃,所述反应的时间为2~7天;
步骤c)中,所述第二有机溶剂为乙醚;
步骤e)中,所述第三有机溶剂为三氟乙酸和溴化氢的乙酸溶液的混合溶液;
步骤g)中,所述透析具体为:采用截流分子量为3500的透析袋进行透析;所述冻干的温度为-18℃~-20℃;所述冻干的时间为60h~72h。
本发明上述技术方案所述的具有式(I)结构的化合物或上述技术方案任一项所述的制备方法制备得到的具有式(I)结构的化合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
优选的,所述治疗包括诱导细胞钙化或抑制肿瘤细胞的增殖。
本发明提供了一种治疗肿瘤的药物,包括上述技术方案所述的化合物或上述技术方案所述的制备方法制备得到的化合物。
与现有技术相比,本发明提供了一种具有诱导细胞钙化能力的化合物,具有式(I)结构。即十二胺-聚(γ-十二烷基谷氨酸-嵌段-组氨酸)-共-聚谷氨酸接枝阿仑膦酸(DDA-P(DLG-co-LH)-P(LG-g-ALN))。式(I)包括三个功能部分,即细胞膜插入部分,肿瘤微环境响应部分和生物矿化诱导部分。其中,组氨酸片段为材料提供了pH响应性,使得十二烷的长碳链部分能够在肿瘤组织弱酸性环境下暴露出来并插入到细胞膜上,ALN部分由于具有双膦酸根结构能够诱导肿瘤微环境中的离子沉积,最终在肿瘤组织周围形成矿化层。该方法不但能抑制原发病灶的生长,而且可以抑制转移灶的形成。作为一种渗透非依赖的治疗方式,避开了限制传统化疗药物疗效的肿瘤渗透压的影响,同时避免耐药性的产生。此外,双磷酸盐限制了破骨细胞的形成和活性,因此抑制了侵袭性骨肉瘤中的骨破坏,而且治疗几乎没有不良反应。
附图说明
图1为实施例1制备的γ-十二烷基谷氨酸-N-环内酸酐的核磁图谱;
图2为实施例2制备的N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸-N-环内羧酸酐的核磁图谱;
图3为实施例3制备的γ-苄基谷氨酸-N-环内酸酐的核磁图谱;
图4为实施例5、8、11制备的第二固体、具有使(II)结构的聚氨基酸和具有式(I)结构的钙化诱导聚氨基酸的核磁谱图;
图5为具有式(I)结构的钙化诱导聚氨基酸将143B肿瘤细胞细胞钙化的激扫描电镜图片;
图6为具有式(I)结构的钙化诱导聚氨基酸抑制143B肿瘤细胞生长的曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种具有诱导细胞钙化能力的聚氨基酸、以及其制备方法和应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种具有诱导细胞钙化能力的化合物,具有式(I)结构:
其中,10≤x≤16,0≤m≤1,1≤n≤10,1≤i≤5,10≤p≤j,20≤j≤50。
优选的,10≤x≤12,0≤m≤1,1≤n≤5,1≤i≤2,10≤p≤j,20≤j≤30,更优选的,x=10,m=1,n=5,i=2,p=20,j=25。
本发明提供了一种具有诱导细胞钙化能力的化合物的制备方法,包括:
由阿仑膦酸与具有式(II)结构的聚氨基酸在水性介质中发生反应得到;
式(II)中,10≤x≤16,0≤m≤1,1≤n≤10,1≤i≤5,20≤j≤50。
按照本发明,具有式(I)结构的具有诱导细胞钙化能力的pH响应性聚氨基酸的制备优选包括以下步骤:
A)将具有式(II)结构的聚氨基酸溶解于水中,与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合,反应,得到第一反应溶液。
B)在第一反应溶液中加入阿仑膦酸,搅拌,进行反应,得到第二反应溶液;
C)第二反应溶液经透析、冻干,得到具有式(I)结构的聚合物。
首先将具有式(II)结构的聚氨基酸溶解于水中,与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺混合,本发明对于所述混合的具体方式不进行限定,本领域技术人员熟知的即可。
本发明所述第一反应溶液的优选pH值需要维持在4.5~6,更优选为5~6,最优选为5.5;本发明所述步骤A中,优选反应温度为20℃~40℃,更优选为20℃~30℃,最优选为25℃;步骤A中所述的优选反应时间为20min~60min,更优选时间为25min~40min,最优选为30min;步骤A中,所述具有式(II)结构的聚氨基酸与EDC、NHS的优选摩尔比为1:2~5,更优选为1:3-4,最优选为1:3.5。
在第一反应溶液中加入阿仑膦酸,搅拌,进行反应,得到第二反应溶液;
发明所述第二反应溶液的优选pH值需要维持在7.5~9,更优选为8~8.5,最优选为8;本发明所述步骤B中,优选反应温度为20℃~40℃,更优选为20℃~30℃,最优选为25℃;所述的优选反应时间为12h~72h,更优选时间为36h~54h,最优选为48h;所述具有式(II)结构的聚氨基酸与与阿仑膦酸的摩尔比为1:2~5;更优选为1:3-4,最优选为1:3.5。
第二反应溶液经透析、冻干,得到具有式(I)结构的聚合物。
本发明所述步骤C中,所述反应后还包括用截流分子量为3500的透析袋进行透析除去未反应的EDC、NHS和阿仑膦酸;
本发明对冻干的方法没有特殊的限制,采用本领域技术人员熟知的冻干技术方案即可;所述冻干的温度优选为-18℃~-20℃;更优选为-20℃;所述冻干的时间优选为60h~72h更优选为72h。
在本发明中,所述的具有式(II)结构的pH响应性聚氨基酸的制备方法包括以下步骤:
a)将十二胺、γ-十二烷基谷氨酸-N-环内羧酸酐、N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸-N-环内羧酸酐溶解于第一有机溶液中,搅拌反应,得到第三反应溶液;
b)在第三反应溶液中加入γ苄基谷氨酸-N-环内羧酸酐,搅拌反应,得到第四反应溶液;
c)将第四反应溶液于第二有机溶剂中沉降,过滤,得到第一固体;
d)将第一固体再次溶解于第一有机溶剂,于去离子水中透析除去有机溶剂和杂质,冻干得到第二固体;
e)将第二固体溶于第三有机溶剂中,得到第三反应溶液;
f)将第三反应溶液于第二有机溶剂中沉降,过滤,得到第三固体;
g)将第三固体溶于第一有机溶剂中,于去离子水中透析,冻干得到具有式(II)结构的聚合物。
其中,所述γ-十二烷基谷氨酸-N-环内羧酸酐的制备方法优选包括以下步骤:
将γ-十二烷基谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯进行缩合反应,得到γ-十二烷基谷氨酸-N-环内酸酐。
本发明将γ-十二烷基谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯混合;所述γ-十二烷基谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯混合的温度优选10℃~40℃,更优选为15℃~35℃,最优选为20℃~30℃。在本发明中,所述γ-十二烷基谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的摩尔比优选为1:(0.1~1.2),更优选为1:(0.3~1),最优选为1:(0.5~0.8)。本发明优选在无水条件下进行γ-十二烷基谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的缩合反应。本发明优选在有机溶剂中先溶解所述γ-十二烷基谷氨酸;所述有机溶剂优选为四氢呋喃;所述有机溶剂的体积和γ-十二烷基谷氨酸的质量比优选为(8~12)mL:1g,更优选为10mL:1g。在本发明中,所述γ-十二烷基谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的缩合反应温度优选为30℃~80℃,更优选为35℃~70℃,最优选为40℃~60℃,所述γ-十二烷基谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的缩合反应时间优选为0.1h~5h,更优选为0.3h~3h,最优选为0.5h~2h。
所述γ-十二烷基谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的缩合反应结束后,本发明优选将得到的反应产物用正己烷沉降,将得到的沉降物分离,然后将得到的分离产物洗涤、重结晶、干燥,得到γ-十二烷基谷氨酸-N-环内酸酐。本发明对洗涤、重结晶、干燥的方法没有特殊的限制,采用本领域技术人员熟知的洗涤、重结晶、干燥的技术方案即可。
所述N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸-N-环内酸酐的制备方法优选包括以下步骤:
本发明将N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸与二氯亚砜混合;所述N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸与二氯亚砜混合的温度优选-5℃~5℃,更优选为-3℃~3℃,最优选为0℃。在本发明中,所述N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸与二氯亚砜的摩尔比优选为1:(0.5~3),更优选为1:(1~2),最优选为1:1.5。本发明优选在无水条件下进行N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸与二氯亚砜的缩合反应。本发明优选在有机溶剂中先溶解所述N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸;所述有机溶剂优选为四氢呋喃;所述有机溶剂的体积和N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸的质量比优选为(8~12)mL:1g,更优选为10mL:1g。在本发明中,所述N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸与二氯亚砜的缩合反应温度优选为-5℃~5℃,更优选为-3℃~3℃,最优选为0℃,所述N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸与二氯亚砜的缩合反应时间优选为1h~5h,更优选为2h~4h,最优选为3.5h。
所述N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸与二氯亚砜的缩合反应结束后,本发明优选将得到的反应产物用正己烷沉降,将得到的沉降物分离,然后将得到的分离产物洗涤、重结晶、干燥,得到N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸-N-环内酸酐。本发明对洗涤、重结晶、干燥的方法没有特殊的限制,采用本领域技术人员熟知的洗涤、重结晶、干燥的技术方案即可。
所述γ-苄基谷氨酸-N-环内酸酐的制备方法优选包括以下步骤:
将γ-苄基谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯进行缩合反应,得到γ-苄基谷氨酸-N-环内酸酐。
本发明将γ-苄基谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯混合;所述γ-苄基谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯混合的温度优选10℃~40℃,更优选为15℃~35℃,最优选为20℃~30℃。在本发明中,所述γ-苄基谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的摩尔比优选为1:(0.1~1.2),更优选为1:(0.3~1),最优选为1:(0.5~0.8)。本发明优选在无水条件下进行γ-苄基谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的缩合反应。本发明优选在有机溶剂中先溶解所述γ-苄基谷氨酸;所述有机溶剂优选为四氢呋喃;所述有机溶剂的体积和γ-苄基谷氨酸的质量比优选为(8~12)mL:1g,更优选为10mL:1g。在本发明中,所述γ-苄基谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的缩合反应温度优选为30℃~80℃,更优选为35℃~70℃,最优选为40℃~60℃,所述γ-苄基谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的缩合反应时间优选为0.1h~5h,更优选为0.15h~3h,最优选为0.2h~2h。
所述γ-苄基谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的缩合反应结束后,本发明优选将得到的反应产物用正己烷沉降,将得到的沉降物分离,然后将得到的分离产物洗涤、重结晶、干燥,得到γ-苄基谷氨酸-N-环内酸酐。本发明对洗涤、重结晶、干燥的方法没有特殊的限制,采用本领域技术人员熟知的洗涤、重结晶、干燥的技术方案即可。
将十二胺、γ-十二烷基谷氨酸-N-环内羧酸酐、N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸-N-环内羧酸酐溶解于第一有机溶液中,搅拌反应,得到第三反应溶液。
所述十二胺、γ-十二烷基谷氨酸-N-环内羧酸酐、N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸-N-环内羧酸酐、γ苄基谷氨酸-N-环内羧酸酐的摩尔比优选为1:(1~3):(10~30):(10~30),更优选为1:(1.5~2.5):(15~25):(15~25),最优选为1:2:20:20。
本发明优选在氮气气氛下进行十二胺、γ-十二烷基谷氨酸-N-环内羧酸酐、N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸-N-环内羧酸酐、γ苄基谷氨酸-N-环内羧酸酐的反应。本发明优选在搅拌的条件下进行。在本发明中,十二胺、γ-十二烷基谷氨酸-N-环内羧酸酐、N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸-N-环内羧酸酐、γ苄基谷氨酸-N-环内羧酸酐进行反应的温度优选为15℃~50℃,更优选为20℃~40℃,最优选25℃~35℃;所述反应的时间选为2天~7天,更优选为3天~5天,最优选为4天。所述第一有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。
在第三反应溶液中加入γ苄基谷氨酸-N-环内羧酸酐,搅拌反应,得到第四反应溶液;本发明所述反应的温度优选为15℃~50℃,更优选为20℃~40℃,最优选25℃~35℃;所述反应的时间选为2天~7天,更优选为3天~5天,最优选为4天。
得到第四反应溶液后本发明优选将第四反应溶液在第二有机溶剂中沉降,过滤,得到第一固体。在本发明中,所述第二有机溶剂优选为乙醚。
将第一固体再次溶解于第一有机溶剂,于去离子水中透析除去有机溶剂和杂质,冻干得到第二固体。
本发明优选将过滤得到的产物第一固体于去离子水中透析,冻干得到具有第二固体。本发明所述冻干的温度为-18℃~-20℃;所述冻干的时间为60h~72h。
将第二固体溶于第三有机溶剂中,得到第三反应溶液。
得到第二固体后,本发明将所述第二固体脱去三苯甲基和苄氧羰基得到第三固体。本发明优选将第三固体溶解在第三有机溶剂中脱去三苯甲基和苄氧羰基;所述第三有机溶剂优选为三氟乙酸和溴化氢的乙酸溶液的混合溶液;所述溴化氢的乙酸溶液中溴化氢和乙酸的体积比优选为0.5:1~5:1,更优选为2:1。
本发明优选在搅拌的条件下进行对第二固体脱去三苯甲基和苄氧羰基。在本发明中,所述固体脱去三苯甲基和苄氧羰基的温度优选为20℃~50℃,更优选为30℃~35℃;所述固体脱去苄氧羰基的时间优选为0.5h~4h,更优选为1h~2h,最优选为1h。
完成第二固体脱去三苯甲基和苄氧羰基的反应后,本发明优选将第三反应溶液于第二有机溶剂中沉降,将抽滤得到的固体产物用第一有机溶剂溶解,然后透析,冻干,得到具有式(II)结构的pH响应性聚氨基酸。
本发明优选采用截留分子量为3500的透析袋去透析;所述透析的时间为4天,每4h换一次透析液。本发明对冻干的方法没有特殊的限制,采用本领域技术人员熟知的冻干技术方案即可;所述冻干的温度为-18℃~-20℃;所述冻干的时间为60h~72h;更优选的,所述冻干的温度优选为-20℃,冻干的时间优选为72h。
本发明提供了一种具有诱导细胞钙化能力的pH响应性聚氨基酸,由阿仑膦酸与具有式(II)结构的pH响应性聚氨基酸在水性介质中发生反应,生成具有诱导细胞钙化能力的pH响应性聚氨基酸。所述具有式(II)结构的pH响应性聚氨基酸为十二胺-聚(γ-十二烷基谷氨酸-嵌段-组氨酸)-共-聚谷氨酸(DDA-P(DLG-co-LH)-PLG),具有良好的生物相容性和可降解性,溶解性好。该分子能够粘附到肿瘤细胞表面,与钙离子结合形成钙沉积,达到非侵入抑制肿瘤细胞生长的目的。
本发明上述技术方案所述的具有式(I)结构的化合物或上述技术方案任一项所述的制备方法制备得到的具有式(I)结构的化合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
按照本发明,所述治疗包括诱导细胞钙化或抑制肿瘤细胞的增殖。
本发明具有式(I)结构的高分子为十二胺-聚(γ-十二烷基谷氨酸-嵌段-组氨酸)-共-聚谷氨酸接枝阿仑膦酸(DDA-P(DLG-co-LH)-P(LG-g-ALN)),其中,组氨酸片段为材料提供了pH响应性,使得十二烷的长碳链部分能够在肿瘤组织弱酸性环境下暴露出来并插入到细胞膜上,ALN部分由于具有双膦酸根结构能够诱导肿瘤微环境中的离子沉积,最终在肿瘤组织周围形成矿化层。该方法不但能抑制原发病灶的生长,而且可以抑制转移灶的形成。作为一种渗透非依赖的治疗方式,避开了限制传统化疗药物疗效的肿瘤渗透压的影响,同时避免耐药性的产生。此外,双磷酸盐限制了破骨细胞的形成和活性,因此抑制了侵袭性骨肉瘤中的骨破坏,而且治疗几乎没有不良反应。
本发明提供了一种治疗肿瘤的药物,包括上述技术方案所述的化合物或上述技术方案所述的制备方法制备得到的化合物。
具体的,本发明提供了一种细胞钙化剂,包括上述技术方案所述的化合物或上述技术方案所述的制备方法制备得到的化合物。
本发明提供了一种肿瘤细胞增殖抑制剂,包括上述技术方案所述的化合物或上述技术方案所述的制备方法制备得到的化合物。
本发明上述治疗肿瘤的药物、细胞钙化剂或肿瘤抑制剂除了包括上述技术方案任意一项所述的化合物或上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到的化合物;还可以包括本领域技术人员熟知的在药学上可以接受的辅料,在此不进行限定。
为了进一步说明本发明,以下结合实施例对本发明提供的一种具有诱导细胞钙化能力的聚氨基酸、以及其制备方法和应用进行详细描述。
实施例1:γ-十二烷基谷氨酸-N-环内酸酐的制备
将1g所述γ-苄基谷氨酸与0.4g双(三氯甲基)碳酸酯在25℃下混合,加入四氢呋喃,加热至50℃反应1h,反应结束后,将反应混合物在过量正己烷中沉降,分离、洗涤、重结晶、干燥后得到γ-十二烷基谷氨酸-N-环内酸酐,核磁图谱参见图1,图1为实施例1制备的γ-十二烷基谷氨酸-N-环内酸酐的核磁图谱。
实施例2:N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸-N-环内羧酸酐的制备
将1g所述N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸溶于四氢呋喃中,与0.2mL二氯亚砜在0℃下混合,反应4h,反应结束后,将反应混合物在过量正己烷中沉降,分离、洗涤、重结晶、干燥后得到N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸-N-环内羧酸酐,核磁图谱参见图2,图2为实施例2制备的N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸-N-环内羧酸酐的核磁图谱。
实施例3:γ-苄基谷氨酸-N-环内酸酐的制备
将1g所述γ-苄基谷氨酸与0.6g双(三氯甲基)碳酸酯在25℃下混合,加入四氢呋喃,加热至50℃反应2h,反应结束后,将反应混合物在过量正己烷中沉降,分离、洗涤、重结晶、干燥后得到γ-苄基谷氨酸-N-环内酸酐,核磁图谱参见图3,图3为实施例3制备的γ-苄基谷氨酸-N-环内酸酐的核磁图谱。
实施例4:不同聚合度的聚氨基酸的制备
将0.187g实施例1制备的γ-十二烷基谷氨酸-N-环内酸酐与1.714g实施例2制备的N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸-N-环内羧酸酐的混合均匀,加入到含有0.05g十二胺的30mL的N,N-二甲基甲酰胺溶液中,氮气气氛下搅拌反应3天,将1.057g实施例3制备的γ-苄基谷氨酸-N-环内酸酐加入到反应体系中,氮气气氛下继续搅拌反应3天,反应后的溶液倾倒入200mL无水乙醚沉降,抽滤取固体,将固体用N,N-二甲基甲酰胺复溶,在去离子水中透析、冻干得到聚氨基酸,平均每个十二胺聚合上2个γ-十二烷基谷氨酸、15个N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸和15个γ-苄基谷氨酸。
实施例5:不同聚合度的聚氨基酸的制备
将0.187g实施例1制备的γ-十二烷基谷氨酸-N-环内酸酐与2.284g实施例2制备的N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸-N-环内羧酸酐的混合均匀,加入到含有0.05g十二胺的20mL的N,N-二甲基甲酰胺溶液中,氮气气氛下搅拌反应3天,将1.409g实施例3制备的γ-苄基谷氨酸-N-环内酸酐加入到反应体系中,氮气气氛下继续搅拌反应3天,反应后的溶液倾倒入160mL无水乙醚沉降,抽滤取固体,将固体用N,N-二甲基甲酰胺复溶,在去离子水中透析、冻干得到聚氨基酸,平均每个十二胺聚合上2个γ-十二烷基谷氨酸、20个N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸和20个γ-苄基谷氨酸。核磁图谱参见图4,图4为实施例5制备的十二胺-聚(γ-十二烷基谷氨酸-共聚-N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸)-嵌段-γ-苄基谷氨酸(DDA-P(DLG-co-TLH)-PBLG)的核磁图谱。
实施例6:不同聚合度的聚氨基酸的制备
将0.187g实施例1制备的γ-十二烷基谷氨酸-N-环内酸酐与2.855g实施例2制备的N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸-N-环内羧酸酐的混合均匀,加入到含有0.05g十二胺的20mL的N,N-二甲基甲酰胺溶液中,氮气气氛下搅拌反应3天,将1.76g实施例3制备的γ-苄基谷氨酸-N-环内酸酐加入到反应体系中,氮气气氛下继续搅拌反应3天,反应后的溶液倾倒入160mL无水乙醚沉降,抽滤取固体,将固体用N,N-二甲基甲酰胺复溶,在去离子水中透析、冻干得到聚氨基酸,平均每个十二胺聚合上2个γ-十二烷基谷氨酸、25个N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸和25个γ-苄基谷氨酸。
实施例7~9:制备的十二胺-聚(γ-十二烷基谷氨酸-共聚-N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸)-嵌段-γ-苄基谷氨酸(DDA-P(DLG-co-TLH)-PBLG)脱去三苯甲基和苄基
分别称取1g实施例4~8中制备的十二胺-聚(γ-十二烷基谷氨酸-共聚-N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸)-嵌段-γ-苄基谷氨酸(DDA-P(DLG-co-TLH)-PBLG)溶解于10mL三氟乙酸中,加入3mL溴化氢的乙酸溶液,室温搅拌反应1h,将反应液倒入100mL乙醚中,抽滤,得到的固体用N,N-二甲基甲酰胺溶解,用截留分子量为3500的透析袋在去离子水中透析3d,每4h换一次透析液,所得溶液冻干后得到具有式(II)结构的十二胺-聚(γ-十二烷基谷氨酸-嵌段-组氨酸)-共-聚谷氨酸(DDA-P(DLG-co-LH)-PLG),核磁图谱参见图4,图4为实施例8制备的具有式(II)结构的pH响应性聚氨基酸的核磁图谱。
实施例10、聚氨基酸十二胺-聚(γ-十二烷基谷氨酸-嵌段-组氨酸)-共-聚谷氨酸接枝阿仑膦酸
称取1g实施例9中制备的聚氨基酸十二胺-聚(γ-十二烷基谷氨酸-嵌段-组氨酸)-共-聚谷氨酸解于30mL去离子水中,加入1.805g的EDC和1.083g的NHS,调节溶液pH为5.5,室温搅拌反应30min,加入2.56g阿伦膦酸,调节溶液pH为8.5,室温下搅拌反应48小时,所得反应体系用截留分子量为3500的透析袋在去离子水中透析三天,每4h换一次透析液,所得溶液冻干后得到具有式(I)结构的具有诱导细胞钙化能力的pH响应性聚氨基酸。
实施例11、聚氨基酸十二胺-聚(γ-十二烷基谷氨酸-嵌段-组氨酸)-共-聚谷氨酸接枝阿仑膦酸
称取1g实施例9中制备的聚氨基酸十二胺-聚(γ-十二烷基谷氨酸-嵌段-组氨酸)-共-聚谷氨酸溶解于30mL去离子水中,加入1.881g的EDC和1.129g的NHS,调节溶液pH为5.5,室温搅拌反应30min,加入2.67g阿伦膦酸,调节溶液pH为8.5,室温下搅拌反应48小时,所得反应体系用截留分子量为3500的透析袋在去离子水中透析三天,每4h换一次透析液,所得溶液冻干后得到具有式(I)结构的具有诱导细胞钙化能力的pH响应性聚氨基酸。核磁图谱参见图4,图4为实施例11制备的具有式(I)结构的钙化诱导pH响应性聚氨基酸的核磁图谱。
实施例12、聚氨基酸十二胺-聚(γ-十二烷基谷氨酸-嵌段-组氨酸)-共-聚谷氨酸接枝阿仑膦酸
称取1g实施例9中制备的聚氨基酸十二胺-聚(γ-十二烷基谷氨酸-嵌段-组氨酸)-共-聚谷氨酸溶解于30mL去离子水中,加入1.931g的EDC和1.160g的NHS,调节溶液pH为5.5,室温搅拌反应30min,加入2.741g阿伦膦酸,调节溶液pH为8.5,室温下搅拌反应48小时,所得反应体系用截留分子量为3500的透析袋在去离子水中透析三天,每4h换一次透析液,所得溶液冻干后得到具有式(I)结构的具有诱导细胞钙化能力的pH响应性聚氨基酸。
实施例13-15:不同聚合度的十二胺-谷氨酸十二醇酯-共聚-组氨酸-嵌段-谷氨酸接枝阿仑膦酸的细胞钙化能力
将实施例10-12中的具有式(I)结构的十二胺-聚(γ-十二烷基谷氨酸-嵌段-组氨酸)-共-聚谷氨酸接枝阿仑膦酸的生理盐水溶液与人源骨肉瘤细胞143B共培养,终浓度为1.0mg/mL,培养基pH为7.4和6.5。混合后一小时,将培养基移除,生理盐水清洗三遍。最后,用2.5%的戊二醛溶液将细胞固定,经乙醇的水溶液梯度脱水,再通过扫描电子显微镜和能谱观测材料对肿瘤细胞的钙化能力影响。
实施例16-18:不同聚合度的十二胺-谷氨酸十二醇酯-共聚-组氨酸-嵌段-谷氨酸接枝阿仑膦酸的肿瘤细胞抑制能力
将实施例10-12中的具有式(I)结构的十二胺-聚(γ-十二烷基谷氨酸-嵌段-组氨酸)-共-聚谷氨酸接枝阿仑膦酸的生理盐水溶液与人源骨肉瘤细胞143B共培养,以最高浓度为1.0mg/mL逐级稀释8个浓度。共培养24小时后,通过常见细胞生存率试验证明其对肿瘤细胞的细胞增殖抑制能力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种具有诱导细胞钙化能力的化合物,具有式(I)结构:
式(I);
其中,10≤x≤16,0≤m≤1,1≤n≤10,1≤i≤5,10≤p≤j,20≤j≤50。
2.一种权利要求1所述的具有诱导细胞钙化能力的化合物的制备方法,其特征在于,包括:
由阿仑膦酸与具有式(II)结构的聚氨基酸在水性介质中发生反应得到;
式(II);
式(II)中,10≤x≤16,0≤m≤1,1≤n≤10,1≤i≤5,20≤j≤50。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
A)将具有式(II)结构的聚氨基酸溶解于水中,与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺混合,反应,得到第一反应溶液;
B)在第一反应溶液中加入阿仑膦酸,搅拌,进行反应,得到第二反应溶液;
C)第二反应溶液经透析、冻干,得到具有式(I)结构的聚合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤A)中,第一反应溶液的pH值为4.5~6;所述反应的温度为20℃~40℃,所述反应的时间为20 min~60 min;
所述具有式(II)结构的聚氨基酸与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:2~5。
5.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤B)中,第二反应溶液的pH值为7.5~9;所述反应的温度为20℃~40℃,所述反应的时间为12 h~72 h;
所述具有式(II)结构的聚氨基酸与阿仑膦酸的摩尔比为1:2~5;
步骤C)中,所述反应后还包括用截流分子量为3500的透析袋进行透析除去未反应的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和阿仑膦酸;
所述冻干的温度为-18℃~-20℃;所述冻干的时间为60 h~72 h。
6.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述具有式(II)结构的聚氨基酸的制备方法包括以下步骤:
a)将十二胺、γ-十二烷基谷氨酸-N-环内羧酸酐、N-叔丁氧羰基-N'-三苯甲基-L-组氨酸-N-环内羧酸酐溶解于第一有机溶液中,搅拌反应,得到第三反应溶液;
b)在第三反应溶液中加入γ苄基谷氨酸-N-环内羧酸酐,搅拌反应,得到第四反应溶液;
c)将第四反应溶液于第二有机溶剂中沉降,过滤,得到第一固体;
d)将第一固体再次溶解于第一有机溶剂,于去离子水中透析除去有机溶剂和杂质,冻干得到第二固体;
e)将第二固体溶于第三有机溶剂中,得到第三反应溶液;
f)将第三反应溶液于第二有机溶剂中沉降,过滤,得到第三固体;
g)将第三固体溶于第一有机溶剂中,于去离子水中透析,冻干得到具有式(II)结构的聚合物。
7.根据权利要求6中所述的制备方法,其特征在于,所述步骤a)中,所述反应的温度为15℃~50℃,所述反应的时间为2~7天;
步骤a)中,所述第一有机溶剂为N, N-二甲基甲酰胺;
步骤b)中,所述反应的温度为15℃~50℃,所述反应的时间为2~7天;
步骤c)中,所述第二有机溶剂为乙醚;
步骤e)中,所述第三有机溶剂为三氟乙酸和溴化氢的乙酸溶液的混合溶液;
步骤g)中,所述透析具体为:采用截流分子量为3500的透析袋进行透析;所述冻干的温度为-18℃~-20℃;所述冻干的时间为60 h~72 h。
8.权利要求1所述的具有式(I)结构的化合物或权利要求2~7任一项所述的制备方法制备得到的具有式(I)结构的化合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述治疗包括诱导细胞钙化或抑制肿瘤细胞的增殖。
10.一种治疗肿瘤的药物,包括权利要求1所述的化合物或权利要求2~7任意一项所述的制备方法制备得到的化合物。
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